JP6758703B2 - エルゴチオネインの産生方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1.エルゴチオナーゼをコードする遺伝子の発現が抑制されることにより、エルゴチオナーゼ活性が欠損又は低減している、Methylobacterium属細菌。
2.エルゴチオナーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)及び(b)から選択されるいずれかのDNAからなる、前項1に記載のMethylobacterium属細菌:
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるエルゴチオナーゼをコードするDNA;
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列に対し30%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
3.さらに、エルゴチオネイン合成遺伝子が導入されている、前項1又は2に記載のMethylobacterium属細菌。
4.エルゴチオネイン合成遺伝子がegtBD遺伝子である、前項3に記載のMethylobacterium属細菌。
5.Methylobacterium属細菌が、受託番号NITE P-02274として寄託されたものである、前項1〜4のいずれかに記載のMethylobacterium属細菌。
6.前項1〜5のいずれかに記載のMethylobacterium属細菌を、炭素源を含有する培地を用いて培養する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
7.アミノ酸源として酵母エキスを含有し、かつ、炭素源を含有する培地を用いて、エルゴチオネイン産生細胞を培養する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
8.酵母エキスが、0.01〜5%で培地中に含有される、前項7に記載のエルゴチオネインの製造方法。
9.さらに、カザミノ酸、トリプトン、麦芽エキス、及びペプトンからなる群から選択される少なくとも1以上を含有する培地を用いる、前項7又は8に記載のエルゴチオネインの製造方法。
10.カザミノ酸が0.1〜5%で培地中に含有され、及び/又は、トリプトンが0.1〜5%で培地中に含有される、前項9に記載のエルゴチオネインの製造方法。
11.炭素源が、メタノール及び/又はグリセリンを含む、前項7〜10のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
12.エルゴチオネイン産生細胞が、Methylobacterium属細菌、カビ、及び/又は担子菌酵母から選択される少なくとも1種の細胞を含む、前項7〜11のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
13.Aureobasidium属の微生物を、炭素源を含む培地を用いて培養する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
14.Aureobasidium属の微生物が、受託番号NITE P-02275として寄託されたものである、前項13に記載のエルゴチオネインの製造方法。
15.受託番号NITE P-02275として寄託されたものである、Aureobasidium属の微生物。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるエルゴチオナーゼをコードするDNA。
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列に対し30%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
MTLTFHPGHVSLQDLERVYRDGVAARLDAGCDAAIERGAARIAAIAEGETPIYGINTGFGKLASIRIAPGDLATLQRNLILSHCCGLGELLEPDVVRLVMALKLISLGRGASGVRLAIVRLIEAMLARGVVPAIPGQGSVGASGDLAPLAHLAAVMIGEGEAFVGGERMPGGEALRRAGLEPVVLAAKEGLALINGTQVSTALALAGLFRAFRALRAALVTGALSTDAAMGSSAPFHPEIHALRGHRGQIEAGAALRALLDGSAIRESHVEGDERVQDPYCIRCQPQVVGACLDLLRQAGRTLEIEANAVTDNPLVLSDGEVVSGGNFHAEPVAFAADQIALAVCEIGSIAQRRIALLVDPALSFGLPAFLARKPGLNSGLMIAEVTSAALMSENKQRSHPASVDSTPTSANQEDHVSMACHGARRLLAMTENLFGILGIEALAGAQGVELRGPLRTSPELERALAAIRAAIRPLDEDRYLADDLRIAAGLVAQGAIDASPSPGILPGLEAA
(c)配列番号2に示される塩基配列からなるDNA。
(d)配列番号2に示される塩基配列に対し、30%以上、好ましくは40%以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA。当該DNAは、エルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
ATGACCCTGACCTTCCATCCGGGACACGTGTCGCTCCAGGACCTCGAGCGCGTCTATCGCGACGGCGTGGCGGCGCGGCTGGATGCGGGCTGCGATGCCGCCATCGAGCGGGGCGCGGCCCGGATCGCGGCGATCGCCGAGGGCGAGACGCCGATCTACGGGATCAATACCGGCTTCGGGAAACTGGCCTCGATCCGGATCGCGCCCGGCGACCTCGCCACCCTCCAGCGCAACCTGATCCTGTCGCATTGCTGCGGCCTCGGCGAGCTCCTGGAGCCGGACGTGGTGCGCCTCGTGATGGCGCTGAAGCTGATCTCGCTCGGCCGCGGCGCGTCGGGGGTGCGGCTGGCGATCGTGCGCCTCATCGAGGCGATGCTCGCCCGCGGCGTCGTCCCGGCCATCCCGGGCCAGGGCTCGGTCGGCGCCAGCGGCGACCTCGCGCCGCTCGCCCACCTGGCCGCCGTGATGATCGGCGAGGGCGAGGCCTTCGTCGGGGGTGAGCGGATGCCGGGCGGCGAGGCGCTGCGGCGCGCCGGGCTCGAGCCGGTGGTGCTGGCCGCCAAGGAAGGGCTCGCGCTCATCAACGGCACGCAGGTCTCGACCGCGTTGGCGCTGGCCGGGTTGTTCCGCGCCTTCCGGGCGCTGCGGGCCGCCCTCGTCACCGGTGCGCTGTCGACCGACGCGGCGATGGGCTCCTCCGCCCCGTTCCACCCCGAGATTCATGCGCTGCGGGGCCATCGCGGGCAGATCGAGGCCGGGGCGGCCCTGCGCGCGCTCCTTGACGGTTCGGCGATCCGCGAGAGCCACGTCGAGGGCGACGAGCGGGTCCAGGATCCCTACTGCATCCGGTGCCAGCCCCAGGTCGTGGGCGCCTGCCTCGACCTCCTGCGCCAGGCCGGCCGCACCCTCGAGATCGAGGCCAATGCCGTCACCGACAACCCCCTGGTCCTGTCCGACGGCGAGGTCGTGTCGGGCGGGAACTTCCATGCCGAGCCGGTCGCCTTCGCGGCCGACCAGATCGCGCTCGCGGTCTGCGAGATCGGCTCGATCGCGCAGCGCCGGATCGCCCTCCTGGTCGACCCGGCCCTGTCCTTCGGCCTGCCGGCGTTCCTGGCGCGCAAGCCCGGCCTGAATTCCGGGCTGATGATCGCCGAGGTGACCTCGGCGGCGCTGATGAGCGAGAACAAGCAGCGGTCTCACCCGGCCTCGGTCGATTCGACGCCCACCTCCGCCAACCAGGAGGACCACGTCTCGATGGCCTGCCACGGCGCCCGCCGCCTGCTGGCGATGACCGAGAACCTGTTCGGCATCCTGGGCATCGAGGCCCTGGCGGGCGCCCAGGGCGTCGAGCTGCGCGGCCCGCTGCGGACGAGCCCGGAGCTGGAGCGGGCGCTCGCGGCGATCCGCGCCGCGATCCGTCCGCTCGACGAGGACCGCTACCTCGCGGACGACCTGCGGATCGCCGCCGGCCTGGTGGCGCAGGGCGCGATCGACGCCAGCCCGTCGCCCGGCATCCTGCCGGGTCTGGAGGCGGCATGA
(e)配列番号3に示されるアミノ酸配列からなるスルホキシドシンターゼをコードするDNA。
(f)配列番号3に示されるアミノ酸配列に対し、40%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、スルホキシドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(g)配列番号4に示される塩基配列からなるDNA。
(h)配列番号4に示される塩基配列に対し、40%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA。当該DNAは、スルホキシドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
MAATATAQAREEVPVARPAFPPPPATARPIDRDAWIAAFRHVRDETERRAAPLSPEDQQVQSMADASPTKWHRAHTTWFFEQFLLQPMVTGYTAFDERFFFLFNSYYVQAGPRAPRISRGLVTRPTCDEVAAYRAHIDRAVAALIAEAPADKLAEIVATLEIGLHHEQQHQELMLTDILHAFAQNPLLPAYDESWRWPALSQRPGTVALDGGVTQMGHAGEGFHFDNEEPRHDVLLRPVGLSRALVTNGEWLEFMQDGGYAKAELWLSDGFVAAQSEGWEAPGYWRQRDGVWSSMTLAGLKPVDPALPVTHVSYYEADAFARWAGRDLPTEAEWEAASGSLDAAFGHVWQWTRSAYSAYPGYRPLPGALGEYNGKFMVSQFVLRGDSVATPEGHSRPTYRNFFYPHQRWQFTGLRLSHYGA
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(i)配列番号5に示されるアミノ酸配列からなるヒスチジンメチルトランスフェラーゼをコードするDNA。
(j)配列番号5に示されるアミノ酸配列に対し、40%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ヒスチジンメチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(k)配列番号6に示される塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号6に示される塩基配列に対し、40%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA。当該DNAは、ヒスチジンメチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである。
VNAPLPHLAPSASLDDTADKGFLRDVLAGLGAPHKHLSAKYFYDRRGSELFEAITRLPEYYPTRTELAILDRYGPEIAAGLPPGAALVEFGSGSTTKVRRLLPHLGDLSAYVPVDVSEEFLRSEAEELCRDFPRLRVEPVAADFTKPFPLPDDLAEAPKAGFFPGSTIGNFEPDAAAGLLGSFARTLGAGATLIVGIDLVKEKAVLDAAYDDEAQVTAAFNLNLLTRINRELGADFDLDAFAHHAFFDENLGRIEMHLVSRRSQLVTVAGVPFHFASGETIHTENSYKYTVPGFRALARRAGWEHTRVWTDEDGLFSVHALTASTIRRH
GTGAACGCCCCGCTTCCCCACCTCGCGCCGAGCGCCTCCCTCGACGACACCGCCGACAAGGGCTTCCTACGGGACGTGCTCGCGGGCCTCGGCGCCCCGCACAAGCACCTCTCGGCGAAGTACTTCTACGACCGGCGCGGCTCGGAGCTGTTCGAGGCGATCACCCGCCTGCCGGAATACTACCCGACCCGCACCGAGCTCGCGATCCTCGACCGGTACGGTCCCGAGATCGCCGCCGGCCTTCCGCCCGGCGCGGCGCTGGTCGAGTTCGGCAGCGGCTCCACCACCAAGGTGCGCCGGCTGCTGCCCCATCTCGGCGACCTCTCGGCCTACGTGCCGGTTGACGTCTCGGAGGAGTTCCTGCGCAGCGAGGCGGAGGAGCTCTGCCGCGACTTCCCGCGCCTGCGCGTCGAGCCGGTGGCGGCGGACTTCACCAAGCCGTTCCCCCTGCCCGACGACCTCGCCGAGGCGCCGAAGGCCGGCTTCTTCCCGGGCTCGACGATTGGCAACTTCGAGCCCGACGCGGCGGCGGGCCTGCTCGGCAGCTTCGCCCGGACGCTCGGGGCCGGCGCGACGCTCATCGTCGGCATCGACCTCGTCAAGGAGAAGGCGGTGCTGGACGCCGCCTACGACGACGAAGCCCAGGTCACGGCGGCCTTCAACCTCAACCTCCTCACCCGCATCAACCGCGAGCTCGGGGCGGATTTCGATCTCGACGCCTTCGCGCACCACGCCTTCTTCGACGAGAACCTGGGGCGGATCGAGATGCACCTGGTGAGCCGGCGCAGCCAGCTCGTCACGGTGGCGGGGGTGCCGTTCCACTTCGCCTCCGGCGAGACGATCCACACCGAGAACAGCTACAAGTACACGGTGCCGGGCTTCCGGGCGCTCGCCCGCCGGGCCGGCTGGGAGCACACCCGGGTCTGGACCGACGAGGACGGCCTGTTCTCGGTCCACGCGCTGACCGCCTCCACCATCCGGCGGCACTGA
Methylobacterium属細菌として、M. aquaticum strain MA-22A(国際受託番号FERM BP-11078)(以下「野生型22A株」と称する。)を用いて、エルゴチオナーゼ遺伝子のクローニングを行った。Burkholderia sp. HME13(Appl MIcrobiol Biotechnol 97, 5389-, 2013)にてクローニングされたエルゴチオナーゼ遺伝子のアミノ酸配列(GenBank Accession No. AB699692)を元に、野生型22A株ゲノムに対してBLASTによりMaq22A_c03965を見いだした(相同性28%、類似性45%)。本遺伝子をegnと名付け、egn遺伝子の上下流を以下のDNAプライマーでそれぞれ増幅した。
126c04_up_fw2:TATGACATGATTACG ATAGGCCTCCTTGTCGTCCT(配列番号7)
126c04_up_rv:CATGGCGAGGTCCTCGTTCGC(配列番号8)
126c04_down_fw:GCGAACGAGGACCTCGCCATGCCGGGTCTGGAGGCGGCATGA(配列番号9)
126c04_down_rv2:TACCGAGCTCGAATT GCGCGAGCTCCATCTGGATC(配列番号10)
126c04_up_fw2及び126c04_up_rvプライマーは、egn遺伝子の上流約1200 bpを増幅し、126c04_down_fw及び126c04_down_rv2プライマーは、下流約700 bpを増幅する。アンダーラインで示す塩基配列は互いに相補的な配列である。
増幅した断片をIn-fusion HD cloningキット(クロンテック社)で連結し、pk18mobSacBベクターのEcoRIサイトに連結してベクターを作製した。当該ベクターを、野生型22A株に大腸菌S17-1株を用いて接合により導入した。定法により、カナマイシン耐性株を選択し、次に10% sucrose選択下で、野生型22A株のegn遺伝子が欠失した欠失株「△egn株」を作製した。
実施例1にて得られた△egn株、△egn(EGT)株、22A(EGT)株、野生型22A株において、EGT生産性を評価した。培地としては、通常微生物の培養に用いられる、Nutrient broth(NB培地)を用いた。またNB培地に2%のメタノール、グリセリンをそれぞれ加えた培地での培養も行い、EGTの定量を行った。EGTのコピー数を増やした株(△egn(EGT)株、及び22A(EGT)株)は、導入遺伝子の抜け落ちを防ぐために、カナマイシン(25 mg/L)を加えて培養した。各菌株ともに、28℃で7日間培養した。
(1)ミネラル培地の炭素源を2%グリセリンとし、アミノ酸源として個別のアミノ酸ではなく、複合培地の酵母エキス(YE)を用いて、EGT産生能に対する影響を確認した。5 mlの培養液で7日間培養して、これまで通り菌体からEGTを熱で抽出し、HPLCでEGTを定量した。ミネラル培地は、ミネラル塩溶液(200 mL)、緩衝液(300 mL)、鉄溶液(0.33 mL)、TE溶液(1 mL)、ビタミン溶液(10 mL)と、炭素源及び水からなり、各溶液を各々殺菌した後混合して調製した。各溶液の組成は、以下の通りである。
・ミネラル塩溶液:1 L当たりNH4Cl 8.09 g及びMgSO4・7H2O 1.0 g
・緩衝液:1 L当たりK2HPO4 8.0 g及びNaH2PO4・H2O 3.6 g
・鉄溶液:1 L当たりFeSO4・7H2O 13.9 gを1 M塩酸に溶解
・ビタミン溶液:1 L当たりパントテン酸カルシウム0.4 g、イノシトール0.2 g、ナイアシン0.4 g、p-アミノ安息香酸0.2 g、塩酸ピリドキシン0.4 g、塩酸チアミン0.4 g、ビオチン0.2 g及びビタミンB12 0.2 g
・本実施例では、2%グリセリンを炭素源として用いた。
様々な植物の花から分離した、計166株の微生物のライブラリを、岡山大学環境生命科学専攻の神崎浩教授より分譲いただいき、MALDI-TOF質量分析器を用いて、菌体を構成するタンパク質の質量プロファイリングによって簡易的に分類を行った。具体的な分類の手法は、PLoS ONE 7(7): e40784 (2012)に準じて行った。全ての菌株を2%グリセリンを炭素源として5 ml培養液で1週間28℃で培養し、Methylobacterium属野生型22A株と同じく熱抽出とHPLCによりEGT産生量を定量した(実験は1連)。EGT生産性の高かった株に関して、ITS領域の配列解析により同定を行った。
Aureobasidium pullulans kz2
Aureobasidium pullulans kz4
Aureobasidium pullulans kz25
Aureobasidium pullulans kz26
Aureobasidium pullulans kz24
Aureobasidium pullulans kz28
Aureobasidium pullulans kz32
Rhodotorula mucilaginosa kz112
Rhodotorula mucilaginosa kz114
Aureobasidium pullulans kz49
実施例4と同様にして、Aureobasidium pullulans kz25、Aureobasidium pullulans kz26、Rhodotorula mucilagionosa z41cの3株について、2%グリセリンを炭素源としてミネラル培地を用いて培養し、EGT定量を行い、EGT産生能を確認した。
Aureobasidium pullulans kz25及びRhodotorula mucilagionosa z41cの2株について、酵母用のSD培地をベースに、炭素源としてグルコース又はグリセリンを用いてEGT産生の評価を行った。各菌株ともに、28℃で7日間培養した。なお培地の組成は、Yeast nitrogen base (without amino acids)6.7 g/Lに、グリセリン又はグルコース2〜5%を添加したものである。
Aureobasidium pullulans kz25及びRhodotorula mucilagionosa z41cの2株について、炭素源をグリセリン2%とし、酵母エキスの添加、peptone等の添加によるEGT産生能への影響を確認した。各菌株ともに、28℃で7日間培養した。
Claims (9)
- エルゴチオナーゼをコードする遺伝子の発現が抑制され、エルゴチオナーゼ活性が欠損又は低減されており、かつ、エルゴチオネイン合成遺伝子が導入されていることにより、エルゴチオネイン生産性が向上したMethylobacterium属細菌。
- エルゴチオナーゼをコードする遺伝子が、以下の(a)及び(b)から選択されるいずれかのDNAからなる、請求項1に記載のMethylobacterium属細菌:
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるエルゴチオナーゼをコードするDNA;
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列に対し90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、エルゴチオナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - エルゴチオネイン合成遺伝子がegtBD遺伝子である、請求項1に記載のMethylobacterium属細菌。
- Methylobacterium属細菌が、受託番号NITE P-02274として寄託されたものである、請求項1〜3のいずれかに記載のMethylobacterium属細菌。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のMethylobacterium属細菌を、アミノ酸源として酵母エキスを含有し、かつ、炭素源を含有する培地を用いて培養する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
- 酵母エキスが、0.01〜5%で培地中に含有される、請求項5に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- さらに、カザミノ酸、トリプトン、麦芽エキス、及びペプトンからなる群から選択される少なくとも1以上を含有する培地を用いる、請求項5又は6に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- カザミノ酸が0.1〜5%で培地中に含有され、及び/又は、トリプトンが0.1〜5%で培地中に含有される、請求項7に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- 炭素源が、メタノール及び/又はグリセリンを含む、請求項5〜8のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
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