JP5737650B2 - アセトイン産生細胞および当該細胞を用いたアセトインの製造方法 - Google Patents
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1.アセトイン脱水素酵素の機能が欠損または低減しており、ピルビン酸からアセト乳酸、及び、アセト乳酸からアセトインの合成を司る酵素群が構成的に発現している、アセトイン産生細胞。
2.前記酵素群をコードする遺伝子が単一のオペロンを形成している、前項1に記載のアセトイン産生細胞。
3.アセトイン脱水素酵素の機能の欠損または低減が、アセトイン脱水素酵素をコードする遺伝子を人為的に破壊したことによるものであり、且つ、前記酵素群の構成的発現が、前記オペロンの発現制御系を改変するような変異を導入したことによるものである、前項2に記載のアセトイン産生細胞。
4.アセトイン脱水素酵素、リン酸アセチル基転移酵素、および乳酸脱水素酵素の3種のタンパク質の機能が欠損または低減している、アセトイン産生細胞。
5.アセトイン脱水素酵素、リン酸アセチル基転移酵素、および乳酸脱水素酵素の3種のタンパク質の機能の欠損または低減が、アセトイン脱水素酵素をコードする遺伝子、リン酸アセチル基転移酵素をコードする遺伝子、および乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の3種の遺伝子を人為的に破壊したことによるものである、前項4に記載のアセトイン産生細胞。
6.さらに、リン酸アセチル基転移酵素および乳酸脱水素酵素のうち、少なくとも1種のタンパク質の機能が欠損または低減している、前項1〜3のいずれか1に記載のアセトイン産生細胞。
7.リン酸アセチル基転移酵素および乳酸脱水素酵素のうち、少なくとも1種のタンパク質の機能の欠損または低減が、リン酸アセチル基転移酵素をコードする遺伝子、および乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子のうち、少なくとも1種の遺伝子を人為的に破壊したことによるものである、前項6に記載のアセトイン産生細胞。
8.細胞がバチルス属に属する菌である前項1〜7のいずれか1に記載の細胞。
9.細胞が、受託番号FERM P-22036(受領日:2010年10月28日)の枯草菌変異株である、前項8に記載の細胞。
10.前項1〜9のいずれか1に記載の細胞を、グルコースの存在下で培養する工程を含む、アセトイン製造方法。
11.前項1〜3、6〜9のいずれか1に記載の細胞を、1〜10w/v%グルコースの存在下で培養する工程を含む、アセトイン製造方法。
12.前項4、5,8のいずれか1に記載の細胞を、0.2〜2w/v%グルコースの存在下で培養する工程を含む、アセトイン製造方法。
13.前記の培養する工程で得られた培養ろ液からアセトインを単離する工程をさらに含む、前項10〜12のいずれか1に記載のアセトイン製造方法。
本発明のアセトイン産生細胞は、アセトイン脱水素酵素の機能が欠損または低減しており、ピルビン酸からアセト乳酸、及び、アセト乳酸からアセトインの合成を司る酵素群が構成的に発現していることを特徴とする。
本発明のアセトイン産生細胞は、目的の酵素をコードする遺伝子を破壊する方法および、目的の制御因子をコードする遺伝子を導入する方法を用いて作製することができる。
本発明はさらに、本発明のアセトイン産生細胞を用いたアセトインの製造方法を包含する。アセトインの製造方法は、本発明のアセトイン産生細胞を、グルコース等の炭素源を含有する培地で培養する工程を含む。さらに、本願のアセトインの製造方法は、好ましくは前記培養する工程で得られた培養ろ液から細胞を除去する工程と、細胞を除去した培養ろ液からアセトインを単離する工程とを含む。
(1)変異株1(ΔlctEΔpta)として、遺伝子型がlctE::spec pta::neoである株を、以下のように段階的に作製した。
始めにlctE遺伝子破壊株を作製した。枯草菌168株の染色体を鋳型として、DNAプライマーlctE-F1(5'-ttggagccaggtaaatgctt-3'(配列番号5))とlctE-R1(5'-acaaaacccgctccgatta-3'(配列番号6))のペア、ならびにlctE-F2(5'-tcgcaggtatcactgagctg-3'(配列番号7))とlctE-R2(5'-gcaatgctggaccgaataat-3'(配列番号8))のペアによるPCR増幅によって、それぞれ約500 bpのDNA断片2種を得た。前者はlctE遺伝子上流側の隣接領域、また後者はlctE遺伝子下流側の隣接領域に相当する。一方、FU341株(Yoshida, K., Fujita, Y., & Ehrlich, S. D. (1999)., J. Bacteriol. 181, 6081-6091)の染色体を鋳型として、プライマーlctE-spec-F(5'-taatcggagcgggttttgtcaataacgctattgggag-3'(配列番号9))とlctE-spec-R(5'-cagctcagtgatacctgcgactatatgctccttctggc-3'(配列番号10))のペアによるPCR増幅によって、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を得た。以上3種のDNA断片を混合したものを鋳型とし、プライマーlctE-F1とlctE-R2のペアを用いてPCR増幅を行うと、lctE-spec-FとlctE-spec-Rには、それぞれlctE-R1とlctE -F2に相補的となる配列が5'側に付加されており、3つの断片が連結した長いDNA断片が得られる。このDNA断片を用いて枯草菌168株を形質転換して、50μg/mlスペクチノマイシンに耐性を示す変異体を選別しlctE遺伝子破壊株とした。
変異株1を、5 mlのLB液体培地(1.0w/v% Bacto Tryptone、1.0w/v% Bacto Yeast Extract、1.0w/v% NaCl)にて、37℃、180 rpmで一晩振盪培養し、前培養とした。本培養は以下のようにして行った。前培養後の培地を、200 ml三角フラスコ内の50 mlの本培養培地(Soytone培地;1.0w/v% Bacto Soytone、0.5w/v% Bacto Yeast Extract、1.0w/v% NaCl、0.4w/v% グルコースを含む)に細胞濁度OD600 = 0.050となるように希釈して混合した。その後、37℃、150 rpmで振盪培養した。三角フラスコはシリコ栓でふたをして内外の空気の交換が最小限になるようにした。
(1)変異株2(ΔacoA)として、遺伝子型がacoA::catである株を、以下のようにして作製した。
枯草菌168株の染色体を鋳型として、DNAプライマーacoA-F1(5'-gctgaaaaagcgcctatgag-3'(配列番号17))とacoA-R1(5'-ttgtgcgcctccttctattt-3'(配列番号18))のペア、ならびにacoA-F2(5'-gaaaaagccgtctcgttcag-3'(配列番号19))とacoA-R2(5'-cgccgaacatataacggaat-3'(配列番号20)) のペアによるPCR増幅によって、それぞれ約500 bpのDNA断片2種を得た。前者はacoA遺伝子上流側の隣接領域、後者はacoA遺伝子下流側の隣接下流側の隣接領域に相当する。一方、FU342株(Yoshida, K., Fujita, Y., & Ehrlich, S. D.(1999)., J. Bacteriol. 181,6081-6091.)の染色体を鋳型として、プライマーacoA-cat-F(5'-aaatagaaggaggcgcacaagattggagctgatgtcac-3'(配列番号21))とacoA-cat-R(5'-ctgaacgagacggctttttcgaacctacctctcctcaa-3'(配列番号22)) のペアによるPCR増幅によって、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を得た。以上3種のDNA断片を混合したものを鋳型とし、プライマーacoA-F1とacoA-R2を用いてPCR増幅を行うと、acoA-cat-FとacoA-cat-Rには、それぞれacoA-R1とacoA-F2に相補的となる配列が5'側に付加されており、3つの断片が連結した長いDNA断片が得られる。このDNA断片を用いて枯草菌168株を形質転換して10μg/mlクロラムフェニコールに耐性を示す変異体を選別し、その一つを変異株2とした。
アセトイン産生細胞1(ΔacoAΔlctEΔpta)として、遺伝子型がacoA::cat lctE::spec pta::neoである株を作製した。アセトイン産生細胞1は、参考例2にて作製した変異株2(acoA::cat)の染色体DNAを用いて、参考例1にて作製した変異株1(lctE::spec pta::neo)の形質転換を行い、10μg/mlクロラムフェニコール、50μg/mlスペクチノマイシン、15μg/mlネオマイシンのすべてに対して耐性を獲得した変異株を選択することにより、作製した。
実施例1にて得られたアセトイン産生細胞1を培養して、アセトインを産生させた。
まず、参考例1(2)と同様の手法により、前培養および、0.4w/v%グルコースを含む培地を用いて本培養を行った。また、参考例1(2)と同様の手法により前培養を行った後、本培養を高濃度グルコース添加Soytone培地(Soytone培地に3.6w/v% グルコースを添加したもの)を4w/v%グルコースを含む培地として用いた以外は、参考例1(2)と同様の手法により培養を行った。
4w/v%グルコースを含む培地の場合、野生型では徐々にアセトイン量が増加していくが、アセトイン産生細胞1により産生されたアセトイン量は、培養後24時間でほぼ最大に達し、その後96時間後まで変化が見られなかった。
(1)変異株3(ΔalsR1)として、遺伝子型がamyE::cat, Pspac-alsR1である株を、枯草菌染色体のamyE領域に、大腸菌プラスミドpCRE-test-alsR1より得られたDNA鎖を相同組み換えにより導入することで作製した。具体的には以下のようにして作製した。
まず、pCRE-test-alsR1の作製では、168株の染色体を鋳型として、プライマーalsR1-F1(5'-cgcggatccatggagcttcgccatcttcaa-3'(配列番号23))とalsR1-R1(5'-catgtatagagcaggccatgc-3'(配列番号24))のペア、ならびにalsR1-F2(5'-gcatggcctgctctatacatg-3'(配列番号25))とalsR1-R2(5'-cgcggatcctgtacctgcatcactctcttt-3'(配列番号26))のペアを用いてPCR増幅を行い、alsRのORF内の5'側断片(約600 bp)と3'側断片(約300 bp)をそれぞれ増幅した(プライマーの塩基配列中の下線部は、制限酵素認識配列を示す)。それぞれのPCR断片を混合したものを鋳型とし、プライマーalsR1-F1とalsR1-R2のペアを用いてPCR増幅を行うと、alsR1-R1とalsR1-F2は互いに相補的であり、かつalsRのORFの592残基目から612残基目にかけての相補的な配列を持ち、さらに601残基目のアデニンがグアニンとなる点変異を持つようにデザインされているためalsRアレル(alsR1)が増幅される。このPCR産物をBamHIで制限酵素処理したものをインサートDNAとしてベクタープラスミドpCRE-test(Miwa, Y., Nakata, A., Ogiwara, A., Yamamoto, M. & Fujita, Y. (2000)., Nucleic. acids. Res. 28, 1206-1210.)のBamHIクローニングサイトに挿入した。alsR1のORFの601残基目の点変異を塩基配列の決定により確認し、pCRE-test-alsR1とした。
このpCRE-test-alsR1をPstIにより制限酵素処理することで得られたDNA鎖を用いて枯草菌168株を形質転換し、10μg/mlクロラムフェニコール耐性株の一つを変異株3とした。
(1)アセトイン産生細胞2(alsR1ΔacoA)として、遺伝子型がamyE::tet,Pspac-alsR1 acoA::catである株を以下のように作製した。
pCm::Tc(Steinmetz, M. & Richter, R. (1994). Gene.142, 79-83)DNAを用いて、参考例3にて得られた変異株3(amyE::cat, Pspac-alsR1)を形質転換し、12.5μg/mlテトラサイクリン耐性かつ10μg/mlクロラムフェニコール感受性となった変異株(染色体上のクロラムフェニコール耐性遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子に置き換えられている)を得た。得られたテトラサイクリン耐性株を、参考例2にて得た変異株2(acoA::cat)の染色体DNAを用いて形質転換し、12.5μg/mlテトラサイクリンと10μg/mlクロラムフェニコールの両方に耐性となった株のうち一つをアセトイン産生変異細胞2(名称 Bacillus subtilis MY05株)とした。
参考例3(2)と同様にして、アセトイン産生細胞2を4w/v%グルコースを含む培地により培養し、アセトインを産生させた。培地中のアセトイン濃度測定の測定は参考例3(2)と同様にして行った。
アセトイン産生細胞3(alsR1ΔacoAΔlacE)として、遺伝子型がamyE::tet,Pspac-alsR1 acoA::cat lctE::specである株を、次のようにして作製した。参考例1にて作製したlctE遺伝子破壊株より抽出した染色体を用いて、アセトイン産生変異細胞2を形質転換し、12.5μg/mlテトラサイクリン、10μg/mlクロラムフェニコール、50μg/mlスペクチノマイシンのいずれに対しても耐性となった株のうち一つをアセトイン産生変異細胞3とした。
アセトイン産生細胞4(alsR1ΔacoAΔpta)として、遺伝子型がamyE::tet,Pspac-alsR1 acoA::cat pta::neoである株を、次のようにして作製した。参考例1にて作製したpta遺伝子破壊株より抽出した染色体を用いて、アセトイン産生変異細胞2を形質転換し、12.5μg/mlテトラサイクリン、10μg/mlクロラムフェニコール、10μg/mlネオマイシンのいずれに対しても耐性となった株のうち一つをアセトイン産生変異細胞4とした。
Claims (12)
- アセトイン脱水素酵素の機能が欠損または低減しており、ピルビン酸からアセト乳酸、及び、アセト乳酸からアセトインの合成を司る酵素群が構成的に発現している細胞であって、細胞がバチルス属に属する菌である、アセトイン産生細胞。
- 前記酵素群をコードする遺伝子が単一のオペロンを形成している、請求項1に記載のアセトイン産生細胞。
- アセトイン脱水素酵素の機能の欠損または低減が、アセトイン脱水素酵素をコードする遺伝子を人為的に破壊したことによるものであり、且つ、前記酵素群の構成的発現が、前記オペロンの発現制御系を改変するような変異を導入したことによるものである、請求項2に記載のアセトイン産生細胞。
- アセトイン脱水素酵素、リン酸アセチル基転移酵素、および乳酸脱水素酵素の3種のタンパク質の機能が欠損または低減している細胞であって、細胞がバチルス属に属する菌である、アセトイン産生細胞。
- アセトイン脱水素酵素、リン酸アセチル基転移酵素、および乳酸脱水素酵素の3種のタンパク質の機能の欠損または低減が、アセトイン脱水素酵素をコードする遺伝子、リン酸アセチル基転移酵素をコードする遺伝子、および乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の3種の遺伝子を人為的に破壊したことによるものである、請求項4に記載のアセトイン産生細胞。
- さらに、リン酸アセチル基転移酵素および乳酸脱水素酵素のうち、少なくとも1種のタンパク質の機能が欠損または低減している、請求項1〜3のいずれか1に記載のアセトイン産生細胞。
- リン酸アセチル基転移酵素および乳酸脱水素酵素のうち、少なくとも1種のタンパク質の機能の欠損または低減が、リン酸アセチル基転移酵素をコードする遺伝子、および乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子のうち、少なくとも1種の遺伝子を人為的に破壊したことによるものである、請求項6に記載のアセトイン産生細胞。
- 細胞が、受託番号FERM P-22036(受領日:2010年10月28日)の枯草菌変異株である、請求項1〜3のいずれか1に記載のアセトイン産生細胞。
- 請求項1〜8のいずれか1に記載の細胞を、グルコースの存在下で培養する工程を含む、アセトイン製造方法。
- 請求項1〜3,6〜8のいずれか1に記載の細胞を、1〜10w/v%グルコースの存在下で培養する工程を含む、アセトイン製造方法。
- 請求項4または5に記載の細胞を、0.2〜2w/v%グルコースの存在下で培養する工程を含む、アセトイン製造方法。
- 前記の培養する工程で得られた培養ろ液からアセトインを単離する工程をさらに含む、請求項9〜11のいずれか1に記載のアセトイン製造方法。
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