CN114606170B

CN114606170B - 一种基于CRISPR-Cas9的麦角硫因生物合成方法及应用

Info

Publication number: CN114606170B
Application number: CN202210215337.9A
Authority: CN
Inventors: 张山; 丁利平; 甘淼; 陈永丽
Original assignee: Shenzhen Upfo Biotech Co ltd
Current assignee: Shenzhen Upfo Biotech Co ltd
Priority date: 2022-03-07
Filing date: 2022-03-07
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2042-03-07
Also published as: CN114606170A

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas9的麦角硫因生物合成方法及应用，属于基因工程领域。本发通过在谷氨酸棒状杆菌中敲除了非必需蛋白肽聚糖内切酶、述胞内蛋白酶、谷氨酸‑胱氨酸连接酶的编码基因，并整合了egt12基因簇，使得重组谷氨酸棒状杆菌具有更好的适应性并具备更好的麦角硫因生产能力。本发明构建的基因工程菌在50L发酵罐条件下30℃发酵56h，麦角硫因产量高达5.47g/L。将有助于麦角硫因的工业化生产。

Description

一种基于CRISPR-Cas9的麦角硫因生物合成方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR-Cas9的麦角硫因生物合成方法及应用，属于基因工程领域。

背景技术

麦角硫因(Ergothioneine，EGT)最早是从寄生在黑麦上的一种真菌——麦角菌(Claviceps purpurea)中分离得到，是一种由组氨酸衍生而来的天然含巯基小分子化合物；麦角硫因是一种功能强大的抗氧化剂，具备清除活性氧(ROS)如羟基自由基、次氯酸、过氧亚硝酸盐和单重态氧的能力，以及调节由细胞过氧化氢、肿瘤坏死因子α或棕榈酸治疗引起的炎症反应的能力；此外麦角硫因还能保护DNA免受损伤、螯合二价金属离子，且麦角硫因螯合后产生的化合物性质稳定，并不会再次分解产生自由基。因此，麦角硫因有望广泛应用于食品、医药、化妆品等诸多领域。

目前市场上占主导地位的麦角硫因产品是由化学合成的，化学合成涉及有机试剂种类繁多、合成步骤复杂，并且涉及部分昂贵试剂，因此其后期纯化困难、安全难以保障、不适合大批量工业化生产。近些年来，随着科学家们对组氨酸——麦角硫因代谢通路持续的挖掘和更新，麦角硫因的生物合成展现出低成本、高产量、易纯化等特点，逐渐在市场中占据主导优势。目前麦角硫因生物合成的方法主要有普通菌体发酵、基因工程菌发酵等。其中普通菌体发酵的方法存在着真菌菌丝体生产周期相对较长，产率偏低的问题(专利公开号：CN103734022A，CN109439701A)。现有的麦角硫因工程菌大多以大肠杆菌(专利公开号：CN113234652A)、芽孢杆菌(专利公开号：CN110358719A)、酿酒酵母(专利公开号：CN110607286B)等菌种直接作为宿主，其中，以芽孢杆菌和酿酒酵母为宿主的生物合成方法依然存在产量偏低、发酵周期长、生产成本高的缺点；而以大肠杆菌为宿主的生物合成方法具有噬菌体感染和内毒素污染的风险，导致应用受限。另外，传统的基因编辑手段，有着步骤复杂、低操作性、难整合至基因组等缺点(专利公开号CN109554414A)。因此，选择更为安全可靠、生长周期较短的菌种，简化基因编辑的步骤、提高基因的稳定性、综合提升麦角硫因生物合成的产量，一直是本领域内所亟需解决的问题。

谷氨酸棒状杆菌是一种革兰氏阳性菌，已应用于诸如谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸等多种氨基酸发酵工业生产。相比于大肠杆菌、芽孢杆菌，谷氨酸棒状杆菌具有更好的抗逆性、更高的安全性、更低的致病性，是麦角硫因生物合成的优秀宿主菌。综上，本发明以更安全的谷氨酸棒状杆菌为宿主，采用CRISPR/Cas9技术构建麦角硫因合成菌株，在相对较短的发酵周期(16h种子，56h发酵)合成了相对较多的麦角硫因(5.47g/L)。

发明内容

随着CRISPR/Cas9的发展，一步实现多基因敲除和敲入已经成为可能，并且基于Cas9的基因编辑技术可以将目的基因定点敲入至宿主菌的染色体基因组上，大幅提高了目的基因转入成功后的稳定性。本发明通过CRISPR/Cas9技术构建的多拷贝EGT合成菌株，相比于单拷贝的EGT合成菌株，在同等条件下发酵时有着更高的麦角硫因产量。

本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌株以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除宿主细胞中的肽聚糖内切酶的编码基因、胞内蛋白酶的编码基因和/或谷氨酸-胱氨酸连接酶的编码基因中的一种或多种，并同时表达egt12基因簇。

在一种实施方式中，所述肽聚糖内切酶的Gene ID：1020444；所述胞内蛋白酶的如Gene ID：3345370；所述谷氨酸-胱氨酸连接酶的GenBank：BAC00130.1。

在一种实施方式中，所述egt12基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。

在一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌为C.glutamicum ATCC 13032或C.glutamicum ATCC 14067。

在一种实施方式中，所述egt12基因簇整合于宿主染色体基因组上。

本发明提供了一种生产麦角硫因的方法，所述方法是利用所述的基因工程菌发酵生产麦角硫因。

在一种实施方式中，将所述基因工程菌在种子培养基中培养得到OD₆₀₀为0.8±0.1的种子液，将种子液以体积比8～10％的量接种至发酵体系中，培养至葡萄糖耗尽后，添加补料培养基，控制发酵体系中糖含量不高于3g/L、溶氧不高于60％。

在一种实施方式中，所述发酵体系中含有葡萄糖10～50g/L，玉米粉15～30g/L，硫酸铵10～15g/L，醋酸铵5～10g/L，尿素1～2g/L，柠檬酸钠1～5g/L，磷酸氢二钠1～2g/L，磷酸二氢钠1～2g/L，微量元素0.5～1g/L。

在一种实施方式中，所述发酵体系中还含有生物素0.1～1mg/L。

优选地，所述发酵体系中含有葡萄糖50g/L，玉米粉30g/L，硫酸铵15g/L，醋酸铵5g/L，尿素2g/L，柠檬酸钠5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，磷酸二氢钠1.5g/L，微量元素1g/L，生物素1mg/L。

在一种实施方式中，发酵过程中pH为7.0±0.5，总共发酵50～60h。

在一种实施方式中，所述发酵体系采用分批补料发酵，补料培养基中添加半胱氨酸和蛋氨酸，提供麦角硫因生物合成所需含硫氨基酸；所述半胱氨酸与蛋氨酸浓度比为(1～4):(1～4)。

在一种实施方式中，所述半胱氨酸与蛋氨酸浓度比优选为1:1、2:3或4:3。

在一种实施方式中，所述半胱氨酸的浓度为10～15g/L。

更优选地，半胱氨酸的浓度为10g/L，蛋氨酸的浓度为15g/L。

本发明提供了制备所述基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法为：

(1)根据目的蛋白对应编码基因的序列设计sgRNA；

(2)根据目的蛋白对应编码基因的序列设计上下游基因序列构建同源修复序列；

(3)将上述sgRNA与同源修复序列整合至pCas9质粒中，分别构建得到三个敲除载体；

(4)在敲除载体上插入egt12基因的上下游同源臂，分别构建得到三个敲入载体；

(5)将步骤(4)构建得到的一个或多个敲入载体转化至谷氨酸棒状杆菌中，构建得到基因工程菌。

在一种实施方式中，所述肽聚糖内切酶对应的sgRNA核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述胞内蛋白酶对应的sgRNA核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；所述谷氨酸-胱氨酸连接酶，其对应的sgRNA核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所示。

在一种实施方式中，所述肽聚糖内切酶、胞内蛋白酶、谷氨酸-胱氨酸连接酶对应上游同源臂序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.7、SEQ ID No.11所示，所述肽聚糖内切酶、胞内蛋白酶、谷氨酸-胱氨酸连接酶对应下游同源臂序列分别如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12所示。

在一种实施方式中，egt12基因簇编码表达的EGT合成酶，其对应的氨基酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。

本发明提供了所述基因工程菌在制备麦角硫因及其衍生物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明采用了相对安全可靠的谷氨酸棒状杆菌，使用CRISPR/Cas9方法敲除了谷氨酸棒状杆菌生产中的一些非必需蛋白的编码基因，提高了谷氨酸棒状杆菌在生产麦角硫因上的适应性和发酵能力；在此基础上，进一步在谷氨酸棒状杆菌染色体上整合了egt12基因簇，赋予了谷氨酸棒状杆菌合成麦角硫因的能力；构建得到的含多拷贝egt12基因簇的谷氨酸棒状杆菌拥有更高的麦角硫因产量，将其在50L发酵罐条件下30℃发酵56h，麦角硫因产量高达5.47g/L。

附图说明

图1为基因敲入载体构建示意图。

图2为核酸电泳图。

图3为低拷贝的EGT-A菌株发酵合成麦角硫因的HPLC检测结果图；图中a为10mg/L麦角硫因标品，b为发酵后菌液离心后稀释100倍的样品。

图4为多拷贝的EGT-ABC菌株发酵合成麦角硫因的HPLC检测结果图；图中a为10mg/L麦角硫因标品，b为发酵后菌液离心后稀释50倍的样品。

图5为多拷贝的EGT-ABC菌株在改良培养基后发酵合成麦角硫因的HPLC检测结果图；图中a为10mg/L麦角硫因标品，b为发酵后菌液离心后稀释50倍的样品。

具体实施方式

下述实施例中，使用的质粒来自中科院微生物所。

下述实施例中，如没有明确说明，所使用的试剂、材料、基因合成和基因测序均是可以通过商业途径获得的。

下述实施例中，如没有明确说明，质粒均采用大肠杆菌扩增，扩增后采用质粒小提试剂盒(天根生化)进行质粒提取；DNA片段均采用PCR扩增。

(一)PCR扩增方法

PCR体系：Buffer 5mL，dNTP(2.5mM)4mL，Forward primer 1mL，Reverse primer1mL，Template 1mL，Fastpfu fly DNA polymerase(全式金生物)0.5mL，纯水补齐至50mL。PCR程序：Step1预变性98℃5min；Step2变性98℃30s；Step3退火55℃45s；Step4延伸72℃3kb/min；Step5 72℃5min。其中Step2-Step4循环25次。

(二)Golden Gate方法

下述实施例中，使用的Golden Gate技术，其基因的顺序拼接是通过设计特定引物实现的，其反应体系为：质粒75ng，片段与质粒摩尔比为2:1，T4 Buffer(10x)2μL，ⅡS型限制酶(BsaI)2μL，T4 DNA连接酶0.5μL，加水补齐至20μL。反应程序：先37℃1h，后60℃5min，反应后的产物进行测序验证。上述T4 Buffer、限制酶、DNA连接酶均采购自赛默飞。

(三)谷氨酸棒状杆菌感受态的制备

下述实施例中，菌株电转前需制备感受态，谷氨酸棒状杆菌感受态的制备步骤如下：

(1)取菌液划线，挑取单菌落于LB培养基中，30℃、200r/min，过夜培养；

(2)上述菌液以2％比例接种于LB培养基中，使初始OD₆₀₀为0.3，30℃、200r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.9；

(3)上述菌液放至离心管中冰浴15min后，4000r/min，4℃离心10min，弃上清；

(4)上述菌泥用预冷的10％甘油充分重悬，4000r/min，4℃离心10min，弃上清，重复2次；

(5)上述菌泥用少量预冷的10％甘油重悬，分装至1.5mL离心管，于-80℃保存。

(四)培养基配方

以下实施例中，质粒去除培养基配方：每升培养基中添加5g脑心浸液，5g酵母粉，10g蛋白胨，10g氯化钠，固体培养基中额外添加15g琼脂。

以下实施例中，BHI培养基为成品培养基，购自环凯微生物。

以下实施例中，筛选培养基为含amp的BHI固体培养基。

以下实施例中，补料培养基配方：每升培养基中含有葡萄糖400g，硫酸铵40g，半胱氨酸10g，蛋氨酸15g。

(五)下述实施例中所使用的引物，所述引物均购买自擎科生物。

表1载体构建使用引物

实施例1

CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建：

本实施例中所述蛋白A为一种肽聚糖内切酶，其编码基因mepA的核苷酸序列如Gene ID：1020444所示；所述蛋白B为cgl2736，其编码基因的核苷酸序列如GenBank：BA000036.3中第2917628至2918758位所示；所述蛋白C为一种胞内蛋白酶，其编码基因clpC的核苷酸序列如Gene ID：3345370所示。

1.sgRNA的设计：以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032为模板设计sgRNA，具体的操作方法为，在sgRNA专用设计网站(http://crispor.tefor.net/)上输入靶基因核苷酸序列，选取谷氨酸棒状杆菌基因组，选择20bp-NGG-sp Cas9作为PAM位点进行分析，选取脱靶率低的两段sgRNA序列。在本实施例中，蛋白A对应的sgRNA核苷酸序列sgRNA-A1和sgRNA-A2分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，蛋白B对应的sgRNA核苷酸序列sgRNA-B1和sgRNA-B2分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，蛋白C对应的sgRNA核苷酸序列sgRNA-C1和sgRNA-C2分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

上述sgRNA通过设计相应引物，互为模板扩增而得，以蛋白A对应的sgRNA为例，其具体的操作方法为，设计两条含有部分互补序列的寡核苷酸序列sgA1、sgA2，其分别含有sgRNA-A1和sgRNA-A2，并且都含有U6启动子对应的终止序列，sgA1、sgA2互为模板扩增得到对应的sgRNA双链片段，类似的，sgB1、sgB2、sgC1、sgC2是基于上述原理设计的，上述寡核苷酸序列如表1所示。

2.上下游同源臂的设计：通过NCBI查询所述敲除基因上下游基因序列，设计出对应的上下游同源臂，所述蛋白A、B、C对应上游同源臂序列分别如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.11所示，所述蛋白A、B、C对应下游同源臂序列分别如SEQ ID No.4、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.12所示。

上述上下游同源臂模板是以谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因组DNA为模板，设计引物扩增获得的，使用的引物如表1所示。

3.通过Golden gate方法将对应的基因片段按sgRNA-上游同源臂-下游同源臂的顺序连接至pCas9质粒，分别构建得到pCas9-A、pCas9-B、pCas9-C敲除载体。

实施例2

CRISPR-Cas9基因敲入载体的构建：

在实施例1所述步骤1-2的基础上，设计引物扩增本公司保有的egt12基因簇(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)，通过Golden gate将对应的基因片段按sgRNA-上游同源臂-egt12-下游同源臂的顺序连接至pCas9质粒，分别构建得到pCas9-A-egt12、pCas9-B-egt12、pCas9-C-egt12敲入载体。

实施例3：麦角硫因合成菌株的构建及筛选

1.蛋白A敲除菌株：通过电击转化法将pCas9-A-egt12载体转入C.glutamicumATCC 13032菌株，将提前制备好的谷氨酸棒状杆菌感受态置于冰上融化，添加5-15μLpCas9-A-egt12质粒至谷氨酸棒状杆菌感受态中，轻轻吹打混匀，冰浴10min后，将含有质粒的感受态细胞加入2mm电转杯中，电转仪电击转化条件为电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF，立即加入1mL 46℃预热的BHI培养基，于46℃金属浴热击6min，然后于30℃、200rpm振荡培养2h。转化后的菌株涂布于含氯霉素的筛选培养基，30℃倒置培养40h后，挑取单克隆进行PCR和测序鉴定，使用Snapgene软件将测序结果与预计结果进行对比，结果正确的即为蛋白A敲除的麦角硫因合成菌株，即EGT-A菌株。挑取EGT-A菌株于质粒去除培养基上，37℃培养16h，利用温敏复制子的特性将质粒去除，用于后续的基因编辑。

2.蛋白B敲除菌株：使用同步骤1的方法，采用步骤1构建的蛋白A敲除菌株，将pCas9-B-egt12载体转入C.glutamicum ATCC 13032菌株，构建蛋白AB敲除菌株，即EGT-AB菌株。挑取EGT-AB菌株于质粒去除培养基上，37℃培养16h，利用温敏复制子的特性将质粒去除，用于后续的基因编辑。

3.蛋白C敲除菌株：使用同步骤1的方法，采用步骤2构建的蛋白AB敲除菌株，将pCas9-C-egt12载体转入C.glutamicum ATCC 13032菌株，构建蛋白ABC敲除菌株，即EGT-ABC菌株。挑取EGT-ABC菌株于质粒去除培养基上，37℃培养16h，利用温敏复制子的特性将质粒去除，用于后续的基因编辑。

上述蛋白敲除菌株，其中任一种均为麦角硫因合成菌株。

实施例4：重组谷氨酸棒状杆菌的敲除、敲入验证

对实施例3中构建的EGT-ABC菌株进行验证。

首先，以蛋白A编码基因的位点为例，设计引物a1(5’)、a2(3’)，其分别存在于蛋白A编码基因的上游同源臂和下游同源臂，设计引物a3(3’)，其仅存在于egt12基因簇；以原始菌株为模板，a1、a2、a3为引物进行扩增，扩增产物取5μL制样后进行核酸电泳。核酸电泳的具体操作方法如下：

(1)0.8％琼脂糖凝胶制备：取0.32g琼脂糖添加至40mL 1×TAE溶液，多次加热沸腾至琼脂糖彻底溶解，放冷至60-70℃，倒入40mL插有对应大小梳子的制胶模具，自然冷却凝固后拔出梳子。50×TAE配方：Tris 242g，冰醋酸57.1mL，0.5mol/L EDTA 100mL，纯化水补齐至1L，混匀后调节pH至8.5，使用时稀释50倍至1×TAE。

(2)样品制备：5μL PCR扩增产物，1μL 10×loading buffer，纯化水补齐至10μL。

(3)将琼脂糖凝胶放入电泳槽内，倒入1×TAE至完全覆盖琼脂糖凝胶，取5μL样品加入样品槽，150V恒定电压，40～50min。

电泳结果如图2中A0所示；以EGT-ABC为模板，a1、a2、a3为引物进行扩增，扩增产物取5uL制样后进行核酸电泳，其结果如图2中A1所示。蛋白B和蛋白C编码基因的位点亦采用上述方法进行验证，其结果如图2所示。

类似的，实施例3中构建的所有菌株，均采用了上述方法进行初步验证。挑取初步验证结果正确的阳性克隆，送检测序(擎科生物)，使用Snapgene软件将测序结果与预计结果进行对比。

实施例5：补料培养基中氨基酸比例探究

麦角硫因的生物合成途径需要含硫氨基酸的参与，虽然谷氨酸棒状杆菌自身可以合成含硫氨基酸，但是其效率有待提高，在不改造其半胱氨酸、蛋氨酸合成途径的前提下，在补料培养基中添加少量半胱氨酸、蛋氨酸，以提高重组菌株的麦角硫因合成效率。

本实施例中种子液培养基配方为，每升培养基中添加葡萄糖20g，玉米粉15g，酵母浸粉10g，柠檬酸钠5g，尿素2g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠2g，微量元素0.1g。

本实施例中发酵培养基配方为，每升培养基中添加葡萄糖10g，玉米粉15g，硫酸铵10g，醋酸铵10g，尿素2g，柠檬酸钠1g，磷酸氢二钠2g，磷酸二氢钠1g，微量元素0.5g。

本实施例中每升补料培养基中添加400g葡萄糖，40g硫酸铵，以及一定量的半胱氨酸和/或蛋氨酸，具体添加量如表2所示。

生物合成的具体操作步骤如下，实施例3步骤3中构建的EGT-ABC菌株被接种至250mL种子培养基中，30℃培养12h至OD₆₀₀约为0.8，得到种子液；将种子液以10％体积比接种至5L发酵罐中，发酵培养基体积为2L，30℃培养至葡萄糖耗尽，补料培养基以平均10mL/h的速度流加至发酵罐中，期间调整补料培养基流加速度，使罐内残糖不高于3g/L，溶氧不高于60％，发酵过程中维持pH在7.0±0.5，5L发酵罐接种后总共发酵56h，取样、下罐并检测麦角硫因含量，其结果如表2所示。

表2不同蛋氨酸、半胱氨酸添加量下麦角硫因的产量

表2中第1行和第1列分别指补料培养基中蛋氨酸和半胱氨酸的添加量(g/L)；第2-6行和第2-6列指，在对应蛋氨酸和半胱氨酸添加量的补料培养基条件下，经重组菌株进行生物合成后，发酵罐中麦角硫因的浓度(g/L)；上表数据为多次平行实验平均值。

下述实施例中均采用氨基酸添加效益较高的一组，即半胱氨酸10g/L，蛋氨酸15g/L。

虽然本实施例补料培养基中含硫氨基酸的添加量已经确定，但是应以补料培养基流加速度和含硫氨基酸浓度综合计算发酵罐中含硫氨基酸的实际添加量，本实施例应视为公布一个较佳的半胱氨酸、蛋氨酸添加比例。

实施例6：基于重组谷氨酸棒状杆菌的麦角硫因生物合成

本实施例采用低拷贝的EGT-A菌株进行麦角硫因合成。

本实施例中每升补料培养基中每升补料培养基中添加400g葡萄糖，40g硫酸铵，半胱氨酸10g/L，蛋氨酸15g/L。

将实施例3步骤1中构建的EGT-A菌株接种至2.5L种子培养基中，30℃培养16h至OD₆₀₀为0.8±0.1，得到种子液；将种子液以10％体积比接种至50L发酵罐中，发酵培养基体积为20L，30℃培养至葡萄糖耗尽，补料培养基以平均100mL/h的速度流加至发酵罐中，期间调整补料培养基流加速度，使罐内残糖不高于3g/L、溶氧不高于60％，发酵过程中维持pH在7.0±0.5，50L发酵罐接种后总共发酵56h，下罐并检测发酵液中麦角硫因含量，本实施例中，麦角硫因产量为2.567g/L，其对应的色谱结果如图3所示。

实施例7：基于重组谷氨酸棒状杆菌的麦角硫因生物合成

本实施例采用EGT-AB菌株进行麦角硫因合成。

具体实施方式参见实施例6，区别在于，利用实施例4步骤2中构建得到的EGT-AB菌株发酵生产麦角硫因，总共发酵56h，下罐并检测发酵液中麦角硫因含量，本实施例中，麦角硫因产量为3.368g/L。

实施例8：基于重组谷氨酸棒状杆菌的麦角硫因生物合成

本实施例采用多拷贝的EGT-ABC菌株进行麦角硫因合成。

实施例3步骤3中构建的EGT-ABC菌株被接种至2.5L种子培养基中，30℃培养16h至OD₆₀₀约为0.8，得到种子液；将种子液以10％体积比接种至50L发酵罐中，发酵培养基体积为20L，30℃培养至葡萄糖耗尽，补料培养基以平均100mL/h的速度流加至发酵罐中，期间调整补料培养基流加速度，使罐内残糖不高于3g/L、溶氧不高于60％，发酵过程中维持pH在7.0±0.5，50L发酵罐接种后总共发酵60h，下罐并检测发酵液中麦角硫因含量，本实施例中，麦角硫因产量为4.674g/L，其对应的色谱结果如图4所示。

实施例9：基于重组谷氨酸棒状杆菌的麦角硫因生物合成

本实施例在实施例5-8的基础上对发酵培养基进行了优化。

本实施例中发酵培养基配方为，每升培养基中添加葡萄糖50g，玉米粉30g，硫酸铵15g，醋酸铵5g，尿素2g，柠檬酸钠5g，磷酸氢二钠1.5g，磷酸二氢钠1.5g，微量元素1g，生物素1mg。

实施例3步骤3中构建的EGT-ABC菌株被接种至2.5L种子培养基中，30℃培养16h至OD₆₀₀约为0.8，得到种子液；将种子液以10％体积比接种至50L发酵罐中，发酵培养基体积为20L，30℃培养至葡萄糖耗尽，补料培养基以平均100mL/h的速度流加至发酵罐中，期间调整补料培养基流加速度，使罐内残糖不高于3g/L，溶氧不高于60％，发酵过程中维持pH在7.0±0.5，50L发酵罐接种后总共发酵56h，下罐并检测发酵液中麦角硫因含量，本实施例中，麦角硫因产量为5.47g/L，其对应的色谱结果如图5所示。

实施例10：C.glutamicum ATCC 14067重组菌株的构建及应用

C.glutamicum ATCC 14067同样具有A、B、C这三个改造位点，并且与C.glutamicumATCC 13032的对应位点同源性大于98％，因此，可以采用同样的方法对C.glutamicum ATCC14067进行改造。

参照实施例1-4的方法构建得到EGT-ABC-14067重组菌株，参照实施例9的培养基配方及实验方法，利用EGT-ABC-14067进行麦角硫因生物合成，发酵56h后，麦角硫因产量为5.192g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳中科欣扬生物科技有限公司

<120> BAA220049A

<130> 一种基于CRISPR-Cas9的麦角硫因生物合成方法及应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 20

<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgcaacatg aagcgtcgac tagcaattgc tgctttcgtc gccaccgcaa ccgctaccgc 60

caccatggca ccagcatccg cgcaaaccga ctacgcaggc ctttcctccg gcgttgccga 120

caccgtcg 128

<210> 4

<211> 118

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 4

gctatggaca gtggatccgc atccagcacg acgacggatc catctccatc tacggacaca 60

tggaatacct ctacgtctcc gtcggcgaac gcgtcgcagc aggccaggaa atcgcagg 118

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgttggaaa tcctggaacg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcttccctc cctgcaacaa 20

<210> 7

<211> 112

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 7

ttagtccagt gctttgaggt cgttgagttc gtcgcaggct aaatcaactg cagctttcca 60

actgccagtt tctttaaaca ctctgcgttg gcgttcgtat ccaccaccac gt 112

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 8

ttgcagggag ggaagctctt cgccagcgtc gatcatgcgg tcgtagtgca ccacgagaca 60

gtgggtcaac gccacgatgg cagacagttc ccgcaggttg gaggtagaat cggccacgcg 120

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctactggcg gtgacgctgt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgggttgttc ttggtacgac 20

<210> 11

<211> 113

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 11

ggtgctgatc tgccacgcgt gcgtcagcaa gttattcagc ttctctccgg ctacgaaggt 60

ggccagggcg gatccccaga gggcggccag ggcgccccta ctggcggtga cgc 113

<210> 12

<211> 114

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 12

ttgcaggttc ccgttaccgc ggtgacttcg aagagcgact gaagaaggtc ctcaaggaga 60

ttaaccagcg cggcgacatc atcctgttta tcgatgagat ccacaccctc gtgg 114

<210> 13

<211> 844

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Ser Pro Leu Pro Cys Pro Ala Lys Asn Val Glu Ile Val Asp Ile

1 5 10 15

His Gln Asn Asp Val Glu Phe Ser Leu Val Ser Glu Ile Arg Lys Gly

20 25 30

Leu Asn Pro Pro Glu Gly Thr Pro Lys Ser Leu Pro Thr Met Leu Leu

35 40 45

Tyr Asp Ala Gln Gly Leu Lys Leu Phe Glu Glu Ile Thr Tyr Val Asp

50 55 60

Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Glu Ile Glu Val Leu Gln Asn Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Lys Ile Val Glu Arg Val Pro Glu Asn Ala Gln Leu Leu Glu Leu

85 90 95

Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Ile Lys Ile Leu Leu Gln Glu Phe Glu

100 105 110

Arg Thr Gly Lys His Val Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Ser Leu Ser

115 120 125

Glu Leu Gln Arg Thr Phe Ala Glu Val Ser Ser Asp Glu Tyr Ser His

130 135 140

Val Asp Leu His Gly Leu His Gly Thr Tyr Asp Asp Ala Leu Ala Trp

145 150 155 160

Leu Ser Asn Pro Gln Asn Leu Gln Arg Pro Thr Val Val Met Ser Met

165 170 175

Gly Ser Ser Ile Gly Asn Phe Ser Arg Glu Gly Ala Ala Glu Phe Leu

180 185 190

Ala Gln Phe Ala Arg Leu Leu Lys Pro Ser Asp Leu Met Ile Ile Gly

195 200 205

Leu Asp Ala Cys Thr Asp Pro Glu Lys Val Tyr Lys Ala Tyr Asn Asp

210 215 220

Ser Lys Gly Ile Thr Gln Arg Phe Tyr Glu Asn Gly Leu Leu His Ala

225 230 235 240

Asn Ala Val Leu Gly Tyr Glu Ala Phe Lys Leu Ser Glu Trp Glu Val

245 250 255

Val Thr Asp Tyr Asp Val Asp Gly Gly Arg His Arg Ala Phe Tyr Ser

260 265 270

Pro Lys Gln Asp Val Thr Ile Asp Gly Val Leu Leu Gln Lys Gly Glu

275 280 285

Lys Leu Val Phe Glu Glu Ala Thr Lys Tyr Ser Pro His Gln Arg Glu

290 295 300

Gln Leu Trp Arg Asp Ala Asn Leu Val Leu Cys Asp Glu Leu Gly Asn

305 310 315 320

Ser Ser Glu Glu Tyr His Ile His Leu Leu Ser Pro Pro Thr Leu Ser

325 330 335

Leu Pro Ser Gln Pro Ser Glu Tyr Ala Ala Asn Pro Val Pro Ser Phe

340 345 350

Lys Glu Phe Gln Ser Leu Trp Thr Ala Trp Asp Thr Val Thr Lys Ala

355 360 365

Met Val Pro Arg Glu Glu Leu Leu Ala Lys Pro Ile Lys Leu Arg Asn

370 375 380

Ala Leu Ile Phe Tyr Phe Gly His Ile Pro Thr Phe Asn Asp Ile His

385 390 395 400

Leu Thr Arg Ala Leu Gly Gly Ser Pro Thr Glu Pro Arg Asn Tyr Arg

405 410 415

Gln Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp Asn Pro Glu His

420 425 430

Cys His Ser His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro Pro Leu Ala Glu

435 440 445

Ile Leu Asp Tyr Gln Asn Arg Val Arg Ser Arg Ile Glu Ser Val Leu

450 455 460

Gln Arg Asp Asp Ile Thr Arg Asn Arg Cys Leu Gly Glu Ala Leu Trp

465 470 475 480

Ile Gly Phe Glu His Glu Ala Met His Leu Glu Thr Phe Leu Tyr Met

485 490 495

Leu Leu Gln Ser Asp Lys Thr Leu Pro Pro Pro Leu Ala Asp Arg Pro

500 505 510

Asp Phe Glu Lys Leu Phe His Gln Ala Arg Ala Asn Ala Lys Pro Asn

515 520 525

Glu Trp Phe Ala Ile Pro Glu Gln Thr Leu Ser Ile Gly Leu Asp Asp

530 535 540

Thr Asp Glu Arg Ser Leu Pro Asp Met Ser Phe Gly Trp Asp Asn Glu

545 550 555 560

Lys Pro Arg Arg Thr Ile Thr Val Arg Ala Phe Glu Ala Gln Ala Arg

565 570 575

Ala Ile Thr Asn Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Leu Gln Ala Thr Arg Gln

580 585 590

Arg Arg Arg Pro Glu Ser Trp Val Leu Thr His Ser Asp Glu Asn Tyr

595 600 605

Pro Ile Ser Lys Gly Val Thr Met Glu Ser Ser Gln Ala Thr Lys Asp

610 615 620

Phe Met Asp Asn Phe Ala Val Arg Thr Val Phe Gly Arg Val Pro Leu

625 630 635 640

Glu Phe Ala Gln Asp Trp Pro Val Met Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ser

645 650 655

Gln Tyr Ala Glu Trp Val Gly Cys Arg Leu Pro Thr Tyr Glu Glu Val

660 665 670

Lys Ser Ile Tyr Asn Tyr Ser Ala Gln Leu Lys Glu Ala Arg Gln Arg

675 680 685

Glu Pro Ser Asp His Glu Ser Asn Gly Val Asn Gly Thr Asn Gly Asp

690 695 700

Met Met Thr Asn Gly His Ser Lys Ile His Pro Asp Lys Pro Arg Thr

705 710 715 720

Pro Glu His Gln Pro Val Gln Pro Pro Ser Gln Ser Thr Met Pro Val

725 730 735

Phe Val Asp Leu His Gly Cys Asn Val Gly Phe Lys His Trp His Pro

740 745 750

Ser Pro Val Ile Gln Asn Gly Asp Arg Leu Ala Gly Gln Gly Glu Phe

755 760 765

Gly Gly Val Trp Glu Trp Thr Ser Thr Pro Leu Thr Pro His Asp Gly

770 775 780

Phe Lys Ala Met Asp Ile Tyr Pro Gly Tyr Thr Ala Asp Phe Phe Asp

785 790 795 800

Gly Lys His Asn Ile Val Leu Gly Gly Ser Trp Ala Thr His Pro Arg

805 810 815

Ile Ala Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn Trp Tyr Gln His Asn Tyr Pro

820 825 830

Tyr Thr Trp Ala Gly Ala Arg Leu Val Arg Ser Gln

835 840

<210> 14

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Met Ser Ala Pro Ala Pro Phe Gly Ala Ser Met Ala Lys Ala His Phe

1 5 10 15

Leu Phe Asp Pro Asp Phe Lys Asn Leu Asn His Gly Ser Phe Gly Thr

20 25 30

Tyr Pro Ile Ala Val Gln Thr Ala Leu Arg His Phe Gln Ser Gln Val

35 40 45

Glu Ala Arg Pro Asp Pro Phe Ile Arg His Ile Gln Pro Gln Leu Ile

50 55 60

Asp Glu Ser Arg Arg Ala Val Ala Ser Leu Leu Asn Val Pro Thr Asn

65 70 75 80

Glu Cys Val Phe Val Lys Asn Ala Ser Thr Gly Ile Asn Thr Val Leu

85 90 95

Arg Asn Leu Val Phe Lys Gln Asp Asp Val Val Val Tyr Phe Asp Thr

100 105 110

Val Tyr Gly Ala Val Glu Lys Thr Leu Val Ser Leu Val Glu Thr Thr

115 120 125

Pro Leu Gln Leu Arg Lys Val Gln Tyr Gln Leu Pro Ile Ser His Asp

130 135 140

Glu Leu Val Arg Arg Phe Leu Glu Val Val Ala Lys Ala Lys Ala Asp

145 150 155 160

Gly Leu Lys Val Arg Val Ala Val Phe Asp Thr Ile Val Ser Met Pro

165 170 175

Gly Val Arg Phe Pro Phe Glu Arg Leu Ile Glu Ala Cys Arg Ala Glu

180 185 190

Gly Ile Leu Ser Val Val Asp Gly Ala His Gly Ile Gly Gln Ile Pro

195 200 205

Leu Asp Leu Gly Ala Leu Gln Pro Asp Phe Leu Thr Thr Asn Leu His

210 215 220

Lys Trp Leu Tyr Thr Pro Arg Gly Ser Ala Ile Leu Tyr Val Pro Leu

225 230 235 240

Arg Asn Gln His Leu Ile Arg Thr Thr Leu Pro Thr Ser Trp Gly Phe

245 250 255

Ile Pro Ser Pro Asp Ser Pro Ala Thr Ala Pro Ser Leu Met Arg Ser

260 265 270

Ser Ser Gly Lys Ser Ala Phe Glu Ala Leu Phe Glu Phe Val Ala Thr

275 280 285

Thr Asp Asp Thr Ala Tyr Leu Cys Val Pro Ala Ala Leu Lys Phe Arg

290 295 300

Ser Gln Val Cys Gly Gly Glu Asp Arg Ile Tyr Ala Tyr Leu Glu Lys

305 310 315 320

Leu Ala Leu Glu Ala Gly Asp Ile Val Ala Ala Ala Leu Gly Thr Glu

325 330 335

Val Met Gln Glu Pro Asp Leu Lys Pro Gly Glu Val Ser Gln Leu Arg

340 345 350

Arg Cys Ala Met Ala Thr Val Arg Leu Pro Phe Ala Val Ser Gly Gly

355 360 365

Glu Glu Asp Pro Lys Lys Ala Ser Ala Arg Leu Arg Leu Gln Ala Ala

370 375 380

Gln Ala Ala Glu Val Ala Gly Glu Ile Gln Thr Ala Leu Ala Arg Asp

385 390 395 400

Tyr Gly Thr Phe Val Pro Val Phe Ala His Gly Gly Trp Leu Trp Thr

405 410 415

Arg Leu Ser Ala Gln Val Tyr Leu Glu Lys Ser Asp Phe Glu Trp Val

420 425 430

Ala Gly Val Leu Ser Glu Leu Cys Asn Lys Val Val Arg Lys Phe Ala

435 440 445

Glu Pro Lys Leu

450

<210> 15

<211> 4380

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aacaggaatg ttcctttcga aaattgagga agccttatgc ccttcaaccc tacttagctg 60

ccaattattc cgggcttgtg acccgctacc cgataaatag gtcggctgaa aaatttcgtt 120

gcaatatcaa caaaaaggcc tatcattggg aggtgtcgca ccaagtactt ttgcgaagcg 180

ccatctgacg gattttcaaa agatgtatat gctcggtgcg gaaacctacg aaaggatttt 240

ttacccatga gcccgctgcc gtgcccggcg aaaaacgtgg aaattgtgga tattcatcag 300

aacgatgtgg aatttagcct ggtgagcgaa attcgcaaag gcctgaaccc gccggaaggc 360

accccgaaaa gcctgccgac catgctgctg tatgatgcgc agggcctgaa actgtttgaa 420

gaaattacct atgtggatga atattatctg accaacgcgg aaattgaagt gctgcagaac 480

tatagcaaaa aaattgtgga acgcgtgccg gaaaacgcgc agctgctgga actgggcagc 540

ggcaacctgc gcaaaattaa aattctgctg caggaatttg aacgcaccgg caaacatgtg 600

gattattatg cgctggatct gagcctgagc gaactgcagc gcacctttgc ggaagtgagc 660

agcgatgaat atagccatgt ggatctgcat ggcctgcatg gcacctatga tgatgcgctg 720

gcgtggctga gcaacccgca gaacctgcag cgcccgaccg tggtgatgag catgggcagc 780

agcattggca actttagccg cgaaggcgcg gcggaatttc tggcgcagtt tgcgcgcctg 840

ctgaaaccga gcgatctgat gattattggc ctggatgcgt gcaccgatcc ggaaaaagtg 900

tataaagcgt ataacgatag caaaggcatt acccagcgct tttatgaaaa cggcctgctg 960

catgcgaacg cggtgctggg ctatgaagcg tttaaactga gcgaatggga agtggtgacc 1020

gattatgatg tggatggcgg ccgccatcgc gcgttttata gcccgaaaca ggatgtgacc 1080

attgatggcg tgctgctgca gaaaggcgaa aaactggtgt ttgaagaagc gaccaaatat 1140

agcccgcatc agcgcgaaca gctgtggcgc gatgcgaacc tggtgctgtg cgatgaactg 1200

ggcaacagca gcgaagaata tcatattcat ctgctgagcc cgccgaccct gagcctgccg 1260

agccagccga gcgaatatgc ggcgaacccg gtgccgagct ttaaagaatt tcagagcctg 1320

tggaccgcgt gggataccgt gaccaaagcg atggtgccgc gcgaagaact gctggcgaaa 1380

ccgattaaac tgcgcaacgc gctgattttt tattttggcc atattccgac ctttaacgat 1440

attcatctga cccgcgcgct gggcggcagc ccgaccgaac cgcgcaacta tcgccagatt 1500

tttgaacgcg gcattgatcc ggatgtggat aacccggaac attgccatag ccatagcgaa 1560

attccggatg aatggccgcc gctggcggaa attctggatt atcagaaccg cgtgcgcagc 1620

cgcattgaaa gcgtgctgca gcgcgatgat attacccgca accgctgcct gggcgaagcg 1680

ctgtggattg gctttgaaca tgaagcgatg catctggaaa cctttctgta tatgctgctg 1740

cagagcgata aaaccctgcc gccgccgctg gcggatcgcc cggattttga aaaactgttt 1800

catcaggcgc gcgcgaacgc gaaaccgaac gaatggtttg cgattccgga acagaccctg 1860

agcattggcc tggatgatac cgatgaacgc agcctgccgg atatgagctt tggctgggat 1920

aacgaaaaac cgcgccgcac cattaccgtg cgcgcgtttg aagcgcaggc gcgcgcgatt 1980

accaacggcg aatatgcgaa atatctgcag gcgacccgcc agcgccgccg cccggaaagc 2040

tgggtgctga cccatagcga tgaaaactat ccgattagca aaggcgtgac catggaaagc 2100

agccaggcga ccaaagattt tatggataac tttgcggtgc gcaccgtgtt tggccgcgtg 2160

ccgctggaat ttgcgcagga ttggccggtg atggcgagct atgatgaact gagccagtat 2220

gcggaatggg tgggctgccg cctgccgacc tatgaagaag tgaaaagcat ttataactat 2280

agcgcgcagc tgaaagaagc gcgccagcgc gaaccgagcg atcatgaaag caacggcgtg 2340

aacggcacca acggcgatat gatgaccaac ggccatagca aaattcatcc ggataaaccg 2400

cgcaccccgg aacatcagcc ggtgcagccg ccgagccaga gcaccatgcc ggtgtttgtg 2460

gatctgcatg gctgcaacgt gggctttaaa cattggcatc cgagcccggt gattcagaac 2520

ggcgatcgcc tggcgggcca gggcgaattt ggcggcgtgt gggaatggac cagcaccccg 2580

ctgaccccgc atgatggctt taaagcgatg gatatttatc cgggctatac cgcggatttt 2640

tttgatggca aacataacat tgtgctgggc ggcagctggg cgacccatcc gcgcattgcg 2700

ggccgcacca cctttgtgaa ctggtatcag cataactatc cgtatacctg ggcgggcgcg 2760

cgcctggtgc gcagccagaa caggaatgtt cctttcgaaa attgaggaag ccttatgccc 2820

ttcaacccta cttagctgcc aattattccg ggcttgtgac ccgctacccg ataaataggt 2880

cggctgaaaa atttcgttgc aatatcaaca aaaaggccta tcattgggag gtgtcgcacc 2940

aagtactttt gcgaagcgcc atctgacgga ttttcaaaag atgtatatgc tcggtgcgga 3000

aacctacgaa aggatttttt acccatgagc gcgccggcgc cgtttggcgc gagcatggcg 3060

aaagcgcatt ttctgtttga tccggatttt aaaaacctga accatggcag ctttggcacc 3120

tatccgattg cggtgcagac cgcgctgcgc cattttcaga gccaggtgga agcgcgcccg 3180

gatccgttta ttcgccatat tcagccgcag ctgattgatg aaagccgccg cgcggtggcg 3240

agcctgctga acgtgccgac caacgaatgc gtgtttgtga aaaacgcgag caccggcatt 3300

aacaccgtgc tgcgcaacct ggtgtttaaa caggatgatg tggtggtgta ttttgatacc 3360

gtgtatggcg cggtggaaaa aaccctggtg agcctggtgg aaaccacccc gctgcagctg 3420

cgcaaagtgc agtatcagct gccgattagc catgatgaac tggtgcgccg ctttctggaa 3480

gtggtggcga aagcgaaagc ggatggcctg aaagtgcgcg tggcggtgtt tgataccatt 3540

gtgagcatgc cgggcgtgcg ctttccgttt gaacgcctga ttgaagcgtg ccgcgcggaa 3600

ggcattctga gcgtggtgga tggcgcgcat ggcattggcc agattccgct ggatctgggc 3660

gcgctgcagc cggattttct gaccaccaac ctgcataaat ggctgtatac cccgcgcggc 3720

agcgcgattc tgtatgtgcc gctgcgcaac cagcatctga ttcgcaccac cctgccgacc 3780

agctggggct ttattccgag cccggatagc ccggcgaccg cgccgagcct gatgcgcagc 3840

agcagcggca aaagcgcgtt tgaagcgctg tttgaatttg tggcgaccac cgatgatacc 3900

gcgtatctgt gcgtgccggc ggcgctgaaa tttcgcagcc aggtgtgcgg cggcgaagat 3960

cgcatttatg cgtatctgga aaaactggcg ctggaagcgg gcgatattgt ggcggcggcg 4020

ctgggcaccg aagtgatgca ggaaccggat ctgaaaccgg gcgaagtgag ccagctgcgc 4080

cgctgcgcga tggcgaccgt gcgcctgccg tttgcggtga gcggcggcga agaagatccg 4140

aaaaaagcga gcgcgcgcct gcgcctgcag gcggcgcagg cggcggaagt ggcgggcgaa 4200

attcagaccg cgctggcgcg cgattatggc acctttgtgc cggtgtttgc gcatggcggc 4260

tggctgtgga cccgcctgag cgcgcaggtg tatctggaaa aaagcgattt tgaatgggtg 4320

gcgggcgtgc tgagcgaact gtgcaacaaa gtggtgcgca aatttgcgga accgaaactg 4380

Claims

1. 一种基因工程菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌为宿主细胞，敲除宿主细胞中的肽聚糖内切酶的编码基因、胞内蛋白酶的编码基因和/或谷氨酸-胱氨酸连接酶的编码基因中的一种或多种，并同时表达egt12基因簇；所述egt12基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所述肽聚糖内切酶的编码基因如Gene ID：1020444所示；所述胞内蛋白酶的编码基因如Gene ID：3345370所示；所述谷氨酸-胱氨酸连接酶的氨基酸序列如GenBank：BAC00130.1所示；所述egt12基因簇整合于宿主染色体基因组上。

2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为C . glutamicum ATCC 13032或C . glutamicum ATCC 14067。

3.一种生产麦角硫因的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的基因工程菌在生物合成麦角硫因中的应用。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵体系中含有：葡萄糖10~50g/L，玉米粉15~30g/L，硫酸铵10~15g/L，醋酸铵5~10g/L，尿素1~2g/L，柠檬酸钠1~5g/L，磷酸氢二钠1~2g/L，磷酸二氢钠1~2g/L，微量元素0.5~1g/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵体系中含有：葡萄糖50g/L，玉米粉30g/L，硫酸铵15g/L，醋酸铵5g/L，尿素2g/L，柠檬酸钠5g/L，磷酸氢二钠1.5g/L，磷酸二氢钠1.5g/L，微量元素1g/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵体系中还含有生物素0.1~1mg/L。

7.根据权利要求3~6任一所述的方法，其特征在于，发酵体系采用分批补料发酵，补料培养基中添加半胱氨酸和蛋氨酸；所述半胱氨酸与蛋氨酸浓度比为(1~4):(1~4)。