TWI735113B - 2,5-呋喃二甲酸之製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,包含:戀臭假單胞菌以及至少一外源基因,所述外源基因為HmfH基因或HMFO基因,且外源基因嵌入戀臭假單胞菌之染色體中。本發明另提供一種2,5-呋喃二甲酸之製備方法,包含:提供包含5-羥甲基糠醛的反應基質,和進行發酵步驟。所述發酵步驟係於反應基質中接種所述生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,並於一發酵溫度下培養一發酵時間,以獲得一發酵物質,其中所述發酵物質中包含2,5-呋喃二甲酸。
Description
本發明是有關於一種戀臭假單胞菌之轉型株,特別是有關於一種生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株及2,5-呋喃二甲酸之製備方法。
美國能源部自2004年以來便特別指出2,5-呋喃二甲酸為世界上十分重要且可從生物質轉化而來的高價值化學品之一。2,5-呋喃二甲酸是聚乙烯喃酸酯(polyethylene furanoate,PEF)的前驅物,聚乙烯喃酸酯為現行從石油資源生產的塑膠原料-聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)的替代原料,其在保有原本聚對苯二甲酸乙二醇酯的特性之下也具有生物可分解性,對環境的衝擊更小更有潛力。此外2,5-呋喃二甲酸具有廣闊的應用前景,例如能合成聚對苯二甲酸丁二酯(polybutylene terephthalate,PBT)與聚對苯二甲酸二丙酯(polypropylene terephthalate,PPT),以及作為琥珀酸和生物尼龍的前驅材料,前述下游產物在原材料市場每年可產出數十億歐元。
近年來也有許多研究結果指出,可以利用化學法或生物法將5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,HMF)轉換為2,5-呋喃二甲酸。5-羥甲基糠醛為一多種用途的中間平台化合物,可從果糖或葡萄糖進行脫水反應而取得,或將木質纖維素水解後所得到的醣類進一步進行脫水反應來生成,而木質纖維素為地球上蘊藏最多醣類的再生原料。因此,以木質纖維素作為料源,用以生產各種特用化學品或生質燃料的技術開發乃為時勢所趨。
以化學法製備2,5-呋喃二甲酸雖然生產效率較高,但通常需要高溫、高壓之操作條件及昂貴的觸媒如白金或是黃金等,並且會產生高鹽類及有機化合物的廢液,製造過程除了昂貴之外,廢液若處理不當也對環境造成影響。而以生物法轉換5-羥甲基糠醛製造2,5-呋喃二甲酸的操作方式相對溫和許多,僅須以培養液培養微生物進行全細胞生物轉換法,不需要高溫高壓的操作方式,亦不會產生有機鹽類及廢酸,對環境的毒性也比較小,然而目前以生物法生產2,5-呋喃二甲酸時,皆以戀臭假單胞菌為宿主細胞並以帶有酵素基因的表現質體作為生產生物工廠。但前述生產方法常較為不穩定,並且需要額外添加抗生素維持,此條件不利於大量生產以供工業使用。
有鑒於此,本發明的一目的是在提供一種可穩定生產2,5-呋喃二甲酸且低成本培養的轉型株,其係將外源
基因嵌入至戀臭假單胞菌的染色體中,而所述的外源基因可轉譯將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸的酵素,使所得到的轉型株可以穩定的表現酵素,且不需額外添加抗生素以維持酵素表現,是以可作為穩定且高效的生物生產工廠。
本發明的另一目的是在提供一種2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其係利用本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,可有效率地將反應基質中的5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸,且培養過程不須添加抗生素及昂貴的誘導劑,在成本考量下非常適合工業化,具有相關市場與工業利用之應用潛力。
本發明之一態樣係在於提供一種生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,其包含一宿主細胞和至少一外源基因。所述宿主細胞為戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。所述至少一外源基因為如序列辨識編號1所示之HmfH基因或如序列辨識編號2所示之HMFO基因,且所述至少一外源基因嵌入宿主細胞之染色體中。
依據前述之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,其中所述至少一外源基因可利用一基因編輯系統嵌入宿主細胞之染色體中。所述基因編輯系統包含一RedCas表達質體和一外源基因表現質體。RedCas表達質體包含依序排列之一第一複製起始點、一第一抵抗抗生素基因、一λ-Red表現卡匣和一Cas表現卡匣。其中第一複製起始點包含序列辨識編號8所示序列,λ-Red表現卡匣包含一第一啟動子、一Gam基因、一Bet基因和一Exo基因,Cas表現卡匣包含一
第二啟動子和一Cas基因。外源基因表現質體包含依序排列之一第二複製起始點、一同源互換左臂、一第二抵抗抗生素基因、一外源基因表現卡匣、一同源互換右臂和一gRNA卡匣。其中外源基因表現卡匣包含一第三啟動子和至少一外源基因,gRNA卡匣包含一第四啟動子和一gRNA序列,且gRNA序列由一間隔(spacer)和一骨架所構成。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成一同源互換區,同源互換區之序列與宿主細胞之染色體之一第一特定序列相對應,間隔之序列與宿主細胞之染色體之一第二特定序列相對應,且第一抵抗抗生素基因和第二抵抗抗生素基因不相同。
依據前述之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,其中Cas基因可包含如序列辨識編號16所示序列、序列辨識編號17所示序列或序列辨識編號18所示序列。
依據前述之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,其中所述至少一外源基因的數量可為2,且二外源基因可相同或不相同。
依據前述之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,當至少一外源基因為HmfH基因時,所述至少一外源基因可更包含如序列辨識編號35所示之HmfT1基因。
依據前述之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,其中所述戀臭假單胞菌可為戀臭假單胞菌S12菌株。
本發明之另一態樣係在於提供一種2,5-呋喃二甲酸之製備方法,包含提供一反應基質以及進行一發酵步驟。所述反應基質包含5-羥甲基糠醛。所述發酵步驟係於反
應基質中接種前段所述之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,並於一發酵溫度下培養一發酵時間,以獲得一發酵物質,其中發酵物質中包含2,5-呋喃二甲酸。
依據前述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中反應基質中5-羥甲基糠醛的起始濃度可為50mM至250mM。
依據前述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中發酵溫度可為30℃,且發酵時間可為24小時。
依據前述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中反應基質可更包含二氧化錳及/或碳酸鈣。所述二氧化錳的添加量可為0.1g/L至1g/L。所述碳酸鈣的添加量可為5g/L至60g/L。
100:2,5-呋喃二甲酸之製備方法
110、120:步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂,所附圖式之說明如下:第1A圖繪示5-羥甲基糠醛的反應途徑及各酵素可進行反應之示意圖;第1B圖繪示各酵素之質體構築示意圖;第1C圖為各酵素將5-羥甲基糠醛轉換為其衍生物之分析結果圖;第2A圖繪示RedCas表達質體構築示意圖;第2B圖繪示外源基因表現質體構築示意圖;第3A圖繪示本發明之實施例1、實施例2和實施例3之轉
型株所使用之RedCas表達質體之構築示意圖;第3B圖繪示本發明之實施例1、實施例2和實施例3之轉型株所使用之外源基因表現質體之構築示意圖;第3C圖繪示將外源基因嵌入戀臭假單胞菌之染色體之運作示意圖;第4A圖為實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之存活菌落之定性圖;第4B圖為實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之同源互換效率之結果圖;第4C圖為實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之存活菌落比例之定量圖;第5A圖繪示進行菌落(colony)PCR而設計之6組獨特引子之位置示意圖;第5B圖為利用菌落PCR確認外源基因嵌入實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之染色體之結果圖;第5C圖為利用菌落PCR確認轉型作用後實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之染色體原始序列存在狀況之結果圖;第5D圖為利用菌落PCR確認轉型作用處理6天後外源基因嵌入實施例1之轉型株之染色體之結果圖;第5E圖為外源基因嵌入實施例1之轉型株之染色體的基因拷貝數之結果圖;第6圖繪示本發明之一實施方式之2,5-呋喃二甲酸之製備方法之步驟流程圖;
第7A圖為實施例1之轉型株將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸之效率分析結果圖;第7B圖為實施例4之轉型株將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸之效率分析結果圖;第8A圖為實施例1和實施例4之轉型株在不同5-羥甲基糠醛起始濃度下將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸之效率分析結果圖;第8B圖為實施例1和實施例4之轉型株在不同5-羥甲基糠醛起始濃度下反應24小時的OD600吸光值;第9圖為實施例5之轉型株將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸之效率分析結果圖;第10圖為實施例6至實施例13將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸之效率分析結果圖;第11圖為實施例14將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸之效率分析結果圖;第12A圖繪示實施例15之轉型株、實施例16之轉型株和實施例17之轉型株將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸的反應途徑之示意圖;以及第12B圖為實施例15之轉型株、實施例16之轉型株和實施例17之轉型株將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸之效率分析結果圖。
本發明之一目的在提供一種可有效率地將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸的轉型株。先前研究指出,包含AAO、CPO、HMFO、UPO、PAMO、GOase和HmfH等酵素可以將HMF轉換為FDCA,由於5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,以下簡稱為HMF)轉換至2,5-呋喃二甲酸(2,5-furandicarboxylic acid,以下簡稱為FDCA)之反應有數個中間產物,各酵素能進行之反應不盡相同,且先前研究的HMF轉換為FDCA反應通常在體外進行,其需要額外的蛋白質萃取步驟,不僅需要高成本且耗時。因此在製備本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株前,先分析各酵素將HMF轉換為其衍生物的能力,以篩選可直接於戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)表現且可直接將HMF轉換為FDCA的酵素,以作為無需任何進一步純化的生物催化劑。
請參照第1A圖,其繪示5-羥甲基糠醛的反應途徑及各酵素可進行反應之示意圖。於第1A圖可見,HMF轉換為FDCA的途徑可為HMF先轉換為5-羥甲基-2-呋喃甲酸(5-hydroxymethyl-2-furancarboxylic acid,以下簡稱為HMFCA)後,再轉換為5-甲醯呋喃-2-羧酸(5-formyl-2-furancarboxylic acid,以下簡稱FFCA),再由FFCA轉換為FDCA。或HMF先轉換為2,5-二甲基呋喃(2,5-diformylfuran,以下簡稱為DFF),再轉換為FFCA,再由FFCA轉換為FDCA。HmfH、HMFO、AAO、CPO、UPO、PAMO和GOase參與的反應途徑不盡相同。
請參照第1B圖,其繪示各酵素之質體構築示意圖。如第1B圖所示,試驗上分別將酵素基因構築於模板質質體pBBR的強啟動子PHCE下游,並將模板質體pBBR之抗抗生素基因更換為卡納霉素(Kanamycin,Km),並將構築好的各酵素質體分別以電穿孔法送入戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)S12菌株中,再培養於含有HMF的反應基質中進行培養,以觀察各酵素將HMF轉換為下游衍生物的能力。其中測試的酵素包含HmfH、HMFO、AAO、CPO、UPO、PAMO和GOase,編碼HmfH的HmfH基因序列如序列辨識編號1所示,編碼HMFO的HMFO基因序列如序列辨識編號2所示,編碼AAO的AAO基因序列如序列辨識編號3所示,編碼CPO的CPO基因序列如序列辨識編號4所示,編碼UPO的UPO基因序列如序列辨識編號5所示,編碼PAMO的PAMO基因序列如序列辨識編號6所示,編碼GOase的GOase基因序列如序列辨識編號7所示。
請再參照第1C圖,為各酵素將HMF轉換為其衍生物之分析結果圖,其中WT代表野生型的戀臭假單胞菌S12菌株,AAO、CPO、HMFO、UPO、PAMO、GOase和HmfH分別表示帶有AAO基因、CPO基因、HMFO基因、UPO基因、PAMO基因、GOase基因和HmfH基因的轉型株。第1C圖的結果顯示,包含野生型的所有組別都可100%將HMF轉換為下游衍生物,顯示其內源酵素ADH即可有效將HMF轉換成HMFCA,但僅有帶有HMFO基因和HmfH基因的組別可直接將HMF轉換成FDCA,是以選用如序列辨
識編號1所示之HmfH基因和如序列辨識編號2所示之HMFO基因作為後續嵌入戀臭假單胞菌之染色體的外源基因。
本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株包含一宿主細胞和至少一外源基因。其中所述宿主細胞為戀臭假單胞菌,所述至少一外源基因為HmfH基因或HMFO基因,且至少一外源基因嵌入宿主細胞之染色體中。
於本發明之一實施方式之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,所述至少一外源基因可利用一基因編輯系統嵌入宿主細胞之染色體中。所述基因編輯系統包含一RedCas表達質體和一外源基因表現質體。請參照第2A圖和第2B圖,第2A圖繪示RedCas表達質體構築示意圖,第2B圖繪示外源基因表現質體構築示意圖。
RedCas表達質體包含依序排列之一第一複製起始點、一第一抵抗抗生素基因、一λ-Red表現卡匣和一Cas表現卡匣。其中第一複製起始點包含序列辨識編號8所示序列,λ-Red表現卡匣包含一第一啟動子、一Gam基因、一Bet基因和一Exo基因,Cas表現卡匣包含一第二啟動子和一Cas基因。進一步地,Cas基因可包含如序列辨識編號16所示序列、序列辨識編號17所示序列或序列辨識編號18所示序列。RedCas表達質體可更包含一araC基因。
外源基因表現質體包含依序排列之一第二複製起始點、一同源互換左臂、一第二抵抗抗生素基因、一外源基因表現卡匣、一同源互換右臂和一gRNA卡匣。其中外源
基因表現卡匣包含一第三啟動子和至少一外源基因,所述至少一外源基因為如序列辨識編號1所示之HmfH基因或如序列辨識編號2所示之HMFO基因。gRNA卡匣包含一第四啟動子和一gRNA序列,且gRNA序列由一間隔(spacer)和一骨架所構成。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區,同源互換區之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第一特定序列相對應,間隔之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第二特定序列相對應,且第一抵抗抗生素基因和第二抵抗抗生素基因不相同。進一步地,外源基因表現質體可更包含二Flp/FRT剔除作用序列,且第二抵抗抗生素基因位於所述二Flp/FRT剔除作用序列之間。
於本發明之一實施方式之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,其中嵌入宿主細胞之染色體中的外源基因數量可為2,且二外源基因可相同或不相同。例如嵌入的二外源基因可為一HmfH基因和一HMFO基因、二HmfH基因或二HMFO基因。此外,於另一實施方式之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,當至少一外源基因為HmfH基因時,所述至少一外源基因可更包含HmfT1基因。而所述宿主細胞可為戀臭假單胞菌S12菌株。
為了製備穩定表現外源基因的生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,試驗上建構了三種不同CRISPR/Cas系統,包括SpCas9、SaCas9以及FnCas12a,並且設計gRNA對
應戀臭假單胞菌染色體之Upp位置(PP_0746)作為對照組,試驗所使用的戀臭假單胞菌為戀臭假單胞菌S12菌株。
請參照第3A圖,其繪示本發明之實施例1、實施例2和實施例3之轉型株所使用之RedCas表達質體之構築示意圖。實施例1-3之轉型株所使用的RedCas表達質體包含依序排列之第一複製起始點、第一抵抗抗生素基因、araC基因、λ-Red表現卡匣和Cas表現卡匣,其中第一複製起始點為RSF1010 ori,其序列辨識編號8所示序列,第一抵抗抗生素基因為如序列辨識編號9所示之抵抗慶大黴素基因,araC基因的核苷酸序列如序列辨識編號10所示。λ-Red表現卡匣包含第一啟動子、Gam基因、Bet基因和Exo基因,其中第一啟動子為如序列辨識編號11所示之araBAD啟動子,Gam基因的核苷酸序列如序列辨識編號12所示,Bet基因的核苷酸序列如序列辨識編號13所示,以及Exo基因的核苷酸序列如序列辨識編號14所示。Cas表現卡匣包含第二啟動子和Cas基因,其中第二啟動子為如序列辨識編號15所示之Tet啟動子。本發明之實施例1、實施例2和實施例3之轉型株所使用的RedCas表達質體分別為pRedSpCas9質體、pRedSaCas9質體和pRedFnCas12a質體。其中pRedSpCas9質體的Cas基因序列如序列辨識編號16所示,pRedSaCas9質體的Cas基因序列如序列辨識編號17所示,pRedFnCas12a質體的Cas基因序列如序列辨識編號18所示。
請參照第3B圖,其繪示本發明之實施例1、實施例2和實施例3之轉型株所使用之外源基因表現質體之構築示意圖。實施例1-3之轉型株所使用的外源基因表現質體包含依序排列之第二複製起始點、同源互換左臂、Flp/FRT剔除作用序列、第二抵抗抗生素基因、Flp/FRT剔除作用序列、外源基因表現卡匣、同源互換右臂和gRNA卡匣,其中第二複製起始點為如序列辨識編號19所示之ColE1 ori,同源互換左臂的序列如序列辨識編號20所示,Flp/FRT剔除作用序列如序列辨識編號21所示,第二抵抗抗生素基因為如序列辨識編號22所示的抵抗四環黴素基因。外源基因表現卡匣包含第三啟動子、外源基因和同源互換右臂,其中第三啟動子為如序列辨識編號23所示的HCE啟動子,外源基因為如序列辨識編號1所示的HmfH基因作為例示,同源互換右臂的序列如序列辨識編號24所示。gRNA卡匣包含第四啟動子和gRNA序列,gRNA序列由間隔(spacer)和骨架所構成。其中第四啟動子為如序列辨識編號25所示之J23119啟動子。本發明之實施例1、實施例2和實施例3之轉型株所使用的外源基因表現質體分別為pHU-Sp質體、pHU-Sa質體和pHU-Fn質體。其中pHU-Sp質體的gRNA序列如序列辨識編號26所示,pHU-Sa質體的gRNA序列如序列辨識編號27所示,pHU-Fn質體的gRNA序列如序列辨識編號28所示。試驗上另建構了pH△U質體做為對照組,其不會對戀臭假單胞菌染色體造成雙股斷裂。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區,同源互換區之序列與戀臭假單
胞菌之染色體之第一特定序列相對應,間隔之序列與戀臭假單胞菌之染色體之戀臭假單胞菌染色體之Upp位置相對應,骨架則與Cas蛋白相互作用。
請再參照第3C圖,其繪示將外源基因嵌入戀臭假單胞菌之染色體之運作示意圖。先將前述構築好的RedCas表達質體(pRedSpCas9質體、pRedSaCas9質體和pRedFnCas12a質體)以電穿孔的方式轉型至戀臭假單胞菌中,並以含有慶大黴素的LB培養基進行培養,以篩選成功轉型RedCas表達質體的轉型株。將轉型株培養於30mL新鮮且含有慶大黴素的LB培養基培養隔夜,加入0.5%的阿拉伯糖後再培養2小時,以誘導轉型株中的RedCas表達質體表現Gam蛋白、Beta蛋白、Exo蛋白和Cas蛋白。以離心收集誘導後的轉型株,並以300mM的蔗糖洗滌2次後,再將外源基因表現質體(pHU-Sp質體、pHU-Sa質體和pHU-Fn質體)以電穿孔的方式轉型至轉型株中,以得到實施例1、實施例2和實施例3之轉型株。進一步地,可利用含有四環黴素的LB培養基培養實施例1、實施例2和實施例3之轉型株,以篩選成功轉型外源基因表現質體的實施例1、實施例2和實施例3之轉型株。再培養實施例1、實施例2和實施例3之轉型株,使外源基因表現質體表現gRNA,其中gRNA與Cas蛋白形成Cas蛋白複合體,對實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之染色體之第二特定序列進行雙股斷裂。Gam蛋白、Beta蛋白和Exo蛋白共同引導外源基因表現質體之同源互換區與第二轉型株之染色體之第一特定序列進行同源
交換,將HmfH基因嵌入實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之染色體之Upp位置中,以得到同源重組體。
為了證實外源基因確實嵌入實施例1、實施例2和實施例3之轉型株的染色體中,將前述以基因編輯系統轉型構築好的質體至戀臭假單胞菌,且經由含有四環黴素的培養基進行篩選獲得的實施例1、實施例2和實施例3之轉型株,最終存活下來之菌落數便代表成功將外源基因同源重組至染色體中之實施例1、實施例2和實施例3之轉型株數量。
請參照第4A圖、第4B圖和第4C圖,第4A圖為實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之存活菌落之定性圖,第4B圖為實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之同源互換效率之結果圖,第4C圖為實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之存活菌落比例之定量圖。
由第4A圖的結果顯示,實施例1、實施例2和實施例3之轉型株(pHU-Sp/Sa或Fn)有明顯的菌落存活,但對照組(pH△U)則完全沒有菌落存活,表示沒有λ-Red系統保護,其外源基因嵌入效率十分低下。試驗上另以未加抗生素所存活的總菌落數作為分母,加入抗生素後的存活菌落數(成功嵌入外源基因之菌落數)作為分子,計算實施例1、實施例2和實施例3之轉型株的存活比率。第4B圖和第4C圖的結果顯示,實施例1、實施例2和實施例3之轉型株的外源基因嵌入效率皆可達接近100%,而實施例1之轉型株的存活比率較實施例2和實施例3之轉型株高。
試驗上進一步利用菌落(colony)PCR進一步驗證送入的外源基因是否嵌入至本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株染色體上的目標位置。請參照第5A圖,繪示進行菌落PCR而設計之6組獨特引子之位置示意圖,菌落PCR之引子係設計於戀臭假單胞菌染色體及嵌入之外源基因兩端交界處,進行PCR後可分別得到之左端PCR產物(P1+P2)約為1.7kb及右端PCR產物(P3+P4)約為1.5kb,另若以P1+P4進行PCR可得到約6.5kb的PCR產物。此外,另針對戀臭假單胞菌染色體上原始序列設計引子P5和P6,進行PCR後可分別得到PCR產物(P5+P6)約為0.5kb,即表示未成功嵌入外源基因至戀臭假單胞菌染色體中。P1的序列如序列辨識編號29所示,P2的序列如序列辨識編號30所示,P3的序列如序列辨識編號31所示,P4的序列如序列辨識編號32所示,P5的序列如序列辨識編號33所示,P6的序列如序列辨識編號34所示。
請參照第5B圖,為利用菌落PCR確認外源基因嵌入實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之染色體之結果圖,其係於實施例1、實施例2和實施例3之轉型株中分別挑選21個菌落,以引子P1與P2或P3與P4進行菌落PCR。結果顯示,雖戀臭假單胞菌具有多倍體的染色體,實施例1、實施例2和實施例3之轉型株的每一個挑選的菌落皆可成功將外源基因嵌入目標位置,顯示外源基因確實嵌入實施例1、實施例2和實施例3之轉型株的多倍體染色體中。
請再參照第5C圖,為利用菌落PCR確認轉型作用後實施例1、實施例2和實施例3之轉型株之染色體原始序列存在狀況之結果圖。其係於實施例1、實施例2和實施例3之轉型株中分別挑選2個菌落,以引子P5與P6進行菌落PCR,若PCR出現訊號表示菌株本該被取代的UPP位置仍然存在,則表示外源基因嵌入錯誤位置或未完全將多倍體的染色體全部嵌入。結果顯示,實施例1、實施例2和實施例3之轉型株的每一個挑選的菌落皆未偵測到PCR產物,再次證明外源基因確實嵌入實施例1、實施例2和實施例3之轉型株。
為了證實本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株的外源基因的表現穩定性,試驗上將外源基因嵌入正確位置的實施例1之轉型株以不含抗生素的LB培養基再培養6天(經過144代),再以菌落PCR進一步驗證送入的外源基因是否仍存在於實施例1之轉型株染色體上的目標位置,並以定量PCR進行外源基因表現的定量分析。
請參照第5D圖和第5E圖,第5D圖為利用菌落PCR確認轉型作用處理6天後外源基因嵌入實施例1之轉型株之染色體之結果圖,第5E圖為外源基因嵌入實施例1之轉型株之染色體的基因拷貝數之結果圖。
第5D圖的結果顯示,經過144代的培養後,外源基因仍存在於實施例1之轉型株之染色體的目標位置。而第5E圖的結果顯示,實施例1之轉型株即使經過144代的培養,於Pseudomonas putida S12的25套染色體中仍能穩
定表現外源基因(HmfH基因),且不表現戀臭假單胞菌原始序列中的Upp基因,證明經由本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株可以於多倍體的染色體中長期穩定的表現所嵌入的外源基因。
請參照第6圖,其繪示本發明之一實施方式之2,5-呋喃二甲酸之製備方法之步驟流程圖。第6圖中,2,5-呋喃二甲酸之製備方法100包含步驟110和步驟120。
步驟110為提供反應基質,其中反應基質包含HMF。進一步地,反應基質中HMF的起始濃度可為50mM至250mM。此外,反應基質可更包含二氧化錳及/或碳酸鈣。所述二氧化錳的添加量可為0.1g/L至1g/L。所述碳酸鈣的添加量可為5g/L至60g/L。較佳地,二氧化錳的添加量可為0.5g/L,所述碳酸鈣的添加量可為30g/L。
步驟120為進行一發酵步驟,係於反應基質中接種本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,並於一發酵溫度下培養一發酵時間,以獲得一發酵物質,其中發酵物質中包含FDCA。進一步地,所述發酵溫度可為30℃,且發酵時間可為24小時。
1.1 實施例1和實施例4
為了證實本發明之2,5-呋喃二甲酸之製備方法可以有效率地將反應基質中的HMF轉換為FDCA,試驗上先分別製備帶有HmfH基因或HMFO基因的生產2,5-呋喃
二甲酸之轉型株,並進一步利用本發明之2,5-呋喃二甲酸之製備方法生產FDCA。
先將前述構築好的pRedSpCas9質體以電穿孔的方式轉型至戀臭假單胞菌中,並以含有慶大黴素的LB培養基進行培養,以篩選成功轉型RedCas表達質體的轉型株。再分別將外源基因為如序列辨識編號1所示之HmfH基因或如序列辨識編號2所示之HMFO基因的外源基因表現質體以電穿孔的方式轉型至轉型株中,以得到實施例1(帶有HmfH基因)和實施例4(帶有HMFO基因)之轉型株。HmfH基因和HMFO基因嵌入實施例1和實施例4之轉型株的機制如前述,在此不再贅述。
試驗上分別將實施例1和實施例4之轉型株接種至含有50mM HMF的反應基質中,於30℃下進行發酵,並於發酵的第0、1、2、3、4、5、6、12、24小時取樣,以HPLC(Shimadzu LC-20A;使用管柱為Thermo scientificTM HypersilTM BDS C18 column;二極管陣列檢測器將以波長230,250,254與285nm進行分析)分析發酵物質中HMF與其他後續衍生物的含量。
請參照第7A圖和第7B圖,第7A圖為實施例1之轉型株將HMF轉換為FDCA之效率分析結果圖,第7B圖為實施例4之轉型株將HMF轉換為FDCA之效率分析結果圖。結果顯示,在HMF濃度50mM時,實施例1之轉型株和實施例4之轉型株將HMF轉換為FDCA最終濃度近似,但實施例1之轉型株在6小時內可測得43mM的FDCA,而實
施例4之轉型株需要超過6小時才能完成FDCA的轉換。前述結果顯示實施例1和實施例4之轉型株已成功將HmfH基因或HMFO基因嵌入戀臭假單胞菌的染色體中,並且不影響其酵素活性同時可成功將HMF轉換為FDCA。
1.2 HMF起始濃度對HMF轉換為衍生物的影響
在確定實施例1和實施例4之轉型株能成功將起始濃度為50mM的HMF轉換為FDCA後,於本試驗例中將進一步提高HMF的初始濃度,以探討不同的HMF起始濃度對HMF轉換為衍生物的影響。試驗上分別將實施例1和實施例4之轉型株接種至含有HMF起始濃度為50mM、60mM、70mM、80mM、90mM和100mM的反應基質中,於30℃下進行發酵,並於發酵的第6小時取樣,以HPLC分析發酵物質中HMF與其他後續衍生物的含量。以及於發酵的第0、3、6、12、24小時取樣測量OD600吸光值。
請參照第8A圖和第8B圖,第8A圖為實施例1和實施例4之轉型株在不同HMF起始濃度下將HMF轉換為FDCA之效率分析結果圖,第8B圖為實施例1和實施例4之轉型株在不同HMF起始濃度下反應24小時的OD600吸光值,其中H50、H60、H70、H80、H90和H100代表實施例1之轉型株於不同起始濃度進行發酵的組別,O50、O60、O70、O80、O90和O100代表實施例4之轉型株於不同起始濃度進行發酵的組別。
第8A圖的結果顯示,以實施例1之轉型株進行發酵,增加HMF的初始濃度會將整個反應累積於中間產物
HMFCA,反而會降低FDCA的轉換。在HMF初始濃度50mM時可將HMF完全轉換為43mM的FDCA,但隨著HMF初始濃度的增加,所轉換的FDCA濃度卻逐步降低至24mM。同時HMFCA的累積量則會隨著HMF起始濃度的提升而逐漸由0mM提升為42mM。以實施例4之轉型株進行發酵,在HMF的初始濃度為60mM時可達最佳FDCA濃度(49mM),然當HMF初始濃度增加為70mM至100mM時則會將整個反應累積於中間產物HMFCA和FFCA,或造成部分HMF為轉換為衍生物,反而會降低FDCA的轉換。
而第8B圖的結果顯示,以不同起始濃度的HMF進行發酵,在24小時內實施例1和實施例4之轉型株的生長狀況皆良好,顯示提高HMF的初始濃度不會影響實施例1和實施例4之轉型株的生長狀況。
1.3 實施例5
由前述結果可見,雖然實施例1和實施例4之轉型株可以將HMF轉換為FDCA,但當提高反應基質中的HMF的起始濃度時,還是有大量的中間產物(HMFCA及/或FFCA)累積無法轉換為FDCA,為了進一步優化本發明之2,5-呋喃二甲酸之製備方法的結果,於本試驗例中以HmfH基因結合與HMFO基因製備生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,並將其用於本發明之2,5-呋喃二甲酸之製備方法來生產FDCA。
先將前述構築好的pRedSpCas9質體以電穿孔的方式轉型至戀臭假單胞菌中,並以含有慶大黴素的LB培
養基進行培養,以篩選成功轉型RedCas表達質體的轉型株。再將同時帶有如序列辨識編號1所示之HmfH基因和如序列辨識編號2所示之HMFO基因的外源基因表現質體以電穿孔的方式轉型至轉型株中,以得到實施例5之轉型株。HmfH基因和HMFO基因嵌入實施例5之轉型株的機制如前述,在此不再贅述。試驗上分別將實施例5之轉型株接種至含有HMF起始濃度為50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM的反應基質中,於30℃下進行發酵,並於發酵的第24小時取樣,以HPLC分析發酵物質中HMF與其他後續衍生物的含量。
請參照第9圖,為實施例5之轉型株將HMF轉換為FDCA之效率分析結果圖。結果顯示,以實施例5之轉型株進行發酵,在HMF初始濃度50mM時可將HMF完全轉換為FDCA,但隨著HMF初始濃度的增加,HMF則轉換為中間產物HMFCA、FFCA和DFF,反而會降低FDCA的轉換。
1.4 二氧化錳及/或碳酸鈣的添加對HMF轉換為衍生物的影響
為了進一步優化本發明之2,5-呋喃二甲酸之製備方法的結果,於本試驗例中於反應基質中添加二氧化錳及/或碳酸鈣,並分別接種實施例1或實施例4之轉型株進行發酵以生產FDCA。
試驗上分別將製備含有100mM HMF的反應基質、含有100mM HMF和0.5g/L二氧化錳的反應基質、含有100mM HMF和30g/L碳酸鈣的反應基質以及含有
100mM HMF、0.5g/L二氧化錳和30g/L碳酸鈣的反應基質,並分別接種實施例1之轉型株或實施例4之轉型株,於30℃下進行發酵,並於發酵的第24小時取樣,以HPLC分析發酵物質中HMF與其他後續衍生物的含量。請參照下表一,為本發明之實施例6至實施例13所使用的轉型株以及二氧化錳及/或碳酸鈣的添加量。
請參照第10圖,為實施例6至實施例13將HMF轉換為FDCA之效率分析結果圖。結果顯示,以實施例1之轉型株進行發酵,在未添加二氧化錳或碳酸鈣的實施例6中可見100mM的HMF轉換為24mM的FDCA和42mM的HMFCA。而添加二氧化錳的實施例7,HMF轉換為FDCA的濃度提高至31mM,HMFCA的濃度降低至33mM。添加碳酸鈣的實施例8,HMF轉換為FDCA的濃度則提高至57mM,HMFCA的濃度降低至27mM。同時添加二氧化錳和碳酸鈣的實施例9,HMF可完全轉換為FDCA,且FDCA的濃度可高達92mM。而以實施例4之轉型株進行發酵,在未
添加二氧化錳或碳酸鈣的實施例10中可見100mM的HMF轉換為13mM的FDCA、5mM的HMFCA和75mM的FFCA,而添加二氧化錳的實施例11,HMF轉換為FDCA的濃度提高至30mM,HMFCA的濃度提高至18mM,FFCA的濃度降低至35mM。添加碳酸鈣的實施例12,HMF轉換為FDCA的濃度則提高至73mM,HMFCA的濃度降低至3mM,FFCA的濃度降低至13mM。同時添加二氧化錳和碳酸鈣的實施例13,HMF轉換為FDCA的濃度可高達74mM,而HMFCA的濃度為19mM。上述結果顯示,二氧化錳或碳酸鈣的添加皆能提高酵素活性。
1.5 二氧化錳及/或碳酸鈣的添加及HMF起始濃度對FDCA生產率的影響
在證明二氧化錳及/或碳酸鈣的添加可優化本發明之2,5-呋喃二甲酸之製備方法的FDCA產量後,本試驗例進一步探討在添加二氧化錳及/或碳酸鈣的情況下,不同的HMF起始濃度對HMF轉換為衍生物的影響。
試驗上將實施例1之轉型株分別接種至含有0.5g/L的二氧化錳、30g/L的碳酸鈣和不同起始濃度的HMF的反應基質作為實施例14,HMF的起始濃度分別為125mM、150mM、175mM、200mM、225mM和250mM,於30℃下進行發酵,並於發酵的第24小時取樣,以HPLC分析發酵物質中HMF與其他後續衍生物的含量,並計算FDCA的生產率。
請參照第11圖,為實施例14將HMF轉換為FDCA之效率分析結果圖。結果顯示,以實施例1之轉型株進行發酵,並於反應基質中同時添加二氧化錳和碳酸鈣的情況下,當HMF起始濃度為200mM時,HMF轉換為FDCA的濃度最高,FDCA的濃度可達177mM,速率為1.15g/L.h。
1.6 實施例15-17
請參照第12A圖,其繪示實施例15之轉型株、實施例16之轉型株和實施例17之轉型株將HMF轉換為FDCA的反應途徑之示意圖。如試驗例1.5的結果可見,當HMF的起始濃度為250mM時,會增加HMFCA的積累。據報導戀臭假單胞菌S12缺乏HMFCA轉運蛋白,而HMFT1是一種膜結合酶,可以將HMFCA從培養基轉運到細胞質中。為了再提高HMF轉換FDCA的產量,本試驗例中進一步製備同時帶有HmfH基因和HmfT1基因的實施例15之轉型株、實施例16之轉型株和實施例17之轉型株,讓HmfT1和HmfH的共表達減輕HMFCA在培養基中的積累,並提高FDCA的產量。
試驗上分別以不同轉錄強度的組成型啟動子(PGm、PTet和PC)作為轉錄HmfT1基因的啟動子,以構築同時帶有如序列辨識編號1所示之HmfH基因和如序列辨識編號35所示之HmfT1基因的外源基因表現質體。在製備實施例15至實施例17之轉型株時,先將前述構築好的pRedSpCas9質體以電穿孔的方式轉型至戀臭假單胞菌
中,並以含有慶大黴素的LB培養基進行培養,以篩選成功轉型RedCas表達質體的轉型株。再分別將帶有不同啟動子且同時帶有HmfH基因和HmfT1基因的外源基因表現質體以電穿孔的方式轉型至轉型株中,以得到實施例15至實施例17之轉型株,其中實施例15之轉型株、實施例16之轉型株和實施例17之轉型株轉錄HmfT1基因所使用的啟動子分別為PGm、PTet和PC。而HmfH基因和HmfT1基因嵌入實施例15至實施例17之轉型株的機制如前述,在此不再贅述。試驗上再分別將實施例15至實施例17之轉型株接種至含有含有0.5g/L的二氧化錳和30g/L的碳酸鈣且HMF起始濃度為250mM的反應基質中,於30℃下進行發酵,並於發酵的第24小時取樣,以HPLC分析發酵物質中HMF與其他後續衍生物的含量。
請參照第12B圖,為實施例15之轉型株、實施例16之轉型株和實施例17之轉型株將HMF轉換為FDCA之效率分析結果圖。第12B圖的結果顯示,藉由在細胞膜上與HmfH共同表達HmfT1,無論使用何種啟動子,實施例15至實施例17之轉型株都能將起始濃度為250mM的HMF轉換為190mM以上的FDCA。特別是在以Pc啟動子轉錄HmfT1基因的實施例17之轉型株,在24小時內可將起始濃度為250mM的HMF轉換為196mM的FDCA,且培養基中僅存有2mM的HMFCA。且與實施例1之轉型株相比,在相同的發酵條件下,實施例17之轉型株亦可提高FDCA的生產率(1.27g/L.h)。
綜上所述,本發明提供一種可穩定生產2,5-呋喃二甲酸且低成本培養的轉型株,其係將外源基因嵌入至戀臭假單胞菌的染色體中,而所述的外源基因可轉譯將5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸的酵素,使所得到的轉型株可以穩定的表現酵素,且不需額外添加抗生素以維持酵素表現,是以可作為穩定且高效的生物生產工廠。本發明另提供一種2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其係利用本發明之生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,可有效率地將反應基質中的5-羥甲基糠醛轉換為2,5-呋喃二甲酸,且培養過程不須添加抗生素及昂貴的誘導劑,並可在添加二氧化錳及/或碳酸鈣的情況下優化2,5-呋喃二甲酸的生產率,在成本考量下非常適合工業化,具有相關市場與工業利用之應用潛力。
然本發明已以實施方式揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明的精神和範圍內,當可作各種的更動與潤飾,因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
序列表 <![CDATA[<110> 國立清華大學;長春人造樹脂廠股份有限公司;長春石油化學股份有限公司;大連化學工業股份有限公司]]> <![CDATA[<120> 生產2,5-喃二甲酸之轉型株及2,5-喃二甲酸之製備方法]]> <![CDATA[<160> 34]]> <![CDATA[<210> 1]]> <![CDATA[<211> 1737]]> <![CDATA[<212> DNA]]> <![CDATA[<213> Artificial Sequence]]> <![CDATA[<223> HmfH gene]]> <![CDATA[<400> 1]]> atggacaccc cgcgcgagcg tttcgactac gtcattgtcg gcggcggtag cgccggctgc 60 gtgttggcga accgtctgtc gcaggacccc gccatccgcg tggccttgat tgaggccggc 120 gtggataccc cgcccgatgc cgtgcccgcg gaaatcctgg actcgtaccc gatgccgctg 180 ttcttcggcg atcgctacat ctggccctcg ctgcaagcgc gcgccgtggc cggcggccgc 240 agcaaggtct atgagcaagg ccgcgtcatg ggcggtggct cgagcatcaa tgtgcaggcc 300 gccaaccgcg gcctgccgcg cgactacgat gaatgggccg cgagcggcgc cagcggctgg 360 agctggcagg atgtgttgcc ctactttcgt cacctggaac gcgacgtgga ctacggcaac 420 agccccctgc acggtagcca cggcccggtg ccgatccgcc gcattttgcc ccaggcctgg 480 ccgccgttct gcacggaatt cgcccatgcc atgggccgct cgggtttgtc ggccctggcc 540 gaccagaacg ccgagttcgg tgacggttgg ttcccggcgg ccttcagcaa cctggacgac 600 aaacgcgtca gcacggcgat cgcgtacctg gatgccgaca cccgccgtcg tgccaacctg 660 cgcatctacg ccgagaccac cgtgcgtaag ctggtcgtgt cgggccgtga agcgcgtggc 720 gtgatcgcca tgcgcgcgga tggttcgcgt ctggccctgg atgcgggtga agtcatcgtg 780 agcgccggcg ccctgcagtc gccggccatc ttgatgcgcg ccggcatcgg tgatgccggc 840 gcgttgcaag ccctgggcat cgaggtggtg gccgatcgtc ctggtgtcgg ccgtaatttg 900 caggaccacc cggcgctgac cttctgccag ttcctggcgc cccagtaccg tatgccgttg 960 tcgcgccgcc gtgccagcat gaccgccgcc cgctttagca gcggcgtgcc gggcggcgag 1020 gccagcgata tgtacctgtc gagctcgacc cgtgccggct ggcacgccct gggcaatcgc 1080 ctgggcttgt ttttcttgtg gtgcaaccgc ccgttcagcc gcggtcaggt gagcttggcc 1140 ggcgcgcagc cggacgtgcc gcccatggtc gagctgaacc tgctggacga tgaacgtgac 1200 ctgcgccgca tggtggccgg cgtgcgtaaa ctggtccaga tcgtgggtgc gtcggccttg 1260 caccaacatc ctggtgattt cttcccggcc accttctcgc cccgtgtgaa agccctgtcg 1320 cgcgtgagcc gtggcaatgt gctgctgacc gaactgctgg gtgccgtcct ggacgtgagc 1380 ggtccgttgc gccgtagcct gatcgcccgt ttcgtgaccg gcggcgccaa cttggccagc 1440 ctgctgacgg acgaaagcgc 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Claims (10)
- 一種2,5-呋喃二甲酸之製備方法,包含:提供一反應基質,該反應基質包含5-羥甲基糠醛及二氧化錳,其中二氧化錳的添加量為0.1g/L至1g/L;以及進行一發酵步驟,係於該反應基質中接種一生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株,並於一發酵溫度下培養一發酵時間,以獲得一發酵物質,其中該發酵物質中包含該2,5-呋喃二甲酸;其中該生產2,5-呋喃二甲酸之轉型株包含:一宿主細胞,其中該宿主細胞為一戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida);以及至少一外源基因,其中該至少一外源基因為如序列辨識編號1所示之HmfH基因或如序列辨識編號2所示之HMFO基因,且該至少一外源基因嵌入該宿主細胞之一染色體之一Upp位置中。
- 如申請專利範圍第1項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該至少一外源基因係利用一基因編輯系統嵌入該宿主細胞之該染色體之該Upp位置中,該基因編輯系統包含:一RedCas表達質體,包含依序排列之一第一複製起始點、一第一抵抗抗生素基因、一λ-Red表現卡匣和一Cas 表現卡匣,其中該第一複製起始點包含序列辨識編號8所示序列,該λ-Red表現卡匣包含一第一啟動子、一Gam基因、一Bet基因和一Exo基因,該Cas表現卡匣包含一第二啟動子和一Cas基因;以及一外源基因表現質體,包含依序排列之一第二複製起始點、一同源互換左臂、一第二抵抗抗生素基因、一外源基因表現卡匣、一同源互換右臂和一gRNA卡匣,其中該外源基因表現卡匣包含一第三啟動子和該至少一外源基因,該gRNA卡匣包含一第四啟動子和一gRNA序列,且該gRNA序列由一間隔(spacer)和一骨架所構成,該gRNA序列對應該宿主細胞之該染色體之該Upp位置;其中該同源互換左臂和該同源互換右臂構成一同源互換區,該同源互換區之序列與該宿主細胞之該染色體之一第一特定序列相對應,該間隔之序列與該宿主細胞之該染色體之一第二特定序列相對應,且該第一抵抗抗生素基因和該第二抵抗抗生素基因不相同。
- 如申請專利範圍第2項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該Cas基因包含如序列辨識編號16所示序列、序列辨識編號17所示序列或序列辨識編號18所示序列。
- 如申請專利範圍第2項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該至少一外源基因的數量為2,且該二外源基因相同或不相同。
- 如申請專利範圍第1項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,當該至少一外源基因為HmfH基因時,該至少一外源基因更包含如序列辨識編號35所示之HmfT1基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該戀臭假單胞菌為戀臭假單胞菌S12菌株。
- 如申請專利範圍第1項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該反應基質中5-羥甲基糠醛的起始濃度為50mM至250mM。
- 如申請專利範圍第1項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該發酵溫度為30℃,且該發酵時間為24小時。
- 如申請專利範圍第1項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該反應基質更包含碳酸鈣。
- 如申請專利範圍第9項所述之2,5-呋喃二甲酸之製備方法,其中該反應基質中碳酸鈣的添加量為5g/L至60g/L。
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