JP5946080B2 - 藍藻においてプラスチック原料および関連物質を生産する方法 - Google Patents
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Description
単細胞性シアノバクテリア(単細胞性藍藻)、Synechocystis sp.PCC 6803(以下Synechocystis)細胞を用いて、窒素応答性レスポンスレギュレーターRre37を過剰発現する株を構築した。Synechocystis sp.PCC 6803は、パスツール研究所(フランス)から入手可能である(http://www.pasteur.fr/ip/easysite/pasteur/en/research/collections/crbip/general-informations-concerning-the-collections/iv-the-open-collections/iv-iii-pasteur-culture-collection-of-cyanobacteria)。rre37遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)に光合成系II反応中心タンパク質をコードするpsbAIIのプロモーターを付加し、ゲノム上の影響の少ない領域へ導入した(図1)。具体的には、Rre37過剰発現株を、以下のとおり作製した。
単細胞性シアノバクテリア、Synechocystis sp.PCC 6803(以下Synechocystis)細胞を用いて、Rre37とSigEの二重過剰発現株を以下のとおり作製した。
実施例1で作製したRre37過剰発現株(ROX370)、実施例2で作製したRre37/SigE二重過剰発現株(Rre37/SigEox)及び野生株(GT)について、細胞を窒素欠乏状態にし、細胞バイオマスを調べた。窒素源のない培地に異なる濃度の塩化アンモニウムを窒素源として加え、これを使い切らせることにより窒素欠乏状態にした。本実施例では、3段階の初期塩化アンモニウム濃度(2、3、5mM)で9日間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を、−80℃で3日間凍結乾燥し、その重量を細胞バイオマスとした。
実施例1で作製したRre37過剰発現株(ROX370)、実施例2で作製したRre37/SigE二重過剰発現株(Rre37/SigEox)及び野生株(GT)について、ポリヒドロキシブタン酸(PHB)の細胞内蓄積量を測定した。PHB定量には、2段階の初期塩化アンモニウム濃度(3、5mM)を使用した以外は実施例3と同様に培養した細胞を用いた。まず細胞を凍結乾燥し、得られた細胞をクロロホルムに懸濁し、4日間70℃のインキュベートと約5分間の超音波破砕を行った。この破砕液をヘキサン、クロロホルム、メタノール等を用いて抽出・精製し、得られたサンプルの重量をPHB量とした。
実施例1で作製したRre37過剰発現株(ROX370)、実施例2で作製したRre37/SigE二重過剰発現株(Rre37/SigEox)及び野生株(GT)について、クエン酸及びコハク酸の細胞内蓄積量を測定した。
反応液:0.2mM BTB、15mM Na2HPO4・12H2O
カラム:Shodex RSpak KC−811x2
結果を図8に示す。Rre37過剰発現株(ROX370)、特にRre37/SigE二重過剰発現株(Rre37/SigEox)において、野生株と比較してコハク酸生産量の顕著な増大が見られた。
実施例1で作製したRre37過剰発現株(ROX370)及び野生株(GT)を培養した場合の水素生産量を測定した。培養は、すべて30℃、白色光50〜80μmolフォトン/m2sで実施した。
実施例2で作製したRre37/SigE二重過剰発現株(Rre37/SigEox)及び野生株(GT)について、嫌気・暗条件での培養液中のコハク酸量を測定した。
Claims (19)
- rre37遺伝子が過剰発現している藍藻。
- 藍藻がポリヒドロキシアルカン酸生産能を有する、請求項1記載の藍藻。
- 藍藻がポリヒドロキシブタン酸生産能を有する、請求項2記載の藍藻。
- phaAB遺伝子とphaEC遺伝子を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の藍藻。
- Synechocystis属に属する、請求項1〜4のいずれか1項記載の藍藻。
- さらにsigE遺伝子が過剰発現している、請求項1〜5のいずれか1項記載の藍藻。
- ポリヒドロキシアルカン酸の生産方法であって、ポリヒドロキシアルカン酸生産能を有し、rre37遺伝子が過剰発現している藍藻を培養すること、及びポリヒドロキシアルカン酸を採取することを含む、前記方法。
- 藍藻がphaAB遺伝子とphaEC遺伝子を有する、請求項7記載の方法。
- 藍藻がSynechocystis属に属する、請求項7又は8記載の方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸がポリヒドロキシブタン酸である、請求項7〜9のいずれか1項記載の方法。
- 藍藻が、さらにsigE遺伝子を過剰発現している、請求項7〜10のいずれか1項記載の方法。
- 培養を窒素欠乏条件で行う、請求項7〜11のいずれか1項記載の方法。
- 藍藻においてポリヒドロキシアルカン酸生産能を増強する方法であって、藍藻においてrre37遺伝子を過剰発現させることを含む、前記方法。
- 藍藻がphaAB遺伝子とphaEC遺伝子を有する、請求項13記載の方法。
- 藍藻がSynechocystis属に属する、請求項13又は14記載の方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸がポリヒドロキシブタン酸である、請求項13〜15のいずれか1項記載の方法。
- コハク酸の生産方法であって、請求項1〜6のいずれか1項記載の藍藻を培養し、コハク酸を採取することを含む、前記方法。
- 培養を窒素欠乏条件で行う、請求項17記載の方法。
- 水素の生産方法であって、請求項1〜6のいずれか1項記載の藍藻を、嫌気条件下で培養することを含む、前記方法。
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