CN114277042A - 一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方法和应用。将从粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中克隆得到的麦角硫因合成基因egt1、egt2导入并整合到圆红冬孢酵母菌基因组中，筛选得到高产麦角硫因菌株。与出发菌株相比，该重组菌株5L发酵罐发酵麦角硫因产量比原始菌株提高270.2％，达到8.5g/L左右，为圆红冬孢酵母菌株工业化生产麦角硫因奠定了良好的基础。同时发酵周期较短，发酵产物中没有毒副作用的产物，且圆红酵母代谢途径改造难度较小，可操作性更强。

Description

一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方 法和应用

技术领域

本发明涉及基因重组领域，尤其涉及一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方法和应用。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine,EGT)最早由Tamcet于1909年从麦角菌(Clavicepspurpurea)中分离得到的一种稀有天然手性组氨酸衍生类硫醇化合物，又叫2-硫基-L-组氨酸三甲基内盐。多存在于动植物体内却不能由动物机体自身合成，只能从食物中摄入并吸收、积累、保存于机体内。同时EGT作为机体内的一种重要活性物质，具有清除自由基、帮助机体解毒、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长以及细胞免疫等多种生理作用，因而也被认为是一种特有的、多功能的细胞生理保护剂。在食品、化妆品、医药等领域应用前景广阔。

当前麦角硫因主要通过化学合成、组织提取以及生物发酵合成等方法来获取，化学合成法由于左旋麦角硫因合成困难，原料昂贵，难以达到预期的产量；提取法主要通过培养和提取如担子菌纲等生物质以获取麦角硫因，但有着生产率低、原料来源不足、培养周期长、提取方法复杂等问题；随着分子生物学及代谢工程等生物科学技术的快速发展，生物发酵合成法生产麦角硫因成为最具有潜力的生产方法。

麦角硫因生物合成途径大致可分为两种，一种是在细菌中由EgtABCDE基因簇编码的5个酶进行连续催化合成的途径；另一种是在真菌中由Egtl、Egt2两个酶催化的合成途径。生物发酵合成的改造多集中于通过基因工程手段强化参与EGT合成的关键基因表达，来获得生产能力显著提升的EGT工程菌株。再通过模式菌株高密度发酵，异源表达EGT合成所需的关键酶基因，再发酵生产EGT。例如Osawa R等将耻垢分枝杆菌(Mycolicibacteriumsmegmatis)的egt基因在大肠杆菌中进行异源表达，将基因簇中的基因拆分连接到多个质粒中，再将质粒转化进大肠杆菌中，优化表达重组酶来提高EGT产量，摇瓶发酵EGT产量达到24mg/L；在此基础上，Tanaka N等对半胱氨酸进行过表达，进行发酵罐培养，持续性补加组氨酸等前体物质，发酵216h最终获得1.3g/L EGT，这是目前利用大肠杆菌发酵生产EGT的最高产量的方法，但是，以大肠杆菌作为出发菌株，会产生内毒素，对后续产品的提纯有很大影响。Takusagawa S等通过在米曲霉(Aspergillus oryzae)中强化表达粗糙脉孢菌来源的egt1和egt2基因，将米曲霉宿主的EGT产量提升至231mg/L的水平，但是，米曲霉的发酵周期长达10天以上，麦角硫因产量低，且后续对其代谢途径的改造难度大。Steven A等利用酿酒酵母，通过异源表达麦角菌、耻垢分枝杆菌等多个来源的EGT合成酶基因(egtA、egtB、egtC、egtD、egtE)，在1L发酵罐流加分批发酵的条件下，经84h培养获得了0.598g/L的EGT产量，但在上罐放大测试中，菌株出现了明显的生长抑制和提前死亡现象，产量没有提升。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改造难度较小，产量高的高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组菌株。

为实现上述目的，本发明提供一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株，其特征在于，含有麦角硫因合成基因egt1和egt2，所述egt1的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，所述egt2的核苷酸序列为SEQ ID NO:9；菌株是圆红冬孢酵母菌。

进一步，制备方法包括，

S1，构建egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2；

S2，构建egt1-egt2双基因表达菌株。

进一步，所述S1步骤中，构建egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2的方法包括：

a.以粗糙脉孢菌基因组cDNA为模板，采用egt1-F和P2A-egt1-R引物扩增带有部分P2A序列的egt1基因、采用P2A-egt2-F和egt2-R引物扩增带有另一部分P2A序列的egt2基因；

b.通过重叠PCR，将扩增得到的带有部分P2A序列的egt1基因和带有另一部分P2A序列的egt2基因连接起来，得到egt1-P2A-egt2片段；

c.通过无缝克隆将egt1-P2A-egt2片段连接到已线性化的pCambia 1301质粒上，得到egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2。

进一步，所述egt1-F的序列如SEQ ID NO:1所示，所述P2A-egt1-R的序列为如SEQID NO:6所示，所述P2A-egt2-F的序列如SEQ ID NO:7所示，所述egt2-R的序列如SEQ IDNO:8所示。

进一步，所述S2步骤中，将egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2导入圆红冬孢酵母菌株中得到egt1-egt2双基因表达菌株。

本发明还提供所述重组表达菌株用于生产麦角硫因的用途。

本发明还提供一种生产麦角硫因的方法，所述方法包括：培养所述重组表达菌株的宿主细胞；诱导所述宿主细胞以表达编码egt1的核酸序列和编码egt2的核酸序列；收集麦角硫因。

本发明以圆红冬孢酵母为宿主，以pCambia 1301质粒作为表达载体，将粗糙脉孢菌来源的麦角硫因合成基因egt1导入圆红冬孢酵母菌中，增强了该菌株麦角硫因生物合成能力。并首次将麦角硫因合成基因egt1和egt2同时导入圆红冬孢酵母中进行异源表达，通过代谢水平验证，筛选得到高产麦角硫因的圆红冬孢酵母菌株Egt1-Egt2-8。与出发菌株相比，该egt1-egt2双基因表达菌株5L发酵罐发酵麦角硫因产量提高270.2％，达到8.5g/L左右，为圆红冬孢酵母菌株工业化生产麦角硫因奠定了良好的基础。本发明以圆红冬孢酵母作为出发菌株，发酵周期较短，发酵产物中没有毒副作用的产物，且圆红酵母代谢途径改造难度较小，可操作性更强。

附图说明

图1为PCR扩增egt1基因产物电泳图。泳道M：5000bp DNA Marker；泳道1-3：PCR扩增egt1基因产物。

图2为pCambia 1301-egt1转化大肠杆菌菌落PCR电泳图。泳道M：5000bp DNAMarker；泳道1：大肠杆菌DH5α作阴性对照；泳道2-10：egt1基因转化子。

图3为pCambia 1301-egt1质粒双酶切电泳验证图。泳道M:5000bp DNA Marker；泳道1：pCambia 1301空质粒双酶切；泳道2：pCambia 1301-egt1质粒双酶切。

图4为egt1基因表达质粒(pCambia 1301-egt1)图谱。

图5为egt1基因导入圆红冬孢酵母得到的转化子PCR验证图。泳道M：5000bp DNAMarker；泳道1：圆红冬孢酵母作阴性对照；泳道2-13：egt1酵母转化子。

图6为PCR扩增P2A-egt1、P2A-egt2电泳图。泳道M：5000bp DNA Marker；泳道1-3：P2A-egt1 PCR产物；泳道4-6：P2A-egt2 PCR产物。

图7为重叠PCR产物电泳图。泳道M：5000bp DNA Marker；泳道1-5：重叠PCR产物；

图8为pCambia 1301-egt1-P2A-egt2转化大肠杆菌菌落PCR电泳图。泳道M：5000bpDNA Marker；泳道1：大肠杆菌DH5α作阴性对照；泳道2-13：egt1-P2A-egt2基因转化子。

图9为pCambia 1301-egt1-P2A-egt2质粒双酶切电泳验证图。泳道M:5000bp DNAMarker；泳道1：pCambia 1301空质粒双酶切；泳道2-3：pCambia 1301-egt1-P2A-egt2质粒双酶切。

图10为egt1-P2A-egt2基因表达质粒(pCambia 1301-egt1-P2A-egt2)图谱。

图11为egt1-P2A-egt2基因导入圆红酵母得到的转化子PCR验证图。泳道M：5000bpDNA Marker；泳道1：圆红冬孢酵母作阴性对照；泳道2-23：egt1-P2A-egt2酵母转化子。

图12为出发菌株、egt1表达菌株Egt1-6和egt1-egt2双基因表达菌株Egt1-Egt2-8摇瓶发酵麦角硫因产量图。

图13为出发菌株、egt1表达菌株Egt1-6和egt1-egt2双基因表达菌株Egt1-Egt2-85L发酵罐发酵麦角硫因产量图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下圆红冬孢酵母(菌株编号：CGMCC 2.1389)和粗糙脉孢菌(菌株编号：CGMCC3.1615)均购自中国微生物菌种菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

实施例1：构建egt1表达质粒(pCambia 1301-egt1)

(1)设计egt1扩增引物

根据诺唯赞无缝克隆试剂

II One Step Cloning Kit说明书以及粗糙脉孢菌egt1基因序列(GenBanK：XP_956324.3，即SEQ ID NO:3)设计引物：

egt1-F：5’-ACTCTTGACCATGGTAGATCTATGCCGAGTGCCGAATCC-3’(BglⅡ)SEQ ID NO:1；

egt1-R：5’-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCACAAATCCCTAACAACTC-3’(BstEⅡ)SEQ IDNO:2。

(2)通过PCR扩增egt1基因

PCR扩增体系：2×Canace Gold PCR buffer 25μL，egt1-F 2.5μL，egt1-R 2.5μL，Hieff Canace Gold High Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，cDNA模板2μL(用Omega真菌RNA提取试剂盒(R6840-01)提取粗糙脉孢菌总RNA后，利用诺唯赞反转录试剂

III1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录得到的基因组cDNA)，ddH₂O补足至50μL。

PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸1-2min，35个循环；然后再72℃延伸5min；4℃保温。

采用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物(图1)，然后割胶并使用全式金胶回收试剂盒回收目的条带。

(3)重组质粒构建

将pCambia1301质粒用限制性内切酶BglⅡ和BstEⅡ进行双酶切，将酶切后的产物进行电泳并割胶回收，得到线性化质粒。然后通过无缝克隆，将egt1基因连接到酶切后的质粒BglⅡ和BstEⅡ酶切位点之间(诺唯赞无缝克隆试剂

II One Step CloningKit)。取连接后的产物加到100μL E.coli DH5α感受态细胞中，用枪头吹打混匀后冰浴30min；42℃水浴锅热激60S，置于冰上2min后，加入900μL LB液体培养基，37℃、200rpm培养45min，10000rpm离心1min，用枪头吸取100μL上清重悬菌体，涂布于LB(含50μg/mL kana⁺)平板上，37℃培养12h。从LB平板上挑取克隆子进行菌落PCR验证(图2)，然后挑选验证正确的菌株扩大培养并提质粒进行双酶切验证(图3)，酶切产物电泳结果显示有切出目的大小的片段，表明egt1表达质粒初步构建成功(质粒图片见图4)，再将验证正确的egt1表达质粒送公司测序，测序结果正确，该质粒构建成功。

实施例2构建egt1表达菌株

(1)制备圆红冬孢酵母感受态

挑取圆红冬孢酵母单菌落于20mL YPD液体培养基中，28℃、180rpm过夜培养，再取5mL菌液接种到100ml YPD液体培养基中，28℃、180rpm培养至OD600为1.6左右。然后将菌液4℃、5000rpm离心5min收集菌体，并用50mL预冷的1M山梨醇洗涤一次。将菌体重悬在40mL1M山梨醇、5mL 10×TE(100mM Tris-HCL、10mM EDTA，pH7.5)和5mL 1M醋酸锂混合液中，并在30℃下振荡孵育30min。将孵育后的混合液4℃、5000rpm离心5min收集菌体，然后将菌体用50mL预冷1M山梨醇洗涤两次。用适量预冷的1M山梨醇重悬菌体，分装并储存于-80℃冰箱。

上述所提及的YPD培养基配方：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，PH 5.9(固体培养基另加20g/L的琼脂)；LB培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，PH 7.0(固体培养基另加20g/L的琼脂)。

(2)电击转化

将构建好的egt1表达质粒通过电击转化圆红酵母，其中电转仪参数设定为：电压2.0KV、电容25μF、电阻200Ω。电转操作根据下列文献进行：Liu H,Jiao X,Wang Y,Yang X,et al.Fast and efficient genetic transformation of oleaginous yeastRhodosporidium toruloides by using electroporation.FEMS Yeast Res.2017Mar 1；17(2).。

实施例3 egt1基因表达菌株验证

(1)设计引物进行PCR验证

挑取电击转化后涂布在含有30μg/mL潮霉素抗性的YPD筛选平板上长出的单菌落接种于10mL YPD液体培养基中，28℃、180rpm摇床过夜培养。取500μL的菌液于1.5mL离心管中进行冻融处理(先放置于-20℃冰箱使管内菌液冻住，再放置于70℃水浴锅中使其解冻，重复2次)，以冻融后的菌液作为PCR模板。在egt1基因表达质粒上的egt1基因两端选择合适的位点设计验证引物YZ1-F/R；用验证引物YZ1-F/R进行PCR验证，原始菌株不能扩增出条带，而转化成功的菌株可以扩增出2677bp大小目的条带(图5)。

验证引物序列为：

YZ1-F：5’-GGACTCTTGACCATGGTAGATCT-3’ SEQ ID NO：4；

YZ1-R：5’-GGGAAATTCGAGCTGGTCACC-3’ SEQ ID NO：5。

(2)egt1基因表达菌株发酵验证

将出发菌株(圆红冬孢酵母)和步骤(1)中PCR验证正确的转化子分别划线YPD平板，28℃培养24h，挑单克隆接种20mL YPD液体培养基，28℃、180rpm培养24h，再将培养好的菌液，以10％的接种量(v/v)分别接种到50mL摇瓶发酵培养基，28℃、180rpm摇床培养72h，HPLC检测发酵液中麦角硫因的产量，筛选得到麦角硫因产量提高最多的egt1基因表达菌株E1-6，其麦角硫因产量达到754mg/L，较原始菌株(368mg/L)，产量提高了104.9％，进而证明在圆红冬孢酵母中表达粗糙脉孢菌egt1基因可以促进其菌株合成麦角硫因。

所提及的摇瓶发酵培养基配方：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，七水合硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，生物素0.5mg/L，七水合硫酸亚铁0.3g/L，一水合硫酸锰0.1g/L，PH 6.5。

所提及的HPLC测定麦角硫因方法根据下述文献中的方法进行：Ying Hao Yu,HongYu Pan,Li Qiong Guo,et al.Successful biosynthesis of natural antioxidantergoth ioneine in Saccharomyces cerevisiae required only two genes fromGrifola frondo sa[J].Microbial Cell Factories,2020,19(1):164.。

实施例4构建egt1-egt2双基因表达菌株

(1)egt1-egt2双基因表达质粒构建

①根据粗糙脉孢菌egt2基因序列(GenBanK：XM_001728079.2，即 SEQ ID NO：9)设计带有部分P2A序列的egt1和egt2基因扩增引物(下划线标注的为酶切位点或P2A序列)。

P2A-egt1-R：5’-TCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCAAATCCCTAACAACTCTCG-3’ SEQ ID NO：6；

P2A-egt2-F：5’-CTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGGTCGCCACCACCGTCG-3’ SEQ ID NO：7；

egt2-R：5’-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCAGGCGCTCTCCTTGTACT-3’(BstEⅡ) SEQID NO：8；

其中人工序列P2A序列为：GGAAGCGGAG CTACTAACTT CAGCCTGCTG AAGCAGGCTGGAGACGTGGA GGAGAACCCT GGACCT SEQ ID NO：10。

②以粗糙脉孢菌cDNA作为模板，egt1-F和P2A-egt1-R为引物，PCR扩增带有部分P2A基因的egt1基因片段(2693bp)；P2A-egt2-F和egt2-R为引物，PCR扩增带有另一部分P2A基因的egt2基因片段(1486bp)(图6)。

③通过重叠PCR将分别带有部分P2A序列的egt1和egt2片段连接，然后电泳并割胶回收egt1-P2A-egt2片段(4163bp)(图7)。

重叠PCR体系：

Max DNA Polymerase 25μL，85ng/μL的egt1基因片段5μL，72ng/μL的egt2基因片段3μL，10μM的引物egt1-F(SEQ ID NO:1)1μL，10μM引物egt2-R(SEQ ID NO:8)1μL，ddH₂O补至50μL。

重叠PCR反应程序：98℃2min，98℃20s，55℃20s，72℃5min，30个循环，72℃5min，4℃保存。

④将回收得到的egt1-P2A-egt2片段通过无缝克隆技术连接到pCambia 1301真核表达载体BglⅡ和BstEⅡ酶切位点之间，构建pCambia 1301-egt1-P2A-egt2双基因表达质粒。从转化板上挑取转化子进行菌落PCR验证(图8)，再将验证正确的转化子扩大培养，提质粒进行双酶切验证(图9)，酶切产物电泳结果显示重组质粒能切出目的大小的条带，表明pCambia 1301-egt1-P2A-egt2双基因表达质粒(质粒图谱见图10)初步构建成功，再将验证正确的双基因表达质粒送公司测序，测序结果正确，该质粒构建成功。

(2)双基因表达质粒电击转化圆红冬孢酵母

将双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2电击转化圆红冬孢酵母，其操作方法与实施例2中步骤(2)相同。

实施例5 egt1-egt2双基因表达菌株验证

(1)设计引物进行PCR验证

挑取上述电击转化后涂布在含有30μg/mL潮霉素抗性的YPD筛选平板上长出的单菌落接种于10mL YPD液体培养基中，28℃、180rpm摇床过夜培养。取500μL的菌液于1.5mL离心管中进行冻融处理，以冻融后的菌液作为PCR模板。在egt1-P2A-egt2基因片段上选择合适的位点设计验证引物YZ2-F/R；用验证引物YZ2-F/R进行PCR验证，原始菌株不能扩增出条带，而转化成功的菌株可以扩增出(526bp)目的条带(图11)。

验证引物序列为：

YZ2-F：5’-ATCGGTCCTCCGCAAGTGGG-3’ SEQ ID NO：11；

YZ2-R：5’-GGATTCGTCGAGGAGTACGG-3’ SEQ ID NO：12。

(2)egt1-egt2双基因表达菌株发酵验证

将出发菌株(圆红冬孢酵母)、egt1表达菌株Egt1-6和步骤(1)中PCR验证正确的转化子分别划线YPD平板，28℃培养24h，挑单克隆接种20mL YPD液体培养基，28℃、180rpm培养24h，再将培养好的菌液，以10％的接种量(v/v)分别接种到50mL摇瓶发酵培养基，28℃、180rpm摇床培养72h，HPLC检测发酵液中麦角硫因的产量，筛选得到麦角硫因产量提高最多的egt1-egt2双基因表达菌株Egt1-Egt2-8，其麦角硫因产量达到1304mg/L，较原始菌株(370mg/L)提高了254.3％；较egt1表达菌株Egt1-6(760mg/L)提高了71.6％(图12)。

所提及摇瓶发酵培养基和HPLC检测方法与实施例3中步骤(2)相同。

实施例6改造菌株发酵罐发酵验证

将发酵菌株划线YPD平板，28℃培养24h，挑单克隆接种20mL YPD液体培养基，28℃、180rpm培养24h，再将培养好的菌液，以5％的接种量(v/v)接种到50mL YPD液体培养基，28℃、180rpm摇床培养24h，再以10％的接种量(v/v)转接发酵罐培养基(发酵罐培养基配方：葡萄糖45g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉20g/L，七水合硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，生物素0.5mg/L，七水合硫酸亚铁0.3g/L，一水合硫酸锰0.1g/L，PH 6.5)。

发酵罐参数设定为：转速500～800rpm，与溶氧偶联，溶氧控制40％，温度设定为28℃，通气量设定为4L/min，补加氨水控制pH维持6.5，发酵持续120h。发酵第12-24h,以10mL/h的速度流加500g/L的葡萄糖溶液；发酵第24-72h,以20mL/h的速度流加500g/L的葡萄糖溶液；发酵第72-96h,以5mL/h的速度流加500g/L的葡萄糖溶液；发酵第24-108h，以5-10mL/h的速度流加100g/L的酵母粉溶液。发酵结束后，HPLC检测改造菌株麦角硫因产量。所提及HPLC检测方法与实施例3中步骤(2)相同。检测结果显示(图13)：原始圆红酵母菌株5L发酵罐产麦角硫因产量为2295mg/L；egt1基因表达菌株Egt1-6 5L发酵罐产麦角硫因产量为4873mg/L；egt1-egt2双基因表达菌株Egt1-Egt2-8 5L发酵罐产麦角硫因产量为8497mg/L。其中egt1-egt2双基因表达菌株Egt1-Egt2-8麦角硫因产量达到约8.5g/L，为该菌株工业化产麦角硫因奠定良好的基础。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古金达威药业有限公司

厦门金达威集团股份有限公司

金达威生物技术（江苏）有限公司

<120> 一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株及其构建方法和应用

<130> JDWJ-21003-CNI

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcttgacc atggtagatc tatgccgagt gccgaatcc 39

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggaaattc gagctggtca cctcacaaat ccctaacaac tc 42

<210> 3

<211> 2628

<212> DNA

<213> 粗糙脉孢菌

<400> 3

atgccgagtg ccgaatccat gaccccaagc agtgccctcg gacagctcaa agcaactgga 60

caacatgtgc tatccaagct tcagcagcag acatcaaacg ccgatatcat cgacatccgc 120

cgcgttgctg tagagatcaa cctcaagacc gagataacct ccatgttccg acctaaagat 180

ggccctagac agctacccac cttgcttctc tacaacgaga gaggcctgca gctgttcgag 240

cgtatcacat accttgaaga gtactatctt accaatgacg agatcaaaat cctcaccaaa 300

catgcgaccg aaatggctag cttcatcccg tcaggtgcca tgatcattga gctcggaagc 360

ggaaatctgc gcaaagtaaa ccttctattg gaagccctag acaacgccgg caaggcaatt 420

gactattatg cccttgacct gtctcgggag gagctggagc gcactctcgc tcaggtacca 480

tcctacaagc acgtcaagtg ccacggtctt ctgggtacat atgacgatgg acgtgactgg 540

ctcaaggccc cagagaacat caataaacag aaatgcatct tgcacctcgg gtcaagcatt 600

ggcaacttta accgcagtga cgccgctacc tttctcaagg gctttacgga cgtccttgga 660

cccaatgaca agatgctcat tggggttgac gcttgcaatg acccggcgag ggtataccac 720

gcttacaacg acaaggttgg tattactcac gagttcatct tgaatggtct tcgcaacgcc 780

aatgaaatta tcggagagac ggccttcatc gagggcgatt ggagagtcat tggcgaatat 840

gtgtatgacg aagagggcgg cagacaccag gccttttacg cccccactcg cgacaccatg 900

gttatggggg agttgattag gtcacacgac aggatccaga tcgaacagag cctaaagtac 960

tcgaaagagg agtcagagag gctctggagc acggcgggat tggaacaagt ctcggaatgg 1020

acgtacggca acgaatatgg actccatctg cttgccaagt caaggatgtc tttcagtctc 1080

atcccttcgg tgtacgctcg cagcgcactc ccaactctgg acgactggga ggccctttgg 1140

gcgacatggg atgtcgtcac acgtcagatg cttccccagg aagagcttct ggagaagccc 1200

atcaagctcc gaaacgcctg catcttttac ctcggtcaca tcccgacctt cctcgacatc 1260

cagctcacaa agaccaccaa gcaggctccg tcagagcccg ctcacttttg caagatcttc 1320

gagcgaggca ttgatcctga tgtcgacaac ccggagctgt gtcatgcgca ctcggagatt 1380

cctgatgaat ggccgccggt ggaagaaatc ctgacctacc aggagacggt acggtcccgg 1440

ttacgcggcc tctatgcgca tggcatcgcg aatattccgc ggaatgtggg tcgggccatt 1500

tgggttgggt ttgagcacga gcttatgcat atcgagacgc tgttgtacat gatgctacag 1560

agcgacaaga cgctgatccc aacccatatt ccacggcccg actttgacaa gctcgcgagg 1620

aaggcagagt ccgagagggt tcccaatcag tggtttaaga ttccggcaca ggagatcacc 1680

atcggtttgg atgatcctga ggatggatct gatatcaaca agcattatgg ctgggacaac 1740

gagaagcctc caaggcgcgt tcaagttgct gcctttcagg ctcaagggag gccgatcacc 1800

aacgaagagt acgcgcaata tctgcttgaa aagaacatcg acaagctccc tgcctcttgg 1860

gcccgcctgg acaacgagaa cattagcaat ggaacaacaa acagcgtgag cggtcaccac 1920

agcaacagaa cctccaagca gcagctccct tcatctttcc tcgagaagac agcagtccgc 1980

acagtctacg gtctcgtgcc tctcaagcac gctctcgact ggcccgtgtt tgcctcttac 2040

gacgaacttg ccggttgcgc agcttacatg ggcggccgta ttcccacctt cgaagagacc 2100

cggagcattt acgcttacgc cgatgctctc aagaagaaga aggaagctga gagacaattg 2160

ggaaggacgg ttccggctgt taatgcccac ctaaccaaca acggcgtgga aatcactccc 2220

ccatcctctc cctcttccga gacccccgcc gagtcttcct ccccctccga cagcaacacc 2280

accctcatca ccaccgaaga cctcttctct gacctagacg gtgccaatgt cggttttcac 2340

aactggcacc ctatgcccat cacctccaaa ggcaacaccc ttgtcgggca aggcgagctc 2400

ggcggcgtgt gggaatggac ttcatcggtc ctccgcaagt gggaggggtt cgagccgatg 2460

gagctgtacc ccggctatac ggcggatttt ttcgatgaga agcacaacat tgtgctggga 2520

gggagctggg ctacgcatcc gaggattgcg gggaggaaga gctttgtgaa ttggtaccag 2580

aggaattatc cttatgcttg ggtgggggcg agagttgtta gggatttg 2628

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggactcttga ccatggtaga tct 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggaaattcg agctggtcac c 21

<210> 6

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccagcctgc ttcagcaggc tgaagttagt agctccgctt cccaaatccc taacaactct 60

cg 62

<210> 7

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatggtcgc caccaccgtc 60

g 61

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggggaaattc gagctggtca cctcaggcgc tctccttgta ct 42

<210> 9

<211> 1422

<212> DNA

<213> 粗糙脉孢菌

<400> 9

atggtcgcca ccaccgtcga gctgcctctg cagcaaaagg ccgacgccgc ccaaactgtt 60

actggccccc tcccattcgg caattccctc ctcaaggaat tcgtcctcga ccctgcctac 120

cggaacctca accatggctc cttcggcacc atcccctccg ccatccaaca aaaactccgc 180

agttaccaaa ccgccgccga agcccgcccc tgccccttcc tccgctacca aacccccgta 240

ctcctcgacg aatcccgcgc cgccgtcgcc aacctcctca aagtccccgt cgaaaccgtc 300

gtcttcgtcg ccaacgccac tatgggcgtc aacactgtcc tgcgcaacat cgtctggtcc 360

gccgacggca aggacgagat cctctacttc gacaccatct acggcgcctg cggcaagacc 420

atcgactacg tcatcgaaga caagcgaggg atcgtttctt ctcgctgtat cccattgatc 480

taccccgccg aagacgacga tgtcgtcgct gccttccggg acgccatcaa gaagagccgc 540

gaagaaggca agcgaccccg tctggctgtt atcgacgtcg tctcctccat gcctggcgta 600

cggttcccgt tcgaggacat cgtcaagatc tgcaaagaag aagagatcat ctcgtgcgtg 660

gacggcgccc aaggcatcgg catggtggac ctcaagatca ccgagaccga cccggatttt 720

ttgattagta actgccacaa gtggctgttt actccgcgcg gatgtgccgt gttctacgtg 780

cctgtgcgta accagcactt gatccgctcg acgctgccta ctagccatgg gttcgtgccg 840

caggtcggga ataggttcaa cccgctggtg ccggcgggga acaagtcagc gtttgttagc 900

aactttgagt ttgtgggcac ggtggataac tcgccgttct tttgtgttaa ggacgcgatc 960

aagtggcgcg aggaggtgct cggtggggag gagaggatca tggagtacat gactaaattg 1020

gcgagggaag gtggacagaa agtggcggag attctgggga cgagggtgtt ggagaatagc 1080

acgggaacgc tgatcaggtg cgccatggtc aatattgcgt tgccgttcgt tgtgggagag 1140

gatcccaagg cgccggtcaa gttgacggag aaggaggaga aggatgttga agggttgtat 1200

gagattcccc atgaggaggc aaacatggcg ttcaagtgga tgtacaacgt gctgcaggac 1260

gagtttaaca cgtttgtacc catgaccttc cacaggagga ggttctgggc cagattgagc 1320

gcgcaggtgt atttggagat gagcgatttc gagtgggcgg ggaagacgtt gaaggagttg 1380

tgtgagaggg tggctaaggg ggagtacaag gagagcgcct ga 1422

<210> 10

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atcggtcctc cgcaagtggg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggattcgtcg aggagtacgg 20

Claims (7)

1.一种高产麦角硫因的圆红冬孢酵母重组表达菌株，其特征在于，含有麦角硫因合成基因egt1和egt2，所述egt1的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，所述egt2的核苷酸序列为SEQ IDNO:9；菌株是圆红冬孢酵母菌。

2.如权利要求1所述圆红冬孢酵母重组表达菌株，其特征在于，制备方法包括：

S1，构建egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2；

S2，构建egt1-egt2双基因表达菌株。

3.如权利要求2所述重组表达菌株，其特征在于，所述S1步骤中，构建egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2的方法包括：

a.以粗糙脉孢菌基因组cDNA为模板，采用egt1-F和P2A-egt1-R引物扩增带有部分P2A序列的egt1基因、采用P2A-egt2-F和egt2-R引物扩增带有另一部分P2A序列的egt2基因；

b.通过重叠PCR，将扩增得到的带有部分P2A序列的egt1基因和带有另一部分P2A序列的egt2基因连接起来，得到egt1-P2A-egt2片段；

c.通过无缝克隆将egt1-P2A-egt2片段连接到已线性化的pCambia 1301质粒上，得到egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2。

4.如权利要求3所述重组表达菌株，其特征在于，所述egt1-F的序列如SEQ ID NO:1所示，所述P2A-egt1-R的序列为如SEQ ID NO:6所示，所述P2A-egt2-F的序列如SEQ ID NO:7所示，所述egt2-R的序列如SEQ ID NO:8所示。

5.如权利要求2所述重组表达菌株，其特征在于，所述S2步骤中，将egt1-egt2双基因表达质粒pCambia 1301-egt1-P2A-egt2导入圆红冬孢酵母菌株中得到egt1-egt2双基因表达菌株。

6.权利要求1-5任一所述重组表达菌株用于生产麦角硫因的用途。

7.一种生产麦角硫因的方法，所述方法包括：培养权利要求1-5中任一项重组表达菌株的宿主细胞；诱导所述宿主细胞以表达编码egt1的核酸序列和编码egt2的核酸序列；收集麦角硫因。

Images