WO2014046178A1 - 遺伝子、微生物、変換方法及び製造方法 - Google Patents

遺伝子、微生物、変換方法及び製造方法 Download PDF

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hydroxybutyryl
microorganism
sequence
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青木　裕史
謙 小木戸
米田　正
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昭和電工株式会社
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    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
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    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to genes, microorganisms, conversion methods and production methods.
  • Examples of compounds expected to convert biomass raw materials include butanediols (referring to 1,3-butanediol and 1,4-butanediol).
  • 1,4-butanediol is used as a synthetic raw material for fine organic chemicals, as a monomer unit for polyester and engineering plastics
  • 1,3-butanediol is used as an organic solvent, a cosmetic base material, and the like.
  • 1,4-butanediol and 1,3-butanediol there is an increasing demand for biochemical processes using renewable resources such as biomass as raw materials.
  • Examples of methods for producing butanediols using a biochemical process include the methods described in Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Document 1.
  • Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Document 1 have complicated processes.
  • a new method for producing 1,4-butanediol is provided that can economically obtain 1,4-butanediol.
  • the conversion method relevant to the said manufacturing method and the gene and microorganisms which can be applied to the said manufacturing method and the said conversion method are provided.
  • the present invention includes the following.
  • A a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • B a gene having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • C a gene having a base sequence complementary to the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and hybridizing under stringent conditions gene
  • a microorganism comprising the gene according to [1] and a gene encoding enoyl CoA hydratase.
  • [6] A production method for producing 1,4-butanediol using the microorganism according to [4] or a culture of the microorganism.
  • An economical method for producing 1,4-butanediol can be provided.
  • the conversion method relevant to the said manufacturing method, the gene and microorganisms which can be applied to the said manufacturing method and the said conversion method can be provided.
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining a conversion method between 3-hydroxybutyryl and 4-hydroxybutyryl according to the present embodiment.
  • CoA means coenzyme A.
  • the gene of this embodiment is a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and its homologue.
  • the gene of the present embodiment is expressed in a microorganism by transformation or the like in combination with a gene encoding an enoyl CoA hydratase enzyme, for example, a conversion method between 3-hydroxybutyryl and 4-hydroxybutyryl Alternatively, it can be applied to a method for producing 1,4-butanediol.
  • the homolog in this embodiment includes an ortholog and a paralog.
  • the ortholog refers to a gene corresponding to a species generated by speciation from a common ancestral gene and a set of enzymes obtained from the gene.
  • the paralog refers to a set of genes corresponding to each other between species generated by gene duplication rather than species differentiation within the same species and an enzyme obtained from the genes.
  • a homolog refers to a gene having sequence identity regardless of an ortholog or paralog and an enzyme obtained from the gene.
  • the homologous gene of the gene having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 has a nucleotide sequence of 90% or more, preferably 95% or more identical to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. More preferably, it includes genes in which one or several of the bases of the gene have been deleted, substituted or added.
  • the homologous gene includes a gene that hybridizes under stringent conditions with a gene having a base sequence complementary to the gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a homology search program for a known database for example, BLAST, FASTA
  • a probe consisting of at least a part of an identified gene base sequence complementary to DNA consisting of the base sequence of the gene
  • the DNA can be obtained based on conventional methods such as hybridization under stringent conditions using the DNA or polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Examples of the transformed host microorganism into which the gene of the present embodiment and the gene encoding the enoyl CoA hydratase enzyme can be introduced are not particularly limited as long as the microorganism can be applied with a gene recombination technique. From the viewpoint of industrial use, specific examples include Escherichia coli, yeast, coryneform bacteria, and Clostridium bacteria. Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kriveromyces lactis, Kriveromyces marxianus and the like.
  • Coryneform bacteria include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Brevibacterium divaricatam, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariofilm, Brevibacterium lactofermentum, Brevi Bacterium Roseum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium carnae, Corynebacterium lilium, Corynebacterium Examples include melase cola, microbacteria and ammonia film.
  • Examples of the bacterium belonging to the genus Clostridium include Clostridium kriveli, Clostridium acetobutylicum, Clostridium aminobutyricum, Clostridium begelinky, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, and the like.
  • the transformed microorganism in the present embodiment may be used in the form of cultured microorganisms themselves or in various forms of the culture.
  • the culture of microorganisms in this embodiment is a suspension of microorganism culture cells in a medium such as a medium or buffer, a cell-free extract from the microorganism culture cells, and further from the cell-free extract. Includes processed products such as those obtained by concentrating, purifying, and extracting components that catalyze the reaction.
  • the culture of microorganisms in this embodiment further includes a product obtained by immobilizing the processed microorganism product on a poorly soluble carrier.
  • immobilization carriers examples include polyacrylamide, polyvinyl alcohol, poly-N-vinylformamide, polyallylamine, polyethyleneimine, methylcellulose, glucomannan, alginate, carrageenan, and the like, as well as copolymers and cross-linked products thereof.
  • the compound which forms the poorly water-soluble solid content which encapsulated the microbial cell of this or its processed material is mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
  • microorganisms or their extract liquid / extraction components retained on a solid object such as activated carbon, porous ceramics, glass fiber, porous polymer molded body, nitrocellulose membrane, etc. It can also be used as a product.
  • the gene of this embodiment is expressed in microorganisms by transformation or the like in combination with a gene encoding the enoyl CoA hydratase enzyme, so that it is between 3-hydroxybutyryl and 4-hydroxybutyryl. It can be applied to the conversion method.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a conversion method between 3-hydroxybutyryl and 4-hydroxybutyryl according to this embodiment.
  • 3-hydroxybutyryl CoA When 3-hydroxybutyryl CoA is supplied into the microorganism, which will be described later, the hydroxyl group (OH group) undergoes a rearrangement reaction by the action of the above gene, and 3-hydroxybutyryl CoA is converted to 4-hydroxybutyryl CoA. Conversion is performed (S105 and S107). Further, when 4-hydroxybutyryl CoA is supplied into the microorganism, the OH group undergoes a rearrangement reaction by the action of the above gene, and 4-hydroxybutyryl CoA is converted to 3-hydroxybutyryl CoA. .
  • the translation result of the gene shown in SEQ ID NO: 1 into the amino acid sequence is GenBank accession no. It is homologous to the translation result of the abfD gene derived from Clostridium aminobutyricum that can be referred to by AJ250267.
  • abfD gene encodes Fermentation of 4-aminobutyrate by Clostridium aminobutyricum: cloning of two genes involved in the formation and dehydration of 4-hydroxybutyryl-CoA, Archives of Microbiology, 174 (3) 189-199 (2000) . It is described in non-patent literature.
  • the gene represented by SEQ ID NO: 1 is considered to encode an enzyme having 4-hydroxybutyryl CoA dehumanlatase activity from the translation sequence and the reaction provided by the gene.
  • the conversion function between 3-hydroxybutyryl and 4-hydroxybutyryl does not act. That is, in this embodiment, in the recombinant, the function of converting between 3-hydroxybutyryl and 4-hydroxybutyryl by co-expression of the gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 with another gene Is considered to be expressed.
  • amino acid sequence encoded by the gene represented by SEQ ID NO: 1 of the present embodiment and the abfD gene described above is homologous, but the homology of the base sequence using gene information processing software (GENETYX; GENETYX CORPORATION) is It is very different from 75%.
  • gene information processing software GENETYX; GENETYX CORPORATION
  • Method for producing 1,4-butanediol 3-hydroxybutyryl CoA and / or 4-hydroxybutyryl CoA obtained by the above-described conversion method is a precursor for producing butanediols by further combining other reactions with the acyl CoA site as a reactive site. It can be a body. Therefore, the gene of the present embodiment can be applied to an efficient method for producing butanediols (for example, 1,4-butanediol).
  • FIG. 1 also shows a schematic diagram for explaining the method for producing 1,4-butanediol according to this embodiment.
  • the gene represented by SEQ ID NO: 1 the gene encoding enoyl CoA hydratase enzyme, and the gene encoding acyl CoA reductase are expressed in the microorganism.
  • 3-hydroxybutyryl CoA is supplied into the microorganism with these genes expressed, it is first converted to 4-hydroxybutyryl CoA (S105 and S107). Thereafter, it is converted into 1,4-butanediol by the action of a gene encoding acyl CoA reductase (S109).
  • 3-hydroxybutyryl CoA is converted to 1,3-butanediol (not shown) by the action of a gene encoding acyl CoA reductase.
  • the reaction proceeds by co-expressing an enzyme or a series of enzymes described below in a microorganism transformed by genetic recombination.
  • the host microorganism is transformed by inserting the gene encoding each enzyme individually or as a series of clusters into an arbitrary vector.
  • Each gene is expressed by culturing the obtained transformant in a medium containing a suitable carbon source, for example, glucose as a carbon source.
  • a suitable carbon source for example, glucose as a carbon source.
  • the gene is expressed by culturing the transformant in a medium.
  • each encoded gene is expressed by adding an induction substrate and moving to an inductive environment.
  • the culture in the present embodiment includes all the usual culture conditions for microbial culture, and the culturing step means that the microorganism is cultured for a sufficient time and condition for producing butanediols. To do.
  • a method for producing 3-hydroxybutyryl CoA or 4-hydroxybutyryl CoA serving as a substrate for the method for producing butanediols of the present embodiment will be described.
  • the enzyme reaction (S101) was used.
  • Acetyl CoA is obtained by a known route such as glycolysis.
  • acetoacetyl-CoA is reduced to give 3-hydroxybutyryl CoA
  • acetoacetyl-CoA reductase EC number 1.1.1.16
  • 3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase EC number 1.1.1.35
  • 3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase EC number 1.1.1.157
  • an enzyme reaction using these homologs can give 3-hydroxybutyryl CoA.
  • propionate CoA transferase As an enzyme that directly transfers CoA to 3-hydroxybutanoic acid, propionate CoA transferase (EC number 2.8.3.1) is known. Supplying 3-hydroxybutanoic acid to a microorganism or a culture containing the microorganism under the expression of a gene encoding a propionate CoA transferase or a homolog thereof, and acetyl CoA serving as a donor of a CoA transfer reaction Can produce 3-hydroxybutyryl CoA. Further, as an enzyme that transfers CoA to 4-hydroxybutanoic acid, Molecular analysis of the analogue succinate degradation pathway in Clostridium kluveri, Journal of Bacteriology, 8 (Journal of Bacteriology, 8) .
  • 4-Hydroxybutyryl CoA CoA transferase described in non-patent literature such as is known.
  • Butyryl CoA By supplying 4-hydroxybutanoic acid to a microorganism or a culture of the microorganism under the expression of a gene encoding this enzyme or a homolog thereof and supplying acetyl-CoA serving as a donor of CoA transfer reaction, Butyryl CoA can be obtained.
  • the enoyl CoA hydratase used in the present embodiment is not particularly limited as long as it is an enzyme that catalyzes a reaction of dehydrating 3-hydroxybutyryl CoA to produce crotonyl CoA.
  • an acetoacetyl CoA reductase that catalyzes a reaction for producing 3-hydroxybutyryl CoA from acetoacetyl CoA depends on the type of enzyme to be applied. Lil CoA can be generated. Enoyl CoA hydratase, which catalyzes the reaction of producing crotonyl CoA from 3-hydroxybutyryl CoA, has similar optical isomer selectivity.
  • the optical selectivity of acetoacetyl-CoA reductase and enoyl-CoA hydratase can be combined appropriately, so that the reaction until the formation of crotonyl-CoA from acetoacetyl-CoA is collected. It is advantageous from the viewpoint of rate.
  • the acyl CoA reductase gene used in the present invention is arbitrarily selected as long as it encodes an enzyme that catalyzes a reaction that reduces the CoA position of 4-hydroxybutyryl CoA to produce 1,4-butanediol. be able to.
  • a gene encoding an oxidoreductase for example, aldehyde dehydrogenase (EC number 1.2.1.10)) acting on an aldehyde, or a homolog thereof, included in a group of EC numbers: 1.2.1 Can be used.
  • 1,4-butanediol can be obtained.
  • 1,4-butanediol can be obtained even when alcohol dehydrogenase having 4-hydroxybutanal reducing activity is co-expressed together.
  • 1,4-butanediol can be obtained from 4-hydroxybutyryl CoA using a gene encoding an aldehyde / alcohol reductase having a composite function or a homologue thereof. It is.
  • the reaction of the present invention is most conveniently performed by, for example, cultivating a transformant in a nutrient medium such as LB medium at a temperature of 15 ° C. to 40 ° C., preferably 18 ° C. to 37 ° C. for about 24 hours.
  • a nutrient medium such as LB medium
  • the concentration of the carbon source in the reaction solution is not limited to the above.
  • Examples of the medium carbon source for culturing microorganisms include sugars such as glucose, sucrose, and fructose, polyols such as glycerol, organic substances such as ethanol, acetic acid, citric acid, succinic acid, lactic acid, benzoic acid, and fatty acids, or alkalis thereof.
  • inorganic nitrogen compounds such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, sodium nitrate, potassium nitrate, nitrogen-containing organic substances such as urea, uric acid, peptone, meat extract, fish extract, soybean flour, etc.
  • nitrogen-containing organic substances such as urea, uric acid, peptone, meat extract, fish extract, soybean flour, etc.
  • fungi with metal salts such as phosphates such as potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, calcium acetate, manganese chloride, copper sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, nickel sulfate, etc.
  • metal salts such as potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, calcium acetate, manganese chloride, copper sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, nickel sulfate, etc.
  • the addition concentration varies depending on the culture conditions, but is usually 0.01% to 5% for phosphate, 10 ppm to 1% for magnesium salt, and about 0.1 ppm to 1,000 ppm for other compounds.
  • yeast extract, casamino acid, or yeast nucleic acid can be added as a source of vitamins, amino acids, nucleic acids, etc., in order to improve the growth and enzyme activity
  • the pH of the medium should be adjusted to 4.5-9, preferably 5-8.
  • microbial cells previously cultured in the medium as described above are separated from the culture solution by a method such as centrifugation or membrane filtration, and water containing the reaction raw material, physiological saline, or a pH equivalent to the culture pH. Suspending and reacting again in a buffer solution consisting of these salts with phosphoric acid, acetic acid, boric acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane, etc. adjusted to reduce the impurities in the reaction solution. It is useful to simplify the fractionation of the product.
  • the pH during the reaction can usually be maintained when a buffer solution with a sufficient concentration is used, but when the reaction deviates from the above pH due to the progress of the reaction, sodium hydroxide, ammonia or the like is used so that the same pH is obtained. It is desirable to adjust accordingly.
  • Separation, recovery and purification of butanediols produced in the reaction solution can be carried out after removing the cells from the reaction solution by centrifugation when the production amount of butanediols reaches a substantial amount, or as it is.
  • the reaction can be carried out by using means for separating and recovering general organic compounds and purifying them. For example, extraction is performed using a suitable organic solvent from a filtrate obtained by removing bacterial cells and the like from the culture solution. In addition to distilling off the extract as it is, high-purity butanediols can be obtained by re-extraction with an appropriate solvent, purification using silica gel or other chromatography, or multistage distillation.
  • reaction rate decreases due to accumulation of butanediols in the reaction solution
  • water, physiological saline, reaction buffer, etc. are added to the reaction solution according to the concentration of the product, and diluted continuously.
  • the method of going is suitable.
  • the bacteria are collected, the supernatant is recovered as a product solution, and the collected bacteria are returned to the solution or suspension containing the reaction raw material again to restore the reaction rate.
  • This operation can be carried out continuously or batchwise using a centrifuge, a separation membrane or the like.
  • Example 1 Blunt end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (4-hydroxybutyryl CoA; corresponding to CoA transferase) with GGATCC (corresponding to BamHI site) added to the 5 ′ end and CTCGAG (corresponding to XhoI site) added to the 3 ′ end
  • the fragment was totally synthesized by a conventional method to obtain a plasmid inserted into the SmaI site in the multicloning site of pUC18.
  • the obtained plasmid was treated with a restriction enzyme to obtain a BamHI-XhoI fragment containing the region of sequence 3.
  • the obtained gene fragment was inserted into the BamHI-XhoI site by a conventional method in the multicloning site of the expression vector pET17b (manufactured by Novagen) to obtain the plasmid pETSD3.
  • the blunt-ended fragment of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 with CACATG (corresponding to NdeI site) added to the 5 ′ end and AAGCTT (corresponding to HindIII site) added to the 3 ′ end was totally synthesized by a conventional method, and a multicloning site of pUC18 A plasmid inserted into the SmaI site was obtained.
  • the obtained plasmid was treated with a restriction enzyme to obtain an NdeI-HindIII fragment containing the region of sequence 1.
  • the obtained gene fragment was inserted into the NdeI-HindIII site in the multicloning site of the expression vector pET17b (manufactured by Novagen) by a conventional method to obtain a plasmid pETSD1.
  • pETSD1 was annealed upstream of the pET17b vector-derived T7 promoter, further added with GGATCC (corresponding to BamHI site) on the 5 ′ side, and the 3 ′ end of sequence 1 of pETSD1 was complemented.
  • PCR was performed using a primer in which GAGCTC (equivalent to a SacI site) was added to the 5 ′ side, and the obtained amplified product was treated with SacI to obtain fragment 1.
  • a blunt-ended fragment of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (corresponding to enoyl CoA hydratase) with CATAGG (corresponding to NdeI site) added to the 5 ′ end and CTCGAG (corresponding to XhoI site) added to the 3 ′ end is synthesized in a conventional manner
  • CATAGG corresponding to NdeI site
  • CTCGAG corresponding to XhoI site
  • the obtained gene fragment was inserted into the NdeI-XhoI site in the multicloning site 2 of the expression vector pETDuet (manufactured by Novagen) by a conventional method to obtain a plasmid pEDSD02.
  • pEDSD02 was annealed upstream of the pETDuet vector-derived T7Lac promoter, and a primer added with GAGCTC (equivalent to the SacI site) on the 5 ′ side was complemented with the 3 ′ end of sequence 1 of pEDSD01.
  • PCR was performed using a primer in which a complementary sequence of GGATCC (corresponding to BamHI site) was added to the 5 ′ side, and the obtained amplified product was treated with SacI to obtain fragment 2.
  • Fragment 1 and fragment 2 were ligated between SacI sites by a conventional method to obtain fragment 3 containing sequence 1 and sequence 2.
  • PCR was performed using fragment 3 and primers designed in advance so that 15 bp upstream and downstream of the BETHI site of pETSD3 (including the BamHI site of fragment 3) were added to both ends on the outside of fragment 3. went.
  • the obtained amplified product and the BamHI-treated fragment of pETSD3 were ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) to obtain a plasmid pETSD123 containing Sequence 3, Sequence 1 and Sequence 2.
  • Escherichia coli Rosetta Blue (DE3) strain (manufactured by Novagen) was transformed by a conventional method.
  • Transformant pETSD123 / Rosetta Blue (DE3) was cultured in 5 mL of LB medium containing ampicillin 100 mg / L and chloramphenicol 32 mg / L at 37 ° C. under aerobic conditions for 12 hours. 0.1 mL of the culture solution was transplanted to 5 mL of evaluation medium 1 containing ampicillin 100 mg / L, chloramphenicol 32 mg / L, IPTG 0.2 mM, and 0.3% sodium 4-hydroxybutanoate. The culture was carried out for 48 hours under air.
  • the composition of the evaluation medium 1 is 2% glucose, 1% peptone (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), 2.4% K 2 HPO 4 , 0.6% KH 2 PO 4 , 600ppm iron citrate, 100 ppm riboflavin / distilled water (pH 7.2), It was.
  • evaluation medium 1 all of the above-mentioned compositions were mixed, stirred at room temperature for 2 hours, and then sterilized by filtration using a ⁇ 0.45 ⁇ m filter.
  • the supernatant of the culture solution was subjected to HPLC (column: Shodex SH-1011 (manufactured by Showa Denko), column temperature: 60 ° C., eluent: 25 mM sulfuric acid aqueous solution, flow rate 0.6 mL / min, detection: differential refraction detector). did. 350 mg / L of 3-hydroxybutanoic acid was detected in the culture medium.
  • the compound having a 4-hydroxybutanoic acid skeleton added to the culture medium is converted into 4-hydroxybutyryl by the action of a gene encoding 4-hydroxybutyryl CoA; CoA transferase represented by Sequence 3. CoA. Further, it is converted into 3-hydroxybutyryl CoA by the action of the gene of sequence 1 and the gene of sequence 2. It is considered that the converted 3-hydroxybutyryl CoA was further excreted into the culture solution as 3-hydroxybutanoic acid by the action of thioesterase possessed by E. coli as a host.
  • Example 1 E. coli Rosetta Blue (DE3) strain (manufactured by Novagen) was transformed by a conventional method to obtain a transformant pETSD3 / Rosetta Blue (DE3).
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Example 1.
  • the culture broth after culturing was subjected to the same HPLC as in Example 1, but 3-hydroxybutanoic acid was not detected.
  • Comparative Example 2 A linear blunt-ended fragment obtained by performing inverse PCR on the plasmid pETSD123 obtained in Example 1 using primers that anneal and amplify outward from around the coding region of sequence 1 on pETSD123, and removing sequence 1 from pETSD123. Got.
  • the blunt-ended fragment of the abfD (corresponding to 4-hydroxybutyryl CoA dehydratase) gene sequence derived from the wild strain of Clostridium aminobutyricum shown in SEQ ID NO: 5 was totally synthesized by a conventional method.
  • the resulting blunt end fragment was ligated with the above-mentioned linear blunt end fragment ligated and transformed, and from the mapping by PCR and restriction enzyme treatment, sequence 5 was single-substituted inserted in the same direction as sequence 1 Plasmid pETSD523 was obtained.
  • a transformant pETSD523 / Rosetta Blue (DE3) was obtained by transforming Escherichia coli Rosetta Blue (DE3) strain (manufactured by Novagen) by a conventional method.
  • the obtained transformant pETSD523 / Rosetta Blue (DE3) was cultured and evaluated in the same manner as in Example 1. 3-hydroxybutanoic acid was not detected in the culture solution.
  • Example 2 The blunt end fragment of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 was totally synthesized by a conventional method to obtain a plasmid inserted into the SmaI site in the multiple cloning site of the cloning vector pUC18.
  • the obtained fragment and a linear fragment obtained by inverse PCR of pETSD123 from the center of the restriction enzyme site NdeI were ligated by In-Fusion cloning to obtain a plasmid pETSD4123 containing sequences 1 to 4.
  • the obtained plasmid pETSD4123 was used to transform E. coli Rosetta Blue (DE3) strain by a conventional method.
  • the obtained transformant pETSD4123 / Rosetta Blue (DE3) was cultured in an LB medium containing ampicillin 100 mg / L and chloramphenicol 32 mg / L at 37 ° C. under aerobic conditions for 12 hours. 0.1 mL of the culture solution was transplanted to 5 mL of the above-described evaluation medium 1 containing ampicillin 100 mg / L, chloramphenicol 32 mg / L, IPTG 0.2 mM, and 0.3% sodium 4-hydroxybutanoate. Cultured for 48 hours under aerobic conditions.
  • the culture supernatant was subjected to HPLC (column: Shodex SH-1011 (manufactured by Showa Denko), column temperature: 60 ° C., eluent: 25 mM sulfuric acid aqueous solution, flow rate 0.6 mL / min, detection: differential refraction detector). .
  • HPLC column temperature: Shodex SH-1011 (manufactured by Showa Denko)
  • column temperature 60 ° C.
  • eluent 25 mM sulfuric acid aqueous solution
  • flow rate 0.6 mL / min
  • detection differential refraction detector
  • the compound having a 4-hydroxybutanoic acid skeleton added to the culture medium is converted into 4-hydroxybutyryl by the action of a gene encoding 4-hydroxybutyryl CoA; CoA transferase represented by Sequence 3. CoA. Further, it is converted into 3-hydroxybutyryl CoA by the action of the gene of sequence 1 and the gene of sequence 2.
  • the converted 3-hydroxybutyryl CoA is converted from 3-hydroxybutyryl CoA or 4-hydroxybutyryl CoA by the action of the gene encoding the aldehyde reductase of sequence 4, respectively, , 4-butanediol is produced, and 3-hydroxybutyric acid is produced from 3-hydroxybutyryl CoA by the action of thioesterase possessed by Escherichia coli as a host, and these are considered to be excreted in the culture medium. .
  • Example 3 The plasmid pETSD4123 obtained in Example 2 was treated with the restriction enzyme BamHI. By cutting out the long chain side of the obtained two fragments and ligating them, plasmid pETSD43 from which the gene sequences of sequences 1 and 2 were removed was obtained.
  • the obtained plasmid pETSD43 was used to transform Escherichia coli Rosetta Blue (DE3) strain by a conventional method.
  • the obtained transformant was cultured by the same method as in Example 2. In the culture broth after the culture, 290 mg / L of 1,4-butanediol was detected, but 3-hydroxybutanoic acid and 1,3-butanediol were not detected.
  • the compound having a 4-hydroxybutanoic acid skeleton added to the culture medium is converted into 4-hydroxybutyryl by the action of a gene encoding 4-hydroxybutyryl CoA; CoA transferase represented by Sequence 3. CoA.
  • 4-hydroxybutyryl CoA is not converted to 3-hydroxybutyryl CoA. Therefore, it is considered that 3-hydroxybutanoic acid and 1,3-butanediol were not detected in the culture broth after culturing.
  • Example 3 In the same manner as in Example 1 and Example 2, T7 promoters were individually placed upstream at the multicloning site of vector pET17b, and sequences 4, 1 and 2 were inserted in this order to obtain plasmid pETSD412. It was.
  • plasmid pCDSD6-7 was obtained in which the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 was inserted into multicloning site 1 of vector pCDFDuet (manufactured by Novagen), and the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 was inserted into multicloning site 2. .
  • the resulting plasmids pETSD412 and pCDSD6-7 were used to transform E. coli Rosetta Blue (DE3) strain by a conventional method.
  • the obtained transformant pETSD412 + pCDSD6-7 / Rosetta Blue (DE3) was cultured at 37 ° C. under aerobic condition for 12 hours in 5 mL of LB medium containing 100 mg / L of ampicillin, 50 mg / L of streptomycin, and 32 mg / L of chloramphenicol. did.
  • 0.1 mL of the culture solution was transplanted to 5 mL of the above evaluation medium 1 containing ampicillin 100 mg / L, streptomycin 50 mg / L, chloramphenicol 32 mg / L, and IPTG 0.2 mM, and cultured at 30 ° C. under aerobic conditions for 48 hours. did.
  • the culture supernatant was subjected to HPLC (column: Shodex SH-1011 (manufactured by Showa Denko), column temperature: 60 ° C., eluent: 25 mM sulfuric acid aqueous solution, flow rate 0.6 mL / min, detection: differential refraction detector).
  • HPLC column temperature: 60 ° C.
  • eluent 25 mM sulfuric acid aqueous solution
  • flow rate 0.6 mL / min
  • detection differential refraction detector
  • 3-hydroxybutyryl CoA is generated by the action of the gene having sequence 6 and sequence 7, using acetyl CoA supplied from the glycolysis system as a substrate.
  • a part of 3-hydroxybutyryl CoA is converted to 4-hydroxybutyryl CoA by the action of the gene of sequence 1 and the gene of sequence 2.
  • 1,3-butanediol or 1,4-butanediol is produced from 3-hydroxybutyryl CoA or 4-hydroxybutyryl CoA, respectively, by the action of the gene encoding the aldehyde reductase of sequence 4. It is considered that 3-hydroxybutyric acid was produced from 3-hydroxybutyryl CoA by the action of thioesterase possessed by Escherichia coli as a host, and these were excreted into the culture medium.
  • plasmid pCDSD6-7 was obtained in which the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 was inserted into multicloning site 1 of vector pCDFDuet (manufactured by Novagen), and the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 was inserted into multicloning site 2. .
  • the resulting plasmids pETSD452 and pCDSD6-7 were used to transform Escherichia coli Rosetta Blue (DE3) strain by a conventional method.
  • Transformant pETSD452 + pCDSD6-7 / Rosetta Blue (DE3) was cultured at 37 ° C. for 12 hours in 5 mL of LB medium containing 100 mg / L of ampicillin, 50 mg / L of streptomycin, and 32 mg / L of chloramphenicol.
  • 0.1 mL of the culture solution was transplanted to 5 mL of the above evaluation medium 1 containing ampicillin 100 mg / L, streptomycin 50 mg / L, chloramphenicol 32 mg / L, and IPTG 0.2 mM, and cultured at 30 ° C. under aerobic conditions for 48 hours. did.
  • the culture supernatant was used for HPLC (column: Shodex SH-1011 (Showa Denko), column temperature: 60 ° C., eluent: 25 mM sulfuric acid aqueous solution, flow rate 0.6 mL / min, detection: differential refraction detector). did. In the culture solution, 530 mg / L of 3-hydroxybutanoic acid and 270 mg / L of 1,3-butanediol were detected.

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Abstract

　下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子であって、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、遺伝子。　（ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子　（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子

Description

遺伝子、微生物、変換方法及び製造方法
　本発明は遺伝子、微生物、変換方法及び製造方法に関する。
　近年、化石資源の枯渇や地球温暖化対策などの観点から、再生可能資源を原料とした化合物製造プロセスが注目されている。特に、バイオマスを原料として、生物化学的プロセスで種々のポリマー原料化合物や化学品原料化合物を製造する、所謂バイオリファイナリーが広く検討されている。
　バイオマスの原料転換が期待されている化合物として、ブタンジオール類（１，３－ブタンジオール及び１，４－ブタンジオールを指す。）が挙げられる。例えば、１，４－ブタンジオールは、精密有機化学品の合成原料、ポリエステル及びエンジニアリングプラスチックのモノマー単位などで使用され、１，３－ブタンジオールは、有機溶媒や化粧品基材などで使用される。１，４－ブタンジオール及び１，３－ブタンジオールのいずれの場合においても、バイオマスなどの再生可能資源を原料とした、生物化学的プロセスに対する要求が大きくなっている。
　生物化学的プロセスを用いたブタンジオール類の製造方法としては、例えば、特許文献１乃至３及び非特許文献１に記載された方法が挙げられる。
特許第４３８０７０４号明細書 国際公開２００８／１１５８４０号公報 国際公開２０１０／１２７３１９号公報
Ｈａｒｒｙ　Ｙｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，　　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｆｏｒ　ｄｉｒｅｃｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　７，　４４５－４５２　（２０１１）．
　しかしながら、特許文献１乃至３及び非特許文献１に記載された方法は、プロセスが複雑である。
　上記課題に対して、経済的に１，４－ブタンジオールを得ることができる、新たな１，４－ブタンジオールの製造方法を提供する。また、当該製造方法に関連する変換方法、並びに当該製造方法及び当該変換方法に適用可能な遺伝子、微生物を提供する。
　本発明者らは、上記のような課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定の遺伝子が有効であることを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は以下のものを含む。
［１］下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子であって、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、遺伝子。
　（ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子
　（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
［２］前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム又はクロストリジウムである［１］に記載の遺伝子。
［３］［１］に記載の遺伝子と、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子と、を含む微生物。
［４］アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を更に含む［３］に記載の微生物。
［５］［３］に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する、変換方法。
［６］［４］に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、１，４－ブタンジオールを製造する、製造方法。
［７］前記微生物が、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素又はアセトアセチルＣｏＡ還元酵素の少なくとも一方をコードする遺伝子を含む、［６］に記載の製造方法。
［８］アセチルＣｏＡから３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由して１，４－ブタンジオールを製造する、［６］に記載の製造方法。
　経済的な１，４－ブタンジオールの製造方法を提供できる。また、当該製造方法に関連する変換方法、並びに当該製造方法及び当該変換方法に適用可能な遺伝子、微生物を提供できる。
本実施形態に係る３－ヒドロキシブチリルと４－ヒドロキシブチリルとの間での変換方法を説明するための概略図である。
　以下、図１を用いて、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において、「ＣｏＡ」とは、コエンザイムＡを意味する。
　（遺伝子）
　先ず、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、本実施形態の遺伝子について説明する。
　本実施形態の遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子とそのホモログである。本実施形態の遺伝子は、エノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子と組み合わせて形質転換などにより微生物体内で発現させることで、例えば、３－ヒドロキシブチリルと４－ヒドロキシブチリルとの間での変換方法や、１，４－ブタンジオールの製造方法に適用することができる。
　本実施形態におけるホモログは、オーソログ及びパラログを含む。オーソログとは、共通祖先の遺伝子から種分化により生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。パラログとは、同種内において、種分化でなく遺伝子重複によって生じた種間で対応する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素の組を指す。ホモログとは、オーソログ、パラログに関係なく配列に同一性を有する遺伝子及びその遺伝子より得られる酵素を指す。
　より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子のホモログ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子、より好ましくは、その遺伝子の塩基の１個若しくは数個が欠失、置換又は付加された遺伝子を含む。
　また、前記ホモログ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を含む。具体的には、公知のデータベースに対するホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）を適用して、又は、同定遺伝子の少なくとも一部から成るプローブ（当該遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ）を用いたストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション若しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの常法に基づいて、遺伝子（又はその遺伝子による形質転換で得られる酵素）として取得することができる。また、当業者であれば、塩基配列を置換等することによって、自ら設計することが可能である。なお、ここで言うストリンジェントな条件としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｄａｖｉｄ　Ｗ．　Ｒｕｓｓｅｌｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）の非特許文献に記載されたハイブリダイズさせる条件が挙げられる。具体的には、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムで、ｐＨ：７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート溶液及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液に、プローブとともに６５℃で８～１６時間恒温保持し、ハイブリダイズさせる条件である。
　（微生物）
　本実施形態の遺伝子及びエノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子を導入することができる形質転換宿主微生物の例としては、遺伝子組み換え技術を適用することができる微生物であれば、特に限定されない。産業上の利用の観点から、具体例としては、大腸菌、酵母、コリネ型細菌、クロストリジウム属細菌が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クリベロマイセス・ラクティス、クリベロマイセス・マルキシアヌス等が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシエンス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、ブレビバクテリウム・インマリオフィルム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・リリウム、コリネバクテリウム・メラセコーラ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等が挙げられる。クロストリジウム属細菌としては、クロストリジウム・クリベリ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・アミノブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカムなどが挙げられる。これらの中でも、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、コリネバクテリウム・グルタミカムを使用することが、形質転換が容易であるため、好ましく、大腸菌を使用することが、より好ましい。
　また、本実施形態における形質転換微生物は、微生物培養菌体そのもの又はその培養物の各種形態で使用されても良い。具体的には、本実施形態における微生物の培養物は、微生物培養菌体の培地・緩衝液等媒体による懸濁物、微生物培養菌体からの無細胞抽出液、さらにこの無細胞抽出液から当該反応を触媒する成分を濃縮・精製・抽出したもの等の処理物を含む。本実施形態における微生物の培養物は更に、前記の微生物の処理物を難溶性の担体に固定化したものを含む。このような固定化担体としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリ－Ｎ－ビニルホルムアミド、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、メチルセルロース、グルコマンナン、アルギン酸塩、カラギーナン等、更にこれらの共重合、架橋化物など、前述の微生物菌体もしくはその処理物を包合した水難溶性の固形分を形成するような化合物が挙げられる。これらは１種類を単独で使用しても良く、２種類以上を混合して使用しても良い。また、活性炭、多孔質セラミックス、グラスファイバー、多孔質ポリマー成形体、ニトロセルロース膜など、予め固形物として形成された物体上に微生物もしくはその抽出液・抽出成分を保持させたものも、微生物の培養物として用いることもできる。
　（変換方法）
　本実施形態の遺伝子は、前述したように、エノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子と組み合わせて形質転換などにより微生物体内で発現させることで、３－ヒドロキシブチリルと４－ヒドロキシブチリルとの間での変換方法に適用することができる。
　図１に、本実施形態に係る３－ヒドロキシブチリルと４－ヒドロキシブチリルとの間での変換方法を説明するための概略図を示す。後述する微生物体内に３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが供給されると、前記の遺伝子の作用により、ヒドロキシル基（ＯＨ基）が転位反応し、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが４－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換される（Ｓ１０５及びＳ１０７）。また、この微生物体内に４－ヒドロキシブチリルＣｏＡが供給されると、前記の遺伝子の作用により、ＯＨ基が転位反応し、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡが３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換される。
　配列番号１で示す遺伝子の、アミノ酸配列への翻訳結果は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッションＮｏ．ＡＪ２５０２６７で参照することができるクロストリジウム　アミノブチリカム由来ａｂｆＤ遺伝子の翻訳結果と相同である。ａｂｆＤ遺伝子がコードする酵素の詳細は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　４－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ　ｂｙ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ：　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＣｏＡ，　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　１７４（３）　１８９－１９９　（２０００）．などの非特許文献に記載されている。配列番号１で示す遺伝子は、翻訳配列及び前記遺伝子が提供する反応から、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒトラターゼ活性を有する酵素をコードすると考えられる。しかしながら、比較例として後述するように、ａｂｆＤ遺伝子配列を含む組換え体を用いた場合では、３－ヒドロキシブチリルと４－ヒドロキシブチリルとの間での変換機能が作用しない。即ち、本実施形態においては、組換え体において、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子と他の遺伝子との共発現によって、３－ヒドロキシブチリルと４－ヒドロキシブチリルとの間での変換機能が発現すると考えられる。なお、本実施形態の配列番号１で示す遺伝子と前述のａｂｆＤ遺伝子とは、コードするアミノ酸配列は相同であるが、遺伝子情報処理ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ；ＧＥＮＥＴＹＸ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製）を用いた塩基配列の相同性は７５％と大きく異なる。塩基配列が大きく異なる遺伝子を適用した本実施形態では、３－ヒドロキシブチリルと４－ヒドロキシブチリルとの間での高い変換効率を有する変換方法を提供することができる。
　（１，４－ブタンジオールの製造方法）
　前述の変換方法で得られる３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ及び／又は４－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、そのアシルＣｏＡ部位を反応点として更に他の反応を組み合わせることで、ブタンジオール類を製造するための前駆体とすることができる。したがって、本実施形態の遺伝子は、効率の良いブタンジオール類（例えば、１，４－ブタンジオール）の製造方法に適用することができる。
　図１には、本実施形態に係る１，４－ブタンジオールの製造方法を説明するための概略図も示した。本実施形態においては、配列番号１で示される遺伝子、エノイルＣｏＡヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子、更にアシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を、微生物体内で発現させる。これらの遺伝子が発現した状態で、この微生物体内に３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが供給されると、先ず、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される（Ｓ１０５及びＳ１０７）。その後、アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子の作用により１，４－ブタンジオールに変換される（Ｓ１０９）。また、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子の作用により、図示しない１，３－ブタンジオールに変換される。
　なお、本実施形態では、下記で説明する酵素又は一連の酵素群を、遺伝子組み換えにより形質転換された微生物体内で共発現させることで、反応を進行させる。各酵素をコードする遺伝子を個別に、或いは、一連のクラスターとして、任意のベクターに挿入して宿主微生物を形質転換する。得られた形質転換体を、適当な炭素源、例えばグルコースを炭素源とする培地により培養することで、各遺伝子を発現させる。宿主で構成発現し得る遺伝子の場合には、培地中で形質転換体を培養することで、遺伝子が発現する。一方、各遺伝子をベクター上に配されたレギュレーターの制御下で構成した場合には、誘導基質を添加し、誘導的環境へ移行することにより、各々のコードする遺伝子が発現する。なお、本実施形態における培養とは、通常の微生物培養の培養条件を全て含み、また、培養するステップとは、微生物がブタンジオール類を製造するための十分な時間及び条件で培養することを意味する。
　本実施形態のブタンジオール類の製造方法の基質となる３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ又は４－ヒドロキシブチリルＣｏＡの製造方法について説明する。先ず、アセチルＣｏＡの供給下で、２分子のアセチルＣｏＡから１分子のＣｏＡが脱離し、アセトアセチルＣｏＡを与える、チオラーゼ（ＥＣ番号２．３．１．９）をコードする遺伝子又はそのホモログを用いた酵素反応（Ｓ１０１）を利用する。なお、アセチルＣｏＡは、解糖系などの既知のルートにより得られる。次に、得られたアセトアセチルＣｏＡを還元して３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを与える活性を有するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号１．１．１．３６）、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．３５）、３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．１．１．１５７）又はこれらのホモログを用いた酵素反応により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。なお、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３６）を使用した場合、（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができ、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．３５）又は３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号：１．１．１．１５７）を使用した場合、（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。
　また、３－ヒドロキシブタン酸に直接ＣｏＡを転移する酵素として、プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素（ＥＣ番号２．８．３．１）が知られている。プロピオン酸ＣｏＡ転移酵素をコードする遺伝子又はそのホモログの発現下、かつ、ＣｏＡ転移反応のドナーとなるアセチルＣｏＡの供給下で、微生物又は該微生物を含む培養物に３－ヒドロキシブタン酸を供給することにより、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成することができる。また、４－ヒドロキシブタン酸にＣｏＡを転移する酵素としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１７８　（３），　８７１－８８０　（１９９６）．などの非特許文献に記載された４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素が知られている。この酵素をコードする遺伝子又はそのホモログの発現下、かつ、ＣｏＡ転移反応のドナーとなるアセチルＣｏＡ供給下で、微生物又は該微生物の培養物に４－ヒドロキシブタン酸を供給することにより、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを得ることができる。
　（その他の酵素及び該酵素をコードする遺伝子）
　次に、上述した各々の酵素と、該酵素をコードする遺伝子の具体例について、説明する。
　　［エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子］
　本実施形態で用いられるエノイルＣｏＡヒドラターゼは、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを脱水してクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。
　（Ｓ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の具体例としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子又はそのホモログが挙げられる。エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１７）をコードする遺伝子の詳細については、Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｏ　ｃｒｏｔｏｎｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ．　Ａ．，　Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ　Ｐ，　Ｄａｒｌｅｙ　ＤＪ，　Ｇｏｌｄｉｎｇ　ＢＴ，　Ｂｕｃｋｅｌ　Ｗ．，　Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　２００８　４７（１７）　３２５４－３２５７　（２００８）．の非特許文献などを参照することができる。また、（Ｒ）－３－ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素をコードする遺伝子としては、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１１９）をコードする遺伝子又はそのホモログなどが挙げられる。エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ番号：４．２．１．１１９）をコードする遺伝子の詳細については、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　ｐｏｌｙ－ｂｅｔａ－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ．　ＩＩ．　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｄ－（－）－ｂｅｔａ　ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｂｙ　ａｎ　ｅｎｏｙｌ　ｈｙｄｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ．，　Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ　ＧＪ，　Ｍｅｒｒｉｃｋ　ＪＭ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，　８　２７４８－２７５５　（１９６９）．の非特許文献などを参照することができる。
　前述した通り、アセトアセチルＣｏＡから３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成する反応を触媒するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、適用する酵素の種類によって、（Ｒ）体及び／又は（Ｓ）体の３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを生成することができる。また、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成する反応を触媒するエノイルＣｏＡヒドラターゼも、同様の光学異性体の選択性を有する。即ち、本実施形態に係るブタンジオール類の製造方法では、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼとエノイルＣｏＡヒドラターゼの光学選択性を適切に組み合わせることができるため、アセトアセチルＣｏＡからクロトニルＣｏＡを生成するまでの反応の収率などの観点から有利である。
　　［アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子］
　本発明で用いられるアシルＣｏＡ還元酵素遺伝子は、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡのＣｏＡ位を還元して１，４－ブタンジオールを生成する反応を触媒する酵素をコードするものであれば任意に選択することができる。具体的には、ＥＣ番号：１．２．１の一群に含まれる、アルデヒド体に作用する酸化還元酵素（例えばアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ番号１．２．１．１０））をコードする遺伝子又はそのホモログを用いることができる。前述の酵素の詳細については、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，　ａｎｄ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ－ｌｉｎｋｅｄ　ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｋｌｕｙｖｅｒｉ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　２０３　　６６３－７５　（１９８０）．等の非特許文献を参照することができる。
　得られるアルデヒド体は、宿主のアルコールデヒドロゲナーゼによりアルコールに導かれるため、１、４－ブタンジオールを得ることができる。本実施形態の変形例として、４－ヒドロキシブタナール還元活性を持つアルコールデヒドロゲナーゼを合わせて共発現させた場合においても、１、４－ブタンジオールを得ることができる。また、本実施形態の他の変形例として、複合機能を有するアルデヒド／アルコール還元酵素をコードする遺伝子又はそのホモログを用いて、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡから１，４－ブタンジオールを得ることも可能である。このような複合機能を有する酵素の詳細については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｄｈＥ２，　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ＮＡＤＨ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ａｌｄｅｈｙｄｅ／Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　Ｂｕｔａｎｏｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｌｃｏｈｏｌｏｇｅｎｉｃ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ　８２４．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，　１８４　（３）　８２１－８３０　（２００２）．などの非特許文献を参照することができる。
（培養条件）
　本発明の反応は、もっとも簡便には、例えば形質転換体をLB培地などの栄養培地で15℃～40℃、望ましくは18℃～37℃の温度で24時間程度培養したのち、通常の炭素源、例えば0.01～50%、望ましくは0.1～30%のグルコースを炭素源とする培地に移殖し、引き続き同様の温度で1時間～200時間程度培養し、その過程で培養液中にブタンジオール類を蓄積させることにより達せられる。また菌の増殖・反応の進行による炭素源の消費に応じて、連続的あるいは間欠的に炭素源を添加してもよく、この場合の炭素源の反応液中濃度は前記の限りではない。
　微生物を培養するための培地炭素源としては、グルコースやシュークロース、フルクトース等の糖類、　グリセロール等のポリオール、エタノールや酢酸、クエン酸、コハク酸、乳酸、安息香酸、脂肪酸などの有機物またはこれらのアルカリ金属塩、n-パラフィンなどの脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、または例えばペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉、ふすま等の天然有機物を、単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常0.01％～30％、望ましくは0.1％～20％程度の濃度で用いることができる。
　微生物を培養するための培地窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素化合物、また尿素、尿酸などの含窒素有機物、ペプトン、肉エキス、魚エキス、大豆粉等の天然有機物を単独、あるいはこれらの組み合わせにより、通常0.01％～20％、望ましくは0.1％～10％程度の濃度で用いることができる。
　さらに必要に応じて、リン酸2水素カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、酢酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、硫酸ニッケルなどの金属塩を菌の生育、酵素活性の改善のために添加することができる。添加濃度は培養条件により異なるが、通常、リン酸塩に関しては0.01％～5％、マグネシウム塩においては10ppm～1％、他の化合物では0.1ppm～1,000ppm程度である。また選択する培地により、ビタミン類、アミノ酸、核酸などの供給源として例えば酵母エキス、カザミノ酸、酵母核酸を1ppm～100ppm程度、菌の生育、酵素活性を改善のために添加することができる。
　培地のpHは、4.5～9、望ましくは5～8に調整することが望ましい。また前記のような培地であらかじめ培養された微生物菌体を、遠心分離、膜ろ過などの方法により培養液から分取し、反応原料を含む水、生理食塩水、または培養のpHと同等のpHに調整されたリン酸、酢酸、ホウ酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどとこれらの塩よりなる緩衝液などに再度懸濁し、反応させることは、反応液中の夾雑物を低減し、後の生成物の分取を簡便にするために有用である。反応中のpHは、充分な濃度の緩衝液を用いる場合においては通常維持されうるが、反応の進行により上記pHを逸脱する場合においては、同様のpHとなるよう水酸化ナトリウム、アンモニアなどを用いて適宜調整することが望ましい。
　反応液中に生成したブタンジオール類の分離回収および精製は、ブタンジオール類の生成量が実質的な量に達した時点で、反応液から菌体を遠心分離により除去してから、あるいはそのままの反応液に、一般の有機化合物の分離回収および精製の手段を用いることで行うことができる。例えば、培養液から菌体その他を除去したろ液より、適当な有機溶媒を用いて抽出する。この抽出物をそのまま留去するほか、更に適当な溶媒で再抽出する、あるいはシリカゲル等のクロマトグラフィーを用いて精製する、もしくは多段蒸留等に供することにより、高純度のブタンジオール類が得られる。
　反応液中にブタンジオール類が蓄積することにより、反応速度が低下する場合、生成物の濃度に応じて反応液中に、水、生理食塩水、反応緩衝液等を追加し連続的に希釈してゆく方法は好適である。また反応速度が低下した時点で菌を分取し、上清を生産物溶液として回収し、分取した菌は再度反応原料を含む溶液あるいは懸濁液に戻すことにより、反応速度を回復することができる。この操作は、遠心分離器や分離膜等を用いて連続的に、あるいは回分的にも実施することができる。
　以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
　（実施例１）
　配列番号３で示される塩基配列（４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素に対応）の、５'末端にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）、３'末端にＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理して、配列３の領域を含むＢａｍＨＩ－ＸｈｏＩ断片を得た。得られた遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＢａｍＨＩ－ＸｈｏＩサイトに常法により挿入して、プラスミドｐＥＴＳＤ３を得た。
　配列番号１で示される塩基配列の、５'末端にＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩサイト相当）、３'末端にＡＡＧＣＴＴ（ＨｉｎｄＩＩＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理し、配列１の領域を含むＮｄｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得た。得られた遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト中、ＮｄｅＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイトに常法により挿入しプラスミドｐＥＴＳＤ１を得た。得られたｐＥＴＳＤ１をテンプレートとして、ｐＥＴＳＤ１のｐＥＴ１７ｂベクター由来Ｔ７プロモーター上流にアニールし、更にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）を５'側に追加したプライマーと、ｐＥＴＳＤ１の配列１の３'末端を相補し、更にＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩサイト相当）を５'側に追加したプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＳａｃＩ処理して、断片１を得た。
　配列番号２で示される塩基配列（エノイルＣｏＡヒドラターゼに対応）の、５'末端にＣＡＴＡＴＧ（ＮｄｅＩサイト相当）、３'末端にＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩサイト相当）を付加した平滑末端断片を常法により全合成し、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドを制限酵素処理し、配列２の領域を含むＮｄｅＩ－ＸｈｏＩ断片を得た。得られた遺伝子断片を、発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト２中、ＮｄｅＩ－ＸｈｏＩサイトに常法により挿入して、プラスミドｐＥＤＳＤ０２を得た。得られたプラスミドｐＥＤＳＤ０２をテンプレートとして、ｐＥＤＳＤ０２のｐＥＴＤｕｅｔベクター由来Ｔ７Ｌａｃプロモーター上流にアニールし、さらに、ＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃＩサイト相当）を５'側に追加したプライマーと、ｐＥＤＳＤ０１の配列１の３'末端を相補し、更にＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩサイト相当）の相補配列を５'側に追加したプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅物をＳａｃＩ処理して断片２を得た。
　断片１及び断片２を常法によりＳａｃＩサイト同士でライゲーションし、配列１及び配列２を含む断片３を得た。次に、断片３と、断片３の外側にｐＥＴＳＤ３のＢａｍＨＩサイトの上・下流側１５ｂｐ（断片３のＢａｍＨＩサイト含む）が各々両端に付加されるよう予め設計されたプライマーとを用いて、ＰＣＲを行った。得られた増幅物と、ｐＥＴＳＤ３のＢａｍＨＩ処理断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）で結合し、配列３、配列１及び配列２を含むプラスミドｐＥＴＳＤ１２３を得た。
　得られたプラスミドｐＥＴＳＤ１２３を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した。
　形質転換体ｐＥＴＳＤ１２３／Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭ、更に０．３％４－ヒドロキシブタン酸ナトリウムを含む５ｍＬの評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。
　評価培地１の組成は、
２％　グルコース、
１％　ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、
０．５％　酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
２．４％　Ｋ２ＨＰＯ４、
０．６％　ＫＨ２ＰＯ４、
６００ｐｐｍ　クエン酸鉄、
１００ｐｐｍ　リボフラビン／蒸留水（ｐＨ　７．２）、
とした。
　なお、評価培地１としては、上述の組成物を全て混和し、常温下で２時間撹拌した後、φ０．４５μｍのフィルターを用いてろ過滅菌したものを供した。
　本実施形態において、４－ヒドロキシブタン酸ナトリウムは、国際公開２０１０／０６８９５３号公報に記載された合成方法に基づいて下記の方法で合成したものを使用した。０．１ＭのＮａＯＨを溶解した５０ｍＬのメタノールを撹拌しながら、０．１Ｍのγ－ブチロラクトンを滴下した。１時間撹拌した後、溶液を６０℃で３時間乾燥することで、無色の結晶を得た。得られた結晶に純水を加えて水溶液にし、得られた水溶液をＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｃ１８Ｐ－４Ｅ（昭和電工製）、カラム温度：４０℃、溶離液：メタノール／１０ｍＭ　リン酸カリウム溶液（ｐＨ３）＝１０／９０、検出：ＵＶ　２１０ｎｍ）に供した。γ－ブチロラクトン由来のピークが完全に消失して、４－ヒドロキシブタン酸ナトリウム由来の単一のピークが得られたことを確認した。
　培養液の上清を、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ－１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供した。培養液中には、３５０ｍｇ／Ｌの３－ヒドロキシブタン酸が検出された。
　本実施形態においては、培養液中に添加した４－ヒドロキシブタン酸骨格を有する化合物が、配列３で示される４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素をコードする遺伝子の作用により４－ヒドロキシブチリルＣｏＡとなる。また、配列１の遺伝子及び配列２の遺伝子の作用により３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される。変換された３－ヒドロキシブチリルＣｏＡは更に、宿主である大腸菌が有するチオエステラーゼの作用により、３－ヒドロキシブタン酸として培養液中に排出されたと考えられる。
　（比較例１）
　実施例１で得られたプラスミドｐＥＴＳＤ３を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換して、形質転換体ｐＥＴＳＤ３／Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を得た。得られた形質転換体を、実施例１と同様の方法により培養した。培養後の培養液を、実施例１と同様のＨＰＬＣに供したが、３－ヒドロキシブタン酸は検出されなかった。
　比較例１の方法では、配列１及び配列２の遺伝子を有さないため、これらの遺伝子の作用がなく、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換されなかったと考えられる。
　（比較例２）
　実施例１で得られたプラスミドｐＥＴＳＤ１２３を、ｐＥＴＳＤ１２３上の配列１のコード領域前後より外向きにアニール・増幅を行うプライマーを用いて、インバースＰＣＲし、ｐＥＴＳＤ１２３から配列１を除去した直鎖平滑末端断片を得た。
　配列番号５で示される、クロストリジウム・アミノブチリカム野生株由来ａｂｆＤ（４－ヒドロキシブチリルＣｏＡデヒドラターゼに対応）遺伝子配列の平滑末端断片を常法により全合成した。得られた平滑末端断片と前述の直鎖平滑末端断片のリン酸化物をライゲーションして形質転換し、ＰＣＲ及び制限酵素処理によるマッピングから、配列１と同方向に配列５が単一置換挿入されたプラスミドｐＥＴＳＤ５２３を得た。
　得られたプラスミドｐＥＴＳＤ５２３を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株（ノバジェン社製）を形質転換した、形質転換体ｐＥＴＳＤ５２３／Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を得た。得られた形質転換体ｐＥＴＳＤ５２３／Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）は、実施例１と同様の方法で培養評価した。培養液中には、３－ヒドロキシブタン酸が検出されなかった。
　本実施形態では、配列５の遺伝子が作用しなかったため、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換が生じなかったと考えられる。
　（実施例２）
　配列番号４で示される塩基配列の平滑末端断片を常法により全合成し、クローニングベクターｐＵＣ１８のマルチクローニングサイト中のＳｍａＩサイトに挿入したプラスミドを得た。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列４の５'末端、３'末端に対応する各１５ｂｐに加え、実施例１で得られたｐＥＴＳＤ１２３のマルチクローニングサイト中のＮｄｅＩサイトＣＡＴＡＴＧの「ＣＡＴ」を含む上流側１５ｂｐ分、「ＡＴＧ」を含む下流側１５ｂｐ分に対応する配列を外側に付加した両端各３０ｂｐのプライマーを調製して増幅反応を行い、配列４を含む平滑末端断片を得た。得られた断片と、ｐＥＴＳＤ１２３を制限酵素サイトＮｄｅＩの中央からのインバースＰＣＲによって得た直鎖断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングによりライゲーションし、配列１乃至４を含むプラスミドｐＥＴＳＤ４１２３を得た。
　得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４１２３を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。
　得られた形質転換体ｐＥＴＳＤ４１２３／Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭ、更に０．３％　４－ヒドロキシブタン酸ナトリウムを含む５ｍＬの前記評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。培養液上清を、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ－１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供した。培養液中には、３２０ｍｇ／Ｌの３－ヒドロキシブタン酸、２４０ｍｇ／Ｌの１，３－ブタンジオール、２２０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールが検出された。
　本実施形態においては、培養液中に添加した４－ヒドロキシブタン酸骨格を有する化合物が、配列３で示される４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素をコードする遺伝子の作用により４－ヒドロキシブチリルＣｏＡとなる。また、配列１の遺伝子及び配列２の遺伝子の作用により３－ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される。変換された３－ヒドロキシブチリルＣｏＡは、配列４のアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子の作用により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ又は４－ヒドロキシブチリルＣｏＡから、各々、１，３－ブタンジオール又は１，４－ブタンジオールが生成し、更に、宿主である大腸菌が有するチオエステラーゼの作用により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブタン酸が生成し、これらが培養液中に排出されたと考えられる。
　（比較例３）
　実施例２で得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４１２３を、制限酵素ＢａｍＨＩで処理した。得られた２つの断片の長鎖側を切り出し、ライゲーションすることで、配列１及び２の遺伝子配列が除去されたプラスミドｐＥＴＳＤ４３を得た。
　得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４３を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。得られた形質転換体を、実施例２と同様の方法により、培養した。培養後の培養液中には、２９０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールが検出され、３－ヒドロキシブタン酸、１，３－ブタンジオールは検出されなかった。
　本実施形態においては、培養液中に添加した４－ヒドロキシブタン酸骨格を有する化合物が、配列３で示される４－ヒドロキシブチリルＣｏＡ；ＣｏＡ転位酵素をコードする遺伝子の作用により４－ヒドロキシブチリルＣｏＡとなる。しかしながら、配列１及び配列２の塩基配列を有する遺伝子の作用がないため、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換されない。そのため、培養後の培養液中には、３－ヒドロキシブタン酸、１，３－ブタンジオールが検出されなかったと考えられる。
　（実施例３）
　実施例１及び実施例２と同様の方法により、ベクターｐＥＴ１７ｂのマルチクローニングサイトに個別に上流にＴ７プロモーターを配置し、配列４、配列１及び配列２をこの順序で挿入して、プラスミドｐＥＴＳＤ４１２を得た。
　また同様に、ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト１に配列番号６で示される塩基配列を、マルチクローニングサイト２に配列番号７で示される塩基配列を挿入したプラスミドｐＣＤＳＤ６－７を得た。
　得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４１２及びｐＣＤＳＤ６－７を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。
　得られた形質転換体ｐＥＴＳＤ４１２＋ｐＣＤＳＤ６－７／Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含む５ｍＬの前記評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。培養液上清を、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ－１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供した。培養液中には、４１０ｍｇ／Ｌの３－ヒドロキシブタン酸、２２０ｍｇ／Ｌの１，３－ブタンジオール、４０ｍｇ／Ｌの１，４－ブタンジオールが検出された。
　本実施形態では、配列６及び配列７を有する遺伝子の作用により、解糖系から供給されるアセチルＣｏＡを基質として３－ヒドロキシブチリルＣｏＡが生成する。また、配列１の遺伝子及び配列２の遺伝子の作用により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡの一部が４－ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換される。配列４のアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子の作用により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡ又は４－ヒドロキシブチリルＣｏＡから、各々、１，３－ブタンジオール又は１，４－ブタンジオールが生成し、更に、宿主である大腸菌が有するチオエステラーゼの作用により、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブタン酸が生成し、これらが培養液中に排出されたと考えられる。
　（比較例４）
　実施例１乃至実施例３と同様の方法により、ベクターｐＥＴ１７ｂのマルチクローニングサイトに、個別に上流にＴ７プロモーターを配置した配列４、配列５及び配列２をこの順序で挿入したプラスミドｐＥＴＳＤ４５２を得た。
　また同様に、ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ（ノバジェン社製）のマルチクローニングサイト１に配列番号６で示される塩基配列を、マルチクローニングサイト２に配列番号７で示される塩基配列を挿入したプラスミドｐＣＤＳＤ６－７を得た。
　得られたプラスミドｐＥＴＳＤ４５２及びｐＣＤＳＤ６－７を用いて、常法により大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）株を形質転換した。
　形質転換体ｐＥＴＳＤ４５２＋ｐＣＤＳＤ６－７／Ｒｏｓｅｔｔａ　Ｂｌｕｅ（ＤＥ３）を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地５ｍＬで３７℃、好気下で１２時間培養した。培養液０．１ｍＬを、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３２ｍｇ／Ｌ、ＩＰＴＧ０．２ｍＭを含む５ｍＬの前記評価培地１に移植し、３０℃、好気下で４８時間培養した。培養液上清を、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＨ－１０１１（昭和電工製）、カラム温度：６０℃、溶離液：２５ｍＭ硫酸水溶液、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折検出器）に供試した。培養液中には、５３０ｍｇ／Ｌの３－ヒドロキシブタン酸、２７０ｍｇ／Ｌの１，３－ブタンジオールが検出された。
　本実施形態では、配列５の遺伝子が作用しなかったため、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡから３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへの変換が生じず、結果として１，４‐ブタンジオールが生成しなかったと考えられる。
　本出願は、２０１２年９月２４日に日本国特許庁に出願された特願２０１２－２０９９８２号に基づく優先権を主張するものであり、特願２０１２－２０９９８２号の全内容を本出願に援用する。

Claims (8)

  1. 　下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載の遺伝子であって、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子との組み合わせにより、微生物又は該微生物の培養物に、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する能力を付与できる、遺伝子。
    　（ａ）配列番号１の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｂ）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有する遺伝子であって、配列番号１の塩基配列に対して９０％以上の同一性の塩基配列を有する遺伝子
    　（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子
  2. 　前記微生物が、大腸菌、酵母、コリネバクテリウム又はクロストリジウムである請求項１に記載の遺伝子。
  3. 　請求項１に記載の遺伝子と、エノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子と、を含む微生物。
  4. 　アシルＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を更に含む請求項３に記載の微生物。
  5. 　請求項３に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを４－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと、或いは、４－ヒドロキシブチリルＣｏＡを３－ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換する、変換方法。
  6. 　請求項４に記載の微生物又は該微生物の培養物を用いて、１，４－ブタンジオールを製造する、製造方法。
  7. 　前記微生物が、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素又はアセトアセチルＣｏＡ還元酵素の少なくとも一方をコードする遺伝子を含む、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　アセチルＣｏＡから３－ヒドロキシブチリルＣｏＡを経由して１，４－ブタンジオールを製造する、請求項６に記載の製造方法。
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