KR20220003035A - 에르고티오네인의 생산 방법 - Google Patents

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KR20220003035A
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이리나 보로디나
더글라스 브루스 켈
데르 회크 스티븐 반
쉬르바네데 베흐루즈 다르바니
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덴마크스 텍니스케 유니버시테트
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Abstract

본 발명은 에르고티오네인의 생산을 위한 미생물 팩토리, 특히 효모 팩토리에 관한 것이다. 효모 세포뿐만 아니라 유용한 핵산, 폴리펩티드, 벡터 및 숙주 세포에서 에르고티오네인의 생산 방법을 또한 제공한다.

Description

에르고티오네인의 생산 방법
본 발명은 에르고티오네인(ergothioneine)의 생산을 위한 미생물 팩토리(factory), 특히 효모 팩토리에 관한 것이다. 효모 세포(yeast cell)뿐만 아니라 유용한 핵산, 폴리펩티드, 벡터(vector) 및 숙주 세포(host cell)에서 에르고티오네인의 생산 방법을 또한 제공한다.
에르고티오네인(ERG)(2-머캅토히스티딘 트리메틸베타인, (2S)-3-(2-티옥소-2,3-디하이드로-1H-이미다졸-4-일)-2-(트리메틸암모니오)프로파노에이트)는 식물과 포유동물에서 보편적으로 발견될 수 있는 천연 산화방지제이며; 토오토머(tautomeric) 구조를 가지고 있으나, 생리학적 pH에서 주로 티온 형태로 존재한다. 에르고티오네인은 유리 라디칼 및 반응성 산소종의 포촉(scavenging)뿐만 아니라, 2가 금속 이온의 킬레이트화를 비롯한 산화방지 성질을 나타낸다. 에르고티오네인은 랫트(rat) 및 인간에서 산화성 손상을 감소시키는 것으로 나타났다.
지금까지는 단지 일부의 세균 및 진균만이 에르고티오네인의 자연 생산자로서 동정되었다. 에르고티오네인은 1909년에 맥각균 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea)에서 발견되었으며 이의 구조는 2년 후에 결정되었다. 이 후에, 섬유상 진균 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 효모 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)를 포함한 다양한 방선균을 비롯하여 여러 다른 유기체가 에르고티오네인을 생산하는 것으로 밝혀졌다.
인간은 식단을 통해 에르고티오네인을 얻어야 하며; 일부 버섯 및 기타 식품에는 최대 7 ㎎.g-1의 건조 중량이 포함되어 있다. 에르고티오네인은 유익한 효과와 질병 예방에 관여할 수 있기 때문에 세계 건강 보조 식품 시장에서 자리를 잡을 준비가 되어 있다.
연구에 따르면 인간의 에르고티오네인은 주로 간, 신장, 적혈구, 골수, 수정체 및 정액에 축적된다. 상기는 대부분의 동물에 공통적인 수송체(transporter)인 SLC22A4(이전에는 OCTN1로 알려짐)에 의해 수송된다. 체내에 에르고티오네인이 풍부하다는 것은 에르고티오네인이 건강 유지 또는 질병 완화에 관여한다는 것을 암시한다. 에르고티오네인은 여러 신경퇴행성 질환, 허혈 재관류 손상 및 기타 다양한 질병의 생체 내 모델에서 효과가 입증되었다. 에르고티오네인은 또한 SLC22A4/OCTN1의 상향 조절을 통해 손상 부위에 축적될 수 있음이 보고되고 있다. 에르고티오네인은 인간에서 단지 천천히 대사되고 배출되며, 이는 다시 한 번 상기가 신체에서 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.
에르고티오네인은 L-히스티딘 1분자, 시스테인 1분자, S-아데노실-L-메티오닌을 통해 공여된 3개의 메틸기로부터 합성된다(도 1). 엠 스메그마티스에서 반응 시퀀스는 하나의 클러스터에 함께 위치하는 EgtA, EgtB, EgtC, EgtD 및 EgtE 유전자에 의해 암호화된 5개의 효소에 의해 촉매화된다. 상기 클러스터의 4개의 효소 EgtA, EgtB, EgtC 및 EgtD는 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인 S-옥사이드(HCO) 중간체를 생성시키는 4개의 개별적인 반응을 촉매화한다. 진균에서, 생합성 경로는 단일 효소 Egt1이 히스티딘의 메틸화를 촉매화하여 헤르시닌을 제공하고, 이는 차례로 시스테인으로 설폭사이드화되어 HCO를 생성하기 때문에 상이하다. HCO는 엠 스메그마티스에서 EgtE, 및 진균에서 Egt2 유전자에 의해 암호화(encoding)되는 β-라이아제에 의해 2-(하이드록시설파닐)헤르시닌으로 전환된다. 상기 화합물은 명백히 자발적으로 에르고티오네인으로 환원된다.
에르고티오네인의 현행 생산 방법은 대부분 화학 합성에 기반을 두고 있다. 이와 같은 방법은 비용-효과적이지 않으며 환경에도 상당한 영향을 미친다. 따라서, 에르고티오네인의 비용-효과적이고 환경-친화적인 생산 방법이 요구된다.
본 발명은 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포, 및 효모 세포에서 에르고티오네인의 생산 방법을 제공한다.
하나의 태양에서 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 제공하며, 상기 효모 세포는
a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
를 발현하고; 여기에서 상기 효모 세포는 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있다.
본원은 또한
i) 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 제공하고, 상기 효모 세포는
a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
를 발현하며; 여기에서 상기 효모 세포는 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있고;
ii) 상기 효모 세포를 배지에서 배양하여
에르고티오네인을 수득하는 단계들을 포함하는 효모 세포에서 에르고티오네인을 생산하는 방법을 제공한다.
본원은 또한
·서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드(CpEgt1) 또는 서열번호 6에 적어도 70% 상동성(homology)을 갖는 이의 기능성 변이체(functional variant), 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 상동체;
·서열번호 12에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드(CpEgt2) 또는 서열번호 12에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체
를 제공한다.
또한 본원은
· 서열번호 5 또는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 핵산, 또는 서열번호 5 또는 서열번호 16에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 핵산;
·서열번호 11 또는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 핵산, 또는 서열번호 11 또는 서열번호 18에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 핵산
을 제공한다.
또한 상기 핵산을 포함하는 벡터뿐만 아니라, 상기 벡터 및/또는 상기 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한 에르고티오네인의 생산을 위한 상기 폴리펩티드, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
도 1: 세균 및 진균에서 에르고티오네인 생합성의 경로. SAM = S-아데노실-L-메티오닌, SAH = S-아데노실-L-호모시스테인, γ-GC = γ-L-글루타밀-L-시스테인, γ-GHCO = γ-L-글루타밀-S-(헤르신-2-일)-L-시스테인 S-옥사이드, HCO = S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드, 2-HSH = 2-(하이드록시설파닐)헤르시닌.
도 2: 통합된 에르고티오네인 생합성 경로를 갖는 균주에서 에르고티오네인 생산. 균주는 표시된 바와 같이, 상이한 유기체들로부터의 유전자의 다양한 조합을 갖는다. 검은색 박스: 세포내 에르고티오네인; 흰색 박스: 세포외 에르고티오네인. Y 축은 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다. 1: SC + 20 g/l 글루코스 + 1 g/l His/Cys/Met(배치(Batch) 배지), 48시간; 2: SC + 40 g/l 글루코스(배치 배지), 72시간; 3: SC + 60 g/l EnPump 기질, 0.6% 시약 A(유가배양(Fed batch) 배지), 72시간. SC= 합성 완료
도 3: 상이한 조건하에서 수송체 MsErgT 또는 HsSCL22A4(도면에서 Hs.SCL22A4X)의 존재 또는 부재하에 생산 균주에서 시간에 따른 에르고티오네인의 생산. 검은색 박스: 세포내 에르고티오네인; 흰색 박스: 세포외 에르고티오네인. 1: SC + 20 g/l 글루코스 + 1 g/l His/Cys/Met(배치 배지), 48시간; 2: SC + 40 g/l 글루코스(배치 배지), 72시간; 3: SC + 60 g/l EnPump 기질, 0.6% 시약 A(유가배양 배지), 72시간. SC= 합성 완료
도 4: 줄무늬 박스: 세포내 에르고티오네인; 검은색 박스; 세포외 에르고티오네인; 검은색 라인: OD. (A): SC + 40 g/L 글루코스 중 ST8461. (B): SC + 40 g/L 글루코스 + 1 g/L aa 중 ST8461. (C): SC + 40 g/L 글루코스 + 2 g/L aa 중 ST8461. (D): SC + 40 g/L 글루코스 중 ST8654. (E) SC + 40 g/L 글루코스 + 1 g/L aa 중 ST8654. (F): SC + 40 g/L 글루코스 + 2 g/L aa 중 ST8654. SC= 합성 완료
도 5: 1 g/l 히스티딘, 시스테인 및 메티오닌이 없는 배지(줄무늬 박스) 대 1 g/l 히스티딘, 시스테인 및 메티오닌이 있는 배지(검은색 박스)에서 수송체를 갖는 표시된 균주에서 대조용에 대한 PI 염색된 세포의 백분율(Y축). (A): ST7574. (B): ST8654. (C): ST8461. SC= 합성 완료.
도 6: 탄소제한 조건하에서 유가배양 동안 ST8927에 의한 에르고티오네인 생산. N = (NH4)2SO4, Mg= MgSO4, tm = 미량 금속, vit = 비타민.
도 7: 통합된 에르고티오네인 생합성 경로(NcEgt1 및 SpEgt2의 2개 사본)를 갖는 균주에서 에르고티오네인 생산. 상기 균주는 통합된 에르고티오네인 생합성 경로 외에, 도면에 표시된 바와 같이, 유전자의 추가적인 변형을 수반한다. Y축은 전체 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다.
도 8: 통합된 에르고티오네인 생합성 경로(NcEgt1 및 SpEgt2의 2개 사본)를 갖는 균주에서 에르고티오네인 생산. 상기 균주는 도면에 표시된 바와 같이, 변형된 유전자의 다양한 조합을 갖는다. Y축은 전체 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다. TRA res. = TRA 내성.
도 9: 통합된 에르고티오네인 생합성 경로(NcEgt1 및 SpEgt2의 2개 사본)를 갖는 균주에서 에르고티오네인 생산. 상기 균주는 도면에 표시된 바와 같이, 변형된 유전자의 다양한 조합을 갖는다. Y축은 전체 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다. TRA res. = TRA 내성.
도 10: 통합된 에르고티오네인 생합성 경로(NcEgt1 및 SpEgt2의 2개 사본)를 갖는 균주에서 에르고티오네인 생산. 상기 균주는 상기 통합된 에르고티오네인 생합성 경로 외에, 도면에 표시된 바와 같이, 유전자의 추가적인 변형을 수반한다. 검은색 박스: 세포내 에르고티오네인; 흰색 박스: 세포외 에르고티오네인. 따라서 Y축은 세포내 및 세포외 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다.
도 11: 통합된 에르고티오네인 생합성 경로(NcEgt1 및 SpEgt2의 2개 사본)를 갖는 균주에서 에르고티오네인 생산. 상기 균주는 상기 통합된 에르고티오네인 생합성 경로 외에, 도면에 표시된 바와 같이, 유전자의 추가적인 변형을 갖는다. Y축은 전체 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다. TRA res. = TRA 내성.
도 12: 균주 ST8460 에스 세레비지아에(S. cerevisiae), ST9584 와이 리포리티카(Y. lipolytica) 및 ST9703 와이 리포리티카에서 에르고티오네인 생산. 검은색 막대: 글루코스: 배치 조건(20 g/L 글루코스를 갖는 SC 배지)하에서 에르고티오네인 생산; 흰색 막대: FiT: 모의 유가배양 조건(20 g/L Enpump 기질 + 0.6% 시약 A를 갖는 SC 배지)하에서 에르고티오네인 생산. Y 축은 전체 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다. SC= 합성 완료.
도 13: X축상에 표시된 바와 같은 다양한 출발 세포 건조 중량 농도 및 다양한 시약 A 농도를 사용하는 에르고티오네인 생산. Y 축은 전체 에르고티오네인 생산(㎎/L)을 나타낸다.
도 14: 선택된 균주에서 에르고티오네인 및 히스티딘 생산. 균주를 0.25 mM β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌을 함유하는 배지에서 증식시켰다. 검은색 박스: 히스티딘: 흰색 박스: 에르고티오네인. Y 축은 전체 에르고티오네인 및 히스티딘 생산(㎎/L)을 나타낸다.
본 개시내용은 에르고티오네인의 생산을 위한 효모 세포 및 방법에 관한 것이다.
효모 세포
본 개시내용은 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포에 관한 것이다.
따라서 본원에서 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 제공하며, 상기 효모 세포는
a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
를 발현하고; 여기에서 상기 효모 세포는 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있다.
따라서 본원에 개시된 효모 세포는 모두 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있다. 이는 상기 효모 세포가 자연적으로(즉 변형 없이) 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시키는 능력을 갖거나 또는 상기 효모 세포가 당해 분야에 공지된 바와 같이 상기 능력을 획득하도록 조작되었기 때문일 수 있다. 일반적으로, 효모 세포를 비롯한 세포는 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인, 특히 티올 형태의 에르고티오네인으로 자발적으로 전환시키는 능력을 가지며, 이어서 상기는 티온 형태의 에르고티오네인으로 전환될 수 있고 이와 역도 마찬가지이다. 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌의 에르고티오네인으로의 자발적인 전환은 전자 공여체를 요하며, 전자 수용체 및 H2O를 방출한다(도 1).
본 개시내용의 효모 세포는 바람직하게는 L-히스티딘 및 L-시스테인을 합성할 수 있다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 GRAS(일반적으로 안전하다고 볼 수 있는 물질) 유기체 또는 비-병원성 유기체 또는 균주의 세포이다.
일부 구현예에서, 상기 효모의 속은 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 야로위아(Yarrowia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces) 중에서 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 상기 효모의 속은 사카로마이세스, 피키아, 클루이베로마이세스 또는 야로위아이다.
효모 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 크립토코커스 알비두스(Cryptococcus albidus), 리포마이세스 리포페라(Lipomyces lipofera), 리포마이세스 스타르케이이(Lipomyces starkeyi), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 트리코스포론 풀루란(Trichosporon pullulan) 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)로 이루어지는 그룹 중에서 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 효모 세포는 클루이베로마이세스 마르시아누스 세포, 사카로마이세스 세레비지아에 세포 또는 야로위아 리포리티카 세포이고; 바람직하게 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지아에 세포이다.
제1 이종 효소
효모 세포에서 발현된 제1 이종 효소는 L-이스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있다. 제1 이종 효소는 효모 세포에서 자연적으로 발현되지 않는다. 상기는 하기에 상세히 기재하는 바와 같이 진핵생물 또는 원핵생물로부터 유래될 수 있다.
상기 반응을 촉매화할 수 있는 효소는 L-히스티딘 Nα-메틸트랜스퍼라제(EC 2.1.1.44), 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.51), 글루타메이트-시스테인 리가제(EC 6.3.2.2), γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.50), 및 γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 하이드롤라제(EC 3.5.1.118)이다. 일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 EC 2.1.1.44, EC 1.14.99.51, EC 6.3.2.2, EC 1.14.99.50 및 EC 3.5.1.118 중에서 선택된 EC 번호를 갖는 효소이다. 하나의 구현예에서, EC 번호는 2.1.1.44이다. 또 다른 구현예에서, EC 번호는 EC 1.14.99.51이다.
L-히스티딘 Nα-메틸트랜스퍼라제(EC 2.1.1.44)(또한 디메틸히스티딘 N-메틸트랜스퍼라제라고도 함)는 하기 반응을 촉매화한다:
3 S-아데노실-L-메티오닌 + L-히스티딘 <=> 3 S-아데노실-L-호모시스테인 + 헤르시닌.
보조인자로서 Fe2+를 사용한다. 따라서 상기와 같은 효소는 기질로서 L-히스티딘이 필요하다.
헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.51)는 하기 반응을 촉매화한다:
헤르시닌 + L-시스테인 + O2 <=> S-헤르신-2-일-L-시스테인 S-옥사이드 + H2O
보조인자로서 Fe2+를 사용한다. 상기와 같은 효소는 기질로서 L-시스테인이 필요하다.
글루타메이트-시스테인 리가제(EC 6.3.2.2)는 하기 반응을 촉매화한다:
헤르시닌 + L-시스테인 + O2 <=> S-헤르신-2-일-L-시스테인 S-옥사이드 + H2O
보조인자로서 Fe2+를 사용한다. 상기와 같은 효소는 기질로서 L-시스테인이 필요하다.
γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.50)는 하기 반응을 촉매화한다:
헤르시닌 + L-시스테인 + O2 <=> S-헤르신-2-일-L-시스테인 S-옥사이드 + H2O
보조인자로서 Fe2+를 사용한다. 상기와 같은 효소는 기질로서 L-시스테인이 필요하다.
γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 하이드롤라제(EC 3.5.1.118)는 하기 반응을 촉매화한다:
헤르시닌 + L-시스테인 + O2 <=> S-헤르신-2-일-L-시스테인 S-옥사이드 + H2O
보조인자로서 Fe2+를 사용한다. 상기와 같은 효소는 기질로서 L-시스테인이 필요하다.
본 개시내용 전체를 통해서, 제1 이종 효소가 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.51), 글루타메이트-시스테인 리가제(EC 6.3.2.2), γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.50), 또는 γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 하이드롤라제(EC 3.5.1.118)인 경우, 효모 세포는 기질로서 L-시스테인이 필요하다. 상기 제1 이종 효소가 L-히스티딘 Nα-메틸트랜스퍼라제(EC 2.1.1.44)(또한 디메틸히스티딘 N-메틸트랜스퍼라제라고도 함)인 경우, 상기 효모 세포는 기질로서 L-히스티딘이 필요하다.
일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 진균, 예를 들어 효모와 같은 진핵생물로부터 유래된 Egt1이다. 본 개시내용의 효모 세포는 상기 제1 이종 효소 외에, 상기 제1 이종 효소와 동일한 반응을 촉매화할 수 있는 효소를 자연적으로 발현하거나 또는 상기 효모 세포는 상기 반응을 촉매화할 수 있는 효소가 없을 수도 있다. 효소, 특히 제1 이종 효소는 유기체에서 자연적으로 발견되는 경우 상기 유기체로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 진핵생물로부터 유래하며 EC 2.1.1.44 및/또는 EC.1.14.99.51로서 분류된다.
일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 클라비셉스 푸르푸레아(Claviceps purpurea), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 리조푸스 스톨로니페라(Rhizopus stolonifera), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 페니실리움 로쿠에포르티(Penicillium roqueforti), 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum), 스포로볼로마이세스 살모니콜라(Sporobolomyces salmonicolor), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 카르보나리우스(Aspergillus carbonarius), 뉴로스포라 테트라스페르마(Neurospora tetrasperma), 아가리쿠스 비스포루스(Agaricus bisporus), 플레우로투스 오스트레아투스(Pleurotus ostreatus), 렌티눌라 에도데스(Lentinula edodes) 또는 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa)로부터의 Egt1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다. "기능성 변이체"란 용어는 전체 또는 부분 활성을 유지하며 여전히 L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는, 예를 들어 질량 분광분석에 임의로 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 생성물을 검출함으로써 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
상기 나열된 Egt1 효소의 수탁 번호를 하기 표 A에 나열한다.
[표 A]
Figure pct00001
일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 스키조사카로마이세스 폼베, 또는 클라비셉스 푸르푸레아로부터 유래된다. 상응하는 Egt1 효소의 서열은 서열번호 2(엔. 크라싸), 서열번호 4(에스. 폼베) 및 서열번호 6(씨. 푸르푸레아)에 제시된다.
특정 구현예에서, 제1 이종 효소는 NcEgt1(서열번호 2), SpEgt1(서열번호 4) 및 CpEgt1(서열번호 6), 및 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
제2 이종 효소
효모 세포에서 발현되는 제2 이종 효소는 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있다. 특히, 상기 제2 이종 효소는 제1 이종 효소에 의해 생산된 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르신으로 전환시킬 수 있다.
상기 반응을 촉매화할 수 있는 효소는 β-라이아제 및 헤르시닐시스테인 설폭사이드 라이아제(또한 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 4.4.1.-)라고도 한다)이다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 제2 이종 효소는 β-라이아제 또는 헤르시닐시스테인 설폭사이드 라이아제(EC 4.4.1.-)이다.
상기와 같은 효소는 하기의 반응을 촉매화할 수 있다:
헤르시닌 + L-시스테인 + O2 <=> S-헤르신-2-일-L-시스테인 S-옥사이드 + H2O
보조인자로서 Fe2+를 사용한다.
일부 구현예에서, 제2 이종 효소는 진균, 예를 들어 효모와 같은 진핵생물로부터 유래된 Egt2이다. 본 개시내용의 효모 세포는 제1 이종 효소 외에, 제2 이종 효소와 동일한 반응을 촉매화할 수 있는 효소를 자연적으로 발현할 수 있거나, 또는 상기 효모 세포는 상기 반응을 촉매화할 수 있는 효소가 없을 수도 있다. 일부 구현예에서, 상기 제2 이종 효소는 세균으로부터 유래된 EgtE이다. 효소, 특히 제2 이종 효소는 유기체에서 자연적으로 발견되는 경우 상기 유기체로부터 유래한다.
일부 구현예에서, 제2 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 클라비셉스 푸르푸레아, 스키조사카로마이세스 폼베, 리조푸스 스톨로니페라, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 노타툼, 스포로볼로마이세스 살모니콜라, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 카르보나리우스, 뉴로스포라 테트라스페르마, 아가리쿠스 비스포루스, 플레우로투스 오스트레아투스, 렌티눌라 에도데스, 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa), 가노데르마 루시둠(Ganoderma lucidum) 또는 칸타렐루스 시바리우스(Cantharellus cibarius)로부터의 Egt2 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다. "기능성 변이체"란 용어는 전체 또는 부분 활성을 유지하며 여전히 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르신으로 전환시킬 수 있는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는, 예를 들어 질량 분광분석에 임의로 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 생성물을 검출함으로써 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
다른 구현예에서, 제2 이종 효소는 세균 EgtE, 예를 들어 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 노카르디아 아스테로이드스(Nocardia asteroids), 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus), 스트렙토마이세스 프라디아에(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 악티노플라네스 필리피넨시스(Actinoplanes philippinensis), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 칸사시이(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 포르푸이툼(Mycobacterium forfuitum), 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코박테리움 발네이(Mycobacterium balnei), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum), 마이코박테리움 미크로티(Mycobacterium microti), 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodocrous)(마이코박테리움 로도크로우스(Mycobacterium rhodocrous)), 아르쓰로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르쓰로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아파니조메논 플로스-아쿠아에(Aphanizomenon flos-aquae), 사이토네마 스페시즈(Scytonema sp.), 오실라토리아 스페시즈(Oscillatoria sp.) 및 로도피타 스페시즈(Rhodophyta sp.)로부터의 EgtE, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다. "기능성 변이체"란 용어는 전체 또는 부분 활성을 유지하며 여전히 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르신으로 전환시킬 수 있는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는, 예를 들어 질량 분광분석에 임의로 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 생성물을 검출함으로써 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
상기 나열된 Egt2 및 EgtE 효소의 수탁 번호를 하기 표 B에 나열한다.
[표 B]
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 구현예에서, 제2 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 스키조사카로마이세스 폼베, 클라비셉스 푸르푸레아 또는 마이코박테리움 스메그마티스로부터 유래된다. 상응하는 Egt2 또는 EgtE 효소의 서열은 서열번호 8(엔. 크라싸), 서열번호 10(에스. 폼베), 서열번호 12(씨. 푸르푸레아) 및 서열번호 14(엠. 스메그마티스)에 제시된다.
특정 구현예에서, 효모에서 발현된 제2 이종 효소는 NcEgt2(서열번호 8), SpEgt2(서열번호 10), CpEgt2(서열번호 12) 및 MsEgtE(서열번호 14), 및 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체 중에서 선택될 수 있다.
제1 및 제2 이종 효소의 조합
본원에 개시된 제1 및 제2 이종 효소의 모든 조합이 에르고티오네인의 생산을 위한 효소 팩토리의 제공에 유용할 수 있지만, 제1 및 제2 이종 효소의 특정 조합이 본 발명의 상황에서 특히 중요할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 이종 효소는
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 하기와 같은 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다:
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체.
일부 구현예에서, 본 발명의 효모 세포는
iii) NcEgt1 및 NcEgt2; 또는
viii) SpEgt1 및 MsEgtE; 또는
x) CpEgt1 및 SpEgt2
가 아닌 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
제1 및 제2 이종 효소를 암호화하는 핵산
본 개시내용의 상황에서 유용한 효모 세포를 당해 분야에 공지된 바와 같이 조작할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 및 제2 이종 효소의 발현을, 효모 세포에 상기 효소들을 암호화하는 핵산을 도입시킴으로써 성취할 수 있다. 상기와 같은 핵산을 당해 분야에 공지된 바와 같이, 효모 세포에서의 발현을 개선시키기 위해 코돈-최적화(codon-optimising)할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 스키조사카로마이세스 폼베, 또는 클라비셉스 푸르푸레아로부터 유래된다. 상응하는 Egt1 효소의 서열은 서열번호 2(엔. 크라싸), 서열번호 4(에스. 폼베) 및 서열번호 6(씨. 푸르푸레아)에 제시된다. 상응하는 핵산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 15(엔. 크라싸), 서열번호 3(에스. 폼베) 및 서열번호 5 또는 서열번호 16(씨. 푸르푸레아)에 제시된다. 따라서, 상기와 같은 핵산, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 변이체를 당해 분야에 공지된 바와 같이, 게놈 중에 또는 발현에 적합한 벡터의 부분으로서 효모 세포에 적합하게 도입시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 스키조사카로마이세스 폼베, 클라비셉스 푸르푸레아 또는 마이코박테리움 스메그마티스로부터 유래된다. 상응하는 Egt2 또는 EgtE 효소의 서열은 서열번호 8(엔. 크라싸), 서열번호 10(에스. 폼베), 서열번호 12(씨. 푸르푸레아) 및 서열번호 14(엠. 스메그마티스)에 제시된다. 상응하는 핵산 서열은 서열번호 7 또는 서열번호 17(엔. 크라싸), 서열번호 9(에스. 폼베), 서열번호 11 또는 서열번호 18(씨. 푸르푸레아) 및 서열번호 13 또는 서열번호 19(엠. 스메그마티스)에 제시된다. 따라서, 상기와 같은 핵산, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 변이체를 당해 분야에 공지된 바와 같이, 게놈 중에 또는 발현에 적합한 벡터의 부분으로서 효모 세포에 적합하게 도입시킬 수 있다.
특정한 구현예에서, 하기에 나타낸 바와 같은 핵산 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 상동체를 효모 세포에 도입시킨다:
i) NcEgt1 및 CpEgt2: 서열번호 1 또는 15 및 서열번호 11 또는 18;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2: 서열번호 1 또는 15 및 서열번호 9;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2: 서열번호 1 또는 15 및 서열번호 7 또는 17;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE: 서열번호 1 또는 15 및 서열번호 13 또는 19;
v) SpEgt1 및 NcEgt2: 서열번호 3 및 서열번호 7 또는 17
vi) SpEgt1 및 SpEgt2: 서열번호 3 및 서열번호 9;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2: 서열번호 3 및 서열번호 11 또는 18;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE: 서열번호 3 및 서열번호 13 또는 19;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2: 서열번호 5 또는 16 및 서열번호 7 또는 17;
x) CpEgt1 및 SpEgt2: 서열번호 5 또는 16 및 서열번호 9;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2: 서열번호 5 또는 16 및 서열번호 11 또는 18;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE: 서열번호 5 또는 16 및 서열번호 13 또는 19.
특정 구현예에서, 상기 i), ii), iv) 또는 xii)에 나타낸 바와 같은 핵산 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 상동체를 도입시킨다. 일부 구현예에서, 상기 도입된 핵산은 상기 iii), viii) 또는 x)에 나타낸 핵산이 아니다.
에르고티오네인 수송체
일부 구현예에서, 효모 세포는 상기 세포가 생산하는 에르고티오네인의 적어도 일부를 분비할 수 있다. 상기 효모 세포는 자연적으로 그렇게 할 수 있거나, 또는 분비가 개선되도록 추가로 변형될 수 있다. 이를 에르고티오네인 수송체, 특히 이종 에르고티오네인 수송체의 발현 또는 과발현(overexpressing)에 의해 수행할 수 있다.
따라서 일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 엠. 스메그마티스의 에르고티오네인 수송체(MsErgT) 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 에이치. 사피엔스(H. sapiens)의 에르고티오네인 수송체(HsSLC22A4), 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현한다. 여기에서 기능성 변이체는 전체 또는 부분 에르고티오네인 수송체 활성을 유지하는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 MsErgT 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 HsSLC22A4와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 MsErgT 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 HsSLC22A4와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 MsErgT 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 HsSLC22A4와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
iii) NcEgt1 및 NcEgt2; 또는
viii) SpEgt1 및 MsEgtE; 또는
x) CpEgt1 및 SpEgt2
가 아닌 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 MsErgT 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 HsSLC22A4와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 발현하고, NcEgt1의 2개 사본 및 CpEgt2의 2개 사본을 발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 에르고티오네인 수송체(AtOCT1), 또는 서열번호 39에 제시된 바와 같은 에스. 세레비지아에의 에르고티오네인 수송체(ScAQR1) 또는 서열번호 41(HsSLC22A16)에 제시된 바와 같은 또는 서열번호 43(HsSLC22A32)에 제시된 바와 같은 에이치. 사피엔스의 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현한다. 여기에서 기능성 변이체는 전체 또는 부분 에르고티오네인 수송체 활성을 유지하는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
AtOCT1을 암호화하는 유전자는 서열번호 38에 제시된다.
ScAQR1을 암호화하는 유전자는 서열번호 40에 제시된다.
HsSLC22A16을 암호화하는 유전자는 서열번호 42에 제시된다.
HsSLC22A32를 암호화하는 유전자는 서열번호 44에 제시된다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 AtOCT1, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 ScAQR1, 서열번호 41에 제시된 바와 같은 HsSLC22A16 또는 서열번호 42에 제시된 바와 같은 HsSLC22A32와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 AtOCT, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 ScAQR1, 서열번호 41에 제시된 바와 같은 HsSLC22A16 또는 서열번호 43에 제시된 바와 같은 HsSLC22A32와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 AtOCT, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 ScAQR1, 서열번호 41에 제시된 바와 같은 HsSLC22A16 또는 서열번호 43에 제시된 바와 같은 HsSLC22A32와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
iii) NcEgt1 및 NcEgt2; 또는
viii) SpEgt1 및 MsEgtE; 또는
x) CpEgt1 및 SpEgt2
가 아닌 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 AtOCT1, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 ScAQR1, 서열번호 41에 제시된 바와 같은 HsSLC22A16 또는 서열번호 43에 제시된 바와 같은 HsSLC22A32와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 발현하고, NcEgt1의 2개 사본 및 CpEgt2의 2개 사본을 발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에의 에르고티오네인 수송체를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScAGP2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000019.1), ScTPO3(GenBank 수탁 번호 BK006949.2), ScTPO4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000150.1), 및/또는 ScTPO1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000165.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실을 수반한다. 여기에서 기능성 변이체는 전체 또는 부분 에르고티오네인 수송체 활성을 유지하는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에의 에르고티오네인 수송체를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScAGP2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000019.1), ScTPO3(GenBank 수탁 번호 BK006949.2), ScTPO4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000150.1), 및/또는 ScTPO1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000165.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 수반한다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에의 에르고티오네인 수송체를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScAGP2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000019.1), ScTPO3(GenBank 수탁 번호 BK006949.2), ScTPO4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000150.1), 및/또는 ScTPO1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000165.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에의 에르고티오네인 수송체를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScAGP2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000019.1), ScTPO3(GenBank 수탁 번호 BK006949.2), ScTPO4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000150.1), 및/또는 ScTPO1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000165.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실, 및
iii) NcEgt1 및 NcEgt2; 또는
viii) SpEgt1 및 MsEgtE; 또는
x) CpEgt1 및 SpEgt2
가 아닌 제1 및 제2 이종 효소를 수반한다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에의 에르고티오네인 수송체를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScAGP2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000019.1), ScTPO3(GenBank 수탁 번호 BK006949.2), ScTPO4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000150.1), 및/또는 ScTPO1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000165.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실을 수반하며, NcEgt1의 2개 사본 및 CpEgt2의 2개 사본을 발현한다.
효모 세포는 상술한 유전자형 중 하나 이상, 예를 들어 본원에서 상술한 바와 같은 유전자의 발현 또는 상기 유전자의 결실의 임의의 조합을 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 MsErgt를 추가로 발현한다. MsErgt 발현 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 HsSLC22A4, AtOCT1, ScAQR1, HsSLC22A16 및 HsSLC22A32 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상 또는 5개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScAGP2, ScTPO4, ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 HsSLC22A4를 추가로 발현한다. HsSLC22A4 발현 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 AtOCT1, ScAQR1, HsSLC22A16 및 HsSLC22A32 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScAGP2, ScTPO4, ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 HsSLC22A4를 추가로 발현한다. HsSLC22A4 발현 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 AtOCT1, ScAQR1, HsSLC22A16 및 HsSLC22A32 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScAGP2, ScTPO4, ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 AtOCT1을 추가로 발현한다. AtOCT1 발현 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScAQR1, HsSLC22A16 및 HsSLC22A32 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScAGP2, ScTPO4, ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 HsSLC22A16을 추가로 발현한다. HsSLC22A16 발현 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 HsSLC22A16 및 HsSLC22A32 중 하나 이상 또는 2개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScAGP2, ScTPO4, ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 HsSLC22A32를 추가로 발현한다. HsSLC22A32 발현 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 HsSLC22A32를 발현하고/하거나 유전자 ScAGP2, ScTPO4, ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScAGP2의 결실을 추가로 수반한다. ScAGP2의 결실을 수반하는 것 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScTPO4, ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScTPO4의 결실을 추가로 수반한다. ScTPO4의 결실을 수반하는 것 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScTPO3 및 ScTPO1 중 하나 이상, 2개 이상의 결실을 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScTPO3의 결실을 추가로 수반한다. ScTPO3의 결실을 수반하는 것 외에 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScTPO1의 결실을 수반할 수 있다.
에르고티오네인 역가(titer)
본원에 개시된 효모 세포는 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 총 역가로 생산할 수 있으며, 여기에서 상기 총 역가는 세포내 에르고티오네인 역가와 세포외 에르고티오네인 역가의 합이다. 실제로, 상기 생산된 에르고티오네인은 세포로부터 분비되거나(세포외 에르고티오네인), 또는 세포 중에 유지될 수 있다(세포내 에르고티오네인).
상기 효모 세포는 세포외 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 역가로 생산할 수 있다.
상기 효모 세포는 세포내 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 역가로 생산할 수 있다.
에르고티오네인 역가의 측정 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포를 용해시키고 역가를 HPLC에 의해 측정하여(실시예 1 참조) 세포내 에르고티오네인 역가를 측정할 수 있다. 역가를 또한 세포가 제거된 상등액 분획에서 HPLC에 의해 측정할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 와이. 리포리티카이며 에르고티오네인을 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L, 예를 들어 적어도 260 ㎎/L, 예를 들어 적어도 270 ㎎/L 에르고티오네인의 역가로 생산할 수 있다.
다른 변형
본 발명에 따른 효모 세포는 에르고티오네인을 생산할 수 있으며, 상기 효모 세포는 본원에 상술한 바와 같은 적어도 하나의 제1 이종 효소 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 상기 제1 이종 효소를 암호화하는 유전자의 적어도 2개의 사본 및 상기 제2 이종 효소를 암호화하는 유전자의 적어도 2개의 사본을 발현한다.
동일한 유전자의 적어도 2개 이상의 사본, 예를 들어 동일한 유전자의 적어도 3개 이상의 사본, 예를 들어 적어도 4개 이상의 사본, 예를 들어 적어도 4개 이상의 사본을 수반하는 효모 세포는 상기 유전자의 단지 하나의 사본만을 수반하는 효모 세포에 의해 생산된 동일한 단백질의 양에 비해, 보다 많은 양의 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 효모 세포는 하나 이상의 추가적인 변형, 예를 들어:
·하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 유전자의 결실을 수반하고/하거나;
·하나 이상의 유전자의 적어도 하나 이상의 추가적인 사본을 수반함, 즉 적어도 하나 이상의 추가적인 유전자를 발현하고/하거나 과발현함
을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "돌연변이"란 용어는 유전자의 암호화 및 비암호화 영역 중의 삽입, 결실, 치환, 변위, 및 점 돌연변이를 포함한다. 점 돌연변이는 하나의 염기쌍의 변화에 관한 것이며, 조기 정지 코돈, 프레임이동 돌연변이, 이어맞추기 부위의 돌연변이 또는 아미노산 치환을 생성시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이는 2개 단백질의 연결을 생성시키는 돌연변이일 수 있다. 돌연변이를 포함하는 유전자를 "돌연변이 유전자"라 칭할 수 있다. 상기 돌연변이 유전자가 야생형과 다른 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 경우, 상기 폴리펩티드를 "돌연변이 폴리펩티드" 및/또는 "돌연변이 단백질"이라 칭할 수 있다. 돌연변이 폴리펩티드를, 상기가 야생형 서열과 다른 아미노산 서열을 포함하는 경우, 돌연변이를 수반하는 것으로서 기재할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은, 에스. 세레비지아에에서 동정된 특정 유전자는 특정 단백질을 암호화한다. 다른 효모 종에서, 상기 특정 유전자는 다른 주석이 달릴 수 있지만, 여전히 유사한 단백질 또는 유사한 기능을 공유하는 기능성 상동체를 암호화한다. 따라서, 에스. 세레비지아에로부터의 지식을 다른 종, 예를 들어 다른 효모 종, 예를 들어 와이. 리포리티카에 전달할 수 있다. 당업자는 에스 세레비지아에 대해 본원에 제공된 정보에 기초하여, 변형되거나, 돌연변이되거나, 결실되거나 과발현된 상응하는 단백질 또는 유전자를 어떻게 확인하는 지를 알 것이다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 효모 세포에서 하기의 경로를 변형시키는 것이 유리할 수 있다:
·질소 이화산물 억제 및/또는 질소 화합물의 수송에 의해 에르고티오네인 전구체 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘 및 시스테인에 대한 질소 이용률 증가
·모든 에르고티오네인 전구체의 모든 합성을 개선시키기 위한 일반 아미노산 조절
·개별적인 아미노산 생합성 경로, 예를 들어 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘, 시스테인 및 아르기닌
·황 동화 경로
이에 의해 상기 효모 세포를, 에르고티오네인 대사가 증가된 에르고티오네인 합성을 향하고, 이에 의해 에르고티오네인의 역가를 더욱 증가시키는 방식으로 변형시킨다.
에르고티오네인 전구체의 증가된 질소 이용률
일부 구현예에서, 효모 세포는 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘 및 시스테인에 대한 질소 이용률을 증가시킬 수 있다. 상기 효모 세포는 자연적으로 그렇게 할 수 있거나, 또는 전구체 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘 및 시스테인에 대한 질소 이용률을 증가시키도록 추가로 변형될 수 있다. 이는 질소 이화산물 억제 및/또는 질소의 수송을 표적화함으로써 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 증가된 질소 이화산물 억제를 생성시키는 하나 이상의 돌연변이를 수반한다. 즉, 상기 효모 세포는 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘 및 시스테인의 증가된 이용률을 생성시키는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다.
특정한 구현예에서, 감소된 질소 이화산물 억제는 질소 이화산물 억제 조절된 유전자, 예를 들어 전사 조절제의 억제해제에 의해 수행될 수 있다. 이의 한 가지 비제한적인 예는 질소 이화산물 억제 전사 조절제 유전자의 결실 또는 불활성화이며, 상응하는 단백질의 전체적인 또는 부분적인 기능 상실을 생성시킨다. 예를 들어 상기 전사 활성제-암호화 유전자 ScURE2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000061.1)를 사카로마이세스 세레비지아에에서 돌연변이시키거나 결실시킬 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScURE2 유전자의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 질소 이화산물 억제의 전사 조절제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScURE2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000061.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실을 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScURE2의 결실 또는 돌연변이를 수반하고, NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
또 다른 구현예에서, 효모 세포는 와이. 리포리티카이며, Ure2의 감소된 활성을 생성시키는 돌연변이를 수반하거나 또는 Ure2에 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 적어도 하나의 단백질의 감소된 활성을 생성시키는 돌연변이를 수반한다.
질소 이용률의 개선은 또한 질소-반응성 유전자를 조절하는 유전자의 발현 또는 과발현에 의해, 따라서 질소 이화산물 억제의 억제해제를 생성시킴으로써 수행될 수 있다. 에스. 세레비지아에에서, 상기와 같은 유전자의 일례는 ScARG82(GenBank 수탁 번호 JRIV01000074.1)이다. 따라서, 하나의 구현예에서, 효모 세포, 바람직하게 에스. 세레비지아에는 ScARG82를 추가로 발현하거나 과발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScARG82를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScARG82의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScARG82의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 염기성 아미노산, 예를 들어 히스티딘 및/또는 SAM의 액포로의 수송을 감소시킬 수 있다. 상기 효모 세포는 자연적으로 그렇게 할 수 있거나, 또는 염기성 아미노산, 특히 히스티딘, 및/또는 SAM의 액포로의 수송을 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 이는 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 돌연변이(들)를 도입시켜 히스티딘 및/또는 SAM의 액포로의 수송을 감소시킴으로써 수행될 수 있다. 에스. 세레비지아에에서 상기와 같은 유전자의 예는 염기성 아미노산의 수송에 관련된 퍼미아제를 암호화하는 ScVBA1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000175.), ScVBA2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000033.1), 및/또는 ScVBA3(GenBank 수탁 번호 BK006937.2), 또는 ScVBA1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000175.), ScVBA2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000033.1), ScVBA3(GenBank 수탁 번호 BK006937.2)에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 공유하는 이의 기능성 상동체, 및/또는 ScPET8(GenBank 수탁 번호 JRIV01000154.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 공유하는 이의 기능성 상동체이다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScVBA2 유전자의 결실 또는 돌연변이를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScVBA1 유전자의 결실 또는 돌연변이를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScVBA3 유전자의 결실 또는 돌연변이를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScPET8 유전자의 결실 또는 돌연변이를 수반한다.
또 다른 구현예에서, 효모 세포는 세포내로의 질소 수송을 증가시킬 수 있다. 상기 효모 세포는 자연적으로 그렇게 할 수 있거나, 또는 세포내로의 질소 수송을 개선시키기 위해 추가로 변형될 수 있다. 이는 또한 세포내로의 질소 수송을 증가시키는 유전자의 발현 또는 과발현, 예를 들어 ScSSY1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000074.1), ScGRR1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000227.1), ScYCK2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000213.1), ScSTP1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000080.1), ScSSY5(GenBank 수탁 번호 JRIV01000167.1), ScPTR3(GenBank 수탁 번호 JRIV01000088.1) 및/또는 ScSTP2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000156.1) 또는 ScSSY1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000074.1), ScGRR1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000227.1), ScYCK2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000213.1), ScSTP1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000080.1), ScSSY5(GenBank 수탁 번호 JRIV01000167.1), ScPTR3(GenBank 수탁 번호 JRIV01000088.1) 및/또는 ScSTP2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000156.1)에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 공유하는 이의 기능성 상동체의 발현 또는 과발현에 의해 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 ScSSY1을 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScGRR1을 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScYCK2를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSSY5를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScPTR3을 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSTP2를 추가로 발현하거나 과발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScSSY1 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSSY1의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScSSY1의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScGRR1 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScGRR1의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScGRR1의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScYCK2 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScYCK2의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScYCK2의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScSSY5 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSSY1의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScSSY1의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScPTR3 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSSY1의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScSSY1의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScSTP1 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSSY1의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScSSY1의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScSTP1 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSTP1의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScSTP1의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 45에 제시된 바와 같은 ScSTP1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 서열을 추가로 발현하거나 과발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 질소 화합물 수송체의 전사 인자, 예를 들어 서열번호 45에 제시된 바와 같은 ScSTP1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현하거나 과발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 45에 제시된 바와 같은 ScSTP1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 일치성을 갖는 서열, 및 NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현하거나 과발현한다.
ScSTP1을 암호화하는 유전자는 서열번호 46에 제시된다.
또 다른 구현예에서, 효모 세포는 와이. 리포리티카이며, Stp1의 감소된 활성을 생성시키는 돌연변이를 수반하거나 또는 Stp1에 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 적어도 하나의 단백질의 감소된 활성을 생성시키는 돌연변이를 수반한다.
일반적인 아미노산 조절 및 개별적인 아미노산 생합성 경로
일부 구현예에서, 효모 세포는 아미노산 생합성, 특히 에르고티오네인 전구체 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘 및 시스테인의 생합성을 증가시킬 수 있다. 상기 효모 세포는 자연적으로 그렇게 할 수 있거나, 또는 아미노산 생합성을 개선시키도록 추가로 변형될 수 있다. 이는 일반적인 아미노산 조절의 변형 및/또는 개별적인 아미노산 생합성 경로의 변형에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 증가된 아미노산 생합성을 생성시키는 하나 이상의 유전자(들)의 하나 이상의 돌연변이(들)를 추가로 수반한다. 일부 구현예에서, 상기 효모 세포는 증가된 아르기닌, 히스티딘, 시스테인 및/또는 S-아데노실메티오닌 생합성을 생성시키는 하나 이상의 유전자(들)의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다.
특정한 구현예에서, 증가된 아미노산 생합성은 아미노산 생합성 유전자의 억제해제, 예를 들어 ScGCN2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000117.1) 및/또는 ScGCN4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000017.1)의 증가된 및/또는 구성적 활성화에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 아미노산 생합성을 개선시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScGCN2 유전자의 돌연변이를 수반하여 Gcn2의 활성을 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScGCN4의 앞에 리더 서열의 결실을 수반한다. 또 다른 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScGCN4의 상류 개시 코돈의 결실을 수반한다. GCN4의 ORF 앞에, 조기 정지 코돈으로 인해 불활성 GCN4로 이어지는 4개의 개시 코돈이 존재함은 일반적으로 공지되어 있다. 상기 세포는 이들 상류 개시 코돈의 차단/해제에 의한 GCN4의 전사에 의해 조절된다. GCN4의 구성적 활성화는 상기 상류 개시 코돈의 결실 및/또는 상기 상류 개시 코돈을 함유하는 GCN4 앞의 리더 서열의 결실에 의해 성취될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScPET18 유전자의 돌연변이를 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 ScGCN4의 하나 이상의 상류 개시 코돈 및/또는 리더 서열 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포, 바람직하게 에스. 세레비지아에는 ScGCN4의 하나 이상의 상류 개시 코돈 및/또는 리더 서열의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반하고, NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
아미노산 생합성의 개선은 또한 아르기닌 생합성의 상향조절에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScARG81의 돌연변이, 예를 들어 ScARG81의 결실 또는 돌연변이를 수반한다.
아미노산 생합성의 개선은 또한 히스티딘 생합성을 상향조절함으로써 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 효모 세포는 히스티딘 생합성을 개선시키는 유전자의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScBAS1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000108.1) 및/또는 ScPHO2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000173.1) 또는 ScBAS1 및/또는 ScPHO2에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반하여, 연결되거나 융합된 Bas1 및 Pho2 단백질을 생성시킨다. Bas1 및 Pho2의 연결은 문헌[Pinson et al. 2000]에 기재된 바와 같이 성취될 수 있다. 따라서, Bas1과 Pho2간의 키메라는 ScBAS1 유전자 및 ScPHO2 유전자와 BAS1 프로모터와의 연결에 의해 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 51에 제시된 바와 같은 융합된 ScBAS1 유전자 및 ScPHO2 유전자 또는 상기에 예를 들어 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85% 상동성인 이의 기능성 상동체를 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 히스티딘을 암호화하는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 ScHIS1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000173.1)의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다.
따라서, 하나의 구현예에서, HIS1의 돌연변이는 하기의 돌연변이 중 하나이다:
a. 프레임이동 돌연변이를 생성시키는 돌연변이;
b. ScHIS1 유전자에 조기 정지 코돈을 형성시키는 돌연변이;
c. ScHIS1 유전자의 이어맞추기 부위의 돌연변이;
d. ScHIS1 유전자의 프로모터 영역의 돌연변이; 및/또는
e. ScHIS1 유전자의 인트론의 돌연변이.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L의 히스티딘을 생산할 수 있다.
아미노산 생합성의 개선은 또한 시스테인 생합성의 상향조절에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 효모 세포는 시스테인 생합성을 개선시키는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 호모시스테인으로부터 시스테인의 증가된 합성을 생성시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScCYS3(GenBank 수탁 번호 JRIV01000001.1) 또는 상기에 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScCYS3의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScCYS3의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScCYS4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000163.1) 또는 상기에 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScCYS4의 추가적인 사본, 예를 들어 ScCYS4의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다. 또 다른 구현예에서, 상기 효모 세포는 호모시스테인을 향한 시스테인의 전환을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScSTR2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000227.1) 또는 상기에 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 돌연변이 또는 결실을 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSTR3의 돌연변이, 예를 들어 ScSTR3(GenBank 수탁 번호 JRIV01000013.1) 또는 상기에 적어도 70%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성인 이의 기능성 상동체의 결실 또는 돌연변이를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScGSH1의 돌연변이, 예를 들어 ScGSH1(GenBank 수탁 번호 JRIV01000144.1)의 결실 또는 돌연변이를 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포, 바람직하게 에스. 세레비지아에는 시스테인 생합성의 시스타티오닌 감마-신타제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScSTR2 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실 또는 돌연변이를 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScSTR2의 결실 또는 돌연변이를 수반하고, NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
또 다른 구현예에서, 효모 세포는 와이. 리포리티카이고, Str2의 활성을 감소시키는 돌연변이를 수반하거나, 또는 Str2에 적어도 70% 서열 상동성을 갖는 적어도 하나의 단백질의 활성을 감소시키는 돌연변이를 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 히스티딘 생합성의 ATP 포스포리보실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScHIS1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 HIS1의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반하고, NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
또 다른 구현예에서, 효모 세포는 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L의 히스티딘을 생산할 수 있으며,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L의 히스티딘을 생산할 수 있고, NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
히스티딘 생산을 증가시킬 수 있는 효모 세포를 당해 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어 효모 세포를 β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌의 존재하에서 증식시킴으로써 성취할 수 있다. 효모 세포는 생존을 위해서 상기 경로상의 피드백 억제를 제거함으로써 히스티딘 과잉생산을 시작하며, 이때 상기 세포는 β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌에 내성이고(TRAR) 히스티딘을 과잉생산한다. TRAR 효모 세포의 생산에 대해서 하기 본원에 기재된 바와 같은 실시예 13을 참조하시오.
아미노산 생합성의 개선은 또한 S-아데노실메티오닌(SAM) 생합성의 상향조절에 의해 수행될 수 있다. 하나의 구현예에서, 효모 세포는 S-아데노실메티오닌(SAM) 생합성을 개선시키는 유전자의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 S-아데노실메티오닌(SAM) 생산 및/또는 풀(pool)을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSAM2를 추가로 발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScSAM2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000080.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScGLC3(GenBank 수탁 번호 BK006939.2) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 돌연변이 또는 결실을 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScSPE2(GenBank 수탁 번호 JRIV01000055.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 돌연변이 또는 결실을 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScERG4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000085.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 돌연변이 또는 결실을 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScMET13(GenBank 수탁 번호 JRIV01000134.1)의 피드백 내성을 제거하는 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScMTHFR의 돌연변이를 수반한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, S-아데노실메티오닌(SAM) 생합성의 S-아데노실메티오닌 데카복실라제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScSPE2 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실 또는 돌연변이를 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScSPE2의 결실 또는 돌연변이를 수반하고, NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, S-아데노실메티오닌(SAM) 생합성의 델타(24(24(1)))-스테롤 리덕타제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScERG4 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실 또는 돌연변이를 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에이며, ScERG4의 결실 또는 돌연변이를 수반하고, NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
황 동화 경로
일부 구현예에서, 효모 세포는 황 동화 경로를 개선시킬 수 있다. 상기 효모 세포는 자연적으로 그렇게 할 수 있거나, 또는 황 동화를 개선시키도록 추가로 개선될 수 있다. 이는 황 동화를 개선시키는 효소, 특히 아데닐일-설페이트 키나제 및/또는 포스포아데노신 포스포설페이트 리덕타제의 발현 또는 과발현에 의해 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 ScMET4(GenBank 수탁 번호 JRIV01000213.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScMET4의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScMet4의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 ScMET14(GenBank 수탁 번호 JRIV01000011.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScMET14의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScMet14의 적어도 2개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
또 다른 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아데닐일-설페이트 키나제(ScMET14) 또는 상기에 적어도 70% 일치성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현한다.
ScMET14를 암호화하는 유전자는 서열번호 48에 제시되어 있다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 ScMET16(GenBank 수탁 번호 JRIV01000176.1) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 75%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현한다. 하나의 구현예에서, 상기 효모 세포는 ScMET16의 적어도 하나의 추가적인 사본, 예를 들어 ScMET16의 적어도 3개의 추가적인 사본, 예를 들어 적어도 4개의 추가적인 사본을 수반한다.
또 다른 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 포스포아데노신 포스포설페이트 리덕타제(ScMET16) 또는 상기에 적어도 70% 일치성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현한다.
ScMET16을 암호화하는 유전자는 서열번호 50에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아데닐일-설페이트 키나제(ScMET14) 또는 상기에 적어도 70% 일치성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아데닐일-설페이트 키나제(ScMET14) 또는 상기에 적어도 70% 일치성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및 NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
일부 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 포스포아데노신 포스포설페이트 리덕타제(ScMET16) 또는 상기에 적어도 70% 일치성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
하나의 구현예에서, 효모 세포는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 포스포아데노신 포스포설페이트 리덕타제(ScMET16) 또는 상기에 적어도 70% 일치성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및 NcEgt1의 2개의 사본 및 CpEgt2의 2개의 사본을 발현한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScHIS1에 하나 이상의 돌연변이(들)를 추가로 수반한다. ScHIS1에 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반하는 것 외에, 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScSTP1, ScMET14 및 ScMET16 중 하나 이상, 또는 3개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScURE2, ScSTR2, ScSPE2 및 ScERG4의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실, 및/또는 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L의 히스티딘을 생산할 수 있다. 상기 효모는 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L의 히스티딘을 생산할 수 있는 것 외에, 또한 유전자 ScSTP1, ScMET14 및 ScMET16 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScURE2, ScSTR2, ScSPE2 및 ScERG4의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실, 및/또는 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScSTP1을 추가로 발현한다. ScSTP1을 발현하는 것 외에, 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScMET14 및 ScMET16 중 하나 이상, 2개 이상을 발현하고/하거나 유전자 ScURE2, ScSTR2, ScSPE2 및 ScERG4의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실, 및/또는 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScMET14를 추가로 발현한다. ScMET14를 발현하는 것 외에, 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScMET16을 발현하고/하거나 유전자 ScURE2, ScSTR2, ScSPE2 및 ScERG4의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실, 및/또는 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScMET16을 추가로 발현한다. ScMET16을 발현하는 것 외에, 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScURE2, ScSTR2, ScSPE2 및 ScERG4의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 결실, 및/또는 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScURE2의 결실을 추가로 수반한다. ScURE2의 결실을 수반하는 것 외에, 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScSTR2, ScSPE2 및 ScERG4의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상의 결실, 및/또는 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScSTR2의 결실을 추가로 수반한다. ScSTR2의 결실을 수반하는 것 외에, 상기 효모 세포는 또한 유전자 ScSPE2 및 ScERG4의 하나 이상 또는 2개 이상의 결실, 및/또는 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 ScERG4의 결실을 추가로 수반한다. ScERG4의 결실을 수반하는 것 외에, 상기 효모 세포는 또한 ScGCN4의 하나 이상의 개시 코돈의 하나 이상의 돌연변이(들)를 수반할 수 있다.
본원에서 상술한 이들 조합 중 어느 하나를 "에르고티오네인 수송체" 섹션(section)에 기재된 변형과 조합할 수 있다.
에르고티오네인 생산 방법
본원은 또한
i) 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 제공하고, 상기 효모 세포는
a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
를 발현하며; 여기에서 상기 효모 세포는 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있고;
ii) 상기 효모 세포를 배지에서 배양하여
에르고티오네인을 수득하는 단계들을 포함하는 효모 세포에서 에르고티오네인을 생산하는 방법을 제공한다.
본원, 특히 "효모 세포" 섹션에 기재된 효모 세포 중 어느 하나를 상기와 같은 방법에 사용할 수 있다. 특히, 상기 효모 세포는 본원, 예를 들어 상기 "제1 이종 효소" 섹션에 기재된 바와 같은 제1 이종 효소, 및 본원, 예를 들어 상기 "제2 이종 효소" 섹션에 기재된 바와 같은 제2 이종 효소를 발현할 수 있다. 특정한 구현예에서, 상기 효모 세포는 "제1 및 제2 이종 효소의 조합" 섹션하에 나열된 조합을 발현한다. 따라서 상기와 같은 세포를 사용하는 에르고티오네인의 생산은 본원에 개시된 효모 세포를, 상기 효모 세포가 에르고티오네인을 생산할 수 있게 하는 조건하에서 배지에서 배양함으로써 성취될 수 있다.
적합한 배지는 당업자에게 공지되어 있다. 최적의 에르고티오네인 생산을 위한 배지 및 배양 조건의 최적화가 또한 구상된다.
효모 세포는 에르고티오네인을 생산하기 위해서 적합한 기질을 필요로 한다. 에르고티오네인은 L-히스티딘 및/또는 L-시스테인으로부터 생성된다. 상기 효모 세포는 L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 합성할 수 있으며, 이어서 이를 기질로서 사용할 수 있다. 따라서, 배지는 이들 아미노산을 반드시 포함할 필요는 없다. 그러나 일부의 경우에 배지에 아미노산, 특히 히스티딘, 바람직하게는 L-히스티딘; 시스테인, 바람직하게는 L-시스테인; 또는 메티오닌, 바람직하게는 L-메티오닌을 보충하는 것이 유용할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 배지에 아미노산, 특히 앞서 나열된 것들을 보충하는 것은 에르고티오네인 역가를 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 배지는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 바람직하게는 L-히스티딘, 시스테인, 바람직하게는 L-시스테인, 또는 메티오닌, 바람직하게는 L-메티오닌을, 바람직하게는 적어도 0.1 g/L, 예를 들어 적어도 0.2 g/L, 예를 들어 적어도 0.3 g/L, 예를 들어 적어도 0.4 g/L, 예를 들어 적어도 0.5 g/L, 예를 들어 적어도 0.75 g/L, 예를 들어 적어도 1 g/L, 예를 들어 적어도 2 g/L의 농도로 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 효모 세포는 L-히스티딘 Nα-메틸트랜스퍼라제(EC 2.1.1.44), 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.51), 글루타메이트-시스테인 리가제(EC 6.3.2.2), γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 신타제(EC 1.14.99.50), 및 γ-글루타밀 헤르시닐시스테인 S-옥사이드 하이드롤라제(EC 3.5.1.118)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 이종 효소를 발현한다. 일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 EC 2.1.1.44, EC 1.14.99.51, EC 6.3.2.2, EC 1.14.99.50 및 EC 3.5.1.118 중에서 선택된 EC 번호를 갖는 효소이다. 하나의 구현예에서, EC 번호는 2.1.1.44이다. 또 다른 구현예에서, EC 번호는 EC 1.14.99.51이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 제1 이종 효소 및 제2 이종 효소를 발현하는 효모 세포를 제공함을 포함하며, 이때 상기 제1 이종 효소는 진균, 예를 들어 효모와 같은 진핵생물로부터 유래된 Egt1이다. 본 개시내용의 효모 세포는 상기 제1 이종 효소 외에, 상기 제1 이종 효소와 동일한 반응을 촉매화할 수 있는 효소를 자연적으로 발현하거나, 또는 상기 효모 세포는 상기 반응을 촉매화할 수 있는 효소가 없을 수도 있다.
일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 진핵생물로부터 유래되며 EC 2.1.1.44 및/또는 EC.1.14.99.51로서 분류된다.
일부 구현예에서, 제1 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 클라비셉스 푸르푸레아, 스키조사카로마이세스 폼베, 리조푸스 스톨로니페라, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 노타툼, 스포로볼로마이세스 살모니콜라, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 카르보나리우스, 뉴로스포라 테트라스페르마, 아가리쿠스 비스포루스, 플레우로투스 오스트레아투스, 렌티눌라 에도데스 또는 그리폴라 프론도사로부터의 Egt1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다. "기능성 변이체"란 용어는 전체 또는 부분 활성을 유지하며 L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 여전히 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는, 예를 들어 질량 분광분석에 임의로 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 생성물을 검출함으로써 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법의 제1 단계에서 제공된 효모 세포에서 발현된 제1 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 스키조사카로마이세스 폼베 또는 클라비셉스 푸르루레아로부터 유래된다. 상응하는 Egt1 효소의 서열은 서열번호 2(엔. 크라싸), 서열번호 4(에스. 폼베) 및 서열번호 6(씨. 푸르푸레아)에 제시된다.
특정 구현예에서, 제1 이종 효소는 NcEgt1(서열번호 2), SpEgt1(서열번호 4) 및 CpEgt1(서열번호 6), 및 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 제2 이종 효소를 발현하는 효모 세포를 제공함을 포함하며, 일부 구현예에서 상기 효소는 β-라이아제 또는 헤르시닐시스테인 설폭사이드 라이아제(EC 4.4.1.-)이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 제공된 효모 세포에서 발현된 제2 이종 효소는 진균, 예를 들어 효모와 같은 진핵생물로부터 유래된 Egt2이다. 본 개시내용의 효모 세포는 상기 제1 이종 효소 외에, 상기 제2 이종 효소와 동일한 반응을 촉매화할 수 있는 효소를 자연적으로 발현하거나 또는 상기 효모 세포는 상기 반응을 촉매화할 수 있는 효소가 없을 수도 있다. 일부 구현예에서, 상기 제2 이종 효소는 세균으로부터 유래된 EgtE이다.
일부 구현예에서, 제2 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 클라비셉스 푸르푸레아, 스키조사카로마이세스 폼베, 리조푸스 스톨로니페라, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 노타툼, 스포로볼로마이세스 살모니콜라, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 카르보나리우스, 뉴로스포라 테트라스페르마, 아가리쿠스 비스포루스, 플레우로투스 오스트레아투스, 렌티눌라 에도데스, 그리폴라 프론도사, 가노데르마 루시둠 또는 칸타렐루스 시바리우스로부터의 Egt2 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다. "기능성 변이체"란 용어는 전체 또는 부분 활성을 유지하며 여전히 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르신으로 전환시킬 수 있는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는, 예를 들어 질량 분광분석에 임의로 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 생성물을 검출함으로써 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
다른 구현예에서, 제2 이종 효소는 세균 EgtE, 예를 들어 마이코박테리움 스메그마티스, 노카르디아 아스테로이드스, 스트렙토마이세스 알부스, 스트렙토마이세스 프라디아에, 스트렙토마이세스 그리세우스, 악티노플라네스 필리피넨시스, 아스퍼질러스 푸미가투스, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 칸사시이, 마이코박테리움 인트라셀룰라레, 마이코박테리움 포르푸이툼, 마이코박테리움 울세란스, 마이코박테리움 발네이, 마이코박테리움 레프라에, 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 미크로티, 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스, 마이코박테리움 플레이, 로도코커스 로도크로우스(마이코박테리움 로도크로우스), 아르쓰로스피라 플라텐시스, 아르쓰로스피라 막시마, 아파니조메논 플로스-아쿠아에, 사이토네마 스페시즈, 오실라토리아 스페시즈 및 로도피타 스페시즈로부터의 EgtE, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다. "기능성 변이체"란 용어는 전체 또는 부분 활성을 유지하며 여전히 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르신으로 전환시킬 수 있는 돌연변이체와 같은 변이체를 지칭한다. 당업자는 기능성 변이체가 상기 활성을 유지하는 지의 여부를 어떻게 결정하는 지를 안다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 제2 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 스키조사카로마이세스 폼베, 클라비셉스 푸르푸레아 또는 마이코박테리움 스메그마티스로부터 유래된다. 상응하는 Egt2 또는 EgtE 효소의 서열은 서열번호 8(엔. 크라싸), 서열번호 10(에스. 폼베), 서열번호 12(씨. 푸르푸레아) 및 서열번호 14(엠. 스메그마티스)에 제시된다.
특정 구현예에서, 제2 이종 효소는 NcEgt2(서열번호 8), SpEgt2(서열번호 10), CpEgt2(서열번호 12) 및 MsEgtE(서열번호 14), 및 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체 중에서 선택될 수 있다.
상응하게, 일부 구현예에서, 상기 방법은 제1 이종 효소 및 제2 이종 효소를 발현하는 효모 세포를 제공하며, 여기에서:
- 제1 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 클라비셉스 푸르푸레아, 스키조사카로마이세스 폼베, 리조푸스 스톨로니페라, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 노타툼, 스포로볼로마이세스 살모니콜라, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 카르보나리우스, 뉴로스포라 테트라스페르마, 아가리쿠스 비스포루스, 플레우로투스 오스트레아투스, 렌티눌라 에도데스 또는 그리폴라 프론도사로부터의 Egt1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이고;
- 제2 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 클라비셉스 푸르푸레아, 스키조사카로마이세스 폼베, 리조푸스 스톨로니페라, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 노타툼, 스포로볼로마이세스 살모니콜라, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 카르보나리우스, 뉴로스포라 테트라스페르마, 아가리쿠스 비스포루스, 플레우로투스 오스트레아투스, 렌티눌라 에도데스, 그리폴라 프론도사, 가노데르마 루시둠 또는 칸타렐루스 시바리우스로부터의 Egt2이거나, 또는 상기 제2 이종 효소는 세균 EgtE, 예를 들어 마이코박테리움 스메그마티스, 노카르디아 아스테로이드스, 스트렙토마이세스 알부스, 스트렙토마이세스 프라디아에, 스트렙토마이세스 그리세우스, 악티노플라네스 필리피넨시스, 아스퍼질러스 푸미가투스, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 칸사시이, 마이코박테리움 인트라셀룰라레, 마이코박테리움 포르푸이툼, 마이코박테리움 울세란스, 마이코박테리움 발네이, 마이코박테리움 레프라에, 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 미크로티, 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스, 마이코박테리움 플레이, 로도코커스 로도크로우스(마이코박테리움 로도크로우스), 아르쓰로스피라 플라텐시스, 아르쓰로스피라 막시마, 아파니조메논 플로스-아쿠아에, 사이토네마 스페시즈, 오실라토리아 스페시즈 및 로도피타 스페시즈로부터의 EgtE, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
특정 구현예에서, 제1 이종 효소는 서열번호 2(엔. 크라싸), 서열번호 4(에스. 폼베) 및 서열번호 6(씨. 푸르푸레아)에 제시된 바와 같은 효소이고, 제2 이종 효소는 서열번호 8(엔. 크라싸), 서열번호 10(에스. 폼베), 서열번호 12(씨. 푸르푸레아) 및 서열번호 14(엠. 스메그마티스)에 제시된 바와 같은 효소, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 이종 효소는
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
특정한 구현예에서, 효모 세포는 하기와 같은 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다:
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체.
일부 구현예에서, 본 발명의 효모 세포는
iii) NcEgt1 및 NcEgt2; 또는
viii) SpEgt1 및 MsEgtE; 또는
x) CpEgt1 및 SpEgt2
가 아닌 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
상기 효소의 발현은 당해 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어 본원의 "제1 및 제2 이종 효소를 암호화하는 핵산" 섹션에서 상술한 바와 같이, 제1 및 제2 이종 효소를 암호화하는 핵산의 효모 세포에의 도입에 의해 성취될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 효모 세포는 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 이종 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 서열번호 35에 제시된 바와 같은 엠. 스메그마티스의 에르고티오네인 수송체(MsErgT) 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 에이치. 사피엔스의 에르고티오네인 수송체(HsSLC22A4), 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 따라서 서열번호 35에 제시된 바와 같은 MsErgT 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 HsSLC22A4와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 발현하는 효모 세포를 제공하고 배양하는 단계를 포함한다.
특정한 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 효모 세포는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 MsErgT 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 HsSLC22A4와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 효모 세포는 서열번호 35에 제시된 바와 같은 MsErgT 또는 서열번호 36에 제시된 바와 같은 HsSLC22A4와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
iii) NcEgt1 및 NcEgt2; 또는
viii) SpEgt1 및 MsEgtE; 또는
x) CpEgt1 및 SpEgt2
가 아닌 제1 및 제2 이종 효소를 발현한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 효모 세포는 본원의 "에르고티오네인 수송체" 및 "다른 변형" 표제하의 섹션에서 기재한 바와 같은 하나 이상의 추가적인 변형, 특히:
·질소 이화산물 억제 및/또는 질소 화합물의 수송에 의해 에르고티오네인 전구체 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘 및 시스테인에 대한 질소 이용률 증가
·모든 에르고티오네인 전구체의 모든 합성을 개선시키기 위한 일반적인 아미노산 조절
·개별적인 아미노산 생합성 경로, 예를 들어 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘, 시스테인 및 아르기닌
·황 동화 경로
·선행 항목 중 어느 하나에 따른 효모 세포(여기에서 상기 효모 세포는 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L의 히스티딘을 생산할 수 있다)
를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 효모 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 발현하거나 과발현한다:
o 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 MsErgT(서열번호 35) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
o 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 HsSLC22A4(서열번호 36) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
o 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 AtOCT1(서열번호 37) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
o 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 ScAQR1(서열번호 39) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
o 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 HsSLC22A16(서열번호 41) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
o 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 HsSLC22A32(서열번호 43) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
o 아데닐일-설페이트 키나제, 예를 들어 ScMET14(서열번호 47) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
o 포스포아데노신 포스포설페이트 리덕타제, 예를 들어 ScMET16(서열번호 49) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체; 및/또는
o 질소 화합물 수송체에 대한 전사 인자, 예를 들어 STP1(서열번호 45) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용된 효모 세포는 하기의 유전자(들) 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이(들)를 추가로 포함한다
o ScAGP2;
o ScTPO4;
o ScTPO3;
o ScTPO1;
o ScURE2;
o ScSTR2;
o ScERG4;
o ScSPE2; 및/또는
o ScGCN4, 예를 들어 GCN4의 상류 개시 코돈 중의 하나 이상의 돌연변이(들).
본 발명의 방법은 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L, 예를 들어 적어도 1.1 g/L, 예를 들어 적어도 1.2 g/L, 예를 들어 적어도 1.3 g/L, 예를 들어 적어도 1.4 g/L, 예를 들어 적어도 1.5 g/L 이상의 총 역가로 생산할 수 있게 하며, 여기에서 상기 총 역가는 세포내 에르고티오네인 역가와 세포외 에르고티오네인 역가의 합이다. 실제로, 상기 생산된 에르고티오네인은 세포로부터 분비되거나(세포외 에르고티오네인), 또는 세포 중에 유지될 수 있다(세포내 에르고티오네인).
특히, 본 발명의 방법은 세포외 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L, 예를 들어 적어도 1.1 g/L, 예를 들어 적어도 1.2 g/L, 예를 들어 적어도 1.3 g/L, 예를 들어 적어도 1.4 g/L, 예를 들어 적어도 1.5 g/L 이상의 역가로 생산할 수 있다.
본 발명의 방법은 세포내 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L, 예를 들어 적어도 1.1 g/L, 예를 들어 적어도 1.2 g/L, 예를 들어 적어도 1.3 g/L, 예를 들어 적어도 1.4 g/L, 예를 들어 적어도 1.5 g/L 이상의 역가로 생산할 수 있다.
상기 방법은 또한 생산된 에르고티오네인을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 세포 물질을 침전시키고 세포내 에르고티오네인을 방출하는 가열 단계, 세포 찌꺼기 및 침전된 물질을 제거하는 원심분리 또는 여과 단계, 임의로 상기 에르고티오네인의 용해도를 변화시키고 이를 다른 성분으로부터 정제하기 위한 용매를 수반하는 pH-조절 및 크로마토그래피 단계를 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 회수된 에르고티오네인을 미경험 또는 가공된 숙주 세포를 갖는 영양 보충물로서 바로 사용할 수 있다.
폴리펩티드
본 발명자는 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 조작하는데 유용한 다수의 폴리펩티드를 식별하였다. 특히, 클라비셉스 푸르푸레아로부터 Egt1 및 Egt2가 동정되었으며 이는 효모 세포에서 이종 발현에 유용한 것으로 밝혀졌고, 이에 의해 에르고티오네인 생산을 위한 미생물 플랫폼을 제공한다.
특히, 본원은 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열 또는 서열번호 6에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체, 예를 들어 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 상동체를 갖는 폴리펩티드(CpEgt1)를 제공한다.
또한, 서열번호 12에 제시된 서열 또는 서열번호 12에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체를 갖는 폴리펩티드(CpEgt2)를 제공한다.
또한 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 제공한다.
또한 에르고티오네인의 생산을 위한 상기 폴리펩티드 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
본원은 또한 상기 폴리펩티드, 즉 클라비셉스 푸르푸레아로부터의 Egt1 및 Egt2를 암호화하는 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 당해 분야에 공지된 바와 같은 효모 세포에서의 발현에 코돈-최적화되었을 수도 있다.
하나의 구현예에서, 핵산은 서열번호 5 또는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 서열을 갖거나, 또는 서열번호 5 또는 서열번호 16에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는다.
일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 11 또는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 서열을 갖거나, 또는 서열번호 11 또는 서열번호 18에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는다.
본 개시내용의 목적을 위해 사용된 핵산을, 변형시키고자 하는 효모 세포내에서 암호화된 단백질의 발현을 개선시키기 위해 당해 분야에 공지된 바와 같이 코돈-최적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 이종 효소를 암호화하는 핵산을 게놈 조작 또는 게놈 편집에 의해 또는 상이한 교배 유형의 효모 세포들을 교잡함으로써 상기 효모 세포의 게놈내에 독립적으로 통합시키거나, 또는 벡터로부터 세포내에서 발현시킬 수 있다.
핵산의 통합 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 따라서 일부 구현예에서 제1 및/또는 제2 이종 효소를, 효모 세포내에 이들을 암호화하는 이종 핵산을 도입시킴으로써 세포에서 발현시킨다. 상기 이종 핵산을 임의의 목적을 위해서 코돈-최적화하거나, 또는 이들 효소는 활성의 개선을 도울 수 있는 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이종 핵산을 변형된 단백질을 암호화하도록 변형시킬 수 있다. 상기와 같은 변형은 비제한적으로 국소화 신호의 도입, 돌연변이 기능 획득 또는 기능 상실, 단백질의 마커 또는 태그, 예를 들어 형광 태그에의 융합, 유도성 프로모터의 삽입, 증가된 안정성 및/또는 반감기를 부여하는 변형의 도입을 포함한다.
관심 활성을 암호화하는 이종 핵산의 도입을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 당업자는 상기와 같은 방법이 비제한적으로 클로닝 및 상동성 재조합-기반 방법을 포함함을 알 것이다. 클로닝 방법은 에스케리키아 콜라이와 같은 유기체에서 플라스미드의 설계 및 구성을 수반할 수 있다. 상기 플라스미드는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있다. 무-클로닝 방법은 상동성 재조합-기반 방법, 예를 들어 어댑터머-매개된 PCR 또는 끊김 수복을 포함한다. 상기와 같은 방법은 종종 효모 세포의 게놈내에 이종 핵산의 통합을 생성시킨다.
핵산은 높은 사본수로 존재할 수 있다.
핵산은 당해 분야에 공지된 바와 같은 유도성 프로모터 또는 구성 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 상기 핵산은 당해 분야에 공지된 바와 같은 강한 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.
또한 상기 핵산을 포함하는 벡터뿐만 아니라, 상기 벡터 및/또는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시내용의 상황에 유용한 벡터는 하기를 포함할 수 있다:
·본원에 기재된 바와 같은 제1 이종 효소를 암호화하는 핵산; 및/또는
·본원에 기재된 바와 같은 제2 이종 효소를 암호화하는 핵산; 및
·임의로 본원에 기재된 바와 같은 에르고티오네인 수송체를 암호화하는 핵산.
또한 에르고티오네인의 생산을 위한 상기 핵산, 벡터 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 구성하기 위한 키트를 제공하며, 여기에서 상기 키트는
·본원에 기재된 바와 같은 효모 세포 및 사용 설명서;
·본원에 기재된 바와 같은 효모 세포를 수득하기 위해 변형시키고자 하는 모 효모 세포 및 상기 효모 세포를 변형시키기에 적합한 핵산 또는 벡터, 및 사용 설명서.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예
실시예 1 - 물질 및 방법
균주, 화학물질, 합성 유전자, 서비스
본 연구에서, 사카로마이세스 세레비지아에 균주 ST7574(Cas9 발현 카세트 및 G418 내성을 갖는 플라스미드로 형질전환된 CEN.PK113-7D 균주)를 대사 조작을 위한 배경 균주로서 사용하였다. 야로위아 리포리티카 ST6512(Cas9 유전자 및 D-세린 내성이 통합된 W29 균주)를 와이. 리포리티카 조작을 위한 배경 균주로서 사용하였다. 에스케리키아 콜라이 DH5α를 플라스미드의 모든 클로닝 과정, 번식 및 보관에 사용하였다. 에르고티오네인(카탈로그 # E7521-25MG, ≥98% 순도)을 Sigma-Aldrich로부터 구입하고, 헤르시닌(카탈로그 # H288900, 100 ㎎, ≥95% 순도)을 Toronto Research Chemicals Inc로부터 구입하였다. 합성 유전자를 the GeneArt Gene Synthesis service of Thermo Fisher Scientific 또는 IDT의 맞춤 유전자 합성 서비스를 통해 주문하였다. 서열분석 결과를 Eurofins Genomics(Ebersberg, Germany)를 통해 그들의 Mix2Seq 키트를 사용하여 획득하였다. Enpump 200을 Enpresso(Berlin, Germany)로부터 수득하였다.
클로닝 전략
스키조사카로마이세스 폼베로부터의 유전자(PCR 및 적합한 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 단리되었다)를 제외하고, 에르고티오네인의 생합성 경로에 필요한 모든 유전자를 코돈-최적화하였다. 생합성 경로 및 후속의 에스 세레비지아에에의 통합을 위한 균주 구성을 EasyClone MarkerFree 방법(Jessop-Fabre et al., 2106)을 사용하여 수행하였다. 와이 리포리티카에서의 에르고티오네인 생합성 경로를 위한 균주 구성을 EasyCloneYALI 방법(Holkenbrink et al., 2018)을 사용하여 수행하였다. ST9553 내지 ST9564에서의 결실을 위해, 카나마이신 내성 카세트를 사용하여 유전자를 결실시켰다. 그렇지 않으면, 결실을 문헌[Stovicek et al., 2015]으로부터 CRISPR/Cas9 방법을 사용하여 수행하였다. 균주를 콜로니 PCR에 의해 정확한 통합에 대해 검사하였다. 생성되는 균주의 목록을 표 1에서 찾을 수 있다.
[표 1]
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배지 및 효모 배양 조건
플라스미드에 의한 형질전환 후에, 이 콜라이를 100 ㎎/l 암피실린이 있는 LB 플레이트상에서 증식시켰다. Cas9 + gRNA에 의한 변형 후 효모 균주의 선택을 위해서, 200 ㎎/l G418 및/또는 노르세오트리신(nourseothricin)(100 ㎎/l)이 보충된 YPD 플레이트를 사용하였다. 실시예 1 내지 3의 경우 에르고티오네인 생산에 대해 선별된 효모 균주를 20 g/l 글루코스 및 1 g/l의 히스티딘, 시스테인 및 메티오닌이 있는 합성 완전(SC) 배지에서 48시간 동안, 40 g/l 글루코스가 있는 SC에서 72시간 동안 또는 60 g/l EnPump 기질, 0.6% 시약 A가 있는 SC에서 72시간 동안 30℃ 및 250 rpm에서 증식시켰다. 세포를 24-깊은-웰 플레이트에 OD600 = 0.5로 접종하였다. 실시예 4의 경우, 에스. 세레비지아에에 의한 시간에 따른 에르고티오네인의 합성을 또한, 상기 균주를 OD600 = 0.5로 접종하고 설정된 시간 간격(하루에 8 및 24시간마다)으로 배양물의 샘플을 채취함으로써 조사하였다. 사용된 배지는 40 g/l 글루코스가 있는 SC 배지였으며, 에르고티오네인 역가에 대한 전구체 보충의 효과를 분석하기 위해서 다양한 농도의 히스티딘, 시스테인 및 메티오닌이 보충되었다. 실시예 6 내지 10의 경우, 에르고티오네인 생산에 대해 선별된 에스. 세레비지아에를 7.5 g/L (NH4)2SO4, 14.4 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4.7H2O, 적합한 생육 인자, 60 g/L EnPump 200 기질 및 0.6% 시약 A를 함유하는 미네랄 배지에서 72시간 동안 30℃ 및 250 rpm에서 증식시켰다. 실시예 6 및 10의 경우, 세포를 96-깊은-웰 플레이트에 OD600 = 0.1로 접종하였다. 실시예 7 내지 9의 경우, 세포를 24-깊은-웰 플레이트에 OD600 = 0.1로 접종하였다. 실시예 11의 경우, 에르고티오네인 생산에 대해 선별된 에스. 세레비지아에 및 야로위아 리포리티카를 20 g/L 글루코스가 있는 SC 배지 또는 60 g/L EnPump 기질 및 0.6% 시약 A가 있는 SC 배지에서 72시간 동안 30℃ 및 250 rpm에서 증식시켰다. 세포를 96-깊은-웰 플레이트에 OD600 = 0.1로 접종하였다.
β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌 내성 균주(HIS1 돌연변이 균주)의 생성
히스티딘 과잉생산 균주를 생성시키기 위해서, 10 OD600 단위의 ST8972를 YNB - 아미노산 - (NH4)2SO4 + 프롤린 + 0.25 mM β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌을 함유하는 플레이트상에 도말하였다. 5 내지 7일 후에, 30개의 콜로니를 채집하고 7.5 g/L (NH4)2SO4, 14.4 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4.7H2O, 적합한 생육 인자, 20 g/L 글루코스 및 30 mM 히스티딘을 함유하는 미네랄 배지에서 선별하였다. 증식되지 않은 콜로니를 7.5 g/L (NH4)2SO4, 14.4 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4.7H2O 및 20 g/L 글루코스를 함유하는 미네랄 배지에서 히스티딘 및 에르고티오네인 생산에 대해 선별하였다. 세포를 24-깊은-웰 플레이트에 OD600 = 0.1로 접종하고 72시간 동안 30℃ 및 250 rpm에서 배양하였다. 콜로니 3을 ST9687로서 사용하기 위해 선택하였다.
HPLC 분석
에르고티오네인 및 히스티딘을 HPLC에 의해 정량분석하였다. 에르고티오네인의 세포내 및 세포외 농도를 문헌[Alamgir et al., 2015]의 방법에 기반하여 상등액 중의 에르고티오네인의 측정 및 세포로부터 에르고티오네인의 추출에 의해 별도로 측정하였다. 1 ㎖의 발효 브로쓰 샘플을 3000 x g에서 5분간 원심분리시키고 상등액을 제거하고 세포외 에르고티오네인의 분석시까지 -4℃에서 보관하였다. 잔여 세포 펠릿을 MilliQ 수로 2회 세척하고 이어서 1 ㎖ 수에 재현탁시켰다. 상기 세포를 94℃에서 10분간 비등시키고 이어서 DVX-2500 Multi-Tube 진탕기(VWR)를 사용하여 1600 rpm에서 30분간 와동시켰다. 10,000 x g에서 5분간 원심분리 후에, 상등액을 채취하고 HPLC를 사용하여 세포내 ERG 농도에 대해 분석하였다. 총 에르고티오네인 농도를, 상기 샘플의 비등 전에 상기 브로쓰로부터 세포를 분리시키지 않고 측정하였다. 전체 샘플(발효 브로쓰 및 세포)을 상기 비등, 와동 및 원심분리에 대해 상술한 바와 같이 처리하였다. 원심분리 후에, 상등액을 채취하여 HPLC에 의해 전체 에르고티오네인 농도를 분석하였다. HPLC 분석을 위해서, 분석 소프트웨어 Chromeleon과 함께 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템을 사용하였다. 샘플을 Cortects UPLC T3 역상 컬럼(입자 크기 1.6 ㎛, 기공 크기 120 Å, 2.1 x 150 ㎜)상에서 실행시켰다. 유량은 0.3 ㎖/분이었으며, 0.1% 포름산 2.5분으로 시작하여, 0.5분 동안 3분째에 70% 아세토니트릴, 30% 0.1% 포름산까지 진행하고, 그 후에 100% 0.1% 포름산을 4 내지 9분간 실행시켰다. 에르고티오네인이 254 ㎚의 파장에서 검출되었다.
프로피디움 요오다이드 염색 및 유식 세포측정 분석
세포 배양물 1 ㎖ 샘플을 효모 배양으로부터 채취하였다. 이를 포스페이트-완충된 염수(PBS)로 2회 세척하고, 후속적으로 PBS 중의 0.5 ㎍/㎖ 프로피디움 요오다이드 중에 재현탁시키고, 실온에서 20분간 배양하였다. 배양 후에, 세포를 PBS로 2회 세척하고 이어서 PI 염색된 세포의 백분율을 MACSQuant VYB 시스템을 사용하여 측정하였다. 분석을 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
에르고티오네인의 모의 유가배양 생산
용액 및 배지: 미량 금속 용액은 4.5 g/L CaCl2·2H2O, 4.5 g/L ZnSO4·7H2O, 3 g/L FeSO4·7H2O, 1 g/L H3BO3, 1 g/L MnCl2·4H2O, 0.4 g/L Na2MoO4·2H2O, 0.3 g/L CoCl2·6H2O, 0.1 g/L CuSO4·5H2O, 0.1 g/L KI 및 15 g/L EDTA를 함유하였다. 비타민 용액은 50 ㎎/L 비오틴, 200 ㎎/L p-아미노벤조산, 1 g/L 니코틴산, 1 g/L Ca-판토테네이트, 1 g/L 피리독신-HCl, 1 g/L 티아민-HCl 및 25 g/L 미오-이노시톨을 함유하였다. 모의 유가배양 배지는 7.5 g/L (NH4)2SO4, 14.4 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4, 1 g/L 효모 추출물, 2 mL/L 미량 금속 용액, 1 ㎖/L 비타민 용액 및 200 g/L Enpump 기질로 이루어졌다. 모든 성분을 칭량하고, 수에 용해시키고, 후속적으로 사용전에 멸균 여과하였다.
에르고티오네인의 모의 유가배양 생산: ST10165(NcEgt1x2 + CpEgt2x2 + TRAR + MET14 + Δspe2)가 있는 YPD 플레이트로부터 단일 콜로니를 사용하여 13 ㎖ 예비배양 튜브 중의 7.5 g/L (NH4)2SO4, 14.4 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4.7H2O, 적합한 생육 인자 및 20 g/L 글루코스를 함유하는 5 ㎖ 미네랄 배지에 접종하였다. 상기 튜브를 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 배양하였다. 상기 밤새 배양물을 500 ㎖ 배플 진탕 플라스크 중의 2 x 50 ㎖ 미네랄 배지로 옮겼다. 이어서 상기 진탕 플라스크를 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 배양하였다. 이어서 상기 배양물을 3,000 x g에서 5분간 원심분리시켰다. 상기 세포를 25 ㎖ 멸균 MilliQ 수에 재현탁시키고 후속적으로 합하였다. 7 ㎖의 용액 중의 5, 10, 20 및 40 g/L의 세포 건조 중량에 충분한 세포를 각각 15 ㎖ Falcon 튜브로 옮기고 3,000 x g에서 5분간 원심분리하였다. 이어서 상기 세포를 7 ㎖의 모의 유가배양 배지에 재현탁시켰다. 24 깊은-웰 플레이트에서, 20개의 상이한 조건을 설정하였다. 출발 세포 건조 중량은 5, 10, 20 또는 40 g/L이고 시약 A의 농도는 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0% 또는 1.2%이었다. 각각의 이러한 조건에 대해서, 정확한 출발 세포 건조 중량을 갖는 1 ㎖의 상기 모의 유가배양 배지를 웰에 가하고, 그 후에 적합한 농도의 시약 A를 가하였다. 이어서 상기 세포를 30℃ 및 250 rpm에서 188시간 동안 배양하였다. 68 및 140시간 후에, 출발 농도와 같은 양의 시약 A를 상기 웰에 가하여 효소 활성의 손실을 피하였다. 188시간 후에, 각각의 조건에 대한 총 에르고티오네인 생산을 HPLC에 의해 분석하였다.
실시예 2 - 결과: 효모에서 에르고티오네인 생합성 경로의 통합
BLAST 검색에서 엔. 크라싸(Genbank 수탁: XP_956324.3)의 서열을 사용하여, 우리는 씨. 푸르푸레아 및 에스. 폼베에서 Egt1 상동체(Genbank 수탁: CCE33591.1 및 NP_596639.2)를 동정하였다. 유사하게, 에스. 폼베로부터 Egt2(Genbank 수탁: NP_595091.1)를 사용하여 엔. 크라싸 및 씨. 푸르푸레아에서 Egt2 상동체(Genbank 수탁: XP_001728131.1 및 CCE33140.1)를 찾았다. 엠. 스메그마티스 유전자 EgtA, EgtB, EgtC, EgtD 및 EgtE에 대한 아미노산 서열을 또한 Genbank로부터 취하였다(Genbank 수탁: AFP42520.1, WP_011731158.1, WP_011731157.1, WP_011731156.1, ABK70212.1). 상기 유전자는 모두, 게놈 DNA 추출물로부터 증폭되었기 때문에, 에스. 폼베로부터의 Egt1 및 Egt2를 제외하고, 에스. 세레비지아에에 대해 코돈-최적화된 합성 DNA 스트링으로서 생성되었다. 종합적으로, 16개의 경로 변이체가 조립되었으며, 이중 9개는 진균이고, 1개는 세균이며, 6개는 혼합 진균-세균이었다(표 2). 상기 생성된 16개의 효모 균주를 상이한 조건하에서 깊은-웰 플레이트에서 배양하고 에르고티오네인의 세포내- 및 세포외 농도를 측정하였다(도 2).
종합적으로, 상이한 조합에 대한 에르고티오네인의 생산은 0 내지 57 ㎎/L의 효모 배양물이었다. 뉴로스포라 크라싸로부터의 Egt1 및 클라비셉스 푸르푸레아로부터 Egt2(두 효소 모두 진핵생물 ERG 생합성 경로의 것이다)를 발현하는 균주 ST8461은 3개의 모든 조건에서 최고의 수행 균주 중 하나였으며 추후의 연구를 위해 선택되었다.
실시예 3 - 결과: 에르고티오네인 수송체
생성된 ERG 중 대략 절반은 세포 중에 유지되었기 때문에, 우리는 효모 세포로부터 ERG의 수출이 적어도 부분적으로 생산에 제한적일 수 있는지의 여부를 조사하였다. 0.37 ㎎/g 효모 습윤 중량의 습윤 중량 농도(SC + 20 g/l 글루코스 + 1 g/l His/Cys/Met 중에서 측정)를 가정하여, 세포 내부의 ERG의 농도는 1.75 mM이거나, 또는 브로쓰 중의 경우보다 120배 더 높을 것이다. 엠. 스메그마티스는 에르고티오네인을 세포내 농도(pg/105 CFU로 제공시)의 최대 4배 수준까지 분비하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 우리는 게놈 중에 ERG에 대한 수송체가 존재함에 틀림없을 것으로 짐작하였다. 따라서, 상기 유기체 중의 생합성 ERG 클러스터를 조사하였다. 공지된 5개의 생합성 Egt 유전자 외에도, 상기 클러스터에는 1개의 막관통 단백질이 포함되어 있으며, 우리는 상기가 ERG 수송체일 수 있다고 가정하였다. 효모에서 ERG 생산에 대한 상기 유전자 산물의 효과를 시험하기 위해, 상기 고-생산 균주 ST8461을 상기 추정 수송체 또는 인간으로부터의 공지된 에르고티오네인 수송체 SLC22A4(SCL22A4X)(Grundemann et al., 2005)를 발현하도록 조작하였다. 두 수송체 모두 모의 유가배양 배지를 사용하는 경우 역가가 약간 증가했지만(도 3), 세포내- 대 세포외 에르고티오네인 비에 변화는 관찰되지 않았다. 중요한 사실은 인간 에르고티오네인 수송체 SLC22A4X가 인간 세포에서 수입원으로 작용하지만, 여기에서 모의 유가배양 배지의 생산 역가에 약간의 영향을 보인다는 것이다.
실시예 4 - 아미노산 보충
에르고티오네인의 역가를 더욱 개선시키기 위해 에르고티오네인의 전구체 역할을 하는 3개 아미노산에 의한 배지 보충의 효과를 추가로 조사하였다. 우리는 3개의 균주, 즉 비-생산 균주(ST7574), 생산 균주(ST8461) 및 엠. 스메그마티스로부터의 에르고티오네인 수송체를 갖는 생산 균주(ST8654)를 시험하였다. 실험은 1 g/L 또는 2 g/L의 각 L-메티오닌, L-시스테인 및 L-히스티딘이 보충된 합성 완전 배지가 있는 진탕 플라스크에서 수행되었다. 바이오매스 성장 및 ERG 생산을 72시간 동안 모니터링하였다(도 3). 에르고티오네인은 주로 배양 첫 24시간 동안 축적되었으며(이는 글루코스의 기하급수적 성장에 해당한다), 이는 임의의 아미노산 보충에 관계없이 두 생산 균주 모두에서 대략 16 ㎎/L에 달하였다. 그러나, 상기 보충은 세포 생육에 영향을 미쳤으며, 이에 상응하게 1 g/L 또는 2 g/L의 아미노산이 첨가되었을 때 최종 OD는 대략 46 및 52% 더 낮았다. 에르고티오네인의 분해는 관찰되지 않았으나; 놀랍게도, 아미노산의 첨가에 따라 ERG의 세포내 대 세포외 분포에 큰 변화가 있었다. 구체적으로, 아미노산의 첨가는 정지기에서 에르고티오네인의 배출을 촉진하였다. 우리는 이것이 세포 사멸에 기인하는 것이라 가정하였다. 실제로 24시간째에 샘플링된 세포의 프로피디움 요오다이드 염색은 아미노산이 1 g/L의 농도로 첨가되었을 때 죽은 세포의 비율이 9에서 70%로 증가하는 것을 보였다(도 4 및 5).
실시예 5 - 이배체 맥주 효모에서 에르고티오네인의 생산
용액 및 배지
미량 금속 용액은 4.5 g/l CaCl2·2H2O, 4.5 g/l ZnSO4·7H2O, 3 g/l FeSO4·7H2O, 1 g/l H3BO3, 1 g/l MnCl2·4H2O, 0.4 g/l Na2MoO4·2H2O, 0.3 g/l CoCl2·6H2O, 0.1 g/l CuSO4·5H2O, 0.1 g/l KI 및 15 g/l EDTA를 함유하였다. 비타민 용액은 50 ㎎/l 비오틴, 200 ㎎/l p-아미노벤조산, 1 g/l 니코틴산, 1 g/l Ca-판토테네이트, 1 g/l 피리독신-HCl, 1 g/l 티아민-HCl 및 25 g/l 미오-이노시톨을 함유하였다. 미네랄 배지는 4.4 g/l (NH4)2SO4, 14.4 g/l KH2PO4, 0.5 g/l MgSO4, 20 g/l 글루코스, 400 ㎎/l 아르기닌, 400 ㎎/l 히스티딘, 400 ㎎/l 메티오닌, 4 ㎎/l 피리독신, 2 ㎖/l 미량 금속 용액 및 1 ㎖/l 비타민 용액으로 이루어졌다. 모든 성분을 칭량하고, 수에 용해시키고, 후속적으로 사용전에 멸균 여과하였다. 피딩 배지는 415 g/l 글루코스, 7.5 g/L (NH4)2SO4, 14.4 g/L KH2PO4, 0.5 g/L MgSO4, 7.5 g/l 아르기닌, 7.5 g/l 히스티딘, 7.5 g/l 메티오닌, 0.5 g/l 피리독신, 4 ㎖/l 미량 금속 용액, 2 ㎖/l 비타민 용액 및 1 ㎖/l 소포제로 이루어졌다. 모든 성분을 칭량하고, 약간 가열된 물로 용해시키고, 후속적으로 사용전에 멸균 여과하였다.
통제된 발효
ST8927 콜로니가 있는 YPD 플레이트의 단일 콜로니를 사용하여 13-㎖ 튜브에서 5 ㎖의 최소 배지에 접종하였다. 상기 튜브를 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 배양하였다. 상기 밤새 배양물을 500 ㎖ 배플 진탕 플라스크 중의 95 ㎖ 최소 배지로 옮겼다. 이어서 진탕 플라스크를 30℃ 및 250 rpm에서 밤새 배양하였다. 상기 농후한 배양물 40 ㎖을 사용하여 새로운 500 ㎖ 배플 진탕 플라스크 중의 60 ㎖ 미네랄 배지에 접종하였다. 2개의 진탕 플라스크를 이렇게 준비하였다. 이들 진탕 플라스크를 30℃ 및 250 rpm에서 4시간 동안 배양하였으며, 상기 두 진탕 플라스크의 내용물을 합하고, 3,000 x g에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 펠릿을 25 ㎖ 멸균수로 세척하고, 이전과 같이 재현탁하고 원심분리하였다. 상등액을 버리고 펠릿을 10 ㎖ 미네랄 배지에 재현탁하였다. 이어서 이를 사용하여 1 l 사르토리우스(Sartorius) 생물반응기에서 0.5 l 미네랄 배지에 접종하였다. 출발 OD600은 0.85였다. 교반 속도는 500 rpm으로 설정하고, 온도는 30℃에서 유지시키며, pH는 2 M KOH 및 2 M H2SO4를 사용하여 pH 5.0에서 유지시켰다. 오프-가스 중의 CO2가 50%로 감소하자마자 피딩을 시작하였다. 초기 공급 속도를 0.6 g 글루코스 h-1로 설정하였으며, 25.5 시간에 걸쳐 2.5 g 글루코스 h-1로 선형으로 증가시켰다. 그 후에, 공급을 일정하게 1.4 g 글루코스 h-1로 설정하고, 17.8시간 후에 공급 속도를 일정하게 2.9 g 글루코스 h-1로 설정하였다. 공급을 84시간째에 멈추었다. 60.5 및 75.5시간째에, 2 g (NH4)2SO4를 멸균 100 g/l 용액으로서 가하였다. 60.5 및 73.5시간째에, 0.1 g MgSO4를 멸균 50 g/l 용액으로서 가하고, 4 ㎖ 멸균 미량 금속 용액을 가하고, 2 ㎖ 멸균 비타민 용액을 가하였다.
결과
에르고티오네인을 실시예 1에서와 같이 HPLC에 의해 정량분석하였다. 세포 건조 중량 및 글루코스 농도를 문헌[Borodina et al., 2015]에서와 같이 측정하였다. 중복 생물반응기에서의 평균 데이터를 도 6에 나타낸다. 에르고티오네인의 최종 총 농도는 0.63 g/l였다.
실시예 6 - 단일 표적 변형-ST8927에서의 표적 선별에 의한 추가적인 대사 조작
실시예 1 내지 5는 에르고티오네인 생합성 경로의 대사 조작에 관한 것이다. 다음 추가의 대사 조작을 수행하여 에르고티오네인의 생산을 더욱 증가시켰다. 이후, 실시예의 실험은 실시예 11을 제외하고, SC 배지보다는 미네랄 배지(물질 및 방법에 기재된 바와 같음)를 사용하여 수행된다.
발명자는 에르고티오네인 생산을 추가로 개선시킬 수도 있는 표적을 합리적으로 선택하였다. 질소 이화산물 억제 및 질소 배경의 수송 내 표적을 전구체 S-아데노실메티오닌(SAM), 히스티딘 및 시스테인에 대한 질소 이용률을 증가시키도록 선택하였다. 더욱 또한, 일반적인 아미노산 조절을, 모든 전구체의 합성을 개선시키도록 표적화하였다. 개별적인 아미노산 생합성 경로를 또한 활성화되도록 선택하였다. 최종적으로, SAM 및 시스테인이 모두 황을 포함하므로, 황 동화 경로내 표적을 또한 선택하였다.
따라서, 하기의 경로를 추가로 변형시켰다:
·질소 이화산물 억제
·질소 화합물의 수송
·일반적인 아미노산 조절
·개별적인 아미노산 생합성 경로
·황 동화 경로
표 2에서 각 표적에 대한 유전자 편집을 균주 ST8927(NcEgt1의 2개 사본 및 CpEgt2의 2개 사본)에 삽입하고 미네랄 배지를 사용하여 96-깊은 웰 플레이트에서 선별하였다.
[표 2]
Figure pct00016
Figure pct00017
결과
29개의 표적 중 9개가 에르고티오네인 생산을 개선시켰다(도 7을 참조하시오). 이들 표적은 URE2, STR2, SPE2, ERG4의 결실 및 GCN4의 상류 개시 코돈; STP1, MET14 및 MET16의 잉여 사본의 통합; 및 히스티딘을 과잉생산하는 β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌 내성의 사용이다. ERG4 및 SPE2의 결실이 특히 유효하였다. 이들 결실은 S-아데노실메티오닌(SAM) 풀을 증가시키며 세포 팩토리에서 SAM을 요하는 다른 화합물의 생산에도 유용할 것이다.
실시예 7 - 유전자 변형의 조합 - STP1, MET14 및/또는 MET16 의 발현 또는 과발현과 조합된 히스티딘 과잉생산
실시예 6은 에르고티오네인 생산을 개선시키는 유전자 편집 중 일부가 유사한 경로로부터 유래하고 유래하거나, 표적이 상호연결된(호모시스테인은 SAM 및 시스테인의 전구체이다) 경로들을 조절함을 보였다. 따라서, 이어서 실시예 6에서 발견된 유전자 편집들이 병용시 에르고티오네인 생산을 추가로 증가시킬 수 있는지의 여부를 조사하였다.
에르고티오네인 생산 균주 ST9687(NcEgt1의 2개 사본 및 CpEgt2의 2개 사본을 가지며 β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌 내성으로 인해 히스티딘을 과잉생산한다)을 사용하여 STP1, MET14 및 MET16 유전자의 상이한 조합을 통합시켰다.
결과
도 8은 결과를 나타낸다. 히스티딘을 과잉생산하는 ST9687은 ST8927에 비해 에르고티오네인을 상당히 더 많이 생산함을 보였다. ST8927은 적어도 43 ㎎/L 에르고티오네인을 생산할 수 있었다. ST9687은 적어도 59 ㎎/L 에르고티오네인을 생산할 수 있었다. 히스티딘 과잉생산과 MET14 통합을 결합함으로써 에르고티오네인 생산(ST9929)을 가장 많이 증가시켰다. 그러나, 추가의 조합들(히스티딘 과잉생산 및 MET14 통합 외에)은 상기 생산을 추가로 증가시키지 않았다.
실시예 8 - 유전자 변형의 조합 - ERG4, SPE2, STR2 및 URE2 의 결실과 조합된 히스티딘 과잉생산 및 MET14
실시예 7은 히스티딘 과잉생산 및 MET14 통합을 갖는 균주 ST9929에서의 증가된 에르고티오네인 생산을 나타내었다. 후속적으로, ERG4, SPE2, STR2 및 URE2의 결실을 균주 ST9929 외에 가하였다.
결과
결과를 도 9에 나타낸다. ERG4 및 SPE2는 모두 히스티딘 과잉생산 및 MET14 통합과 결합시 에르고티오네인을 더욱 증가시켰다. 실시예 7 및 9는 모두 실시예 6에서 발견된 유전자 편집의 조합이 다수 전구체의 공급을 동시에 증가시킴으로써 균주 ST8927의 에르고티오네인 생산을 더욱 증가시킬 수 있음을 명백히 나타낸다.
실시예 9 - 에르고티오네인 생산에 대한 수송체의 추가 시험
10개 더 많은 수송체 편집을 시험하여 에르고티오네인 생산을 개선시켰다. 이들 수송체를 ST8927 균주(NcEgt1 및 CpEgt2의 2개 사본)에 통합시켰다.
에스. 세레비지아에로부터의 수송체 Agp2, Tpo3, Tpo4 및 Aqr1을 결실시키고; 에스. 세레비지아에의 수송체 Tpo1, 아라비도프시스 탈리아나의 OCT1 및 OCT7, 호모 사피엔스의 SLC22A12, SLC22A16 및 SLC22A32를 개별적으로 각각의 균주에 통합시켰다.
결과
에스. 세레비지아에의 TPO4의 결실은 에르고티오네인 생산을 증가시켰다. ST9691은 적어도 51 ㎎/L의 에르고티오네인을 생산할 수 있었다. 도 10을 참조하시오. 이는 스페르미딘 및 스페르민의 축적을 가장 잘 유도하여, 판토테네이트의 생산에서 SAM의 필요성을 감소시키는 것으로 이어지는 듯하다. 반대로, AQR1의 결실 및 TPO1의 통합은 에르고티오네인 생산을 감소시켰다(도 10을 참조하시오). 이로부터, TPO1의 결실이, TPO4의 결실이 에르고티오네인 생산을 증가시키는 것과 같은 이유로 에르고티오네인 생산을 증가시킨다는 결론을 내릴 수 있다. AQR1은 과잉 아미노산의 배출과 관련된 수송체이다. 따라서 AQR1의 결실에 의해 야기된 에르고티오네인 생산의 감소는 세포 밖으로의 에르고티오네인의 감소된 수송에 의해 설명될 수 있다. 따라서, AQR1의 통합은 상기 균주의 에르고티오네인 생산성을 증가시킬 수 있다.
실시예 10 - 다른 에르고티오네인 생산 효소 조합에서 표적 확인
유전자 편집이 에르고티오네인 생산에 미치는 효과를 확인하기 위해서, 실시예 6에서 발견된 유전자 편집을 또한 상이한 에르고티오네인 생산 효소를 갖는 다른 균주에 도입시켰다. 상기 유전자 편집을 모두 균주 ST8460(NcEgt1 및 SpEgt2의 1개 사본)에 도입시킨 반면, 상기 편집의 부분집합(Δerg4, Δspe2, Δstr2, Δure2, MET14 및 MET16)을 균주 ST8474(CpEgt1 및 MsEgtE의 1개 사본)에 도입시켰다.
결과
상기 모든 유전자 편집이 균주 ST8460에서 에르고티오네인 생산의 증가를 나타낸 반면(도 11A), URE2의 결실 및 MET14의 통합은 도 11B에 나타낸 바와 같이 ST8474에서 에르고티오네인 생산을 증가시키지 않았다. 이는 잠재적으로 CpEgt1 + MsEgtE의 상이한 활성에 의해 유발될 수 있으며, 전구체 공급의 상이한 요구로 이어진다.
실시예 11 - 다른 효모에서 에르고티오네인 생산
우리는 실시예 2에서 발견된 에르고티오네인 생산에 대한 최고 성능의 효소 조합이 또한 다른 효소에서도 에르고티오네인을 효율적으로 생산할 수 있음을 입증하고자 하였다. 이를 위해서, 우리는 NcEgt1 및 CpEgt2를 야로위아 리포리티카에서 강한 구성 프로모터 TEF인트론 및 GDP(두 변이 모두 제조되고 시험되었다) 하에서 발현시켰다. 에스. 세레비지아에 및 와이. 리포리티카를 비교하기 위해서 ST8461(NcEgt1 및 CpEgt2의 1개 사본) 및 2개의 와이 리포리티카 균주를 20 g/L 글루코스가 있는 SC 배지(배치 조건) 및 60 g/L Enpump 기질 + 0.6% 시약 A가 있는 SC 배지(모의 유가배양 조건)에서 배양하였다.
결과
도 12는 와이. 리포리티카가 배치 조건하에서 최대 278 ㎎/L 에르고티오네인 및 모의 유가배양 조건에서 최대 236 ㎎/L를 생산할 수 있음(에스. 세레비지아에에 의한 이들 각각의 조건에 대하 34 ㎎/L 및 78 ㎎/L에 비해)을 나타낸다. 이는 에르고티오네인이 다양한 효모에서 생산될 수 있으며 특히 와이. 리포리티카가 에르고티오네인 생산에 유망한 숙주임을 나타낸다.
실시예 12 - 에르고티오네인의 모의 유가배양 생산
우리 균주 ST10165(NcEgt1x2 + CpEgt2x2 + TRAR + MET14 + Δspe2)의 에르고티오네인 생산 능력을 조사하기 위해서, 우리는 상기 균주를 모의 유가배양 배지(1 g/L 효모 추출물 및 200 g/L Enpump 기질이 있는 미네랄 배지)에 상이한 출발 세포 건조 중량 농도로 접종하였다. 이들 각각의 출발 세포 건조 중량 조건에서 효소(시약 A)의 농도를 변화시킴으로써, 출발 세포 건조 중량 및 시약 A 농도의 조합을 최고의 에르고티오네인 생산에 대해 선별할 수 있다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 0.4% 시약 A를 갖는 40 g/L의 출발 세포 건조 중량은 1.1 g/L의 에르고티오네인 생산을 생성시켰다.
실시예 13 - 히스티딘 과잉생산 균주
에르고티오네인 생산을 증가시키기 위해서, β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌(TRA)을 사용하여 증가된 히스티딘 생산을 갖는 균주를 생성시켰다. TRA는 세포에 독성인 아미노산 유사체이다. 0.25 mM TRA를, 주요 질소원으로서 아미노산 및 암모늄 설페이트 및 프롤린이 있는 효모 질소 베이스로 제조된 플레이트에 첨가하는 경우, 세포는 (i) 경로상의 피드백 억제를 제거함으로써 히스티딘 과잉생산을 시작해야 하거나, 또는 (ii) 세포는 증식을 위해 히스티딘 수송체를 통한 TRA의 흡수를 제거할 필요가 있다. 이들 2개의 옵션 중 어느 하나가 발생하는 경우, 세포는 β-(1,2,4-트리아졸-3-일)-DL-알라닌에 내성이다(TRAR). 이어서 생성 균주를, 히스티딘 수송체에 돌연변이를 함유하는 균주 또는 히스티딘을 과잉생산하는 균주를 구별하기 위해서 독성량의 히스티딘(30 mM)을 함유하는 배지를 사용하여 선별해야 한다. 생육 균주는 돌연변이된 히스티딘 수송체를 가지며 이를 버릴 수 있다. 30 mM 히스티딘을 함유하는 배지에서 증식하지 않는 균주에서의 과잉 생산은, 문헌[Rasse-Messenguy et al. 1973]에서 TRAR 반수체와 his1-1 온도 민감성 반수체와의 교잡을 통해 입증된 바와 같이, HIS1 유전자좌의 변화에 기인한다.
이 때문에, ST8927을 TRA를 함유하는 플레이트상에 도말하여 다양한 TRA 내성 돌연변이체를 생성시켰다. 30 mM 히스티딘에서 선별 후에, 콜로니 번호 1, 2, 3, 4, 5, 10, 14, 25 및 28이 히스티딘 수송체에 돌연변이를 갖지 않는 것으로 측정되었으며 미네랄 배지에서 히스티딘 및 에르고티오네인 생산에 대해 선별될 수 있었다.
결과
도 14는 상기 선택된 콜로니의 에르고티오네인 및 히스티딘 생산을 나타낸다. ST9687 col 3은 283 ㎎/L 히스티딘을 생산할 수 있었다. 콜로니 3은 추가적인 공학적 작업에 사용되도록 선택되었다.
참고문헌
Figure pct00018
항목
1. 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포로, 상기 효모 세포는
a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
를 발현하고; 여기에서 상기 효모 세포는 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있다.
2. 1항에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 GRAS 유기체이다.
3. 1항 또는 2항에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 제1 이종 효소를 암호화하는 유전자의 적어도 2개 사본을 포함한다.
4. 1항 내지 3항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 제2 이종 효소의 적어도 2개 사본을 포함한다.
5. 1항 내지 4항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 250 ㎎/L의 히스티딘을 생산할 수 있다.
6. 1항 내지 5항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 하기 중 하나 이상을 추가로 발현하거나 과발현한다:
a. 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 MsErgT(서열번호 35) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
b. 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 HsSLC22A4(서열번호 36) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
c. 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 AtOCT1(서열번호 37) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
d. 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 ScAQR1(서열번호 39) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
e. 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 HsSLC22A16(서열번호 41) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
f. 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 HsSLC22A32(서열번호 43) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
g. 아데닐일-설페이트 키나제, 예를 들어 ScMET14(서열번호 47) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체;
h. 포스포아데노신 포스포설페이트 리덕타제, 예를 들어 ScMET16(서열번호 49) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체; 및/또는
i. 질소 화합물 수송체에 대한 전사 인자, 예를 들어 STP1(서열번호 45) 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체.
7. 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 하기의 유전자(들) 중 하나 이상에서 하나 이상의 돌연변이(들)를 추가로 포함한다
a. ScAGP2;
b. ScTPO4;
c. ScTPO3;
d. ScTPO1;
e. ScURE2;
f. ScSTR2;
g. ScERG4;
h. ScSPE2; 및/또는
i. ScGCN4, 예를 들어 GCN4의 상류 개시 코돈 중의 하나 이상의 돌연변이(들).
8. 1항 내지 7항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 에르고티오네인을 자연적으로 생산하지 않는다.
9. 1항 내지 8항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포의 속은 사카로마이세스, 피키아, 야로위아, 클루이베로마이세스, 칸디다, 로도토룰라, 로도스포리디움, 크립토코커스, 스키조사카로마이세스, 트리코스포론 및 리포마이세스로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게 상기 속은 사카로마이세스, 피키아, 야로위아 또는 클루이베로마이세스이다.
10. 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 효모 세포에서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에, 피키아 파스토리스, 코마가타엘라 파피이, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 클루이베로마이세스 락티스, 스키조사카로마이세스 폼베, 크립토코커스 알비두스, 리포마이세스 리포페라, 리포마이세스 스타르케이이, 로도스포리디움 토룰로이데스, 로도토룰라 글루티니스, 트리코스포론 풀루란 및 야로위아 리포리티카로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에, 클루이베로마이세스 마르시아누스 또는 야로위아 리포리티카이다.
11. 1항 내지 10항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제1 이종 효소는 EC 2.1.1.44, EC 1.14.99.51, EC 6.3.2.2, EC 1.14.99.50 및 EC 3.5.1.118 중에서 선택된 EC 번호를 갖고, 바람직하게 상기 EC 번호는 2.1.1.44 또는 EC 1.14.99.51이다.
12. 1항 내지 11항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제1 이종 효소는 진핵생물, 예를 들어 진균으로부터 유래된 효소이다.
13. 1항 내지 12항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제2 이종 효소는 원핵생물 또는 진핵생물, 바람직하게는 원핵생물로부터 유래된 효소이다.
14. 1항 내지 13항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제2 이종 효소는 β-라이아제 또는 헤르시닐시스테인 설폭사이드 라이아제(EC 4.4.1.-)이다.
15. 1항 내지 14항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제1 이종 효소는 뉴로스포라 크라싸, 클라비셉스 푸르푸레아, 스키조사카로마이세스 폼베, 리조푸스 스톨로니페라, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 노타툼, 스포로볼로마이세스 살모니콜라, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 카르보나리우스, 뉴로스포라 테트라스페르마, 아가리쿠스 비스포루스, 플레우로투스 오스트레아투스, 렌티눌라 에도데스 또는 그리폴라 프론도사로부터의 Egt1 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
16. 1항 내지 15항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제1 이종 효소는 NcEgt1(서열번호 2), SpEgt1(서열번호 4) 및 CpEgt1(서열번호 6), 및 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
17. 1항 내지 15항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제2 이종 효소는
- 뉴로스포라 크라싸, 클라비셉스 푸르푸레아, 스키조사카로마이세스 폼베, 리조푸스 스톨로니페라, 아스퍼질러스 니둘란스, 아스퍼질러스 니거, 페니실리움 로쿠에포르티, 페니실리움 노타툼, 스포로볼로마이세스 살모니콜라, 아스퍼질러스 오리자에, 아스퍼질러스 카르보나리우스, 뉴로스포라 테트라스페르마, 아가리쿠스 비스포루스, 플레우로투스 오스트레아투스, 렌티눌라 에도데스, 그리폴라 프론도사, 가노데르마 루시둠, 칸타렐루스 시바리우스로부터의 Egt2, 또는
- 마이코박테리움 스메그마티스, 노카르디아 아스테로이드스, 스트렙토마이세스 알부스, 스트렙토마이세스 프라디아에, 스트렙토마이세스 그리세우스, 악티노플라네스 필리피넨시스, 아스퍼질러스 푸미가투스, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 마이코박테리움 칸사시이, 마이코박테리움 인트라셀룰라레, 마이코박테리움 포르푸이툼, 마이코박테리움 울세란스, 마이코박테리움 발네이, 마이코박테리움 레프라에, 마이코박테리움 아비움, 마이코박테리움 보비스, 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 미크로티, 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스, 마이코박테리움 플레이, 로도코커스 로도크로우스(마이코박테리움 로도크로우스), 아르쓰로스피라 플라텐시스, 아르쓰로스피라 막시마, 아파니조메논 플로스-아쿠아에, 사이토네마 스페시즈, 오실라토리아 스페시즈 및 로도피타 스페시즈로부터의 EgtE; 또는
상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
18. 1항 내지 17항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제2 이종 효소는 NcEgt2(서열번호 8), SpEgt2(서열번호 10), CpEgt2(서열번호 12) 및 MsEgtE(서열번호 14), 및 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
19. 1항 내지 18항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제1 및 제2 이종 효소는
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
20. 1항 내지 19항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제1 및 제2 이종 효소는
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체이다.
21. 1항 내지 20항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 제1 및 제2 이종 효소는
iii) NcEgt1 및 NcEgt2; 또는
viii) SpEgt1 및 MsEgtE; 또는
x) CpEgt1 및 SpEgt2
가 아니다.
22. 1항 내지 21항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 에르고티오네인 수송체, 임의로 MsErgT(서열번호 35) 또는 HsSLC22A4(서열번호 36)와 같은 이종 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체를 추가로 발현하거나 과발현한다.
23. 1항 내지 22항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 에르고티오네인의 적어도 일부를 분비할 수 있다.
24. 1항 내지 23항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 서열번호 37에 제시된 바와 같은 AtOCT1, 서열번호 39에 제시된 바와 같은 ScAQR1, 서열번호 41에 제시된 바와 같은 HsSLC22A16 또는 서열번호 43에 제시된 바와 같은 HsSLC22A32와 같은 에르고티오네인 수송체 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 발현하거나 과발현한다.
25. 1항 내지 24항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 에스. 세레비지아에의 에르고티오네인 수송체를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScAGP2, ScTPO3, ScTPO4, 및/또는 ScTPO1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실, 및
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제1 및 제2 이종 효소를 수반한다.
26. 1항 내지 25항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 질소 화합물 수송체에 대한 전사 인자, 예를 들어 서열번호 45에 제시된 바와 같은 ScSTP1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 발현하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
27. 1항 내지 26항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 ScGCN4의 상류 개시 코돈 및/또는 리더 서열의 결실, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 상류 개시 코돈 및/또는 리더 서열의 결실을 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
28. 1항 내지 27항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 전사 활성제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScURE2, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실을 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
29. 1항 내지 28항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 시스테인 생합성의 시스타티오닌 감마-신타제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScSTR2, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실을 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
30. 1항 내지 29항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 히스티딘을 암호화하는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 ScHIS1 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 하나 이상의 돌연변이를 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
31. 1항 내지 30항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 S-아데노실메티오닌(SAM) 생합성에서 S-아데노실메티오닌 데카복실라제 및/또는 델타(24(24(1)))-스테롤 리덕타제를 암호화하는 유전자, 예를 들어 ScSPE2 및/또는 ScERG4, 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체의 결실을 수반하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
32. 1항 내지 31항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 서열번호 47에 제시된 바와 같은 아데닐일-설페이트 키나제(ScMET14) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 추가로 발현하거나 과발현하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
33. 1항 내지 32항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 서열번호 49에 제시된 바와 같은 포스포아데노신 포스포설페이트 리덕타제(ScMET16) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 상동체를 발현하거나 과발현하고,
i) NcEgt1 및 CpEgt2;
ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
v) SpEgt1 및 NcEgt2;
vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
x) CpEgt1 및 SpEgt2;
xi) CpEgt1 및 CpEgt2; 및
xii) CpEgt1 및 MsEgtE, 또는
상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제1 및 적어도 하나의 제2 이종 효소를 발현한다.
34. 1항 내지 33항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 총 역가로 생산할 수 있으며, 여기에서 상기 총 역가는 세포내 에르고티오네인 역가와 세포외 에르고티오네인 역가의 합이다.
35. 1항 내지 34항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 세포외 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 역가로 생산할 수 있다.
36. 1항 내지 35항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 세포내 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 역가로 생산할 수 있다.
37. 1항 내지 36항 중 어느 하나에 따른 효모 세포에서, 상기 효모 세포는 L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 합성할 수 있다.
38. 효모 세포에서 에르고티오네인의 생산 방법으로,
i) 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 제공하고, 상기 효모 세포는
a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
를 발현하며; 여기에서 상기 효모 세포는 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있고;
ii) 상기 효모 세포를 배지에서 배양하여
에르고티오네인을 수득하는 단계들을 포함한다.
39. 38항에 따른 방법에서, 효모 세포는 1항 내지 37항 중 어느 하나에 정의된 바와 같다.
40. 38항 또는 39항에 따른 방법에서, 에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 총 역가로 수득하며, 여기에서 상기 총 역가는 세포내 에르고티오네인 역가와 세포외 에르고티오네인 역가의 합이다.
41. 38항 내지 40항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 효모 세포는 GRAS 유기체이다.
42. 38항 내지 41항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 효모 세포는 에르고티오네인을 자연적으로 생산하지 않는다.
43. 38항 내지 42항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 상기 효모 세포의 속은 사카로마이세스, 피키아, 야로위아, 클루이베로마이세스, 칸디다, 로도토룰라, 로도스포리디움, 크립토코커스, 트리코스포론 및 리포마이세스로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
44. 38항 내지 43항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지아에, 피키아 파스토리스, 클루이베로마이세스 마르시아누스, 크립토코커스 알비두스, 리포마이세스 리포페라, 리포마이세스 스타르케이이, 로도스포리디움 토룰로이데스, 로도토룰라 글루티니스, 트리코스포론 풀루란 및 야로위아 리포리티카로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
45. 38항 내지 44항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 효모 세포는 제1 이종 효소를 암호화하는 제1 핵산 및/또는 제2 이종 효소를 암호화하는 제2 핵산을 포함한다.
46. 38항 내지 45항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 제1 핵산은 효모 세포의 게놈내에 또는 상기 효모 세포내에 포함된 벡터상에 포함된다.
47. 38항 내지 46항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 제2 핵산은 효모 세포의 게놈내에 또는 상기 효모 세포내에 포함된 벡터상에 포함된다.
48. 38항 내지 47항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 제1 및/또는 제2 핵산은 높은 사본수로 존재한다.
49. 38항 내지 48항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 제1 및/또는 제2 핵산은 유도성 프로모터의 조절하에 있다.
50. 38항 내지 49항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 제1 및/또는 제2 핵산은 효모 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화된다.
51. 38항 내지 50항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 효모 세포는 배지내에 에르고티오네인을 분비할 수 있다.
52. 38항 내지 51항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 배지는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 바람직하게는 L-히스티딘, 시스테인, 바람직하게는 L-시스테인, 또는 메티오닌, 바람직하게는 L-메티오닌을, 바람직하게는 적어도 0.1 g/L, 예를 들어 적어도 0.2 g/L, 예를 들어 적어도 0.3 g/L, 예를 들어 적어도 0.4 g/L, 예를 들어 적어도 0.5 g/L, 예를 들어 적어도 0.75 g/L, 예를 들어 적어도 1 g/L, 예를 들어 적어도 2 g/L의 농도로 포함한다.
53. 38항 내지 52항 중 어느 하나에 따른 방법으로, 배지로부터 에르고티오네인을 회수하는 단계를 또한 포함한다.
54. 38항 내지 52항 중 어느 하나에 따른 방법에서, 효모 세포는 L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 합성할 수 있다.
55. 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드(CpEgt1) 또는 서열번호 6에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체.
56. 서열번호 12에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드(CpEgt2) 또는 서열번호 12에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체.
57. 55항의 폴리펩티드 및/또는 56항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
58. 사카로마이세스 세레비지아에 또는 야로위아 리포리티카와 같은 효모 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화된, 57항에 따른 핵산.
59. 57항 또는 58항 중 어느 하나에 따른 핵산으로, 서열번호 7 또는 서열번호 17에 제시된 바와 같은 서열을 갖거나, 또는 서열번호 7 또는 서열번호 17에 적어도 70% 상동성을 갖는다.
60. 57항 또는 58항 중 어느 하나에 따른 핵산으로, 서열번호 5 또는 서열번호 16에 제시된 바와 같은 서열을 갖거나, 또는 서열번호 5 또는 서열번호 16에 적어도 70% 상동성을 갖는다.
61. 57항 또는 58항 중 어느 하나에 따른 핵산으로, 서열번호 11 또는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 서열을 갖거나, 또는 서열번호 11 또는 서열번호 18에 적어도 70% 상동성을 갖는다.
62. 57항 또는 58항 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터.
63. 55항 또는 56항 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 중 적어도 하나를 발현하거나 또는 57항 내지 61항 중 어느 하나에 따른 핵산 또는 62항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
64. 63항에 따른 숙주 세포로, 55항 및 56항의 폴리펩티드를 발현한다.
65. 에르고티오네인의 생산을 위한, 55항 또는 56항 중 어느 하나의 폴리펩티드, 57항 내지 61항 중 어느 하나의 핵산, 63항 또는 64항 중 어느 하나의 숙주 세포, 또는 62항의 벡터의 용도.
66. 38항 내지 54항 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 에르고티오네인.
SEQUENCE LISTING <110> Danmarks Tekniske Universitet <120> Methods for production of ergothioneine <130> P5051PC00 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2631 <212> DNA <213> Neurospora crassa <400> 1 atgccgagtg ccgaatccat gaccccaagc agtgccctcg gacagctcaa agcaactgga 60 caacatgtgc tatccaagct tcagcagcag acatcaaacg ccgatatcat cgacatccgc 120 cgcgttgctg tagagatcaa cctcaagacc gagataacct ccatgttccg acctaaagat 180 ggccctagac agctacccac cttgcttctc tacaacgaga gaggcctgca gctgttcgag 240 cgtatcacat accttgaaga gtactatctt accaatgacg agatcaaaat cctcaccaaa 300 catgcgaccg aaatggctag cttcatcccg tcaggtgcca tgatcattga gctcggaagc 360 ggaaatctgc gcaaagtaaa ccttctattg gaagccctag acaacgccgg caaggcaatt 420 gactattatg cccttgacct gtctcgggag gagctggagc gcactctcgc tcaggtacca 480 tcctacaagc acgtcaagtg ccacggtctt ctgggtacat atgacgatgg acgtgactgg 540 ctcaaggccc cagagaacat caataaacag aaatgcatct tgcacctcgg gtcaagcatt 600 ggcaacttta accgcagtga cgccgctacc tttctcaagg gctttacgga cgtccttgga 660 cccaatgaca agatgctcat tggggttgac gcttgcaatg acccggcgag ggtataccac 720 gcttacaacg acaaggttgg tattactcac gagttcatct tgaatggtct tcgcaacgcc 780 aatgaaatta tcggagagac ggccttcatc gagggcgatt ggagagtcat tggcgaatat 840 gtgtatgacg aagagggcgg cagacaccag gccttttacg cccccactcg cgacaccatg 900 gttatggggg agttgattag gtcacacgac aggatccaga tcgaacagag cctaaagtac 960 tcgaaagagg agtcagagag gctctggagc acggcgggat tggaacaagt ctcggaatgg 1020 acgtacggca acgaatatgg actccatctg cttgccaagt caaggatgtc tttcagtctc 1080 atcccttcgg tgtacgctcg cagcgcactc ccaactctgg acgactggga ggccctttgg 1140 gcgacatggg atgtcgtcac acgtcagatg cttccccagg aagagcttct ggagaagccc 1200 atcaagctcc gaaacgcctg catcttttac ctcggtcaca tcccgacctt cctcgacatc 1260 cagctcacaa agaccaccaa gcaggctccg tcagagcccg ctcacttttg caagatcttc 1320 gagcgaggca ttgatcctga tgtcgacaac ccggagctgt gtcatgcgca ctcggagatt 1380 cctgatgaat ggccgccggt ggaagaaatc ctgacctacc aggagacggt acggtcccgg 1440 ttacgcggcc tctatgcgca tggcatcgcg aatattccgc ggaatgtggg tcgggccatt 1500 tgggttgggt ttgagcacga gcttatgcat atcgagacgc tgttgtacat gatgctacag 1560 agcgacaaga cgctgatccc aacccatatt ccacggcccg actttgacaa gctcgcgagg 1620 aaggcagagt ccgagagggt tcccaatcag tggtttaaga ttccggcaca ggagatcacc 1680 atcggtttgg atgatcctga ggatggatct gatatcaaca agcattatgg ctgggacaac 1740 gagaagcctc caaggcgcgt tcaagttgct gcctttcagg ctcaagggag gccgatcacc 1800 aacgaagagt acgcgcaata tctgcttgaa aagaacatcg acaagctccc tgcctcttgg 1860 gcccgcctgg acaacgagaa cattagcaat ggaacaacaa acagcgtgag cggtcaccac 1920 agcaacagaa cctccaagca gcagctccct tcatctttcc tcgagaagac agcagtccgc 1980 acagtctacg gtctcgtgcc tctcaagcac gctctcgact ggcccgtgtt tgcctcttac 2040 gacgaacttg ccggttgcgc agcttacatg ggcggccgta ttcccacctt cgaagagacc 2100 cggagcattt acgcttacgc cgatgctctc aagaagaaga aggaagctga gagacaattg 2160 ggaaggacgg ttccggctgt taatgcccac ctaaccaaca acggcgtgga aatcactccc 2220 ccatcctctc cctcttccga gacccccgcc gagtcttcct ccccctccga cagcaacacc 2280 accctcatca ccaccgaaga cctcttctct gacctagacg gtgccaatgt cggttttcac 2340 aactggcacc ctatgcccat cacctccaaa ggcaacaccc ttgtcgggca aggcgagctc 2400 ggcggcgtgt gggaatggac ttcatcggtc ctccgcaagt gggaggggtt cgagccgatg 2460 gagctgtacc ccggctatac ggcggatttt ttcgatgaga agcacaacat tgtgctggga 2520 gggagctggg ctacgcatcc gaggattgcg gggaggaaga gctttgtgaa ttggtaccag 2580 aggaattatc cttatgcttg ggtgggggcg agagttgtta gggatttgtg a 2631 <210> 2 <211> 876 <212> PRT <213> Neurospora crassa <400> 2 Met Pro Ser Ala Glu Ser Met Thr Pro Ser Ser Ala Leu Gly Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ala Thr Gly Gln His Val Leu Ser Lys Leu Gln Gln Gln Thr Ser 20 25 30 Asn Ala Asp Ile Ile Asp Ile Arg Arg Val Ala Val Glu Ile Asn Leu 35 40 45 Lys Thr Glu Ile Thr Ser Met Phe Arg Pro Lys Asp Gly Pro Arg Gln 50 55 60 Leu Pro Thr Leu Leu Leu Tyr Asn Glu Arg Gly Leu Gln Leu Phe Glu 65 70 75 80 Arg Ile Thr Tyr Leu Glu Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Asp Glu Ile Lys 85 90 95 Ile Leu Thr Lys His Ala Thr Glu Met Ala Ser Phe Ile Pro Ser Gly 100 105 110 Ala Met Ile Ile Glu Leu Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Val Asn Leu 115 120 125 Leu Leu Glu Ala Leu 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gtgatgtgca tttttacgcc cttgacctta atgaagccga gttgcaaaaa 360 ggactgcagg agcttcgtca gactaccaat tatcagcatg ttaaggtgtc tggtatttgc 420 ggttgctttg aaagattgct acaatgtttg gacaggtttc gtagtgagcc caatagtcga 480 attagcatgt tgtacttggg tgcttcgatt ggtaattttg ataggaaatc cgcagcatca 540 tttttacgtt cgtttgccag tcgtttgaat attcatgaca accttttaat ctccttcgat 600 catagaaaca aggctgagct agtccaacta gcttacgatg atccttatcg tattactgaa 660 aaatttgaaa agaatatttt ggctagtgtc aatgcggttt ttggtgaaaa ccttttcgac 720 gaaaatgatt gggaatataa aagtgtctac gatgaagatc tcggtgttca tagggcctac 780 ttacaagcca aaaatgaagt tactgttatt aagggtccaa tgttttttca atttaaacct 840 agtcatttaa ttttgatcga agaaagttgg aagaatagcg atcaagaatg tcgtcaaatc 900 attgagaaag gtgattttaa attagtctct aagtatgaaa gtacgattgc agattactcg 960 acctatgtta ttaccaaaca atttcctgct atgcttcaac tccctcttca gccttgtcct 1020 tcgttagcag aatgggatgc tctacgcaaa gtatggcttt ttattacaaa taaattgctt 1080 aacaaagata acatgtacac cgcatggatt cctttgagac accctccaat tttttacatc 1140 ggacatgtcc ctgtttttaa tgatatttat ctcacaaaga ttgtcaaaaa caaagcaact 1200 gctaacaaaa aacatttttg ggagtggttt caacgtggta tagatccgga cattgaagat 1260 ccctccaagt gccattggca ttctgaagtt cctgaaagct ggccttctcc tgaccaactt 1320 cgtgaatacg agaaagagtc ttgggaatat catattgtaa agttgtgcaa agcaatggat 1380 gaattgtcta cttctgaaaa gagaattctc tggctttgtt acgaacatgt agccatgcat 1440 gtggagacaa ctctttacat ctacgtacag tcatttcaaa atgcaaacca gactgtatca 1500 atttgcggat cacttcctga accagctgaa aaacttacga aagctccgtt atgggtgaat 1560 gtacctgaaa cggaaattgc agttggtatg cccttgacaa cacaatacac gagtgttgga 1620 tcaaatttgc aatcatccga tcttagtgcc catgaaaata cagatgaact tttttatttt 1680 gcgtgggata atgagaaacc aatgaggaag aaactggttt ctagcttttc tattgccaat 1740 cgtccaattt ctaacggtga atatttagat tttatcaata aaaagtcaaa aacagaaagg 1800 gtgtatccaa agcaatgggc ggagattgat ggaacgcttt acatacgaac catgtacggc 1860 ttattacccc ttgacgacta cttgggttgg cctgttatga cttcatacga cgatctaaac 1920 aattatgcga gctcccaagg atgcagacta ccaactgagg atgaactgaa ctgtttttac 1980 gatcgggttc tcgagagaac 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gtgtgggaat ccagaaatgt cacgcataca acgattcatt 720 ctgaacggac tcagcaatgc caatagcgtc tacggcaagg aaatattcta cgtccctgac 780 tggcgtgtca tcggcgaata cgtctacgat gacgaaggcg gtcgccacca ggccttcatc 840 tctccgctca aagaggtcac cgccctaggg tctgtgatca aagctcacga gcgtatcaag 900 atcgagcaga gtctcaaata ctccaaggct agtgcggatg acctatggcg aaacgcaggt 960 tttcgcgaaa ctcagacctg gactcggaat ggcgagtatg gccttcatat gctccaaaga 1020 gcagacccgc ccttcagcaa agctccctct ctctacgccg ccaatactct cccttccctc 1080 tccgactggc gagccctctg gtgcgcttgg gatatcgtca ccagggccat gctccctcag 1140 caggaactca ccgagaagcc catcgagctt cgacacgcat atattttcta cctcggccat 1200 atcccgacct tcctcgatat acagcttaca aagacaagcg cctgggcccc cactagccca 1260 gtctcctacc acgccatatt cgagcgcggc atcgacccag acgttgataa ccccgagaaa 1320 tgccacgacc attctgaaat tccagatgag tggccgcccg tggaagaaat tatcgcgtac 1380 caagatcgtg tgcgggtccg tctgaccgag ctctacaagc agggcgtgca cacgattacg 1440 cgaaaagcag ctagggccat ctgggtcagt ttcgagcatg aggcgatgca cctcgagact 1500 ctattgtaca tgatgctgca gagcgataag gtcttgccac cgccacacac gggtgtgcct 1560 gattttgaga gaatggctac gaaggcgttt gaggctcgca cgcagaatat gtggttcgaa 1620 attcccgagc agactatttc tctggggacg gacgacccgg aggacgggga cgaagatgtg 1680 cactttggat gggacaatga aaagccagtg cgaagagtca aagttcatgc gcttcaggca 1740 caaggtcggc ctatcaccaa tgaagagtat gccttgtaca tctaccacac gaactcctct 1800 aaactacccg cctcttggtc gtcgtcccca tcctcttctc tttcgaatgg tgtatcccac 1860 cccagcagtc acaataaaca cattcccaca gatcttccgc actccttcct ccaaggaaag 1920 tttgtccgga cagtttacgg ccttatccct ctcagcctag ctctcgactg gcctgtccaa 1980 gcatcttacg atgaactcgc cgactgtgcg ctatggatgg gcggccgcat cccgactctg 2040 gaagaagccc gcagcatcta cgcctttgta gagtccaaaa cccaaatcgc cacgggaaat 2100 actctggtca agaaagtccc cgccgtgaac ggccatcttg taaacaacgg cgtcgaagag 2160 acaccccccc acgagtcgtc ctctgcggtc gagaacagcc tgttcatcga ccttgccggc 2220 ctgaatgttg gcttcaagag ctggaatccg gagccagtaa cttcgagtgg cacctctctg 2280 gccggacagt cctctatggg aggagtttgg gagtggacgt cctccgtttt gcgcccccat 2340 gaaggtttcc accccatgga gctgtaccct 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tagctgttag accagaatta 660 gctgaaagat tacaaccaag aattccacca tctgattggc caatcccaat gtctgttttg 720 gaaaaattgg aattaggtga gcataacgct gctgctagag ttggtttttc tgttgctgtg 780 ggtgaacatc tcgcagctgg accaactgct gtcagggaaa gattagctga agttggtaga 840 ttatctaggc aagtcttggc tgaagttgat ggatggagag tcgtcgaacc agttgatcaa 900 ccaactgcaa ttactacttt agaatctacc gatggtgcag atccagcttc tgttagatct 960 tggttaatcg ctgaaagagg tattgttact actgcttgtg agttggctag agctccattt 1020 gaaatgagaa ctccagtcct gagaatttct ccacatgttg acgttacagt tgatgaatta 1080 gaacaatttg ctgcagcttt gagagaagct ccatga 1116 <210> 20 <211> 392 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 20 Met Ala Glu Asn Asn Val Tyr Gly His Glu Met Lys Lys His Phe Met 1 5 10 15 Leu Asp Pro Asp Tyr Val Asn Val Asn Asn Gly Ser Cys Gly Thr Glu 20 25 30 Ser Leu Ala Val Tyr Asn Lys His Val Gln Leu Leu Lys Glu Ala Gln 35 40 45 Ser Lys Pro Asp Phe Met Cys Asn Ala Tyr Met Pro Met Tyr Met Glu 50 55 60 Ala Thr Arg Asn Glu Val Ala Lys Leu Ile Gly Ala Asp Ser Ser Asn 65 70 75 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Ile Gly Gly Glu Glu Lys Ile Gln Gln Tyr Cys His Glu Ile Ala 290 295 300 Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile Ser Lys Glu Leu Gly Thr Ser Phe Ile 305 310 315 320 Lys Pro Pro Tyr Pro Val Ala Met Val Asn Val Glu Val Pro Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Glu Thr Gln Lys Val Phe Trp Pro Lys Tyr Asn 340 345 350 Thr Phe Leu Arg Phe Met Glu Phe Lys Gly Lys Phe Tyr Thr Arg Leu 355 360 365 Ser Gly Ala Val Tyr Leu Glu Gln Ser Asp Phe Tyr Tyr Ile Ala Lys 370 375 380 Val Ile Lys Asp Phe Cys Ser Leu 385 390 <210> 21 <211> 392 <212> PRT <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 21 Met Ala Glu Asn Asn Val Tyr Gly His Glu Met Lys Lys His Phe Met 1 5 10 15 Leu Asp Pro Asp Tyr Val Asn Val Asn Asn Gly Ser Cys Gly Thr Glu 20 25 30 Ser Leu Ala Val Tyr Asn Lys His Val Gln Leu Leu Lys Glu Ala Gln 35 40 45 Ser Lys Pro Asp Phe Met Cys Asn Ala Tyr Met Pro Met Tyr Met Glu 50 55 60 Ala Thr Arg Asn Glu Val Ala Lys Leu Ile Gly Ala Asp Ser Ser Asn 65 70 75 80 Ile Val Phe Cys Asn Ser Ala Thr Asp Gly Ile Ser Thr Val Leu Leu 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ccatggaaca gttcttcacc gcgagcggta ccgccgaggc cggcgccgcg 480 atgatgacgg caaccgcgtc ggtgcaggtc aacctggatg ccggtccgcg cgacggctgg 540 gccgagcggg tccggttggc acatgcgctg gggcccacga tgatcgcgat caccgccaac 600 tcaccgatgc tgggtggaca gttcacgggc tggtgttcga cgcggcaacg cgtgtggggg 660 cagctcgact cggcgcggtg cgggccggtg ctgggtgtgg acggcgacga tcccgcctcc 720 gaatgggcgc gctacgcgct gcgcgcgccg gtgatgctgg tgaactctcc ggacgcggtg 780 cccgtgacca actgggtgcc gttcgcggac tgggccgacg ggcgcgccgt gctgggtgga 840 cgcagaccga ccgaggccga cctggactat cacctgacga cgctgttccc gccggtgcgg 900 ccgcgccgct ggctggagat ccgctatctc gacagcgtgc ccgacgcgct gtggccggcc 960 gctgtgttca ccctcaccac attgctcgac gatcccgtcg cggccgaaag tgccgctgag 1020 gcaacacgtc cagtcgccac agcctgggac cgcgccgcgc ggatgggcct gacggaccga 1080 catctgcaca ccgcggccct gacgtgcgtg cgcctcgcgg cggagcgggc accggccgag 1140 ctcgaggaat cgatgacgct gttgatgcgt tcggtccagc agaggcgtag tcccgccgac 1200 gacttctcgg accgggtggt ggcacgtgga atcgcagccg ccgtccggga actggcgaaa 1260 ggtgagcttt ga 1272 <210> 23 <211> 1272 <212> DNA <213> Mycolicibacterium smegmatis <400> 23 atggctttgc cagctagatc tgattctggc tgtgccgttc cagtcgagtt cacttctgct 60 gaacaagctg ctgcccatat tggtgctaac tctttacaag atggtccaat tggtcgtgtt 120 ggtctggaaa ttgaagctca ctgtttcgat ctgtctaatc caactcgtag accatcttgg 180 gatgaattgt ctgctgtcat tgctgatgtt cctccattgc caggaggttc tagaataaca 240 gtggaacccg gaggtgcagt tgaattgtct ggtccaccat atgatggtcc attggctgct 300 gttgctgctt tacaagctga cagggccgtc ttgagggctg aatttgctag aagaaattta 360 ggcttggtct tgttaggtac agatccattg agaccaacga gaagagtgaa cccaggtgct 420 agatattctg ctatggagca gttcttcact gcatcaggta ctgctgaggc tggtgccgct 480 atgatgactg ctactgcatc tgtccaagtt aatttggatg ctggtccaag agatggttgg 540 gccgagagag ttagattggc tcatgcttta ggtcccacca tgatcgccat tactgctaat 600 tctccaatgc taggtggtca atttaccggt tggtgttcta caagacaaag agtttggggg 660 caattggatt ctgctagatg tggtcccgtt ttaggtgttg atggcgacga tccagcctca 720 gaatgggcca gatatgcttt gagagctcca gtgatgttag tgaattctcc agatgctgta 780 ccagttacta actgggtccc attcgctgat tgggctgatg ggagagctgt cttgggtggt 840 agaagaccaa ctgaagctga cttggattat catttaacta ctttatttcc tccagttagg 900 ccacggagat ggttagaaat tagatattta gactcggttc ccgacgcttt atggccagct 960 gcagttttca ctttaactac tttgttggat gatccagttg cagcagaatc tgctgcggaa 1020 gctactagac cagtagctac tgcttgggat cgtgctgcta gaatgggttt aactgataga 1080 catttacaca ccgcggcttt aacttgtgta agattagctg ctgaaagagc tccggctgaa 1140 ttggaagaat ctatgacatt attaatgaga tctgttcaac aaagacggtc accagctgat 1200 gatttttccg atagagttgt tgctaggggt atcgctgccg cagttagaga attggcaaaa 1260 ggtgaattgt ga 1272 <210> 24 <211> 425 <212> PRT <213> Mycolicibacterium smegmatis <400> 24 Met Val Met Ala Leu Pro Ala Arg Ser Asp Ser Gly Cys Ala Val Pro 1 5 10 15 Val Glu Phe Thr Ser Ala Glu Gln Ala Ala Ala His Ile Gly Ala Asn 20 25 30 Ser Leu Gln Asp Gly Pro Ile Gly Arg Val Gly Leu Glu Ile Glu Ala 35 40 45 His Cys Phe Asp Leu Ser Asn Pro Thr Arg Arg Pro Ser Trp Asp Glu 50 55 60 Leu Ser Ala Val Ile Ala Asp Val Pro Pro Leu Pro Gly Gly Ser Arg 65 70 75 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gctgcccgag 240 gacgatccgg gcttccggtt cgcgctggtg atcagccacg agaaccagca cgacgagacc 300 atgctgcagg cactcaacct gcgcgagggc ccacccctgc tcgacaccgg aattcccctg 360 cccgcgggca ggccaggcgt ggcaggcacg tcggtgctgg tgccgggcgg cccgttcgtg 420 ctcggggtcg acgcgctgac cgaaccgcac tcactggaca acgaacggcc cgcccacgtc 480 gtggacatcc cgtcgttccg gatcggccgc gtgccggtca ccaacgccga atggcgcgag 540 ttcatcgacg acggtggcta cgaccaaccg cgctggtggt cgccacgcgg ctgggcgcac 600 cgccaggagg cgggcctggt ggccccgcag ttctggaacc ccgacggcac ccgcacccgg 660 ttcgggcaca tcgaggagat cccgggtgac gaacccgtgc agcacgtgac gttcttcgaa 720 gccgaggcct acgcggcgtg ggccggtgct cggttgccca ccgagatcga atgggagaag 780 gcctgcgcgt gggatccggt cgccggtgct cggcgccggt tcccctgggg ctcagcacaa 840 cccagcgcgg cgctggccaa cctcggcggt gacgcacgcc gcccggcgcc ggtcggggcc 900 tacccggcgg gggcgtcggc ctatggcgcc gagcagatgc tgggcgacgt gtgggagtgg 960 acctcctcgc cgctgcggcc gtggcccggt ttcacgccga tgatctacga gcgctacagc 1020 acgccgttct tcgagggcac cacatccggt gactaccgcg tgctgcgcgg cgggtcatgg 1080 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tgcaatcagt tctggtgttg tcggggactt cactttgaag 660 catgaaagag gtacatttgt tggcgccacc tcagggtttg ttttactggg tcaatgtttt 720 ggtagtctta ttggtgccgt cctgactgca aggtgggatt ggagagctat cttttggttt 780 ttgaccattg gttgtggaag ttgttttcta attgcctttc ttattttgcc agaaacaaag 840 cgaaccattg caggtaacct ttccattaag cctaaaagat tcatcaacag agcgccgatt 900 ttcctactgg gcccagttag aaggagattc aagtacgata atcctgatta tgagacatta 960 gatcccacca ttccgaaact agatttgtca tccgccggga agatccttgt attgccagaa 1020 attattctgt ctttatttcc atcagggctc ttatttgcta tgtggacgtt aatgctttcc 1080 tctatttcat ccggtttatc agtggcgcca tacaactatc atttggtcat tattggtgtg 1140 tgttatctac ccggtggtat tggcggttta atgggttcct tcttcacagg tagaattatt 1200 gacatgtatt tcaagagaaa gatcaagaaa ttcgagcaag acaaagctaa cgggttgatt 1260 ccacaagacg cagagattaa tatgttcaaa gtccgtttag tttgtcttct gccccaaaat 1320 ttcttggccg tcgtagccta tcttttattt ggttggagta tagataaggg ctggaggatc 1380 gaatctattt taattacttc atttgtctgt tcatactgtg ctatgagtac attatcaaca 1440 tcaactacgt tattggtcga tttgtaccca acgaaatcat ctacagcaag tagttgtttc 1500 aactttgtta ggtgcagttt gagtaccatc ttcatgggtt gctttgccaa aatgaaagct 1560 gcgatgactg taggtggtac ttttacattt ttatgtgcgc tggtattttt cttcaacttc 1620 ttaatgttta ttccgatgaa atatggtatg aagtggaggg aggatagatt attgaaacaa 1680 caaagacagt cttggttaaa caccttggca gtcaaagcca aaaagggaac aaaaagagac 1740 cagaacgata atcataatta a 1761 <210> 41 <211> 577 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Gly Ser Arg His Phe Glu Gly Ile Tyr Asp His Val Gly His Phe 1 5 10 15 Gly Arg Phe Gln Arg Val Leu Tyr Phe Ile Cys Ala Phe Gln Asn Ile 20 25 30 Ser Cys Gly Ile His Tyr Leu Ala Ser Val Phe Met Gly Val Thr Pro 35 40 45 His His Val Cys Arg Pro Pro Gly Asn Val Ser Gln Val Val Phe His 50 55 60 Asn His Ser Asn Trp Ser Leu Glu Asp Thr Gly Ala Leu Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gly Gln Lys Asp Tyr Val Thr Val Gln Leu Gln Asn Gly Glu Ile Trp 85 90 95 Glu Leu Ser Arg Cys Ser Arg Asn Lys Arg Glu Asn Thr Ser Ser Leu 100 105 110 Gly Tyr Glu Tyr Thr Gly Ser Lys Lys Glu Phe Pro Cys Val Asp Gly 115 120 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attatttgtt ggtactatgg ctttgttgtc cggtgttttg 1560 actcttaaat tgcccgaaac tctaggtaaa agattggcta ccacttggga ggaagctgct 1620 aaattggaat ctgaaaatga atctaaatca agcaaattat tgctaactac taacaattct 1680 ggtttagaga aaactgaagc tattactcca agagattctg gtttgggtga ataa 1734 <210> 43 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Gly Trp Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Pro Arg Pro Pro Ile His 1 5 10 15 Gln Gln Pro Pro Glu Arg Arg Val Val Thr Val Val Phe Leu Gly Leu 20 25 30 Leu Leu Asp Leu Leu Ala Phe Thr Leu Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly 35 40 45 Leu Leu Glu Ser His Gly Arg Ala His Asp Pro Leu Tyr Gly Ser Trp 50 55 60 Gln Gly Gly Val Asp Trp Phe Ala Thr Ala Ile Gly Met Pro Val Glu 65 70 75 80 Lys Arg Tyr Asn Ser Val Leu Phe Gly Gly Leu Ile Gly Ser Ala Phe 85 90 95 Ser Val Leu Gln Phe Leu Cys Ala Pro Leu Thr Gly Ala Thr Ser Asp 100 105 110 Cys Leu Gly Arg Arg Pro Val Met Leu Leu Cys Leu Met Gly Val Ala 115 120 125 Thr Ser Tyr Ala Val Trp Ala Thr Ser Arg Ser Phe Ala Ala Phe Leu 130 135 140 Ala Ser Arg Leu 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Gly Leu Thr Gly Leu Val Thr Ile Asp Met Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Ser Glu Lys Tyr Tyr Met Pro Glu Leu Leu Phe Ile Asp Thr Leu His 65 70 75 80 His Phe Pro Gln Thr Leu Thr Leu Lys Asn Glu Ile Glu Lys Lys Tyr 85 90 95 Tyr Gln Pro Lys Asn Gln Thr Ile His Val Tyr Lys Pro Asp Gly Cys 100 105 110 Glu Ser Glu Ala Asp Phe Ala Ser Lys Tyr Gly Asp Phe Leu Trp Glu 115 120 125 Lys Asp Asp Asp Lys Tyr Asp Tyr Leu Ala Lys Val Glu Pro Ala His 130 135 140 Arg Ala Tyr Lys Glu Leu His Ile Ser Ala Val Phe Thr Gly Arg Arg 145 150 155 160 Lys Ser Gln Gly Ser Ala Arg Ser Gln Leu Ser Ile Ile Glu Ile Asp 165 170 175 Glu Leu Asn Gly Ile Leu Lys Ile Asn Pro Leu Ile Asn Trp Thr Phe 180 185 190 Glu Gln Val Lys Gln Tyr Ile Asp Ala Asn Asn Val Pro Tyr Asn Glu 195 200 205 Leu Leu Asp Leu Gly Tyr Arg Ser Ile Gly Asp Tyr His Ser Thr Gln 210 215 220 Pro Val Lys Glu Gly Glu Asp Glu Arg Ala Gly Arg Trp Lys Gly Lys 225 230 235 240 Ala Lys Thr Glu Cys Gly Ile His Glu Ala Ser Arg Phe Ala Gln Phe 245 250 255 Leu Lys Gln Asp Ala 260 <210> 50 <211> 786 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 50 atgaagacct atcatttgaa taatgatata attgtcacac aagaacagtt ggatcattgg 60 aatgaacaac taatcaagct ggaaacgcca caggagatta ttgcatggtc tatcgtaacg 120 tttcctcacc ttttccaaac cactgcattt ggtttgactg gcttggttac tatcgatatg 180 ttgtcaaagc tatctgaaaa atactacatg ccagaactat tatttataga cactttgcac 240 catttcccac aaactttaac actaaaaaac gagattgaga aaaaatacta ccagcctaaa 300 aatcaaacca ttcacgtata taagccggat ggatgtgaat cggaggcaga ttttgcctcg 360 aaatacgggg atttcttatg ggagaaagat gatgacaagt acgattatct ggccaaagtg 420 gaacctgcac atcgtgccta caaagagcta catataagtg ctgtgtttac tggtagaaga 480 aaatcacaag gttctgcccg ctcccaactg tcgattattg aaatagacga acttaatgga 540 atcttaaaaa taaatccatt gatcaattgg acgttcgagc aggttaaaca gtatatagat 600 gcaaacaatg taccatacaa cgaacttttg gaccttggat atagatccat tggtgattac 660 cattccacac aacccgtcaa ggaaggtgaa gatgagagag caggaagatg gaagggcaag 720 gccaagaccg agtgtggaat tcatgaagcc agccgattcg cgcaattttt aaagcaagat 780 gcctag 786 <210> 51 <211> 3801 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 51 atgtcgaata taagtaccaa agatatacga aaaagtaagc caaaaagagg atccggcttc 60 gatttacttg aagtgactga atcacttggc tatcagacac acaggaaaaa tggaagaaac 120 tcatggtcaa aggacgacga taatatgcta cgatcgctag taaacgaatc cgcaaaggag 180 ttaggctatg agaatggact tgaagacgta aaaacaattc aacaatccaa ccatctttct 240 aaatgtattg cttgggatgt tttagctaca cgattcaaac acaccgtaag aacttcaaag 300 gatgtaagaa agcgttggac aggatctctg gacccaaact tgaagaaagg taaatggaca 360 caagaagagg atgagcagct cttgaaagct tatgaagaac atgggcctca ctggctgagt 420 atctccatgg atatccctgg aagaacagag gatcaatgtg cgaaaaggta cattgaagtg 480 ttgggacctg gaagtaaagg tagattaaga gaatggacgc tcgaggaaga tttaaatctg 540 ataagtaaag tgaaggcata cggcacgaaa tggagaaaga tttcgtcgga aatggaattc 600 agaccaagtt taacgtgcag gaacagatgg cggaaaatta ttactatggt tgtgcgagga 660 caagcatcag aagtaataac aaaggctata aaagaaaaca agaacataga catgacagac 720 ggaaaactcc gacaacatcc aatcgccgat tctgatatac gctcagattc tacaccgaat 780 aaagaagaac agttgcagct atctcaacag aacaaccctt cattgataaa gcaggatata 840 ttgaatgtta aagagaacga atcgagcaaa ctaccaagat taaaggataa tgatggaccc 900 attttaaatg acagcaagcc acaagcatta cctcccttaa aagagatatc tgcacctcca 960 ccaatcagga tgacgcaagt cggtcagact cacaccagtg gtagcattag gagcaaagta 1020 tctttaccaa ttgaaggtct ttctcaaatg aacaagcaaa gtcctggagg aatctcagat 1080 agcccacaga caagccttcc cccagcattc aatccagcat ctctcgatga gcatatgatg 1140 aatagtaata gtatttcaga ttctccgaag cacgcctatt ctactgtgaa aactagagaa 1200 ccaaattcct ctagcacaca atggaaattt acattaaaag atggtcaagg tttgtcaatt 1260 tctaacggaa ctattgacag cacaaaatta gtaaaagaat tggttgacca agctaagaag 1320 tactctttaa aaatttcgat acatcaacat attcacaatc attatgttac atccacagac 1380 catcctgtca gcagcaatac tggattgtca aatataggaa atataaatgg aaaccctcta 1440 ttaatggata gtttcccaca tatgggtaga caactgggaa atggtcttcc agggttaaat 1500 tcaaatagtg acacttttaa cccagaatat aggacttctc tggacaacat ggatagcgat 1560 tttttatcaa gaacacccaa ctataacgca ttcagcttgg aagcaacttc acacaatccc 1620 gctgacaatg caaatgaact tggttcacaa agcaatagag aaacaaacag cccgtctgta 1680 ttttatcctc aagcaaatac attgatccca actaattcta ccgctacaaa taatgaaatc 1740 attcaaggaa acgttagtgc taatagtatg tcaccgaatt tcaatggaac aaatggcaag 1800 gcaccaagtt cgacggcatc atatacaacg agcggttcag aaatgccacc tgatgtaggt 1860 cctaatagaa tagcgcattt caactatttg ccaccaacta tacggcctca tttaggctca 1920 tcagatgcga caagaggtgc tgacttgaat aagttactca atccatctcc aaattcagta 1980 agaagtaacg gcagtaaaac taagaaaaaa gaaaaaagaa aaagtgaatc atctcagcat 2040 cattctacat catctgtgac aatcaataaa ttcaatcaca ttgatcagtc ggagatatca 2100 aggactacat ccagatcccc cgggatgatg gaagaattct cgtacgatca cgattttaac 2160 acacattttg ctacagattt ggattatttg caacatgacc aacaacaaca acagcaacaa 2220 catgatcaac aacataatca acagcaacaa ccacaaccac aaccaattca aactcaaaac 2280 ctggagcacg accacgacca acatactaat gatatgagtg cttcatcgaa tgcatcagat 2340 agtggacctc agaggcccaa gaggactcgc gcaaagggtg aagcactaga tgtcctaaag 2400 cgtaaatttg aaataaatcc aacaccctct ttggtagaaa gaaagaaaat atcagatctg 2460 ataggaatgc ctgaaaaaaa 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attcatgaat tctctaattc tagactataa atcatcgaat 3360 gaaatattac ctacgatcaa tacagcgatc cccactgctg cagttccaca acagaatatt 3420 gcccctccct ttctgaatac aaattcaagt gcaacagact caaatccaaa tacaaattta 3480 gaagattctc tcttcttcga tcatgatctg ttatcgagtt cgataaccaa caccaacaac 3540 ggacaaggct ctaataatgg acgtcaagct agcaaggatg atacgctcaa tttactggat 3600 actaccgtca acagcaataa caatcataat gctaataatg aggagaatca tctagcgcaa 3660 gaacatttat ccagcgatgc tgatattgtt gcaaatccaa atgatcattt gttgtcttta 3720 ccgactgata gtgaacttcc aaatactcca gattttttga agaacactaa cgaactaact 3780 gacgagcata gatggatatg a 3801

Claims (15)

  1. 에르고티오네인(ergothioneine)을 생산할 수 있는 효모 세포(yeast cell)로서,
    a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
    b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
    를 발현하고; 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있는 효모 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 크립토코커스 알비두스(Cryptococcus albidus), 리포마이세스 리포페라(Lipomyces lipofera), 리포마이세스 스타르케이이(Lipomyces starkeyi), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 트리코스포론 풀루란(Trichosporon pullulan) 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에, 클루이베로마이세스 마르시아누스 또는 야로위아 리포리티카인 효모 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 및 제2 이종 효소가
    i) NcEgt1 및 CpEgt2;
    ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
    iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
    iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
    v) SpEgt1 및 NcEgt2;
    vi) SpEgt1 및 SpEgt2;
    vii) SpEgt1 및 CpEgt2;
    viii) SpEgt1 및 MsEgtE;
    ix) CpEgt1 및 NcEgt2;
    x) CpEgt1 및 SpEgt2;
    xi) CpEgt1 및 CpEgt2;
    xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
    또는 상기에 적어도 70% 상동성(homology), 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체(functional variant)인 효모 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 이종 효소가
    i) NcEgt1 및 CpEgt2;
    ii) NcEgt1 및 SpEgt2;
    iii) NcEgt1 및 NcEgt2;
    iv) NcEgt1 및 MsEgtE;
    xii) CpEgt1 및 MsEgtE,
    또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 기능성 변이체인 효모 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    에르고티오네인 수송체(transporter), 임의로 이종 에르고티오네인 수송체, 예를 들어 MsErgT(서열번호 35) 또는 HsSLC22A4(서열번호 36) 또는 상기에 적어도 70% 상동성, 예를 들어 상기에 적어도 71%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 73%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 75%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 77%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 79%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 81%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 83%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 87%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 89%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99% 상동성을 갖는 이의 변이체를 추가로 발현하거나 과발현(overexpressing)하는 효모 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    에르고티오네인을 적어도 1 ㎎/L, 예를 들어 적어도 2 ㎎/L, 예를 들어 적어도 3 ㎎/L, 예를 들어 적어도 4 ㎎/L, 예를 들어 적어도 5 ㎎/L, 예를 들어 적어도 6 ㎎/L, 예를 들어 적어도 7 ㎎/L, 예를 들어 적어도 8 ㎎/L, 예를 들어 적어도 9 ㎎/L, 예를 들어 적어도 10 ㎎/L, 예를 들어 적어도 11 ㎎/L, 예를 들어 적어도 12 ㎎/L, 예를 들어 적어도 13 ㎎/L, 예를 들어 적어도 14 ㎎/L, 예를 들어 적어도 15 ㎎/L, 예를 들어 적어도 20 ㎎/L, 예를 들어 적어도 25 ㎎/L, 예를 들어 적어도 30 ㎎/L, 예를 들어 적어도 35 ㎎/L, 예를 들어 적어도 40 ㎎/L, 예를 들어 적어도 45 ㎎/L, 예를 들어 적어도 50 ㎎/L, 예를 들어 적어도 100 ㎎/L, 예를 들어 적어도 150 ㎎/L, 예를 들어 적어도 200 ㎎/L, 예를 들어 적어도 300 ㎎/L, 예를 들어 적어도 400 ㎎/L, 예를 들어 적어도 500 ㎎/L, 예를 들어 적어도 600 ㎎/L, 예를 들어 적어도 700 ㎎/L, 예를 들어 적어도 800 ㎎/L, 예를 들어 적어도 900 ㎎/L, 예를 들어 적어도 1 g/L 이상의 총 역가(total titer)로 생산할 수 있으며, 상기 총 역가가 세포내 에르고티오네인 역가와 세포외 에르고티오네인 역가의 합인 효모 세포.
  7. 효모 세포에서 에르고티오네인을 생산하는 방법으로서,
    i) 에르고티오네인을 생산할 수 있는 효모 세포를 제공하고,
    상기 효모 세포가
    a) L-히스티딘 및/또는 L-시스테인을 S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제1 이종 효소; 및
    b) S-(헤르신-2-일)-L-시스테인-S-옥사이드를 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌으로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 이종 효소
    를 발현하며; 상기 효모 세포가 추가로 2-(하이드록시설파닐)-헤르시닌을 에르고티오네인으로 전환시킬 수 있는 단계;
    ii) 상기 효모 세포를 배지에서 배양하는 단계
    를 포함하고, 이에 의해 에르고티오네인을 수득하는 방법으로서, 임의로 상기 효모 세포가 GRAS 유기체인 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    효모 세포가 제1 이종 효소를 암호화하는 제1 핵산 및/또는 제2 이종 효소를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    배지가 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 히스티딘, 바람직하게는 L-히스티딘, 시스테인, 바람직하게는 L-시스테인, 또는 메티오닌, 바람직하게는 L-메티오닌을, 바람직하게는 적어도 0.1 g/L, 예를 들어 적어도 0.2 g/L, 예를 들어 적어도 0.3 g/L, 예를 들어 적어도 0.4 g/L, 예를 들어 적어도 0.5 g/L, 예를 들어 적어도 0.75 g/L, 예를 들어 적어도 1 g/L, 예를 들어 적어도 2 g/L의 농도로 포함하는 방법.
  10. 서열번호 6에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드(CpEgt1) 또는 서열번호 6에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체.
  11. 서열번호 12에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드(CpEgt2) 또는 서열번호 12에 적어도 70% 상동성을 갖는 이의 변이체.
  12. 제10항의 폴리펩티드 및/또는 제11항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로서, 임의로 사카로마이세스 세레비지아에 또는 야로위아 리포리티카와 같은 효모 세포에서의 발현에 대해 코돈-최적화(codon-optimising)되고/되거나 임의로 서열번호 7, 서열번호 17, 서열번호 5, 서열번호 16, 서열번호 11 또는 서열번호 18에 제시된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 상기에 적어도 70% 상동성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 핵산.
  13. 제12항에 정의된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터(vector).
  14. 제10항 또는 제11항에 따른 폴리펩티드 중 적어도 하나를 발현하거나, 또는 제12항에 따른 핵산 또는 제13항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포(host cell).
  15. 에르고티오네인을 생산하기 위한, 제10항 또는 제11항에 따른 폴리펩티드, 제12항에 따른 핵산, 제13항에 따른 숙주 세포 또는 제14항에 따른 벡터의 용도.
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