CN107250347A - 麦角硫因生产能力增强的转化丝状菌及麦角硫因的制备方法 - Google Patents

麦角硫因生产能力增强的转化丝状菌及麦角硫因的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供具有麦角硫因生产能力的生物体，该生物体与现有技术相比，更加简便和耗时短，并且能够高产量地生产麦角硫因，因此能够以工业规模制备麦角硫因。上述目的通过插入了编码以下(1)的酶的基因或者编码以下(1)和(2)的酶的基因，并且过量表达该插入的基因的转化丝状菌解决。(1)在S‑腺苷甲硫氨酸、铁(II)和氧的存在下，催化由组氨酸和半胱氨酸生成组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应的酶；(2)将5’‑磷酸吡哆醛作为辅酶，催化由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应的酶。

Description

麦角硫因生产能力增强的转化丝状菌及麦角硫因的制备方法
关联申请的相互参照
本申请主张于2015年1月30日申请的申请号为特愿2015-17328的日本专利申请以及于2015年8月7日申请的申请号为特愿2015-157444号的日本专利申请的优先权，并以全文引用的形式在本文中公开。
技术领域
本发明涉及麦角硫因生产能力被认可的菌类和利用该菌类的麦角硫因的制备方法。
背景技术
下式[II]：
所表示的麦角硫因是一种含硫氨基酸，是已确认存在于包括人类在内的动物肝脏等脏器或血液中的生物物质。
已知麦角硫因具有抗氧化活性，据报道具有例如羟自由基的捕获作用、来自铁或铜依赖性过氧化氢的羟自由基的生成抑制作用、铜依赖性氧合血红蛋白的氧化抑制作用、肌红蛋白和过氧化氢对花生四烯酸的氧化抑制作用等。另外，据报道麦角硫因还具有弹性蛋白酶活性抑制作用、酪氨酸酶活性抑制作用、抗炎作用、细胞能量增进作用、抗应激作用、抗老化作用、皱纹形成抑制作用、脂质过氧化物生成抑制作用等。
充分利用作为具有这样的多种生理活性的功能性生物物质和耐热水溶性物质的特征，可期待将麦角硫因应用于功能性食品、营养补充剂、化妆品、药品、类药品(quasi-drug)、动物饲料等。
作为麦角硫因的制备方法，除了从动物的脏器或血液中提取的方法以外，还已知从具有麦角硫因生产能力的蕈类(mushrooms)的菌丝体中提取麦角硫因的方法(例如，参照以下专利文献1和2，该文献的全部内容以引用的方式在此公开)。另外，在以下非专利文献1和2(该文献的全部内容以引用的方式在此公开)中记载了大多数细菌没有麦角硫因生产能力，还记载了在菌类当中尽管黑曲霉(Aspergillus niger，黑曲霉)或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa，粉色面包霉菌)也具有生产麦角硫因的能力，但是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，面包酵母)几乎没有生产麦角硫因的能力。
另外，还报道了在具有生产麦角硫因的能力的菌类中麦角硫因的生物合成系统。例如，在以下非专利文献3和4(该文献的全部内容以引用的方式在此公开)中记载了粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的生物合成系统，以下非专利文献5(该文献的全部内容以引用的方式在此公开)记载了作为分裂酵母的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的生物合成系统。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第4865083号公报
专利文献2：日本特许第5231025号公报
非专利文献
非专利文献1：Donald B.Melville et al,J.Biol.Chem.1956,223:9-17
非专利文献2：Dorothy S.Genghof,J.Bacteriology,Aug.1970,p.475-478
非专利文献3：Fungal Genet Biol 49(2012)160-172
非专利文献4：Org Lett.2014Oct 17；16(20):5382-5385
非专利文献5：PLoS One 2014May 14；9(5):e97774
发明内容
发明要解决的问题
专利文献1和2记载的方法是在培养蕈类的菌丝体之后提取麦角硫因的方法，由于培养蕈类的菌丝体需要熟练和长期间，因此不适合工业规模生产麦角硫因。
从非专利文献1-5的记载可以获知，可以利用蕈类以外的一部分菌类来生物合成麦角硫因。其中，在非专利文献3中记载了使编码酶(NcEgt-1)的基因(NCU04343)缺失而转化成的转化粗糙脉孢菌，该酶(NcEgt-1)催化以下反应：将组氨酸的-NH2基甲基化生成组氨酸三甲基内盐(hercynine)，由该组氨酸三甲基内盐和半胱氨酸生成下列式[I]所示的组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜(hercynyl cysteine sulfoxide)。
另外，在非专利文献3和4中，作为能够对由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应进行催化的酶，记载了NCU04636和NCU11365。进而在非专利文献4中记载了，实际上从使NCU11365基因超表达(过量表达)而转化成的转化大肠杆菌中提取NCU11365，利用该NCU11365通过试验管内(in vitro)反应可由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因。
但是，在非专利文献3和4中并没有记载利用使基因NCU04343、NCU04636或NCU11365过量表达而转化成的转化体，通过活体内(in vivo)反应来生成麦角硫因。
另一方面，在非专利文献5中记载了使编码相当于上述NcEgt-1的酶的基因SPV+BC1604.01过量表达而转化成转化粟酒裂殖酵母，利用该转化粟酒裂殖酵母体内(in vivo)合成麦角硫因。但是，在非专利文献5中记载的利用转化粟酒裂殖酵母所获得的麦角硫因的量非常少，并且没有记载使相当于上述NCU11365基因的基因过量表达而转化成的转化体。
因此，本发明要解决的问题是，提供与专利文献1和2记载的蕈类菌丝体相比可简便、短时间而高产量地生产麦角硫因，从而能够以工业规模制备麦角硫因的具有麦角硫因生产能力的生物体，以及提供利用该生物体制备高纯度麦角硫因含有物的方法。
用于解决问题的手段
本发明人为了解决上述问题而反复进行了深入研究，最终在一种菌类酱油曲霉(Aspergillus sojae，酱油麴霉)中，成功地鉴定了编码对由组氨酸和半胱氨酸生成组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应进行催化的酶的基因AsEgtA，以及编码对由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应进行催化的酶的基因AsEgtB和AsEgtC。
接着，本发明人通过制作用于过量表达分离的各基因的DNA构建体并将其导入酱油曲霉进行转化，成功地制作了过量表达AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC的转化酱油曲霉；过量表达AsEgtA和AsEgtB的转化酱油曲霉；以及过量表达AsEgtA和AsEgtC的转化酱油曲霉。
对这些转化酱油曲霉进行各种实验后，结果令人惊讶地发现过量表达AsEgtA的转化株相较于野生株，具有麦角硫因的生产能力提高的趋势，而过量表达AsEgtB或AsEgtC的转化株则没有发现这样的趋势。
更令人惊讶的是，在这样事实的基础上，发现了过量表达AsEgtA和AsEgtB的转化株以及过量表达AsEgtA和AsEgtC的转化株相较于过量表达AsEgtA的转化株，具有麦角硫因的生产能力提高的趋势。这显示了过量表达参与麦角硫因生物合成系统的两种基因的转化体累加性地、甚至于协同性地增强麦角硫因的生产能力。
另外，过量表达参与麦角硫因生物合成系统的上述一种或者两种基因的转化株可以按照常规方法进行培养，其增殖速度等与野生株也无显著差异。本发明是基于这样的成功例和见解而完成的。
由此，根据本发明提供了一种转化丝状菌，该转化丝状菌中插入了编码以下(1)的酶的基因或者编码以下(1)和(2)的酶的基因，并且过量表达该插入的基因。
(1)在S-腺苷甲硫氨酸、铁(II)和氧的存在下，催化由组氨酸和半胱氨酸生成组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应的酶；
(2)将5’-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应的酶。
优选地，在本发明的转化丝状菌中，上述丝状菌为曲霉属(Aspergillus)微生物。
优选地，在本发明的转化丝状菌中，上述丝状菌为选自酱油曲霉(Aspergillus sojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、白曲霉(Aspergillus kawachii)以及斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)中的曲霉属微生物。
优选地，在本发明的转化丝状菌中，上述转化丝状菌是：编码上述(1)的酶的基因或者编码上述(1)和(2)的酶的基因的表达增强，使得与宿主丝状菌相比麦角硫因的量增加的转化丝状菌。
优选地，在本发明的转化丝状菌中，上述转化丝状菌是：编码上述(1)和(2)的酶的基因的表达增强，使得与编码上述(1)的酶的基因的表达增强的转化丝状菌相比，麦角硫因的量增加的转化丝状菌。
优选地，在本发明的转化丝状菌中，上述转化丝状菌是：编码上述(1)的酶的基因或者编码上述(1)和(2)的酶的基因的表达增强，使得利用适于宿主丝状菌生长的培养基将该转化丝状菌在30℃下培养3日时麦角硫因的量为每克质量的干燥菌体达到10.0mg以上的转化丝状菌。
优选地，在本发明的转化丝状菌中，编码上述(1)的酶的基因选自具有序列表中SEQ ID NO:1所示的碱基序列的基因、具有序列表中SEQ ID NO:23所示的碱基序列的基因、以及具有序列表中SEQ ID NO:33所示的碱基序列的基因，或者上述(1)的酶选自具有序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的酶、具有序列表中SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的酶、以及具有序列表中SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的酶。
优选地，在本发明的转化丝状菌中，编码上述(1)的酶的基因选自具有序列表中SEQ ID NO:1所示的碱基序列的基因、具有序列表中SEQ ID NO:23所示的碱基序列的基因、以及具有序列表中SEQ ID NO:33所示的碱基序列的基因，或者上述(1)的酶选自具有序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的酶、具有序列表中SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的酶、以及具有序列表中SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的酶。
根据本发明的其他方面，提供了一种高纯度麦角硫因含有物的制备方法，该制备方法包括：利用适于宿主丝状菌生长的培养基培养本发明的转化丝状菌，从所得的培养物中得到纯度为5％以上的麦角硫因含有物的工序。
根据本发明的其他方面，提供一种重组载体，该重组载体包括：选自编码上述(1)的酶的基因和编码上述(2)的酶的基因中的至少一种基因、以及异源基因。
根据本发明的其他方面，提供一种组合物，该组合物包含：含有编码上述(1)的酶的基因和异源基因的重组载体、以及含有编码上述(2)的酶的基因和异源基因的重组载体。
优选地，在本发明的重组载体和组合物中，编码上述(1)的酶的基因和编码上述(2)的酶的基因是来源于应插入上述重组载体的宿主生物的基因，或者是为了在该宿主生物中表达而进行了最优化的基因。
根据本发明的其他方面，提供了一种转化大肠杆菌，该转化大肠杆菌插入了编码上述(1)的酶的基因或者编码上述(1)和(2)的酶的基因，并且过量表达该插入的基因。
发明效果
根据本发明的转化丝状菌或制备方法，能够通过常规培养丝状菌的条件，制备高含量且高纯度的麦角硫因。结果，根据本发明，与以往的具有麦角硫因生产能力的蕈类或者使用该蕈类制备麦角硫因的方法相比，能够简便地在短时间内生产麦角硫因。因此，根据本发明可期待以工业规模制备麦角硫因。
附图说明
图1是表示实施例记载的转化酱油曲霉和对照株的麦角硫因产量的检测结果的图，图中的“EGT”表示麦角硫因；
图2是表示从实施例记载的对照株和AsEgtA转化株中得到的麦角硫因提取液的高效液相色谱图(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)；
图3是使用从实施例记载的转化株和对照株中提取的全蛋白质的SDS-PAGE照片；Lane1表示来自对照株的蛋白质、Lane2表示来自AsEgtA转化株的蛋白质、Lane3表示来自AsEgtB转化株的蛋白质、Lane4表示来自AsEgtC转化株的蛋白质、Lane5表示来自(AsEgtA+AsEgtB)转化株的蛋白质、Lane6表示来自(AsEgtA+AsEgtC)转化株的蛋白质；
图4是表示菌类的麦角硫因生物合成系统的示意图，图中“SAM”表示S-腺苷甲硫氨酸，“PLP”表示5’-磷酸吡哆醛；
图5是表示实施例记载的转化米曲霉和对照株的麦角硫因产量的检测结果的图，图中的“EGT”表示麦角硫因；
图6是表示实施例记载的转化大肠杆菌和对照株的麦角硫因产量的检测结果的图；
图7是表示实施例记载的转化大肠杆菌的培养结果和对照株的麦角硫因产量的检测结果的图，图中的“菌体内”表示麦角硫因提取液中的麦角硫因的定量结果，“菌体外”表示培养上清中的麦角硫因的定量结果。
具体实施方式
以下说明本发明的详情。
(本发明的转化丝状菌的概要)
本发明的转化丝状菌插入了编码以下(1)的酶的基因或者编码以下(1)和(2)的酶的基因，并且过量表达该插入的基因。
(1)在S-腺苷甲硫氨酸、铁(II)和氧的存在下，催化由组氨酸和半胱氨酸生成组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应的酶；
(2)将5’-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应的酶。
本发明的转化丝状菌，通过过量表达作为外源基因而插入的编码上述(1)和(2)的酶(以下分别称为酶(1)和酶(2))的基因，从而能够最终由组氨酸和半胱氨酸生成麦角硫因。本发明的转化丝状菌大致分为两种形态：过量表达编码酶(1)的基因，且不过量表达编码酶(2)的基因的转化丝状菌；以及，过量表达编码酶(1)的基因，且过量表达编码酶(2)的基因的转化丝状菌。应予说明，过量表达的编码酶(1)的基因和过量表达的编码酶(2)的基因可以分别是单独一种或者两种以上。
菌类所设想的麦角硫因的生物合成系统示意图如图4所示。酶(1)相当于图4中的egtA，酶(2)相当于图4中的egtB或者egtC。
(酶(1)和酶(2)的酶学性质)
如图4所示，酶(1)具有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)依赖性甲基转移酶的活性，可以SAM依赖性地催化将组氨酸转化为-NH2基三甲基化的组氨酸三甲基内盐的反应。而且，酶(1)具有硫酸酯酶活性，在铁(II)和氧的存在下，可以催化由组氨酸三甲基内盐和半胱氨酸生成下列式[I]：
所示的组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应。因此，酶(1)因为具有这些活性，结果能够在S-腺苷甲硫氨酸、铁(II)和氧的存在下，由组氨酸和半胱氨酸生成组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜。
酶(2)具有5’-磷酸吡哆醛(PLP)结合型半胱氨酸脱硫酶活性，能够将PLP作为辅酶，催化由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应
本发明的转化丝状菌，通过表达编码酶(1)或编码酶(1)和酶(2)的基因，在各个酶的活化条件下，能够由组氨酸和半胱氨酸生成麦角硫因。
(酶(1)和酶(2)的结构特性)
酶(1)只要是具有上述酶学性质的酶，即只要是具有在S-腺苷甲硫氨酸、铁(II)和氧的存在下，催化由组氨酸和半胱氨酸生成组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应的SAM依赖性甲基转移酶活性和硫酸酯酶活性的酶，则不受限于氨基酸序列、整体或部分的立体结构、分子量等结构特性；最适pH、最适温度、失活条件等生化学性质；来源物种等没有特别限定。但是，酶(1)由于具有SAM依赖性甲基转移酶的活性和硫酸酯酶活性，因此优选为含有SAM依赖性甲基转移酶和硫酸酯酶内保存良好的结构域(Domain)的酶。
作为SAM依赖性甲基转移酶的保守结构域(conserved domain)，例如可列举含有结构域DUF2260的SAM依赖性甲基转移酶结构域。另外，作为硫酸酯酶的保守结构域，例如可列举甲酰甘氨酸生成酶(FGE)-硫酸酯酶结构域。但是，上述结构域可以不连结成一体，例如也可以在结构域内包含非保守结构域。另外，酶(1)优选为在SAM依赖性甲基转移酶的保守结构域和硫酸酯酶的保守结构域之间包含DinB_2结构域，更优选为包含含有铁结合基序HX3HXE的DinB_2结构域。
例如，酶(1)的一形态具有包含SAM依赖性甲基转移酶的保守结构域、DinB_2结构域和硫酸酯酶的保守结构域的结构。酶(1)的另一形态具有包含含有结构域DUF2260的SAM依赖性甲基转移酶、含有HX3HXE的DinB_2结构域和FGE-硫酸酯酶结构域的结构。
酶(1)的优选形态是：具有与非专利文献3记载的NcEgt-1(NCU04343)的氨基酸序列的序列同一性优选为30％以上、更优选为40％以上、进一步优选为45％以上的氨基酸序列。应予说明，在本说明书中“序列同一性”是指将两个序列比对时序列间的同一性(一致性，Identity)，而非序列间的相似性(Simirality)。
酶(1)的优选形态的具体例子，可列举登录号(括号内的数值表示以SEQ ID NO:4所示的AsEgtA蛋白质的氨基酸序列作为查询序列(query)由Blastp所得的序列同一性)分别为：XP_001727309.1(97％)、XP_002375556.1(97％)、XP_001211614.1(74％)、GAA90479.1(75％)、XP_001261027.1(72％)、XP_001275843.1(72％)、EDP55069.1(72％)、XP_755900.1(72％)、EHA24811.1(74％)、XP_001397117.2(73％)、EYE96655.1(72％)、CAK42541.1(71％)、XP_680889.1(69％)、EPS32723.1(66％)、GAD91762.1(63％)、EKV06018.1(63％)、XP_002487159.1(61％)、XP_002145387.1(61％)、CDM31097.1(62％)、XP_002623045.1(57％)、EQL36096.1(57％)、EEQ91012.1(57％)、XP_002794316.1(57％)、XP_002540839.1(57％)、XP_001246505.1(57％)、XP_003066681.1(56％)、EFW18329.1(56％)、EEH06820.1(56％)、XP_003172803.1(55％)、EGE82230.1(56％)、EGD95426.1(54％)、EZF30391.1(54％)、EHY53149.1(53％)、XP_002844140.1(54％)、XP_003237555.1(54％)、EXJ78765.1(52％)、XP_001543980.1(53％)、EXJ84167.1(53％)、EXJ76804.1(51％)、ETI21425.1(52％)、EXJ55868.1(52％)、EKG13377.1(51％)、XP_003836988.1(51％)、EON60831.1(50％)、EGE08446.1(52％)、EMD86163.1(51％)、EUN21814.1(51％)、EMD69895.1(50％)、EME40669.1(52％)、EUC45427.1(51％)、EEH18365.1(52％)、XP_001939537.1(51％)、EUC28327.1(50％)、XP_003296645.1(50％)、EER38486.1(54％)、XP_007587632.1(50％)、EOA87110.1(50％)、EEH47303.1(54％)、EMC91772.1(51％)、EJT79063.1(50％)、XP_007289878.1(51％)、EMF09308.1(50％)、XP_007274188.1(49％)、XP_003849540.1(51％)、ENH83409.1(50％)、EQB47754.1(48％)、XP_006693510.1(51％)、ETN41916.1(50％)、XP_003711933.1(49％)、EWG46299.1(50％)、EGU87412.1(49％)、ESZ95365.1(48％)、EGC47631.1(52％)、EXM31381.1(49％)、EXL83373.1(49％)、XP_385823.1(50％)、EMT70054.1(50％)、EXK95313.1(49％)、CCT71860.1(50％)、EXM04867.1(49％)、EXA38531.1(49％)、EWZ34577.1(49％)、EWY87102.1(49％)、ENH70585.1(49％)、EYB29661.1(50％)、EXK37219.1(49％)、EWZ95323.1(49％)、EGY20613.1(49％)、EME78671.1(50％)、EKJ73623.1(50％)、EFQ30701.1(48％)、EPE09977.1(48％)、EXV06624.1(49％)、ERS99852.1(49％)、EGO59462.1(49％)、XP_003348780.1(48％)、EFY99927.1(49％)、XP_007594915.1(47％)、XP_003660752.1(49％)、EAA27088.3(49％)、ERF68279.1(49％)、EFX04429.1(50％)、ETR98676.1(49％)、EFY84340.1(48％)、XP_006968620.1(48％)、XP_003048884.1(49％)、EHK20832.1(49％)、EPE24413.1(49％)、EJP62962.1(49％)、ETS83740.1(48％)、EHK45989.1(49％)、ELQ64904.1(47％)、XP_006672555.1(48％)、ELQ40007.1(46％)、EXL83375.1(50％)、EXK95315.1(50％)、CCE33591.1(48％)、EXM04869.1(51％)、EXA38533.1(50％)、EWZ95325.1(50％)、EXK37221.1(50％)、EWZ34579.1(50％)、EWY87104.1(50％)、CCX31754.1(47％)、XP_956324.2(46％)和XP_956324.2(46％)的蛋白质，但并不限于此。其中，例如登录号为XP_001727309.1(97％)的蛋白质是具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的蛋白质。另外，登录号为XP_001397117.2(73％)的蛋白质是具有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的蛋白质。由此，具有与AsEgtA蛋白质的氨基酸序列的序列同一性为40％以上、优选为50％以上、更优选为70％以上的氨基酸序列的甲基转移酶，或者具有被推定为甲基转移酶(methyltransferase，putative)的氨基酸序列或被视为甲基转移酶的假定蛋白质(hypothetical protein)的氨基酸序列的蛋白质，可以作为酶(1)而使用。
酶(2)也同样只要是具有上述酶学性质的酶，即只要是具有以5’-磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶，催化由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应的PLP结合型半胱氨酸脱硫酶活性的酶，则不受限于结构特性、生化学性质和来源物种等。但是，酶(2)由于具有PLP结合型半胱氨酸脱硫酶活性，因此优选包含PLP结合型半胱氨酸脱硫酶的保守结构域(Domain)。
作为酶(2)在结构上至少可为以下两个种类：含有与非专利文献3记载的NCU04636的序列同一性为75％左右的PLP结合型半胱氨酸脱硫酶结构域的结构；以及含有与非专利文献4记载的NCU11365的序列同一性为44％左右的PLP结合型半胱氨酸脱硫酶结构域的结构。酶(2)既可以是这两种酶中的任一种，也可以是这两种酶。
(酶(1)和(2)的氨基酸序列)
酶(1)和(2)只要是具有上述酶学性质、优选具有上述酶学性质和结构特性的酶，则对于氨基酸序列没有特别限定。例如作为具有上述酶学性质和结构特性的酶(1)的一形态有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，作为具有上述酶学性质和结构特性的酶(2)的一形态有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。具有SEQ ID NO:4-6所示的氨基酸序列的酶全部来源于酱油曲霉(Aspergillus so jae)，本发明人将其分别命名为AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC蛋白质。另外，编码这些酶的基因的碱基序列为SEQ ID NO:1-3所示的碱基序列。
同样地，作为具有上述酶学性质和结构特性的酶(1)的一形态，有SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。具有SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的酶，分别来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)，本发明人将其分别命名为AoEgtA蛋白质和AnEgtA蛋白质。另外，编码这些酶的基因的碱基序列分别为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:33所示的碱基序列。另外，作为具有上述酶学性质和结构特性的酶(2)的一形态，有SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。由于具有SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的酶分别来源于米曲霉，本发明人等将其分别命名为AoEgtB蛋白质和AoEgtC蛋白质。另外，编码该酶的基因的碱基序列分别为SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的碱基序列。
AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC是由编码存在于酱油曲霉的染色体DNA上的这些酶的基因所编码的蛋白质。另外，AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC是由编码存在于米曲霉的染色体DNA上的这些酶的基因所编码的蛋白质。而且，AnEgtA是由编码存在于黑曲霉的染色体DNA上的这些酶的基因所编码的蛋白质。在本说明书中有时会将这样的存在于生物源性染色体DNA上的基因和由该基因编码的蛋白质或酶分别称为“野生型基因”，以及“野生型蛋白质”或“野生型酶”。
酶(1)和(2)的氨基酸序列只要分别具有上述酶(1)和(2)的酶学性质，则也可以包含在野生型酶所具有的氨基酸序列中有一个至数个氨基酸缺失、置换、添加等的氨基酸序列。此处，氨基酸序列的“一个至数个氨基酸的缺失、置换、添加”中的“一个至数个”的范围没有特别限定，例如是指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个左右，更优选为1、2、3、4或5个左右。另外，“氨基酸的缺失”是指序列中的氨基酸残基的脱落或消失，“氨基酸的置换”是指序列中的氨基酸残基被替换为别的氨基酸残基，“氨基酸的添加”是序列中插入而添加新的氨基酸残基。
作为“一个至数个氨基酸的缺失、置换、添加”的具体形态，有一个至数个氨基酸被置换为其他的化学性相似的氨基酸的形态。例如，可列举将某疏水性氨基酸置换为其他疏水性氨基酸的情况，将某极性氨基酸替换为具有相同电荷的其他极性氨基酸的情况等。像这样化学性质相似的氨基酸，每个氨基酸在其技术领域均已知。列举具体的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸可列举出丙氨酸、缬胺酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸等。作为带正电荷的碱性氨基酸，可列举精氨酸、组氨酸或赖氨酸等。另外，作为带负电荷的酸性氨基酸，可列举天冬氨酸或谷氨酸等。
作为在野生型酶所具有的氨基酸序列中有一个至数个氨基酸缺失、置换、添加等的氨基酸序列，可列举与野生型酶所具有的氨基酸序列具有一定以上的序列同一性的氨基酸序列，例如可列举与野生型酶所具有的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性、优选为85％以上的序列同一性，更优选为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性，进一步优选为具有99.5％以上的序列同一性的氨基酸序列。
(编码酶(1)和(2)的氨基酸序列)
编码酶(1)和(2)的基因只要含有编码具有上述酶学性质、优选具有上述酶学性质和结构特性的酶(1)和(2)所具有的氨基酸序列的碱基序列，则没有特别限定。通过编码酶(1)和(2)的基因在转化丝状菌内过量表达，从而生产酶(1)和(2)。在本说明书中“基因的表达”是指通过转录或翻译等，以具有本来的催化剂活性的形态生产基因所编译的酶。另外，在本说明书中的“基因的过量表达”是指通过插入基因，使得宿主生物超过本来的表达量，生产该基因所编码的蛋白质(酶)。
编码酶(1)和(2)的基因既可以是在被导入宿主生物之际，能够在该基因转录后经由剪接(splicing)而生成酶(1)和(2)的基因，也可以是能够在该基因转录后不经由剪接(splicing)而生成酶(1)和(2)的基因，可以是二者中的任意一者。
编码酶(1)和(2)的基因可以与来源生物原本所具有的基因(即野生型基因)不完全相同，只要是至少编码具有上述酶学性质的酶的基因，也可以是具有与野生型基因的碱基序列的互补碱基序列在严格条件(stringent conditions)下杂交的碱基序列的DNA。
本说明书中“在严格条件下杂交的碱基序列”是指，将含有野生型基因的碱基序列的DNA用作探针，通过利用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印迹杂交(southern blothybridization)法等所获得的DNA碱基序列。
在本说明书中的“严格条件”是指，可明确识别特异性杂交信号和非特异性杂交信号的条件，根据所用的杂交系统、以及探针的种类、序列和长度而不同。这样的条件可以通过改变杂交的温度、清洗的温度和盐浓度来决定。例如，在连非特异性杂交信号都强烈地检测出的情况下，可以通过在提高杂交和清洗的温度的同时，根据需要降低清洗时的盐浓度，以提高特异性。另外，在连特异性杂交信号都检测不出的情况下，可以通过在降低杂交和清洗的温度的同时，根据需要提高清洗时的盐浓度，使杂交稳定化。
作为严格条件的具体例子，例如使用DNA探针作为探针，杂交使用5×SSC、1.0％(w/v)核酸杂交用封闭试剂(blocking reagent)(德国宝灵曼公司)、0.1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、0.02％(w/v)SDS，进行一夜(8-16小时左右)。使用0.1-0.5×SSC、0.1％(w/v)SDS、优选使用0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS，清洗两次每次15分钟。进行杂交和清洗的温度为65℃以上，优选为68℃以上。
另外，作为具有在严格条件下杂交的碱基序列的DNA，可列举例如使用将具有来自菌落或噬菌斑的野生型基因的碱基序列的DNA或者该DNA片段固定化的过滤器，通过在上述严格条件下杂交而得到的DNA；或在0.5-2.0M的NaCl的存在下以40-75℃实施杂交后，优选在0.7-1.0M的NaCl的存在下以65℃实施杂交后，能够通过使用0.1-1×SSC溶液(1×SSC溶液为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)在65℃的条件下清洗过滤器而鉴定的DNA等。探针的制作或杂交的方法可以按照以下文献记载的方法实施：Molecular Cloning：A laboratoryManual，2nd-Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989、Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，John Wiley&Sons，1987-1997(以下将这些文献称为参考技术文献。这些文献的全部内容以引用的方式在此公开)。应予说明，除了以上缓冲液的盐浓度或温度等条件以外，本领域技术人员也可以对探针浓度、探针长度、反应时间等各种条件加以考虑，适当设定用于获得具有与野生型基因的碱基序列的互补碱基序列和在严格条件下杂交的碱基序列的DNA的条件。
作为具有在严格条件下杂交的碱基序列的DNA，可列举与用作探针的含有野生型基因的碱基序列的DNA的碱基序列具有一定以上的序列同一性的DNA。例如，与野生型基因的碱基序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上，进一步优选为99.5％以上的序列同一性的DNA。
作为与野生型基因的碱基序列的互补碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列，包括例如在野生型基因的碱基序列中有一个至数个、优选为1-50个、更优选为从1-30个、进一步优选为1-20个、再进一步优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基缺失、置换、添加等的碱基序列。在此，“碱基的缺失”是指序列中的碱基有脱落或消失，“碱基的置换”是指序列中的碱基被替换为别的碱基，“碱基的添加”是指插入而添加新的碱基。
由与野生型基因的碱基序列的互补碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列所编码的酶，可能具有在由野生型基因的碱基序列编码的酶所具有的氨基酸序列中有一个至数个氨基酸缺失、置换、添加等的氨基序列，但是具有与由野生型基因所编码的酶相同的酶活性。
(用于计算序列同一性的手段)
获取碱基序列或氨基酸序列的序列同一性的方法没有特别限制，例如可以利用常规方法，将野生型基因或由野生型基因编码的酶的氨基酸序列与目标碱基序列或氨基酸序列进行比对，通过使用用于计算两个序列的一致率的程序来求得。
作为用于计算两个氨基酸序列或碱基序列的一致率的程序，例如，已知karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268、1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877、1993)，使用该算法的BLAST程序由Altschul等开发(J.Mol.Biol.215：403－410、1990)。而且，还已知了灵敏度比BLAST更好的确定序列同一性的程序Gapped BLAST(Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1997)。因此，本领域技术人员例如可以利用上述程序，针对所提供的序列从数据库中检索表现出高序列同一性的序列。这些程序，例如可以在美国National Center for Biotechnology Information的网页(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中使用。
上述各方法通常可以用于从数据库中检索表现出序列同一性的序列，但是作为确定个别序列的序列同一性的手段，也可以使用Genetyx网络版version12.0.1(GENETYX公司)的同源性分析。该方法基于Lipman-Pearson法(Science 227：1435-1441，1985)。分析碱基的序列同一性时，尽可能使用编码蛋白质的区域(CDS或ORF)。
(编码酶(1)和(2)的基因的来源)
编码酶(1)和(2)的基因例如来源于具有麦角硫因生产能力的物种或者出现酶(1)和(2)的表达物种等。作为编码酶(1)和酶(2)的基因的来源生物，例如可列举微生物。由于在微生物当中，丝状菌的很多菌种已知具有麦角硫因生产能力，因此优选丝状菌。作为丝状菌的具体例，可列举曲霉(Aspergillus)属丝状菌，更具体地可列举酱油曲霉(Aspergillus sojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、白曲霉(Aspergillus kawachii)以及斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)等。
作为上述曲霉属丝状菌的具体例而列举的酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、宇佐美曲霉、白曲霉以及斋藤曲霉在味噌、酱油、日本酒和烧酒等酿造食品的制造，柠檬酸制造，淀粉酶等酶制剂制造中的使用实际成果丰硕，酶生产性高，长年使用的安全可靠性高，因此是可以工业应用的微生物。
如上所述，编码酶(1)和(2)的基因的来源生物没有特别限定，但是在转化丝状菌中表达的酶(1)和(2)有可能不因宿主丝状菌的生长条件而失活，或者表现各自的活性。因此，编码酶(1)和(2)的基因的来源生物优选为，通过插入编码酶(1)和(2)的基因而应转化的宿主丝状菌或者生长条件与宿主丝状菌的近似的丝状菌。
(由基因工程方法克隆编码酶(1)和(2)的基因)
编码酶(1)和(2)的基因能够插入适当的公知的各种载体中。而且，将该载体导入适当的公知宿主生物，能够制作被导入了含有编码酶(1)和(2)的基因的重组载体(重组DNA)的转化体。本领域技术人员可以适当选择编码酶(1)和(2)的基因的取得方法，或者编码酶(1)和(2)的基因序列、编码酶(1)和(2)的氨基酸序列信息的取得方法，各种载体的制备方法或转化体的制作方法等。另外，在本说明书中，转化或转化体中分别包含了转导或转导子。以下对编码酶(1)和(2)的基因的克隆的一例进行非限制性说明。
为了克隆编码酶(1)和(2)的基因，可以适当使用常规使用的基因克隆方法。例如，可以从具有酶(1)和(2)的生产能力的微生物或各种细胞中，利用常规方法，例如利用记载在参考技术文献内的方法，提取染色体DNA或mRNA。可以将提取的mRNA作为模板合成cDNA。利用像这样得到的染色体DNA或cDNA，可以制作染色体DNA或cDNA的文库。
例如编码酶(1)和(2)的基因可以通过将具有该基于的微生物源性染色体DNA或cDNA作为模板进行克隆而得到。编码酶(1)和(2)的基因的来源生物如上所述，作为具体的例子，可列举酱油曲霉NBRC4239株、米曲霉RIB40株、黑曲霉IAM2533株等，但并不限于此。例如，培养酱油曲霉NBRC4239株，从所得的菌体中除去水分，在液氮中冷却的同时利用乳钵等物理磨碎，从而制成微细的粉末状菌体片，利用常法从该菌体片中提取染色体DNA组分。染色体DNA的提取操作可以利用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)等市售的染色体DNA提取试剂盒。
接下来，将上述染色体DNA作为模板，利用与5'末端序列和3'末端序列互补的合成引物进行聚合酶链式反应(以下记为“PCR”)，从而扩增DNA。作为引物，只要能够扩增含有该基因的DNA片段，则没有特别限定。作为其例，可列举参考酱油曲霉的基因组序列而设计的由SEQ ID NO:17-22所表示的引物等。应予说明，由于若使用这些引物则会扩增目标基因的全长，因此可以省略RACE。作为其他方法，可以通过5'RACE或3'RACE等适当的PRC，扩增含有目标基因片段的DNA，使其连接得到含有全长的目标基因的DNA。
另外，取得编码酶(1)和(2)的基因的方法没有特别限定，即便不采用基因工程的方法，也可以利用例如化学合成法构建编码酶(1)和(2)的基因。
通过PCR扩增得到的扩增产物或化学合成的基因中的碱基序列的确认，例如可如下进行。首先，将欲确认序列的DNA按照常法插入适当的载体中，制作重组DNA。对于载体的克隆，可使用TA Cloning Kit(Invitrogen公司)等市售的试剂盒；pUC119(宝生物工程公司)、pUC18(宝生物工程公司)、pBR322(宝生物工程公司)、pBluescript SK+(Stratagene公司)、pYES2/CT(Invitrogen公司)等市售的质粒载体DNA；λEMBL3(Stratagene公司)等市售的噬菌体载体DNA。使用该重组DNA，对宿主生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、优选为大肠杆菌JM109株(宝生物工程公司)或大肠杆菌DH5α(宝生物工程公司)进行转化。利用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN公司)等对得到的转化体所含的的重组DNA进行纯化。
通过双脱氧序列分析法(Methods in Enzymology、101、20-78、1983)等确定插入该转化体DNA中的各基因的碱基序列。确定碱基序列时使用的序列分析装置没有特别限定，例如可列举Li-COR MODEL 4200L测序仪(Aloka公司)、370DNA测序系统(perkinelmer公司)、CEQ2000XL DNA分析系统(Beckman公司)等。然后，可以基于所确定的碱基序列获知翻译的蛋白质，即酶(1)和(2)的氨基酸序列。
(含有编码酶(1)和(2)的基因的重组载体的构建)
含有编码酶(1)和(2)的基因的重组载体(重组体DNA)可以通过将含有编码酶(1)和(2)的任一基因的PCR扩增产物和各种载体以能够表达编码酶(1)和(2)的基因的形式结合来构建。例如，通过利用适当的限制酶切割含有编码酶(1)和(2)的任一基因的DNA片段，将该DNA片段与利用适当的限制酶切断的质粒连接来构建。另外，可以通过利用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech公司)等市售的重组载体制作试剂盒，将含有在两个末端附着有与质粒相同的序列的该基因的DNA片段与来源于由反向PCR扩增后的质粒的DNA片段连接而得到。
作为本发明的又一形态，可列举含有编码酶(1)的基因的重组载体，含有编码酶(2)的基因的重组载体，以及含有编码酶(1)的基因和编码酶(2)的基因的重组载体。本发明的重组载体用于制作本发明的转化丝状菌。
本发明的重组载体优选为含有异源基因或异源核酸序列。异源基因只要是原本不存在于(not naturally occuring)宿主生物中的基因，则没有特别限定，例如，可列举不依赖来源于宿主生物的核酸序列的合成基因，来自与编码酶(1)的基因的来源生物不同的生物的基因，来自与宿主生物不同的其他的丝状菌或微生物、植物、动物、病毒等生物的基因等。作为宿主生物为丝状菌的情况下的异源基因的具体例可以列举来自pUC19的DNA片段等，但是并不限于此。
作为本发明的重组载体的具体例，可列举由来自pUC19的DNA片段、来自Ptef的DNA片段、来自AsEgtA和/或AsEgtC的DNA片段、来自Talp的DNA片段、来自pyrG的DNA片段、以及来自pUC19的DNA片段连接而成的重组载体
(转化丝状菌的制作方法)
本发明的转化丝状菌的制作方法没有特别限定，例如可列举按照常规方法，编码酶(1)和(2)的基因以表达的方式插入宿主丝状菌的方法。具体而言，将编码酶(1)和(2)的任一基因插入诱导表达启动子和终止子之间制作DNA构建体，然后通过仅用含有编码酶(1)的基因的DNA构建体对宿主丝状菌进行转化，或者通过用含有编码酶(1)的基因的DNA构建体和含有编码酶(2)的基因的DNA构建体的对宿主丝状菌进行转化，从而得到仅过量表达编码酶(1)的基因的转化丝状菌，或者过量表达编码酶(1)和(2)的基因的转化丝状菌。在本说明书中，将为了转化宿主丝状菌而制作的、由诱导表达启动子-编码酶(1)或(2)的基因-终止子构成的DNA片段以及含有该DNA片段的重组载体统称为DNA构建体(DNAconstruct)。
编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因以表达的方式插入宿主丝状菌中的方法没有特别限定，例如可列举通过利用同源重组而直接插入至宿主生物的染色体上的方法、通过连接至质粒载体上而导入宿主丝状菌内的方法。
在利用同源重组的方法中，可以将DNA构建体连接在与染色体上重组部位的上游区及下游区相同的序列之间，插入宿主丝状菌的基因组中。通过在DNA构建体自身的高表达启动子的控制下在宿主丝状菌内过量表达，可以得到自克隆的转化体。高表达启动子没有特别限定，例如可列举翻译延伸因子TEF1基因(tef1)的启动子区、α-淀粉酶基因(amy)的启动子区、碱性蛋白酶基因(alp)启动子区等。
在利用载体的方法中，可以利用常规方法将DNA构建体整合到用于丝状菌的转化的质粒载体中，利用常规方法转化对应的宿主丝状菌。
作为这样适宜的载体-宿主系统只要是可在宿主丝状菌中生产酶(1)、或者酶(1)和(2)的系统，则没有特别限定，例如可列举pUC19和丝状菌系统、pSTA14(Mo1.Gen.Genet.218、99-104、1989)和丝状菌系统等。
DNA构建体优选导入宿主丝状菌的染色体中使用，但是作为其他的方法，也可以通过向自我复制型载体(Ozekietal.Biosci.Biotechnol.Biochem.59，1133(1995))中整合DNA构建体，以不导入染色体中的形式使用。
在DNA构建体中也可以含有能够选择被转化细胞的标记基因。对于标记基因没有特别限定，例如可列举像pyrG、niaD、adeA这样的与宿主的营养需求性互补的基因、对吡啶硫胺、潮霉素B寡霉素等药物具有抗药性的基因等。另外，DNA构建体优选含有启动子、终止子以外的控制序列(例如增强子、多聚腺苷酸化序列等)，该控制序列可在宿主细胞中过量表达编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因。对于启动子没有特别限定，可列举适宜的诱导表达启动子或组成型启动子，例如tef1启动子、alp启动子、amy启动子等。对于终止子也没有特别限定，例如可列举alp终止子、amy终止子、tef1终止子等。
在DNA构建体中，当含有插入的编码酶(1)或(2)的基因的DNA片段包含具有表达控制功能的序列时，编码酶(1)或(2)的基因的表达控制序列不是必须的。另外，通过共转化法进行转化的情况下，DNA构建体有时可以不含标记基因。
在DNA构建体中可以加上用于纯化的标签。例如，通过将适宜的接头序列连接至编码酶(1)或(2)的基因的上游或下游，将编码组氨酸的氨基序列连接6密码子以上，能够利用镍柱进行纯化。
DNA构建体的一实施方式，例如是将tef1基因启动子、编码酶(1)或(2)的基因、alp基因的终止子以及pyrG标记基因连接在位于pUC19的多克隆位点上的In-Fusion克隆位点处的DNA构建体。
向丝状菌的转化方法，可以适当选择本领域技术人员已知的方法。例如，可以使用在制备宿主丝状菌的原生质体后，利用聚乙二醇和氯化钠的原生质体PEG法(例如，参照Mo1.Gen.Genet.218、99-104、1989、日本特开2007-222055号公报等)。用于使转化丝状菌再生的培养基，可以根据所用的宿主丝状菌和转化标记基因而使用适当的培养基。例如，在使用酱油曲霉作为宿主丝状菌、使用pyrG基因作为转化标记基因的情况下，转化丝状菌的再生，例如可利用含有0.5％琼脂和1.2M山梨糖醇的Czapek-Dox基本培养基(Difco公司)来进行。
另外，例如为了得到本发明的转化丝状菌，也可以利用同源重组，将宿主丝状菌的染色体上原本所具有的编码酶(1)和(2)的基因的启动子置换成tef1等高表达启动子。此时，优选除了高表达启动子，还插入pyrG等转化标记基因。例如，为了该目的，参照日本特开2011-230681记载的实施例1或图1，可以利用编码酶(1)或(2)的基因的上游区-转化标记基因-高表达启动子-编码酶(1)或(2)的全部或部分基因所组成的转化盒。在此情况下，编码酶(1)或(2)的基因的上游区和编码酶(1)或(2)的全部或部分基因被用于同源重组。编码酶(1)或(2)的全部或部分基因可以使用包含从起始密码子到中间区域的部分。适用于同源重组的区域的长度优选为0.5kb以上。
可以通过在可确认酶(1)、或者酶(1)和(2)的酶活性的条件下，培养本发明的转化丝状菌，然后确认培养后所得培养物中麦角硫因的量是否大于相同环境下培养的宿主丝状菌的培养物中麦角硫因的量，从而确认本发明的转化丝状菌已制成。
另外，还可以通过从转化丝状菌提取染色体DNA，以其为模板进行PCR，确认当发生转化时是否生成可扩增的PCR产物，从而确认本发明的转化丝状菌已制成。
例如，以使用的启动子的碱基序列对应的正向引物、转化标记基因的碱基序列对应的反向引物的组合进行PCR，确认是否生成设想长度的产物。
在通过同源重组来进行转化的情况下，优选以位于比使用的上游侧同源区更接近上游的正向引物和比使用的下游侧同源区更接近下游的反向引物的组合来进行PCR，确认在发生同源重组时是否生成设想长度的产物。
(宿主丝状菌)
作为宿主丝状菌，只要是能够通过含有编码酶(1)的基因的DNA构建体、或者含有编码酶(1)的基因的DNA构建体和含有编码酶(2)的基因的DNA构建体的转化生产酶(1)、或者酶(1)和(2)的丝状菌，则没有特别限定，例如，优选为已确认生产麦角硫因的丝状菌、或者在基因组DNA上具有编码酶(1)和(2)的基因的丝状菌。作为宿主丝状菌的具体例，可列举非专利文献1和2记载的丝状菌，例如可列举属于曲霉属、脉孢菌(Neurospora)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、木霉(Trichoderma)属、毛霉(Mucor)属、根霉(Rhizopus)属等的丝状菌。作为在基因组DNA上具有编码酶(1)和(2)的基因的丝状菌，例如可列举属于新萨托菌(Neosartorya)属、丝衣霉(Byssochlamys)属、篮状菌(Talaromyces)属、阿耶罗菌(Ajellomyces)属、副球孢子菌(Paracoccidioides)属、Uncinocarpus属、球孢子菌(Coccidioides)属、节皮菌(Arthroderma)属、毛癣菌(Trichophyton)属、外瓶霉(Exophiala)属、刺壳腔菌(Capronia)属、Cladophialophora属、壳球孢(Macrophomina)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、平脐蠕孢(Bipolaris)属、褥盘孢(Dothistroma)属、核腔菌(Pyrenophora)属、Neofusicoccum属、毛球腔菌(Setosphaeria)属、双极霉(Baudoinia)属、顶囊壳(Gaeumannomyces)属、盘二孢菌(Marssonina)属、亚球壳(Sphaerulina)属、核盘菌(Sclerotinia)属、间座壳(Magnaporthe)属、轮枝菌(Verticillium)属、假尾孢(Pseudocercospora)属、刺盘孢(Colletotrichum)属、蛇口壳(Ophiostoma)属、绿僵菌(Metarhizium)属、孢子丝菌(Sporothrix)属、粪壳(Sordaria)属等的丝状菌。
若考虑到安全性或培养的容易性，在丝状菌中优选上述作为编码酶(1)和(2)的基因的来源生物而列举的酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、宇佐美曲霉、白曲霉以及斋藤曲霉等曲霉属微生物。
(编码酶(1)和(2)的基因的具体例)
作为来源于酱油曲霉NBR4239株的编码酶(1)的基因，例如可列举后述实施例中记载的基因AsEgtA。另外，作为来源于酱油曲霉NBR4239株的编码酶(2)的基因，例如可列举后述实施例中记载的基因AsEgtB和AsEgtC。基因AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC的碱基序列分别表示为序列表中的SEQ ID NO:1-3。另外，基因AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC蛋白质的氨基酸序列分别表示为序列表中的SEQ ID NO:4-6。
作为来源于米曲霉RIB40株的编码酶(1)的基因，例如可列举后述实施例中记载的基因AoEgtA。另外，作为来源于米曲霉RIB40株的编码酶(2)的基因，例如可列举后述实施例中记载的基因AoEgtB和AoEgtC。基因AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC的碱基序列分别表示为序列表中的SEQ ID NO:23-25。另外，基因AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC蛋白质的氨基酸序列分别表示为序列表中的SEQ ID NO:26-28。
作为来源于黑曲霉IAM2533株的编码酶(1)的基因，例如可列举后述实施例中记载的基因AnEgtB。基因AnEgtA的碱基序列表示为序列表中的SEQ ID NO:33。另外，基因AnEgtA蛋白质的氨基酸序列表示为序列表中的SEQ ID NO:34。
对于从除了酱油曲霉、米曲霉和黑曲霉以外的丝状菌中得到编码酶(1)和(2)的基因的方法没有特别限定，例如可以通过根据AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC的碱基序列(SEQ IDNO:1-3)以及AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:4-6)，对其他丝状菌的基因组DNA进行BLAST同源性检索，识别具有与基因AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC的碱基序列高序列同一性的碱基序列的基因，从而得到编码酶(1)和(2)的基因。另外，可以根据丝状菌的全蛋白质，识别具有与AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC高序列同一性的氨基酸序列的蛋白质，并识别编码该蛋白质的基因，从而得到编码酶(1)和(2)的基因。可以利用所得的基因将来源丝状菌作为宿主丝状菌进行转化，确认与宿主丝状菌相比麦角硫因的产量是否增强，从而确认所得的基因是否相当于编码酶(1)和(2)的基因。
由于酱油曲霉、米曲霉和黑曲霉的生长条件相近，有可能通过插入各自具有的基因而相互转化。例如可以将从酱油曲霉中得到的编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因导入作为宿主丝状菌的米曲霉或黑曲霉中进行转化。鉴于酶(1)、或者酶(1)和(2)确实具有所需的酶活性，优选编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的来源丝状菌与宿主丝状菌相同。例如可以列举将来源于酱油曲霉中的编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因在相同的酱油曲霉中进行转化。
编码酶(1)和(2)的基因，也可以是根据来源于酱油曲霉等的编码酶(1)或酶(2)的基因的氨基酸序列，为了在宿主生物中表达而将密码子、二级结构、GC含量等最优化的基因。作为这样的基因的具体例，可列举为了在大肠杆菌中表达而合成的EcEgtA(SEQ ID NO:37)和EcEgtC(SEQ ID NO:38)。
(本发明的转化丝状菌的一实施方式)
本发明的一实施方式为，将基因AsEgtA、AoEgtA和/或AnEgtA插入酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉以外的丝状菌中进行转化使得插入的基因所编码的蛋白质过量表达而得到的转化丝状菌。本发明的另一实施方式为，将基因AsEgtA、AoEgtA和/或AnEgtA、以及基因AsEgtB、AsEgtC、AoEgtB和/或AoEgtAC插入酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉以外的丝状菌中进行转化使得插入的基因所编码的蛋白质过量表达而得到的转化丝状菌。这样的转化丝状菌通过对插入的基因所编码的酶(1)、或者酶(1)和酶(2)进行过量表达，其麦角硫因的产量比宿主丝状菌的大。另外，如后述实施例所述，例如，过量表达AsEgtA蛋白质和AsEgtB或AsEgtC蛋白质而转化的转化酱油曲霉，与仅过量表达AsEgyA蛋白质而转化的酱油曲霉相比，麦角硫因的产量更大。因此，本发明的转化丝状菌优选为，编码酶(1)、或者酶(1)和酶(2)的基因的表达增强，使得与宿主丝状菌相比麦角硫因的量增加的转化丝状菌。另外，本发明的转化丝状菌更优选为，编码酶(1)和(2)的基因的表达增强，使得与编码酶(1)的基因的表达增强的转化丝状菌相比麦角硫因的量增加的转化丝状菌。
另外，如后述实施例所述，例如，过量表达AsEgtA蛋白质的而转化的转化酱油曲霉，或者过量表达AsEgtA蛋白质和AsEgtB或AsEgtC蛋白质而转化的转化酱油曲霉，通过利用适于宿主丝状菌即酱油曲霉生长的DPY培养基在30℃下培养3日，每1g质量干燥菌体可得到26.6-37.3mg的麦角硫因。与此相对，过量表达AsEgtB或AsEgtC蛋白质而转化的转化酱油曲霉通过在相同条件下培养，每1g质量的干燥菌体只能生产0.9-1.2mg的麦角硫因。因此，本发明的转化丝状菌的一实施方式为：编码酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的表达增强，使得在利用适于宿主丝状菌生长的培养基将本发明的转化丝状菌在30℃下培养3日时，每1g质量的干燥菌体可得到260mg以上、优选为10.0mg以上、更优选为20.0mg以上、进一步优选为25.0mg以上的转化丝状菌。另外，本发明的转化丝状菌的另一实施方式为：编码酶(1)和(2)的基因的表达增强，使得在利用适于宿主丝状菌生长的培养基将本发明的转化丝状菌在30℃下培养3日时，每1g质量的干燥菌体可得到27.0mg以上、优选为28.0mg以上、更优选为29.0mg以上、进一步优选为30mg以上的转化丝状菌。
本发明的转化丝状菌有时在利用插入的编码酶(1)和酶(2)的基因生产酶(1)和(2)的同时，利用宿主丝状菌原本所具有的编码酶(1)和(2)的基因生产结构特性与上述酶(1)和(2)相同或不同种类的野生型酶(1)和(2)。
作为本发明的又一实施方式，可列举插入了编码酶(1)和(2)的基因，并且过量表达该插入的基因的转化古细菌或转化真细菌。作为转化真细菌的非限制性的例子，可列举由含有EcEgtA、或者EcEgtA和EcEgtC的质粒载体转化的转化大肠杆菌。
(本发明的麦角硫因的制备方法)
本发明的麦角硫因的制备方法至少包括：使组氨酸和半胱氨酸作用于本发明的转化丝状菌而得到麦角硫因的工序。关于使组氨酸和半胱氨酸作用于本发明的转化丝状菌的方法，只要是能够使组氨酸和半胱氨酸与转化丝状菌接触，利用转化丝状菌所具有的酶生产麦角硫因的方法，则没有特别限制，例如可列举通过利用含有组氨酸和半胱氨酸且适于转化丝状菌的生长的培养基，在适于转化丝状菌的各种培养条件下培养转化丝状菌而制备麦角硫因的方法。对于培养方法没有特别限定，例如可列举在通气条件下进行的固体培养法或液体培养法。
关于培养基，只要是培养丝状菌的常规培养基，即以适当比例含有碳源、氮源、无机物、其他营养素，则可以使用合成培养基或天然培养基中的任一者。当丝状菌为曲霉属微生物的情况下，可以使用后述实施例所述的DPY培养基等，但没有特别限定。但是，培养基的成分中优选含有酶(1)的活化所必须的铁(II)。铁(II)可以作为化合物而添加到培养基中，也可以作为矿物成分而添加。
对于组氨酸和半胱氨酸没有特别限定，例如可列举组氨酸和半胱氨酸本身、含有组氨酸和半胱氨酸作为结构单元的衍生物(例如胱氨酸)、组氨酸和半胱氨酸含有物等。
培养条件可以采用本领域人员通常知悉的丝状菌的培养条件，例如可以将培养基的初始pH调整为5-10，适当设定培养温度为20-40℃，培养时间为数小时-数日、优选为1-7日、更优选为2-5日等。对于培养方法没有特别限定，可采用通气搅拌深层培养、振荡培养、静置培养等，优选溶解氧充足的条件下培养。例如，作为培养曲霉属微生物时的培养基和培养条件的一例，可列举使用后述实施例所述的DPY培养基，在30℃下、以160rpm振荡培养3-5日。
对于培养结束后从培养物中提取麦角硫因的方法没有特别限定。提取既可以直接使用通过过滤、离心等操作从培养物中回收的菌体，也可以使用回收后经干燥的菌体或者进一步粉碎后的菌体。对于菌体的干燥方法没有特别限定，例如可列举冷冻干燥、日光干燥、热风干燥、真空干燥、通气干燥、减压干燥等。
提取溶剂只要是溶解麦角硫因的溶剂，则没有特别限定，例如可列举甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等有机溶剂；这些有机溶剂与水混合而成含水有机溶剂；水、温水和热水等。加入溶剂后，边适当施加菌体破碎处理边提取麦角硫因。提取溶剂温度可以设定为室温至100℃。
作为麦角硫因的提取方法的一实施方式，例如可列举以下方法：用水洗涤从培养物中回收的菌体后，将菌体加入水中制成悬浮液，然后将所得悬浮液在98-100℃下实施15分钟等加热处理后，离心，回收上清，接下来将回收的上清过滤除去不溶物。另外，也可以不对该加热处理后的悬浮液进行离心而直接过滤。
另外，代替上述加热处理，例如，还可以进行以下菌体破碎处理：利用超声波破碎机、弗氏压碎器(French press)、砂磨机(DYNO-MILL)、乳钵等破碎手段将菌体破碎的方法；丝状菌破壁酶(Yatalase)等细胞壁溶解酶来溶解菌体细胞壁的方法；利用SDS、Triton X-100等表面活性剂溶解菌体的方法等。这些方法可以单独或者组合使用。
所得的提取液可以通过进行离心、过滤器过滤、超滤、凝胶过滤、溶解度差异分离、溶剂提取、层析法(吸附层析法、疏水层析法、阳离子交换层析法、阴离子交换层析法、反相层析法等)、结晶化、活性炭处理、膜处理等纯化处理，将麦角硫因纯化。
对于麦角硫因的定性或定量分析没有特别限定，例如可以通过HPLC等进行。本领域技术人员可以适当选择HPLC分离条件，例如可以按照后述实施例所述的条件来实施。
若使用本发明的转化丝状菌，则能够得到高收率的麦角硫因。例如，非专利文献5的Fig.S6中记载的麦角硫因的收率非常少，最多也不过是每40mL培养液10μg左右。与此相对，在使用本发明的转化丝状菌的情况下，每10ml培养液可以制备3mg以上的麦角硫因。
(本发明的高纯度麦角硫因含有物的制备方法)
本发明的高纯度麦角硫因含有物的制备方法包括以下工序：利用含有组氨酸和半胱氨酸、优选为适于宿主丝状菌生长的培养基来培养本发明的转化丝状菌，从所得的培养物中得到纯度为5％以上的麦角硫因含有物。
只要通过本发明的高纯度麦角硫因含有物的制备方法而得到的麦角硫因含有物的纯度为5％以上，则没有特别限定，优选为6％以上，更优选为8％以上，进一步优选为9％以上。麦角硫因含有物的纯度测定，例如可以如下进行：从培养本发明的转化丝状菌所得的培养物中获得麦角硫因提取液，然后对获得的麦角硫因提取液进行冷冻干燥得到干燥粉末，接下来将所得的干燥粉末以适当浓度溶于蒸馏水中，得到纯度测定试样，再接下来通过HPLC等麦角硫因的定量方法对所得的纯度测定试样进行测定，再接下来由测定结果和纯度测定试样计算出麦角硫因含有物的纯度。
本发明的制备方法的其他形态为利用在基因组DNA上具有编码酶(1)、或者酶(1)和酶(2)的基因的微生物，而非转化体的制备方法。例如，本发明的制备方法的其他形态为以下麦角硫因或高纯度麦角硫因含有物的制备方法，包括：使组氨酸和半胱氨酸作用于在基因组DNA上具有编码酶(1)、或者酶(1)和酶(2)的基因的曲霉属微生物之类的曲霉等丝状菌，得到麦角硫因或高纯度麦角硫因含有物的工序。
在本发明的制备方法中，产物麦角硫因会引发对所用微生物的增殖抑制或者生长抑制。因此，通过向培养基中添加铜离子等氧化剂将生产的麦角硫因二聚体化(形成S-S键)，可能能够避免微生物的增殖抑制或者生长抑制。因此，在本发明的制备方法中，在使组氨酸和半胱氨酸作用于微生物时，优选存在铜离子等氧化剂。
关于本发明的制备方法，只要能够达到本发明的目的，可以在上述的工序的前段或者后段，又或者工序当中，加入各种工序或操作。
(麦角硫因的用途)
利用本发明的转化丝状菌或本发明的制备方法而得到的麦角硫因，充分利用其作为具有各种生理活性的功能性生物物质或者作为耐热性强的水溶性物质的特性，可以用作功能性食品、特定保健用食品饮料、营养功能食品饮料、保健功能食品饮料、特殊用途食品饮料、营养辅助食品饮料、健康辅助食品饮料、营养补充剂、美容食品饮料、化妆品、药品、类药品、动物饲料等或者用于制造他们的原料。
以下进一步详细地说明本发明的实施例，但是本发明并不限于这些实施例，只要能够解决本发明的问题，本发明可以采用各种形态。
[例1.插入基因AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC的DNA构建体的制作]
(1)目标基因的查找
在粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中，作为与麦角硫因生物合成相关的酶，已知NCU04343和NCU1136(参照非专利文献3和4)。另外，在非专利文献3中提示了NCU04636与麦角硫因的生物合成相关的可能性。因此，将粗糙脉孢菌的编码上述3种酶的基因作为查询基因，基于酱油曲霉(Aspergillus sojae)NBRC4239株的基因组序列，检索与分别编码NCU04343、NCU04636和NCU11365的基因的序列同一性比较高的区域。检索使用BLAST程序(tblastn)和酱油曲霉NBRC4239株的基因组序列(DDBJ/EMBL/GenBank DNA databases、Accession numbers for the 65scaffold sequences；DF093557-DF093585、DNA RESEARCH18，165-176，2011)。
其结果，作为与NCU04343的基因序列的同一性比较高的序列区，发现了SEQ IDNO:1所示的基因。鉴于该基因是来源于酱油曲霉的egtA基因，将其命名为AsEgtA基因(SEQID NO:1)。作为与NCU04636的基因序列的同一性比较高的序列区，发现了SEQ ID NO:2所示的基因，将该基因命名为AsEgtB基因(SEQ ID NO:2)。作为与NCU11365的基因序列的同一性比较高的序列区，发现了SEQ ID NO:3所示的基因，将该基因命名为AsEgtC基因(SEQ IDNO:3)。
使用遗传信息处理软件Genetyx网络版version 12.0.1(GENETYX公司)对氨基酸水平的序列同一性进行比较，AsEgtA蛋白质(SEQ ID NO:4)、AsEgtB蛋白质(SEQ ID NO:5)和AsEgtC蛋白质(SEQ ID NO:6)与NCU04343、NCU04636和NCU11365的序列同一性分别为46％、75％和44％。另外，AsEgtC蛋白质与NCU11365粟酒裂殖酵母的直向同源物SPBC660.12c的序列同一性为27％。以上结果提示，基于AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC的碱基序列或氨基酸序列，即可查找其他曲霉属微生物的egtA基因、egtB基因和egtC基因。
(2)酱油曲霉NBRC4239株的染色体DNA的提取
在150ml容量的锥形烧瓶中，用30ml的蒸馏水配制多聚蛋白胨糊精培养基(1％(w/v)多聚蛋白胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)KH2PO4、0.1％(w/v)NaNO3、0.05％(w/v)MgSO4·7H2O、0.1％(w/v)酪蛋白氨基酸，pH6.0)，接种酱油曲霉NBRC4239的分生孢子，在30℃下振荡培养一夜。通过过滤从得到的培养液中回收菌体，除去纸巾(paper towel)中所含的水分，利用预先用液氮冷却的乳钵和研杵，边用液氮冷却边将菌体粉碎。利用DNeasy PlantMini Kit(Qiagen公司)从得到的粉碎菌体中提取染色体DNA。
(3)构建体用质粒的制作
按照如下方法，将翻译延伸因子基因tef1的启动子序列Ptef(tef1基因的上游748bp、SEQ ID NO:7)、碱性蛋白酶基因alp的终止子序列Talp(alp基因的下游800bp、SEQID NO:8)、以及与尿苷需求性互补的转化标记基因pyrG(上游407bp、编码区896bp、SEQ IDNO:9)连接至质粒pUC19，制作构建体用质粒。
使用上述所得的酱油曲霉NBRC4239株染色体DNA作为模型DNA、使用KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺社)作为PCR的酶、使用酶附带的反应试剂作为反应试剂、使用Mastercyclergradient(Eppendorf公司)作为装置，按照酶附带的试验方案(protocol)，对Ptef、Talp和pyrG实施PCR。用于扩增Ptef、Talp和pyrG的引物和PCR条件示于下表1-3中。应予说明，表内的序列中，小写字母的序列表示用于将Ptef、Talp和pyrG的各扩增片段依次连接，进而与pUC19连接的附加序列。将扩增的DNA在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离，使用QIAquick GelExtracetion Kit(QIAGEN公司)进行纯化。
[表1]
[表2]
[表3]
pUC9使用In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)附带的pUC19线性化载体(linearized Vector)。使用上述In-Fusion HD Cloning Kit按照试剂盒附带的试验方案将扩增的Ptef、Talp和pyrG连接至位于pUC19的多克隆位点的In-Fusion克隆位点，得到构建体用质粒。
利用所得的构建体用质粒，按照制造商的指示对感受态细胞ECOS CompetentE.coli JM109(日本基因公司)进行转化，从而得到转化大肠杆菌。
将得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃下振荡培养一夜。将培养后的培养液离心，回收菌体。对于得到的菌体，使用FastGene PlasmidMini Kit(日本Genetics公司)，按照试剂盒附带的试验方案提取质粒DNA。
(4)目标基因插入构建体的制作
按照如下方法在构建体用质粒的Ptef和Talp之间连接目标基因AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC，制作DNA构建体。
使用上述所得的构建体用质粒作为模型DNA、使用KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺社)作为PCR的酶、使用酶附带的反应试剂作为反应试剂、使用Mastercycler gradient(Eppendorf公司)作为装置，按照酶附带的试验方案来实施反向PCR，从而得到构建体用质粒的载体片段。所用的引物和PCR条件示于下表4中。将扩增的载体片段在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离，使用QIAquick Gel Extracetion Kit(QIAGEN公司)进行纯化。
[表4]
为了扩增来源于酱油曲霉的基因AsEgtA(SEQ ID NO:1)、AsEgtB(SEQ ID NO:2)和AsEgtC(SEQ ID NO:3)，使用上述所得的酱油曲霉NBRC4239株染色体DNA作为模型DNA、使用KOD-Plus-DNA聚合酶(东洋纺社)作为PCR的酶、使用酶附带的反应试剂作为反应试剂、Mastercycler gradient(Eppendorf公司)作为，按照酶附带的试验方案来实施PCR。用于扩增AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC引物和PCR条件示于下表5-7中。应予说明，在表内的序列中，小写字母的序列表示用于连接至构建体用质粒(Ptrf和Talp之间)的附加序列。将扩增的DNA在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离，使用QIAquick Gel Extracetion Kit(QIAGEN公司)进行纯化。
[表5]
[表6]
[表7]
使用In-Fusion HD Cloning Kit，按照试剂盒附带的试验方案将如上述所扩增的载体片段与AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC连接，得到插入了AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC的目标基因插入DNA构建体。由此所的的DNA构建体是从5'末端侧到3'末端侧连接有来自pUC19的DNA片段、Ptef的DNA片段，AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC的DNA片段、Talp的DNA片段，pyrG的DNA片段、以及来自pUC19的DNA片段的构建体。即，得到在pUC19的MCS依次连接有Ptef-AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC-Taip-pyrG的序列的3种DNA构建体。
利用所得的构建体，按照制造商的指示对感受态细胞ECOS Competent E.coliJM109(日本基因公司)进行转化，从而得到转化大肠杆菌。
将得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃下振荡培养一夜。将培养后的培养液离心，回收菌体。对于得到的菌体，使用FastGene PlasmidMini Kit(日本Genetics公司)，按照试剂盒附带的试验方案提取质粒DNA(DNA构建体)。
通过确定插入至提取的质粒DNA中的各DNA碱基序列，确认得到插入了AsEgtA、AsEgtB或AsEgtC的DNA构建体。
[例2.转化酱油曲霉的制作(1)]
(1)来自酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株
将各DNA构建体用乙醇沉淀后，溶解于TE，将配制成所需浓度的DNA溶液按照以下顺序用于来自酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株(pyrG基因的上游48bp、编码区896bp、下游240bp)的转化。
(2)来源于酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株的转化
在500ml容量锥形瓶内的含有20mM尿苷的多聚蛋白胨糊精液体培养基100ml中接种来源于酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株的分生孢子，在30℃下进行约20小时的振荡培养后，回收菌体。由回收的菌体制备原生质体。利用得到的原生质体和20μg目标基因插入DNA构建体，通过原生质体PEG法进行转化，然后利用含有0.5％(w/v)琼脂和1.2M山梨糖醇的Czapek-Dox基本培养基(Difco公司；pH6)，在30℃下孵育5日以上，得到具有集落形成能力的转化酱油曲霉。
得到的转化酱油曲霉，通过导入与尿苷需求性互补的基因pyrG，可以在未添加尿苷的培养基上生长，从而可作为导入了目标基因的菌株进行选择。
[例3.转化酱油曲霉的麦角硫因的生产(1)]
如下表8所示，分别对作为对照的酱油曲霉NBRC4239株；由基因AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC中的任意一种基因转化而成的转化酱油曲霉；以及由基因AsEgtA和AsEgtB或AsEgtC转化而成的转化酱油曲霉各自的麦角硫因生产能力进行如下比较。
[表8]
导入基因 菌株名称
- 对照株
AsEgtA、AsEgtB (AsEgtA+AsEgtB)转化株
AsEgtA、AsEgtC (AsEgtA+AsEgtC)转化株
AsEgtA AsEgtA转化株
AsEgtB AsEgtB转化株
AsEgtC AsEgtC转化株
在50ml容量锥形瓶内的DPY液体培养基(1％(w/v))多聚蛋白胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)酵母提取物、05％(w/v)KH2PO4、0.05％(w/v)MgSO4·7H2O，pH未调整)10ml中，接种表8所示的各菌株的分生孢子，在30℃下以160rpm振荡培养3日。然后在Miracloth(Calbiochem公司)上从培养后的培养物中回收菌体。用40ml蒸馏水将回收的菌体洗涤后，将菌体夹在纸巾中，从而将水分挤出得到湿菌体。称量所得湿菌体的重量，添加相对于该湿菌体质量的两倍的水并搅拌，得到菌悬浮液。得到的菌悬浮液在98℃、15分钟的条件下进行加热处理。经该处理后，将悬浮液离心，作为上清回收菌体外液，用0.45μm的过滤器进行过滤，从而得到麦角硫因提取液。
关于得到的麦角硫因提取液，通过以下条件的HPLC进行分析。
色谱柱：COSMOSIL HILIC(4.6×250mm)
洗脱液：乙腈∶10mM醋酸铵＝8∶2
流速：1ml/min
检测波长：220nm
温度：室温
定量方法：使用麦角硫因样品(Enzo Life Sciences公司；Cat.No.BML-FR111)的标准曲线法。
在表8所示的各菌株中选取麦角硫因的量最大的菌株，对这些菌株进行麦角硫因(EGT)产量的比较。比较结果如表9和图1所示。在此，关于上述所得的AsEgtA转化株的湿菌体(用纸巾除去水分的菌体)的一部分，利用水分计(MX-50；A&D公司)测定水分含量，结果湿菌体的水分含量为77.7％。因此表9中，在计算干燥菌体单位的麦角硫因产量时，水分含量估算为78％。
另外，使用了对照株(control)和AsEgtA转化株的麦角硫因提取液的HPLC色谱图如图2所示。接着按照以下顺序测定麦角硫因提取液中麦角硫因的纯度。
即，在500ml容量锥形瓶内的DPY液体培养基100ml中，接种AsEgtA转化株的分生孢子，在30℃下以160rpm振荡培养3日、。然后在Miracloth上从培养后的培养物中回收菌体。用200ml蒸馏水将回收的菌体后，将菌体夹在纸巾中，从而将水分挤出得到湿菌体。称量所得湿菌体的重量，添加相对于该湿菌体质量的两倍的水并搅拌，得到菌悬浮液。得到的菌悬浮液在沸腾水浴中加热15分钟。加热结束后，将悬浮液离心，作为上清回收菌体外液，用0.45μm的过滤器进行过滤，从而得到麦角硫因提取液。将得到的麦角硫因提取液冷冻干燥，得到冷冻干燥粉末。将得到的冷冻干燥粉末以20mg/ml溶于蒸馏水中，作为纯度测定试样。对于该纯度测定试样，测定麦角硫因量的结果为2.3mg/ml。因此，计算出提取液中的EGT的纯度为9.2％。
[表9]
如表9和图1所示，通过导入三种目标基因中的一种或两种基因而转化的AsEgtA转化株、(AsEgtA+AsEgtB)转化株和(AsEgtA+AsEgtC)转化株与未转化的对照株、AsEgtB转化株和AsEgtC转化株相比，麦角硫因的产量更高。另外，AsEgtA转化株虽然麦角硫因产量高，但AsEgtB转化株和AsEgtA转化株的麦角硫因产量与对照株没有区别，并且(AsEgtA+AsEgtB)转化株和(AsEgtA+AsEgtC)转化株的麦角硫因产量大于AsEgtA转化株的麦角硫因产量与AsEgtB转化株或者AsEgtC转化株的麦角硫因产量之和，鉴于此可知(AsEgtA+AsEgtB)转化株和(AsEgtA+AsEgtC)转化株相对于AsEgtA转化株、AsEgtB转化株、AsEgtC转化株，麦角硫因产量累加性地、甚至于协同性地增强。
另外，(AsEgtA+AsEgtB)转化株，通过利用培养常规丝状菌时的培养基和培养条件，一次实施3日培养可生产以干燥菌体计37.3mg/g的麦角硫因。与此相对，例如对比文献1中使用添加了高浓度氨基酸的培养基对姬菇(Pleurotus cornucopiae)的菌丝体进行两阶段共计28的培养，才能得到以干燥菌体计34mg/g的麦角硫因。因此，可知只要使用本发明的转化丝状菌，可以采用常规的丝状菌的培养方法简便且短时间地生产高产量的麦角硫因。
另外，如图2所示，从与对照株的比较可知，AsEgtA转化株能够高效地生产高纯度的麦角硫因。这从使用AsEgtA转化株而得到的麦角硫因提取液中的麦角硫因纯度测定结果中可以得到印证。同样地，也获知了在(AsEgtA+AsEgtB)转化株和(AsEgtA+AsEgtC)转化株中，能够高效地生产高纯度的麦角硫因。
[例4.转化酱油曲霉的确认]
在试管内的DPY液体培养基10ml中接种表8所示的各菌株的分生孢子，在30℃下振荡培养3日后，回收菌体。利用珠式细胞破碎装置(bead cell disrupter，MS-100R；TOMY精工公司)在冷却条件下对回收的菌体进行破碎，将破碎后的菌体粉末悬浮于0.1％(w/v)SDS水溶液中，从而得到SDS悬浮液。在得到的SDS悬浮液中添加1/4容量的样品缓冲液(LaneMarker Reducing Sample Buffer，ImmunoPure(5×)；Thermo Fisher Scientific公司)并搅拌，然后在98℃、3分钟的条件下进行加热处理。经该处理后，对于离心所回收的上清，采用相当于0.2mg菌体的量，进行丙烯酰胺凝胶电泳，实施SDS-PAGE。结果如图3所示。
如图3所示，AsEgtA蛋白质根据氨基酸序列设想的分子量为95.7kDa，SDS-PAGE中在90kDa附近可见两条带。同样地，AsEgtB蛋白质根据氨基酸序列设想的分子量为56.4kDa，SDS-PAGE中可见50kDa的弱带。另外，AsEgtC蛋白质根据氨基酸序列设想的分子量为51.2kDa，SDS-PAGE中可见50kDa的带。
从图3可知，对照株几乎未表达AsEgtA蛋白质、AsEgtB蛋白质和AsEgtC蛋白质，而(AsEgtA+AsEgtB)转化株和(AsEgtA+AsEgtC)转化株表达了AsEgtA蛋白质和AsEgtB蛋白质或AsEgtC蛋白质。另外，AsEgtA转化株、AsEgtB转化株和AsEgtC转化株表达了各自所对应的AsEgtA蛋白质、AsEgtB蛋白质和AsEgtC蛋白质。
[例5.插入了基因AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC的DNA构建体的制作]
(1)目标蛋白质的查找
基于米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40株的全蛋白质，以酱油曲霉的AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC蛋白质的各氨基酸序列作为查询序列，检索序列同一性高的蛋白质。检索使用DOGAN(http：//www.Bio.nite.go.jp/dogan/project/view/AO)。
结果，作为与AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC蛋白质的各氨基酸序列的序列同一性比较高的蛋白质，分别发现了AO090012000265(SEQ ID NO:26)、AO090020000619(SEQ ID NO:27)和AO090026000291(SEQ ID NO:28)。应予说明，AO090012000265作为类似S.pombe的Egt1，记载在非专利文献5的Table 2。确认AO090012000265、AO090020000619和AO090026000291分别与AsEgtA、AsEgtB和AsEgtC蛋白质具有97％、99％和93％的序列同一性。从米曲霉的基因组DNA中识别分别编码AO090012000265、AO090020000619和AO090026000291的基因，鉴于来源于米曲霉的egtA、egtB和egtC基因，将这些基因命名为基因AoEgtA(SEQ ID NO:23)、AoEgtB(SEQ ID NO:24)和AoEgtC(SEQ ID NO:25)。
(2)米曲霉RIB40株的染色体DNA的提取
除使用米曲霉RIB40株的分生孢子以外，按照上述例1-(2)相同的方法实施。
(3)构建体用质粒的制作
采用上述例1-(3)制作的载体片段。
(4)目标基因插入构建体的制作
目标基因为AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC基因，采用上述得到的米曲霉RIB40株的染色体DNA作为模型DNA，除此之外，按照上述例1-(4)相同的方法实施。应予说明，用于扩增AoEgtA、AoEgtB和AoEgtC基因的引物和PCR条件示于下表10-12中。
[表10]
[表11]
[表12]
应予说明，与上述例1-(4)相同，通过确定所提取的质粒DNA中插入的DNA碱基序列，确认得到插入了基因AoEgtA、AoEgtB或AoEgtC的DNA构建体。
[例6.转化米曲霉的制作]
使用插入了基因AoEgtA、AoEgtB或AoEgtC的DNA构建体，对来源于日本特开2013-034416号公报记载的米曲霉RIB40的pyrG破坏株进行转化，除此之外按照上述例2-(1)和(2)相同的方法实施。
[例7.转化米曲霉的麦角硫因的生产]
如下表13所示，对照株即米曲霉RIB40株、由基因AoEgtA转化的转化米曲霉、以及由基因AsEgtA和AsEgtB或AsEgtC转化的转化米曲霉各自的麦角硫因生产能力比较如下。
[表13]
导入基因 菌株名称
- 对照株
AoEgtA、AoEgtB (AoEgtA+AoEgtB)转化株
AoEgtA、AoEgtC (AoEgtA+AoEgtC)转化株
AoEgtA AoEgtA转化株
除接种了表13所示的各菌株的分生孢子以外，按照上述例3相同的方法实施。
在表13所示的各菌株中，选取麦角硫因的量最大的菌株，对这些菌株进行麦角硫因(EGT)产量的比较。比较结果如图5所示。
如图5所示，与转化酱油曲霉相同，转化米曲霉的麦角硫因的产量比未转化的对照株高。另外(AoEgtA+AoEgtB)转化株和(AoEgtA+AoEgtC)转化株的麦角硫因的产量比AoEgtA转化株的麦角硫因产量高。根据这些结果，可以获知，在米曲霉的转化株中也能高效地生产麦角硫因。
[例8.插入了基因AnEgtA的DNA构建体的制作]
(1)目标蛋白质的查找
基于数据库Non-redundant protein sequences(nr)，将酱油曲霉的AsEgtA蛋白质的氨基酸序列作为查询序列，检索序列同一性高的蛋白质。检索使用了Blastp(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)。
结果，在与AsEgtA蛋白质的氨基酸序列的序列同一性高的蛋白质中，黑曲霉Aspergillusniger CBS 513.88株的同源蛋白质发现了XP_001397117.2(SEQ ID NO:34)。确认XP_001397117.2与AsEgtA蛋白质具有73％的序列同一性。从黑曲霉的基因组DNA中识别编码XP_001397117.2的基因，鉴于来源于酱油曲霉的egtA基因，将该基因命名为基因AsEgtA(SEQ ID NO:33)。
(2)黑曲霉IAM2533株的染色体DNA的提取
除使用黑曲霉IAM2533株的分生孢子以外，按照上述例1-(2)相同的方法实施。
(3)构建体用质粒的制作
采用上述例1-(3)制作的载体片段。
(4)目标基因插入构建体的制作
目标基因为AnEgtA基因，采用上述得到的黑曲霉IAM2533株的染色体DNA作为模型DNA，除此之外按照上述例1-(4)相同的方法实施。应予说明，用于扩增AnEgtA基因而使用的引物和PCR条件示于下表14中。
[表14]
应予说明，与上述例1-(4)相同，通过确定所提取的质粒DNA中插入的DNA碱基序列，确认得到插入了基因AnEgtA的DNA构建体。
确认所克隆的基因AnEgtA的序列后，基因组信息与公开的A.niger CBS 513.88株的预测基因(ANI_1_792134)的序列一致(对应的氨基酸序列为上述XP_001397117.2)。
[例9.转化酱油曲霉的制作(2)]
除利用插入了基因AnEgtA的DNA构建体以外，按照上述例2-(1)和(2)相同的方法实施。
[例10.转化酱油曲霉的麦角硫因生产(2)]
除了接种对照株即酱油曲霉NBRC4239株、以及由基因AnEgtA转化的转化酱油曲霉的分生孢子以外，按照上述例3相同的方法实施。
选取各菌株中麦角硫因的量为最大的菌株，对这些菌株进行麦角硫因(EGT)产量的比较。比较结果如表15所示。
[表15]
如图15所示，与由基因AsEgtA转化的转化酱油曲霉相同，由基因AnEgtA转化的转化酱油曲霉的麦角硫因的产量比未转化的对照株高。根据这些结果，可以获知，在由来源于不同物种的异源基因AnEgtA转化的转化酱油曲霉也能够高效地生产麦角硫因。
[例11.转化大肠杆菌的制作]
基于AsEgtA和AsEgtC各自的氨基酸序列，从密码子、二级结构、GC含量等观点出发为了大肠杆菌表达而将基因序列最优化，在基因的上游添加EcoRV序列(GATATC)、并且在下游添加SpeI序列(ACTAGT)，从而得到EcEgtA(SEQ ID NO:37)和EcEgtC(SEQ ID NO:38)。
构建pUTE120K'作为表达用载体。即，利用NheI和HpaI消化日本特开平6-292584号公报记载的pUTE100K'，除去lac启动子。然后，在PKK223-3(GE公司)的Tac启动子区域的3'末端添加NheI位点，5'末端添加EcoRV位点，利用PCR进行扩增和纯化。接着，NheI消化后，插入至pUTE100K'原本的lac启动子所在的部位，制作pUTE120K'。
利用EcoRV和SpeI对pUTE120K'进行限制酶处理，然后连接EcEgtA或者EcEgtC，制作插入了EcEgtA或者EcEgtC的质粒pUTE120K'-EcEgtA和pUTE120K'-EcEgtC。
使用上述构建体用质粒培养转化的大肠杆菌，对质粒pUTE120K'-EcEgtA和pUTE120K'-EcEgtC进行纯化。接着，利用BamHI和SpeI对pUTE120K'-EcEgtC进行限制酶处理，切下含有基因EcEgtC的片段，进行纯化。另外，利用BamHI和SpeI对pUTE120K′-EcEgtA进行限制酶处理，插入含有上述基因EcEgtC的片段，制作质粒pUTE120K′-EcEgtA-EcEgtC。利用该质粒转化大肠杆菌JM109株，得到转化大肠杆菌。
利用含有0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的TY培养基(1％(w/v)细菌用胰蛋白胨、0.5％(w/v)细胞用酵母提取物、0.5％(w/v)NaCl、pH7.0)，将转化大肠杆菌在25℃下培养16小时，在全部培养液和回收菌体的热水提取液中检测出了麦角硫因。
[例12.转化大肠杆菌的麦角硫因的生产(1)]
如下表16所示，导入了对照株即表达用载体pUTE120K’的大肠杆菌、由基因EcEgtA或者EcEgtC转化的转化大肠杆菌、以及由基因EcEgtA和EcEgtC的转化的转化大肠杆菌各自的麦角硫因生产能力比较如下。
[表16]
导入基因 菌株名称
pUTE120K’ 对照株
EcEgtA EcEgtA转化株
EcEgtC EcEgtC转化株
EcEgtA，EcEgtC (EcEgtA+EcEgtC)转化株
在19ml容量试管内的TY培养基2.5ml中接种表16所示的各菌株，在37℃、16小时、180rpm的振荡条件下进行种子培养(seed-culture)。将种子培养所得的培养液0.02ml接种至在19ml容量试管内的含有氨苄青霉素和0.5mM IPTG的TY培养基2.5ml中，在25℃、24小时、180rpm的振荡条件下进行主培养(main-culture)。应予说明，用于主培养的TY培养基准备了以下3个系统：未添加氨基酸的系统(TY-)，添加了0.005％(w/v)组氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸的系统(TY+)，以及添加了0.01％(w/v)组氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸的系统(TY++)。
从培养后的培养物中通过离心(12000rpm、4℃、10分钟)回收作为沉淀物的菌体。向从1ml培养液所得的菌体中添加0.5ml水，得到菌悬浮液。将得到的菌悬浮液在98℃、10分钟的条件下进行加热处理。经该处理后，将悬浮液离心，作为上清回收菌体外液，用0.45μm的过滤器进行过滤，从而得到麦角硫因提取液。
对于从所得的麦角硫因提取液和主培养后的培养物中得到的培养上清(经0.45μm过滤器过滤处理后)，按照以下条件进行LC-MS分析。
LC装置：Agilent1100系列(安捷伦公司)
质量分析装置：QSTARElite(AB sciex公司)
色谱柱：COSMOSIL HILIC(4.6×250mm)
洗脱剂：乙腈+0.1％甲酸:水+0.1％甲酸＝75:25(v/v)
流速：250μl/ml
检测：ESIpositive
注入：10μl
温度：室温
定量法：使用麦角硫因样品(Enzo Life Sciences公司；Cat.No.BML-FR111)的标准曲线法。
对于表16所示的各菌株进行麦角硫因(EGT)产量的比较。应予说明，对于(EcEgtA+EcEgtC)转化株，使用任选的两株。
比较结果如图6所示。如图6所示，在对照株和EcEgtC转化株中，不论培养上清中还是麦角硫因提取液中均未确认到麦角硫因量。由此可以获知，对照株和EcEgtC转化株无麦角硫因生产能力，或者麦角硫因的生产能力非常微小。
另一方面，在EcEgtA转化株和(EcEgtA+EcEgtC)转化株中，能够确认麦角硫因生产能力。另外，(EcEgtA+EcEgtC)转化株所得的麦角硫因量大于EcEgtA转化株所得的麦角硫因量，这些差异在培养上清中显著。另外，比较向培养基中添加组氨酸、蛋氨酸和半胱甘酸的影响进行比较，在EcEgtA转化株和(EcEgtA+EcEgtC)转化株的任一者中，通过向培养基中添加组氨酸、蛋氨酸和半胱甘酸，使麦角硫因的量增加。
根据以上结果可以获知，EcEgtA转化株的麦角硫因产量高，但由于无法检测出EcEgtC转化株的麦角硫因产量，因此(EcEgtA+EcEgtC)转化株相对于EcEgtA转化株，麦角硫因产量累加性地、甚至于协同性地增强。
[例13.转化大肠杆菌的麦角硫因生产(2)]
在19ml容量试管内的含50μ/ml氨苄青霉素的TY培养基(1％(w/v)细菌用胰蛋白胨、0.5％(w/v)细胞用酵母提取物、(1％(w/v)NaCl、pH7.0)2.5ml中，接种表16所示的各菌株，在37℃、一夜、180rpm的振荡条件下进行种子栽培。然后，将得到的种子培养液0.8ml接种至500ml容量磨口锥形瓶内的含0.2mM IPTG+50μg/ml的氨苄青霉素的TY培养基100ml中，在25℃、24小时、150rpm的振荡条件下进行主培养。
从培养后的培养物中通过离心(12000rpm、4℃、10分钟)回收作为沉淀物的菌体。向从1ml培养液所得的菌体中添加5ml蒸馏水并搅拌，得到菌悬浮液。将得到的菌悬浮液在98℃、10分钟的条件下进行加热处理。经该处理后，将悬浮液离心，作为上清回收菌体外液，用0.45μm的过滤器进行过滤，从而得到麦角硫因提取液。
对于从所得的麦角硫因提取液和主培养后的培养物中得到的培养上清(经0.45μm过滤器过滤处理后)，按照上述例12记载的条件进行LC-MS分析。另外，对于从40ml培养液中得到的菌体，通过在60℃的培养箱内干燥来测定干燥菌体的重量。麦角硫因(EGT)产量的比较结果如表17所示。
[表17]
如表17所示，可以获知，与上述例12相同，对照株和EcEgtC转化株没有麦角硫因生产能力或者该生产能力非常微小；(EcEgtA+EcEgtC)转化株所得的麦角硫因量大于EcEgtC转化株所得的麦角硫因量。这些差异在培养上清中显著；(EcEgtA+EcEgtC)转化株相对于EcEgtA转化株，麦角硫因产量累加性地、甚至于协同性地增强。
[例14.转化大肠杆菌的麦角硫因生产(3)]
在19ml容量试管内的含1μ/ml氨苄青霉素的TY培养基2.5ml中，接种表16所示的(EcEgtA+EcEgtC)转化大肠杆菌，在30℃、16小时、140rpm的振荡条件下进行种子培养。然后，将得到的种子培养液全量接种在31缸式发酵槽(jar fermenter，丸菱生物工程公司)内的含有0.1mM IPTG、0.1％(w/v)组氨酸、0.1％(w/v)蛋氨酸和0.6％(w/v)硫代硫酸钠的高密度培养用培养基2000ml中，控制25℃、0.01MPa、750rpm的条件进行主培养。
从培养后的培养物中通过离心(12000rpm、4℃、5分钟)回收作为沉淀物的菌体。向从1ml培养液所得的菌体中添加1ml蒸馏水并搅拌，得到菌悬浮液。将得到的菌悬浮液在100℃、15分钟的条件下进行加热处理。经该处理后，将悬浮液离心，作为上清回收菌体外液，用0.45μm的过滤器进行过滤，从而得到麦角硫因提取液。
对于从所得的麦角硫因提取液和主培养后的培养物中得到的培养上清(经0.45μm过滤器过滤处理后)，按照上述例3记载的条件进行HPLC分析。另外，菌体浓度利用吸光度(OD600nm)进行分析。
培养中的吸光度(OB600nm)、麦角硫因提取液和培养上清中的麦角硫因量的测定结果示于图7中。如图7所示，麦角硫因提取液中(菌体内)的麦角硫因量最大为0.64mg/ml，培养上清中(菌体外)的麦角硫因量最大为0.05mg/ml。另外，菌体浓度(OD600)最大为47.1。根据该结果，通过高密度培养(EcEgtA+EcEgtC)转化大肠杆菌，可以在培养液中制备大量的麦角硫因。
根据上述例11-例14的结果可以获知，基于来源于酱油曲霉的AsEgtA蛋白质和AsEgtC蛋白质各自的氨基酸序列，从密码子、二级结构、GC含量等观点出发，利用为使宿主生物表达而最优化的基因egtA、或者egtA和egtC，通过对宿主生物进行转化，，与宿主生物原本的麦角硫因生产能力无关，能够在宿主生物中生产麦角硫因。
另外，根据上述例11-例14的结果可以获知，通过大量或者高密度地培养麦角硫因生产转化株，能够大量制备麦角硫因。这些结果表明，对于转化丝状菌，也能够通过大量或者高密度培养工业规模地制备麦角硫因。
产业上利用的可能性
本发明的转化丝状菌或制备方法，能够用于制备高纯度的麦角硫因。由于麦角硫因为高含硫氨基酸，因此，本发明可以应用于工业规模地制造用于制造具有抗氧化功能的化妆品或营养补充剂等抗氧化产品的原料。
序列表
<110> 龟甲万株式会社
<120> 麦角硫因生产能力增强的转化丝状菌及麦角硫因的制备方法
<130> 15DF0403PCT
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2925
<212> DNA
<213> 酱油曲霉
<400> 1
atgtcacctt tggctctctc tcctaagacc gttgacattg tcaacatctt tcagaatgat 60
gtggagttct ccctcgtaaa tgagatccat aagggtatta gtcctcccgc tggcgttagg 120
aagtcaatgc caacgatgct tctttacgat gccaatggcc tcaagctttt tgagaacatc 180
acctatgtga aggagtatta tctaacaaat gcggaaattg aggtcttgga gacaaattcc 240
aggaggatag ttgaacggat tccagacaat gcgcaactgc ttgaattagg tagcgggtgc 300
gtcatccttc caaatcaaat cgtaaccttt caggctgcgt agcgtatcat taccgttctc 360
cggttttaac cgccttttag gaatcttcgg aaaattgaga ttctgctacg ggagtttgag 420
cgcgtgggaa agcgcgtgga ttattatgcc ctggacctgt ctctatcaga actgcagcgc 480
acattcgcag aggtgtccat tgatgattac acacacgttg gcctccatgg tctccatgga 540
acctacgatg atgccgtcac ttggcttaac agccccgaaa acaggaagcg gcccacggtg 600
atcatgtcta tgggttcctc tttagggaac tttgaccgtc ccggcgcagc aaagtttctc 660
tcgcagtatg ctagccttct tggtccatcc gatatgatga tcattggtct ggatggctgc 720
aaggacccgg gcaaagtata cagggcatac aatgattcag aaggtgttac acggcagttc 780
tacgagaacg gactagtgca tgcaaatgtt gttcttggat acgaagcctt caaatctgat 840
gagtgggaag tagtgactga ctacgatacc gtggagggac gacactgggc agcctactca 900
cccaagaagg acgtcactat caacggggtc cttcttaaga agggtgagaa acttttcttt 960
gaagaggcgt acaagtacgg accagaggaa cgcgatcaac tgtggcgtga tgccaagtta 1020
attcagtcta cggaaatggg caatgggtct gacgattacc gtgagtagca aatggctgcc 1080
tcatttcaat agacgtgtat gctgactctg gcttttcgca aaatagatct ccatcttctg 1140
acatcggcta ccctcaacct ccccacgtct ccctctcaat atgcagctca tcctataccc 1200
agctttgaag aatggcagtc cctgtggaca gcatgggata atgctacaaa ggctatggtc 1260
cctcgcgagg agcttctgtc aaagccgatc aagctacgga actctttgat cttctatctg 1320
ggacacattc ctacattctt gggttagtct acatggctta ctattcccaa cacatagctt 1380
gatgctaatt atgcaaacag acatccatct gacccgagcc ctgcgcggaa aattaacaga 1440
gccaaagtct tataaactaa ttttcgaacg tgggattgat cctgatgtag atgaccccga 1500
gaagtgccac tcccatagcg agatcccaga cgagtggcca gctcttgatg acattctaga 1560
ctaccaagag cgagtcagaa gcagagttag atccatctac caaatcgagg gccttgcaga 1620
gaacagaatc ctgggtgagg cgctttggat tggatttgag cacgaagtga tgcacctcga 1680
gacattcctg tacatgttga tccagagcga aaggatactt cccccgcccg ccactgagcg 1740
gccggacttc aaaaaactgt atcaagaagc tcggagaagc atgaaagcaa atgagtggtt 1800
ctctgttcct gaacagacac ttactattgg ccttgatggt gctgatacca acgacgtacc 1860
cccaacgacc tatgggtggg acaatgagaa acctgcgaga acagtcacgg ttccagcatt 1920
tgaggcgcag ggcaggccca tcaccaatgg tgagtacgcc aagtacttgc aagcgaatca 1980
gtcgcgcaga aggccagcat catgggtcct gacccattcg gatgaagact acgccatacc 2040
tatggcggtc aacggaagca gtgtcggggc tacgcaggac tttatgtcca actttgctgt 2100
ccgtacggtc ttcggcccag ttccacttga atttgctcag gactggcctg tgatggcgtc 2160
atatgatgaa ttagctgaat acgccgaatg ggtgggttgc aggatcccaa ccttcgaaga 2220
gacaaggagt atctatctgc actcagcgct attgaaggaa agaggtggcg tgaatcataa 2280
tggggagccc aacggccata ggttagtgca gcctcattat aacaccacat tcgggattaa 2340
gctgagctaa cggctgtcag tttgaacggc gatctgaatg gggtgaatgg aaatggttac 2400
tcgaagatca acccaggcaa acctcgtaag ccggatcacc agcctgtaca atatccttcc 2460
cgagacgccc tgccagtgtt ccttgatctg cacggtctca acgtcgggtt caagcactgg 2520
caccccaccc cagttatcca gaacggcgat cgactcgccg gtcagggtga actgggaggc 2580
gcatgggagt ggactagcac gccattagcg ccacacgatg gctttaaagc catggagatc 2640
tacccgggat acacctgtaa gtaccagtcc cgttatcggg taccctctaa aagtctatca 2700
ttacatacta attccgcaca gccgatttct tcgacggtaa acataatatc atcctgggtg 2760
gttcttgggc tactcatccc cgcgtcgctg ggcgtaccac tttgtaagtt taccggtata 2820
gaactcgggg cactataaga tgctgacatc acctctagcg tcaattggta ccagcacaac 2880
tatccttaca cctgggcagg agcacgcctg gtgcgggatc tttag 2925
<210> 2
<211> 1770
<212> DNA
<213> 酱油曲霉
<400> 2
atgtctaatg ttacccaatc agccttgaga caggcaactc gcgcctacgc tcgccgactg 60
ccatcgacgc agcatggctc cttcgcttcc gcccttccca gacgggcgct cgccactcca 120
tacagacggt tctatgtctc cgaaactaag gctggaaatg ctcaggtttc ggtagatacc 180
gctatgaagc aggagcagaa ggaattcatg aaacaaactg gggtgcagcc gcagaaggtg 240
gagctcccta gttctggtgt ttccggcgat gcctcgatga gcccgtctgc cggcatcctc 300
aagcaggcca ctgtcatgga ccaaggaacg cgaccgatct atctcgatat gcaggccaca 360
accccaacgg atccccgtgt tctcgacgcc atgctcccct tcttgaccgg aatttacggc 420
aaccctcatt cgagaaccca tgcatacggt tgggagtcag aaaaggcagt cgagcaatcc 480
cgagagcata tcgccaagct gatcggcgcg gacccgaaag agatcatctt cactagcggt 540
gctactgaga gtaacaacat gagcattaag ggtgtggcga ggttttttgg gcgctccggc 600
aaaaaaaacc acatcatcac aacgcagacc gagcacaagt gtgttcttga cagctgtcgg 660
catcttcagg atgagggcta cgaggttacg tatctccccg tgcagaacaa cggcttgatt 720
cggatggaag acctcgaggc cgccattcgc cctgaaacgg ccctggtcag catcatggcc 780
gtcaacaatg agatcggtgt tatccagccc ctggaacaga ttggaaagtt gtgccgctcc 840
aagaagattt tcttccacac ggacgctgca caggccgtgg gaaagatccc gttggatgtg 900
aataaattga atattgattt gatgtctatt tcgagccaca agatttacgg ccccaagggt 960
attggagctt gctatgtcag acgtcgtccc agggttcgcc ttgaccctct cattactgga 1020
ggtggacagg agcgaggcct gcgcagtggt actcttgctc ctcatctggt cgttgggttc 1080
ggtgaggcct gccggatcgc cgcccaagat atggaggtac gttctatttt tcttttgttt 1140
ctgcttactt gcaatccctt ttctattttc cgatgattat atactgcaaa tatggatttc 1200
cgagaccggt gggggtagct gcacgcctaa cgcgtgaccc atgggcctat gacgtctcag 1260
caggggtgat gagttgacta ttgctttgtt tgccttgttt gcctcatgcg gctatgcgtc 1320
agtggacatc gctaatcgag ttggcagtat gacaccaagc acattgatcg tttgtccaag 1380
cgcctgaccg acgggctcct atccatggag cacacacacc tcaacggaga ccctgaacat 1440
cactacccgg gatgtgtcaa tgtctccttt gcctacatcg aaggagagtc tctcctgatg 1500
gccttgaaag acattgctct gtcgtcgggt agtgcctgta cctctgcgtc attggagccc 1560
agctacgtcc ttcgtgcctt gggtagcagt gacgagagcg cccatagcag tatccggttt 1620
ggaattggac gattcacttc ggatagcgaa attgactacg tgctgaaggc ggtacaggac 1680
cgcgttcatt tcctacgcga gctgagcccc ttgtgggaat tggtgcagga aggtatcgac 1740
ctgaacacga tcgaatggag tcaacattaa 1770
<210> 3
<211> 1529
<212> DNA
<213> 酱油曲霉
<400> 3
atgaccactc ccttcggagc tcccatgaga gagcacttcc tctttgacac caacttcaaa 60
aacctcaacc atggtatagt atcctactcc agtaacaagt accaacatta gctaactata 120
aaccaggctc cttcggcaca tacccccgtg ccgtccagac agtcctccgc caacaccaac 180
actccgccga ggcccgtcca gacctcttct accgcatcac ccgcggccaa ggcatcgacg 240
gatcgcgccg catcgtagcc aacctgctca acatccccgt caacgaatgt gtcttcgtca 300
agaacgcaac cacgggggtc gccaccgtgc tccgtaatct agtcttccag aagggagacg 360
cagtcgtgta cttcgacact atctatggcg ctgtggagaa gaatgtacac tctattatgg 420
aggctagtcc tgtgactact cgaaaggttg agtgtgcgtt acccgttagc catgaggacc 480
tggtgaaacg gttcagggat gtcgtgagtc gtgcaagagg ggaagggctg catgtgaaag 540
ttgcggtgtt tgacaccatc gtcagtgtgc ctggggtcag gttcccgttc gagaccttgg 600
taggggtctg tcgggaggag ggtatactca gtcttatcga tggggcgcat ggtattggac 660
atataccgtt ggatttgggg actttgaggc cggatttctt tactagtaac ctgcataagt 720
atgttccttt cccctttctt tctttctttc gtttgattac tgtgtgagga tcttgtatgc 780
tgatatagag caaaaaaaaa agatggctat tcgtcccccg cggctgcgca gttctccacg 840
tcccactccg caaccaacat ctcatccgca ccacattccc aacctcatgg ggatacatcc 900
cccctccctc atccggggag ataaccccca ccgccacgca gggtaaatcc gccttcgaat 960
atctcttcga acacatctcc acaaccgacg acacgccctg gctatgcgtc cccgccgcca 1020
tgaaattccg aactgaagtc tgcggcggcg aagaccgcat ctacgcttac ctggagaccc 1080
tagcccgcga ggccggggat atcgttgccc gcgccctcgg gacggaagtc atgcaggagc 1140
ccgggttgaa ggagggagag gtgagtcagc ttaggaggtg tgggatggct actgtgcggt 1200
tgccgattgc tgtgacttct tcttcttctt ctgattctgg gtctggtaat ggtgggggtg 1260
ctgttatgag ggtgcagggt gaggatggga gttcgtattt gcgaatccag acgtctttgg 1320
tggggactgt gagtaattgg tttcgggata cgttgtttga taagtacgag acgtttgtgc 1380
cggtgttcca gcatgggggg tggttgtgga cgagactcag tgcgcaggtt tatttggaga 1440
agggggattt tgagtggttg gggggtgttt tgagggagtg ttgtgagagg gttgagaggg 1500
aggttggggt ttcttctgcg aagctttga 1529
<210> 4
<211> 845
<212> PRT
<213> 酱油曲霉
<400> 4
Met Ser Pro Leu Ala Leu Ser Pro Lys Thr Val Asp Ile Val Asn Ile
1 5 10 15
Phe Gln Asn Asp Val Glu Phe Ser Leu Val Asn Glu Ile His Lys Gly
20 25 30
Ile Ser Pro Pro Ala Gly Val Arg Lys Ser Met Pro Thr Met Leu Leu
35 40 45
Tyr Asp Ala Asn Gly Leu Lys Leu Phe Glu Asn Ile Thr Tyr Val Lys
50 55 60
Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Glu Ile Glu Val Leu Glu Thr Asn Ser
65 70 75 80
Arg Arg Ile Val Glu Arg Ile Pro Asp Asn Ala Gln Leu Leu Glu Leu
85 90 95
Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Ile Glu Ile Leu Leu Arg Glu Phe Glu
100 105 110
Arg Val Gly Lys Arg Val Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Ser Leu Ser
115 120 125
Glu Leu Gln Arg Thr Phe Ala Glu Val Ser Ile Asp Asp Tyr Thr His
130 135 140
Val Gly Leu His Gly Leu His Gly Thr Tyr Asp Asp Ala Val Thr Trp
145 150 155 160
Leu Asn Ser Pro Glu Asn Arg Lys Arg Pro Thr Val Ile Met Ser Met
165 170 175
Gly Ser Ser Leu Gly Asn Phe Asp Arg Pro Gly Ala Ala Lys Phe Leu
180 185 190
Ser Gln Tyr Ala Ser Leu Leu Gly Pro Ser Asp Met Met Ile Ile Gly
195 200 205
Leu Asp Gly Cys Lys Asp Pro Gly Lys Val Tyr Arg Ala Tyr Asn Asp
210 215 220
Ser Glu Gly Val Thr Arg Gln Phe Tyr Glu Asn Gly Leu Val His Ala
225 230 235 240
Asn Val Val Leu Gly Tyr Glu Ala Phe Lys Ser Asp Glu Trp Glu Val
245 250 255
Val Thr Asp Tyr Asp Thr Val Glu Gly Arg His Trp Ala Ala Tyr Ser
260 265 270
Pro Lys Lys Asp Val Thr Ile Asn Gly Val Leu Leu Lys Lys Gly Glu
275 280 285
Lys Leu Phe Phe Glu Glu Ala Tyr Lys Tyr Gly Pro Glu Glu Arg Asp
290 295 300
Gln Leu Trp Arg Asp Ala Lys Leu Ile Gln Ser Thr Glu Met Gly Asn
305 310 315 320
Gly Ser Asp Asp Tyr His Leu His Leu Leu Thr Ser Ala Thr Leu Asn
325 330 335
Leu Pro Thr Ser Pro Ser Gln Tyr Ala Ala His Pro Ile Pro Ser Phe
340 345 350
Glu Glu Trp Gln Ser Leu Trp Thr Ala Trp Asp Asn Ala Thr Lys Ala
355 360 365
Met Val Pro Arg Glu Glu Leu Leu Ser Lys Pro Ile Lys Leu Arg Asn
370 375 380
Ser Leu Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Thr Phe Leu Asp Ile His
385 390 395 400
Leu Thr Arg Ala Leu Arg Gly Lys Leu Thr Glu Pro Lys Ser Tyr Lys
405 410 415
Leu Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp Asp Pro Glu Lys
420 425 430
Cys His Ser His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro Ala Leu Asp Asp
435 440 445
Ile Leu Asp Tyr Gln Glu Arg Val Arg Ser Arg Val Arg Ser Ile Tyr
450 455 460
Gln Ile Glu Gly Leu Ala Glu Asn Arg Ile Leu Gly Glu Ala Leu Trp
465 470 475 480
Ile Gly Phe Glu His Glu Val Met His Leu Glu Thr Phe Leu Tyr Met
485 490 495
Leu Ile Gln Ser Glu Arg Ile Leu Pro Pro Pro Ala Thr Glu Arg Pro
500 505 510
Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Gln Glu Ala Arg Arg Ser Met Lys Ala Asn
515 520 525
Glu Trp Phe Ser Val Pro Glu Gln Thr Leu Thr Ile Gly Leu Asp Gly
530 535 540
Ala Asp Thr Asn Asp Val Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Trp Asp Asn Glu
545 550 555 560
Lys Pro Ala Arg Thr Val Thr Val Pro Ala Phe Glu Ala Gln Gly Arg
565 570 575
Pro Ile Thr Asn Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Leu Gln Ala Asn Gln Ser
580 585 590
Arg Arg Arg Pro Ala Ser Trp Val Leu Thr His Ser Asp Glu Asp Tyr
595 600 605
Ala Ile Pro Met Ala Val Asn Gly Ser Ser Val Gly Ala Thr Gln Asp
610 615 620
Phe Met Ser Asn Phe Ala Val Arg Thr Val Phe Gly Pro Val Pro Leu
625 630 635 640
Glu Phe Ala Gln Asp Trp Pro Val Met Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ala
645 650 655
Glu Tyr Ala Glu Trp Val Gly Cys Arg Ile Pro Thr Phe Glu Glu Thr
660 665 670
Arg Ser Ile Tyr Leu His Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Gly Val
675 680 685
Asn His Asn Gly Glu Pro Asn Gly His Ser Leu Asn Gly Asp Leu Asn
690 695 700
Gly Val Asn Gly Asn Gly Tyr Ser Lys Ile Asn Pro Gly Lys Pro Arg
705 710 715 720
Lys Pro Asp His Gln Pro Val Gln Tyr Pro Ser Arg Asp Ala Leu Pro
725 730 735
Val Phe Leu Asp Leu His Gly Leu Asn Val Gly Phe Lys His Trp His
740 745 750
Pro Thr Pro Val Ile Gln Asn Gly Asp Arg Leu Ala Gly Gln Gly Glu
755 760 765
Leu Gly Gly Ala Trp Glu Trp Thr Ser Thr Pro Leu Ala Pro His Asp
770 775 780
Gly Phe Lys Ala Met Glu Ile Tyr Pro Gly Tyr Thr Ser Asp Phe Phe
785 790 795 800
Asp Gly Lys His Asn Ile Ile Leu Gly Gly Ser Trp Ala Thr His Pro
805 810 815
Arg Val Ala Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn Trp Tyr Gln His Asn Tyr
820 825 830
Pro Tyr Thr Trp Ala Gly Ala Arg Leu Val Arg Asp Leu
835 840 845
<210> 5
<211> 512
<212> PRT
<213> 酱油曲霉
<400> 5
Met Ser Asn Val Thr Gln Ser Ala Leu Arg Gln Ala Thr Arg Ala Tyr
1 5 10 15
Ala Arg Arg Leu Pro Ser Thr Gln His Gly Ser Phe Ala Ser Ala Leu
20 25 30
Pro Arg Arg Ala Leu Ala Thr Pro Tyr Arg Arg Phe Tyr Val Ser Glu
35 40 45
Thr Lys Ala Gly Asn Ala Gln Val Ser Val Asp Thr Ala Met Lys Gln
50 55 60
Glu Gln Lys Glu Phe Met Lys Gln Thr Gly Val Gln Pro Gln Lys Val
65 70 75 80
Glu Leu Pro Ser Ser Gly Val Ser Gly Asp Ala Ser Met Ser Pro Ser
85 90 95
Ala Gly Ile Leu Lys Gln Ala Thr Val Met Asp Gln Gly Thr Arg Pro
100 105 110
Ile Tyr Leu Asp Met Gln Ala Thr Thr Pro Thr Asp Pro Arg Val Leu
115 120 125
Asp Ala Met Leu Pro Phe Leu Thr Gly Ile Tyr Gly Asn Pro His Ser
130 135 140
Arg Thr His Ala Tyr Gly Trp Glu Ser Glu Lys Ala Val Glu Gln Ser
145 150 155 160
Arg Glu His Ile Ala Lys Leu Ile Gly Ala Asp Pro Lys Glu Ile Ile
165 170 175
Phe Thr Ser Gly Ala Thr Glu Ser Asn Asn Met Ser Ile Lys Gly Val
180 185 190
Ala Arg Phe Phe Gly Arg Ser Gly Lys Lys Asn His Ile Ile Thr Thr
195 200 205
Gln Thr Glu His Lys Cys Val Leu Asp Ser Cys Arg His Leu Gln Asp
210 215 220
Glu Gly Tyr Glu Val Thr Tyr Leu Pro Val Gln Asn Asn Gly Leu Ile
225 230 235 240
Arg Met Glu Asp Leu Glu Ala Ala Ile Arg Pro Glu Thr Ala Leu Val
245 250 255
Ser Ile Met Ala Val Asn Asn Glu Ile Gly Val Ile Gln Pro Leu Glu
260 265 270
Gln Ile Gly Lys Leu Cys Arg Ser Lys Lys Ile Phe Phe His Thr Asp
275 280 285
Ala Ala Gln Ala Val Gly Lys Ile Pro Leu Asp Val Asn Lys Leu Asn
290 295 300
Ile Asp Leu Met Ser Ile Ser Ser His Lys Ile Tyr Gly Pro Lys Gly
305 310 315 320
Ile Gly Ala Cys Tyr Val Arg Arg Arg Pro Arg Val Arg Leu Asp Pro
325 330 335
Leu Ile Thr Gly Gly Gly Gln Glu Arg Gly Leu Arg Ser Gly Thr Leu
340 345 350
Ala Pro His Leu Val Val Gly Phe Gly Glu Ala Cys Arg Ile Ala Ala
355 360 365
Gln Asp Met Glu Tyr Asp Thr Lys His Ile Asp Arg Leu Ser Lys Arg
370 375 380
Leu Thr Asp Gly Leu Leu Ser Met Glu His Thr His Leu Asn Gly Asp
385 390 395 400
Pro Glu His His Tyr Pro Gly Cys Val Asn Val Ser Phe Ala Tyr Ile
405 410 415
Glu Gly Glu Ser Leu Leu Met Ala Leu Lys Asp Ile Ala Leu Ser Ser
420 425 430
Gly Ser Ala Cys Thr Ser Ala Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Val Leu Arg
435 440 445
Ala Leu Gly Ser Ser Asp Glu Ser Ala His Ser Ser Ile Arg Phe Gly
450 455 460
Ile Gly Arg Phe Thr Ser Asp Ser Glu Ile Asp Tyr Val Leu Lys Ala
465 470 475 480
Val Gln Asp Arg Val His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Pro Leu Trp Glu
485 490 495
Leu Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu Asn Thr Ile Glu Trp Ser Gln His
500 505 510
<210> 6
<211> 463
<212> PRT
<213> 酱油曲霉
<400> 6
Met Thr Thr Pro Phe Gly Ala Pro Met Arg Glu His Phe Leu Phe Asp
1 5 10 15
Thr Asn Phe Lys Asn Leu Asn His Gly Ser Phe Gly Thr Tyr Pro Arg
20 25 30
Ala Val Gln Thr Val Leu Arg Gln His Gln His Ser Ala Glu Ala Arg
35 40 45
Pro Asp Leu Phe Tyr Arg Ile Thr Arg Gly Gln Gly Ile Asp Gly Ser
50 55 60
Arg Arg Ile Val Ala Asn Leu Leu Asn Ile Pro Val Asn Glu Cys Val
65 70 75 80
Phe Val Lys Asn Ala Thr Thr Gly Val Ala Thr Val Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Val Phe Gln Lys Gly Asp Ala Val Val Tyr Phe Asp Thr Ile Tyr Gly
100 105 110
Ala Val Glu Lys Asn Val His Ser Ile Met Glu Ala Ser Pro Val Thr
115 120 125
Thr Arg Lys Val Glu Cys Ala Leu Pro Val Ser His Glu Asp Leu Val
130 135 140
Lys Arg Phe Arg Asp Val Val Ser Arg Ala Arg Gly Glu Gly Leu His
145 150 155 160
Val Lys Val Ala Val Phe Asp Thr Ile Val Ser Val Pro Gly Val Arg
165 170 175
Phe Pro Phe Glu Thr Leu Val Gly Val Cys Arg Glu Glu Gly Ile Leu
180 185 190
Ser Leu Ile Asp Gly Ala His Gly Ile Gly His Ile Pro Leu Asp Leu
195 200 205
Gly Thr Leu Arg Pro Asp Phe Phe Thr Ser Asn Leu His Lys Trp Leu
210 215 220
Phe Val Pro Arg Gly Cys Ala Val Leu His Val Pro Leu Arg Asn Gln
225 230 235 240
His Leu Ile Arg Thr Thr Phe Pro Thr Ser Trp Gly Tyr Ile Pro Pro
245 250 255
Pro Ser Ser Gly Glu Ile Thr Pro Thr Ala Thr Gln Gly Lys Ser Ala
260 265 270
Phe Glu Tyr Leu Phe Glu His Ile Ser Thr Thr Asp Asp Thr Pro Trp
275 280 285
Leu Cys Val Pro Ala Ala Met Lys Phe Arg Thr Glu Val Cys Gly Gly
290 295 300
Glu Asp Arg Ile Tyr Ala Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Arg Glu Ala Gly
305 310 315 320
Asp Ile Val Ala Arg Ala Leu Gly Thr Glu Val Met Gln Glu Pro Gly
325 330 335
Leu Lys Glu Gly Glu Val Ser Gln Leu Arg Arg Cys Gly Met Ala Thr
340 345 350
Val Arg Leu Pro Ile Ala Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly
355 360 365
Ser Gly Asn Gly Gly Gly Ala Val Met Arg Val Gln Gly Glu Asp Gly
370 375 380
Ser Ser Tyr Leu Arg Ile Gln Thr Ser Leu Val Gly Thr Val Ser Asn
385 390 395 400
Trp Phe Arg Asp Thr Leu Phe Asp Lys Tyr Glu Thr Phe Val Pro Val
405 410 415
Phe Gln His Gly Gly Trp Leu Trp Thr Arg Leu Ser Ala Gln Val Tyr
420 425 430
Leu Glu Lys Gly Asp Phe Glu Trp Leu Gly Gly Val Leu Arg Glu Cys
435 440 445
Cys Glu Arg Val Glu Arg Glu Val Gly Val Ser Ser Ala Lys Leu
450 455 460
<210> 7
<211> 748
<212> DNA
<213> 酱油曲霉
<400> 7
tgtggaccag acaggcgcca ctcggccggg ccacaactgc ttgggttttg accgggagcg 60
gaccaattaa ggactcgaac gaccgcgggg ttcaaatgca aacaagtaca acacgcagca 120
aacgaagcag cccaccactg cgttgatgcc cagtttgtct gtccgaaatc caccggaaag 180
gtggaaacat actatgtaac aatcagaggg aagaaaaatt ttttatcgac gaggcaggat 240
agtgactgat ggtggggtca tggtcgggtc tccgagcgaa agagaaccaa ggaaacaaga 300
tcaacgaggt tggtgtaccc aaaaggccgc agcaacaaga gtcatcgccc aaaagtcaac 360
agtctggaag agactccgcc gtgcagattc tgcgtcggtc ccgcacatgc gtggtggggg 420
cattacccct ccatgtccaa tgataagggc ggcggtcgag ggcttaagcc cgcccactaa 480
ttcgccttct cgcttgcccc tccatataag gattcccctc cttcccctcc cacaactttt 540
ttcctctttc tctcttcgtc cgcatcagta cgtatatctt tcccccctac ctctttctca 600
ctcttcctcg attcattcca ctcttctcct tactgacatc tgttttgctc agtacctcta 660
cgcgatcagc cgtagtatct gagcaagctt ttttacagaa tctttctagt atcttacaaa 720
gaactacaaa gttcgcacca ccttcaaa 748
<210> 8
<211> 800
<212> DNA
<213> 酱油曲霉
<400> 8
gtaccaggag tacattggag agttctacca ttgttgctgg aatacaatga tgattagaaa 60
ccgaagagtg ttatgattcg gacggatata cgcatggcac gcatacagcg tgatacatag 120
gctgtttgct caagaattag gattttatct gaatccatgt acagagttta cttatgttag 180
tagtcaatga aatcttggct ttctaatttt gtccgatcta caaggggtag tcgatcacag 240
aacgaactag atgtgcaggg aacgatgatc acccgctctt agcaagacct ctagtagttt 300
tcgaccatag ctttaacgcg aatcatgacc ctactatttt ctagattgca gaccaagtca 360
catgacaatg tcctctttga agtaggatca gtagctgatt agattccggg aaatgaatta 420
gggctggcgt tccaactact ggggagtgcc gatgttgctg tatgaaagat agtaagatta 480
ctagtgcaca gctgtagtaa ttatttactc tagattatat attccaaata ataagtaatc 540
taagatagta gacagtccta tgatatagct ccgggttcga agtcggcaaa agatatgcaa 600
tcacctgtcg ggatgatata tgtatatctg aaataccgac atcaaccatc cagtcggatc 660
agctaaacga agtatcactt ctttcgccac tgccaatcac tacttctatt aaagttcatg 720
ttacagtata agccacaaga cttatctcca gaactaactt gtgcatagga gctctgccga 780
tagccgggtg gttggatcgg 800
<210> 9
<211> 1838
<212> DNA
<213> 酱油曲霉
<400> 9
ttgggcttat tgctatgtcc ctgaaaggat atcaaaagca ggcaaaaagc caggcataac 60
cccgcgcgga tggtacccta aggataagcc ctaatcttat ctacatgtga ctgcgtcgat 120
gtgtttggtc caaatgaggc atgtggctca ccccacaggc ggagaaacgt gtggctagtg 180
catgacggtc ccctccatag attcaattta atttttcgcg gcaattgtcg tgcagtttgt 240
atctaccgtt cattctacat attaagggtt agtaattgga catcctgatt actttgtcta 300
attactgaaa actcgaagta ctaacctact aaataagtca gtttcaacca ctaagtactc 360
atttatacaa tagttgcaga accccgcgct acccctccat tgccaacatg tcttccaagt 420
cgcaattgac ctacagcgca cgcgctagca agcaccccaa tgcgctcgtg aagaagctct 480
tcgaggttgc cgaggccaag aaaaccaatg tcaccgtttc cgccgacgtg acaaccacca 540
aagagctgct ggatttggct gaccgtatgc gcaccgggga tgccacttac atatgatcta 600
gtaatggtta atggtggaat atataacagg actcggtccg tacattgccg tgatcaaaac 660
tcacatcgat atcctctccg atttcagcga agagaccatc atcggtctga aggcccttgc 720
agagaagcac aatttcctca tcttcgaaga tcgcaagttc atcgatatcg gaaacacagt 780
ccaaaagcag taccatggcg gcactctgcg catctctgag tgggcccaca tcatcaactg 840
cagtattctg cccggtgagg gtatcgtcga ggctctggcc cagactgctt cggccgagga 900
cttcccctat ggctctgaga ggggcctttt gatccttgcg gagatgacat ccaagggatc 960
tttggctacc ggtcaatata ctacttcttc tgttgactat gcccggaagt ataagaagtt 1020
tgtgatggga ttcgtctcga cgcgtcacct gggcgaggtt cagtctgaag ttagctcgcc 1080
ttcggaggag gaggatttcg tcgtcttcac gacaggtgtc aacctctcct cgaagggaga 1140
caaactggga cagcaatacc agactcctga gtctgctgtt ggacgcggtg ccgactttat 1200
cattgctggt cgtggaattt atgctgctcc tgatcccgtg gaggcagcga agcggtacca 1260
gaaagaggga tgggatgcat accagaagcg tgttggtgcg caataagtag tggtgaatac 1320
gtgctctttt tatggcagta tatcgcaagt atgatgcgat tcataaattc agcagtcgaa 1380
ttctacgaga gaacgatgct aagagatacc ctctctatat gaataatatg cctgcctcga 1440
gatatggaca tattcaagat cagagttaag ggtcatgttt caaaatcaca ccaatctcca 1500
acatagacga gaatttttac cggattgtct gaaggtgcag ctggagattg gtctattttc 1560
taagagtggg gtatcactaa tgtacagtcg gtcactatcg tacaaacaat cacaattata 1620
tacaagattt cccatcaccc cttactctaa catggcactt ttatccatcg agtccgagcc 1680
tagccaccat ttggtgcttt cgtagagacc aaagtataac cctgatccga cagcggccat 1740
aaacgtgttg atagcacacc ctcggaatag tcctctcggg ccatctgttc gtataatctc 1800
ccgtacggta ttgatcatcc ttttcttctg aggtgcgg 1838
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
cggtacccgg ggatctgtgg accagacagg cgccactc 38
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
atgtactcct ggtactttga aggtggtgcg aactttgtag 40
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gtaccaggag tacattggag agttctac 28
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ccgatccaac cacccggcta tcg 23
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gggtggttgg atcggttggg cttattgcta tgtccctgaa agg 43
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
cgactctaga ggatcccgca cctcagaaga aaaggatga 39
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tttgaaggtg gtgcgaactt tgtag 25
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
cgcaccacct tcaaaatgtc acctttggct ctctctcc 38
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
atgtactcct ggtacctaaa gatcccgcac caggcgt 37
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
cgcaccacct tcaaaatgtc taatgttacc caatcagcct tgag 44
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
atgtactcct ggtacttaat gttgactcca ttcgatcgtg ttcag 45
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cgcaccacct tcaaaatgac cactcccttc ggagct 36
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
atgtactcct ggtactcaaa gcttcgcaga agaaacccca acc 43
<210> 23
<211> 2917
<212> DNA
<213> 米曲霉
<400> 23
atgtcaccgt tggctctttc tcctaagacc gttgacattg tcaacatctt tcagaatgac 60
gtggagttct ccctcgtaaa tgagatccat aagggcatta gtcctcccgc tggcgttagg 120
aagtcaatgc caacgatgct tctttacgat gccaatggcc tcaagctttt tgagaaaatc 180
acctatgtga aggagtatta tctaacaaat gcggaaatcg aggtcttgga gacaaattcc 240
aggaggatag ttgaacggat tccagacaat gcgcaactgc ttgaattagg tagcgggtgc 300
gtcatccttc caaatcaaat cgtaaccttt caggctgcgt agcgtatcat taccgttctc 360
cggttttaac cgccttttag gaatcttcgg aaaattgaga ttctgctacg ggagtttgag 420
cgcgtgggaa agcgcgtgga ttattatgcc cttgacctgt ctctatcaga actgcagcgc 480
acattcgcag aggtgtccat tgatgattac acacacgttg gcctccatgg tctccatgga 540
acctacgacg atgccgtcac ttggcttaac agccccgaaa acaggaagcg gcccacggtg 600
atcatgtcta tgggttcctc tttagggaac tttgaccgtc ctggcgcagc aaagtttctc 660
tcgcagtatg ctagccttct tggtccatcc gatatgatga tcattggtct ggatggctgc 720
aaggacccgg gcaaagtata cagggcatac aatgattcag aaggtgttac acggcagttc 780
tatgagaacg gactagtgca tgcaaatgtt gttcttggat acgaagcctt caaacctgat 840
gagtgggaag tagtgactga ctacgatgcc gtggagggac gacactgggc agcctactca 900
cccaggaggg acgtcactat caacggggtc cttcttaaga agggggagaa actcttcttt 960
gaagaggcgt acaagtacgg accagaggaa cgcgatcaac tgtggcgtga tgccaagtta 1020
ctccagtcta cggaagtggg caatgggtct gacgattacc gtgagtagca aatggctgcc 1080
tcatttcagt agacgtgtat gctaaatctg gcttttcgca aaatagatct ccatcttctg 1140
acatccgctg ccctcaacct ccccacgtct ccctctcaat atgcagctca tcctataccc 1200
agctttgaag aatggcagtc cctgtggaca gcatgggata atgctacaaa ggctatggtc 1260
cctcgcgagg agcttctgtc aaagccgatc aagctacgga actctttaat cttctatctg 1320
gggcacattc ctacattctt gggttagtct acatggctta ctattcccaa cacataactt 1380
gatgctaatt atgcaaacag acatccatct gacccgagcc ctgcgcggaa aactgacaga 1440
gccaaagtct tataaactaa ttttcgaacg tgggattgat cctgatgtag atgaccccca 1500
gaagtgccac tcccatagcg agatcccaga cgagtggcca gctcttgatg acattctaga 1560
ctaccaagag cgagtcagaa gcagagttag atccatctac cagatcgagg gccttgcaga 1620
aaacagaatc ctgggtgagg cgctttggat tggatttgag cacgaagtga tgcacctcga 1680
gacattcctg tacatgttga tccagagcga aaggatactt cccccgcccg ccactgaacg 1740
gccggacttc aaaaaactgt accaagacgc tcggagaagc atgaaaacaa atgagtggtt 1800
ctccgttcct gaacagacac ttactattgg ccttgatggt gctgatacca acgacgtacc 1860
cccaacgacc tatgggtggg acaatgagaa acctgcgaga acagtgacgg ttccagcatt 1920
tgaggcgcag ggcaggccca tcaccaatgg tgagtacgcc aagtacttgc aagcgaatca 1980
gtcgcgcaga aggccagcat catgggtcct gacccattcg gatgaaaact accccatacc 2040
tatggccgtc aacggaagca gtgtcggggc tacgcaggac tttatgtcca actttgctgt 2100
ccgtactgtc ttcggcccag ttccacttga atttgctcag gactggcctg tgatggcgtc 2160
atatgatgaa ttagccgaat atgccgaatg ggtgggttgc agaatcccaa ccttcgaaga 2220
gacaaggagt atctatctgc actcagcgct actgaaggaa agaggtggcg taaatcataa 2280
tggggagccc aatggccata ggttagtgca gcctcattat aacgccacat tccggggatt 2340
gagctgagct aacggctttc agtgtgaacg gctatctgaa cgggatgaat ggaaatagct 2400
actcgaagat caacccaggc aaacctcgta cgccggacca ccagcctgta caatatcctt 2460
cccgggacgc cttgccagtg ttccttgatc tggacggtct caacgtcggg ttcaagcact 2520
ggcaccccac cccagttatc cagaacggcg atcgactcgc cggtcagggt gaactgggag 2580
gcgcatggga gtggactagc acgccattag cgccacacga tggctttaaa gccatggaga 2640
tctacccggg atacacctgt aagtaccagt cccgttatcg ggtaccctct cattacatac 2700
taattccgca cagccgattt cttcgacggt aaacataaca tcatcctggg tggttcttgg 2760
gctactcatc cccgcgttgc tgggcgtacc actttgtaag tttaccggta tagaacccgg 2820
ggcactataa gatgctgaca acacctctag cgtcaattgg taccagcaca actatcctta 2880
cacctgggca ggagcacgcc tagtgcggga tctttag 2917
<210> 24
<211> 1769
<212> DNA
<213> 米曲霉
<400> 24
atgtctaatg ttacccaatc agccttgaga caggcaactc gcgcctacgc tcgtcgactg 60
ccatcgacgc agcatggctc cttcgcttcc gcccttccca gacgggcgct cgccactccg 120
tacagacggt tctatgtctc cgaaaccaag gctggaaatg ctcaggtttc ggtagatacc 180
gctattaagc aggagcagaa ggaattcatg aagcaaactg gggtgcagcc gcagaaggtg 240
gagctcccta gttctggtgt ttccggcgat gcctcgatga gcccgtctgc cggcatcctc 300
aagcaggcca ctgtcatgga ccaaggaacg cgaccgatct atctcgatat gcaggccaca 360
accccaacgg acccccgtgt tctagacgca atgctcccct tcttgaccgg aatttacggc 420
aaccctcact cgagaaccca tgcatacggt tgggagtcag aaaaggcagt cgagcaatcc 480
cgagagcaca tcgccaagct gatcggcgcg gacccgaaag agatcatctt cactagcggt 540
gctactgaga gtaacaacat gagcattaag ggtgtggcga ggttttttgg tcgctccggc 600
aaaaagaacc acatcatcac aacgcagacc gagcacaagt gtgttcttga cagctgtcgg 660
catcttcagg atgagggcta cgaggttacg tatctccccg tgcagaacaa cggcttgatt 720
cggatggaag acctcgaggc cgccattcgc cctgaaacgg ccctggtcag catcatggcc 780
gtcaacaacg agatcggtgt tatccagccc ctggaacaga ttggaaagtt gtgccgctcc 840
aagaagattt tcttccacac ggacgctgca caggccgtgg gaaagattcc gttggatgtg 900
aataaattga atattgatct gatgtctatt tcgagccaca agatttacgg ccccaagggt 960
attggagctt gctatgtcag acgtcgtccc agggttcgcc ttgaccctct cattactgga 1020
ggtggacagg agcgaggcct gcgcagtggt acccttgctc ctcatctggt cgttgggttc 1080
ggtgaggcct gccgtatcgc cgcccaagat atggaggtac gttctatttt tcttttgttt 1140
tctgcttact tgcaatctct tttttatttc cgatgattat atactgcaaa cttgatttcc 1200
gagatcagtg ggagtagctg cacgcctaac gcgtgaccca tcggcctatg acgtctcagc 1260
aggggtgatg agttgactat tgctttgttt gccctgtttg cctcatgcgg ctatgcgtca 1320
gtggacatcg ctaatagaat tgacagtatg acaccaagca cattgatcgt ttgtccaagc 1380
gcctgaccga cgggctccta tccatggagc acacccacct caacggagac cctgaacatc 1440
actacccggg atgtgtcaat gtctcctttg cctacatcga aggagagtct cttctgatgg 1500
ccctgaaaga cattgctctg tcgtcgggta gtgcctgtac ctctgcgtca ctggagccca 1560
gctacgtcct tcgtgccttg ggtagcagtg acgagagcgc ccatagcagt atccgatttg 1620
gaattggacg attcacttcg gatagcgaga tcgactacgt actgaaggcg gtacaggacc 1680
gcgttcattt cctacgcgag ctgagccccc tgtgggagtt ggtgcaggaa ggtatcgatc 1740
tgaacacgat cgaatggagt caacattaa 1769
<210> 25
<211> 1528
<212> DNA
<213> 米曲霉
<400> 25
atgaccacac ccttcggagc ccccatgaga gagcacttcc tcttcgacac caagttcaaa 60
aacctcaacc atggtataac tcaaccttac aagtaacaag tacaaacacc aactaactat 120
aatccaggct ccttcggcac atacccccgc gccgtccaaa cagccctccg ccaacaccaa 180
cactcggcgg aggcccgtcc agacctcttc taccgcatca cccgcggcca aggcatcgac 240
gaatcgcgcc gcatcgtagc caacctgctc aacatccccg tcaacgaatg cgtctttgtc 300
aagaacgcaa ccacgggtgt cgccaccgtg ctccgtaatc tagtcttcca gaagggagac 360
acagtcgtct acttcgacac gatctatggc gccgtggaga agaatgtaca ctctattatg 420
gagtccagcc ccgtgactac ccggaaggtt gagtatgcgt tgcctgttag ccatgaggac 480
ctggtgaaac ggttccagga tgtcgtgagt cgtgcaaggg gtgaggggct gaatgtgaag 540
gtcgcggtgt tcgacaccat cgtcagtatg cctggtgtac ggttcccgtt tgaggccttg 600
gtagaggtct gtcgggagga gggcatactc agtcttgttg atggggcaca tggtattggc 660
cacataccgt tggatttggg ggctttgaga ccggatttct ttactagtaa tctgcataag 720
tatgtcccct ccttctttcc ttctttcctc cgtttgatta ctatgtggga atacagtttt 780
gggatgctga tatggaacca aaaaaagatg gctattcgtc ccccgcggct gcgcagtcct 840
ccacgtccca ctccgcaacc aacatctcat ccgcaccaca ttcccaacct catggggata 900
catcccccct ccctcatccg gggagataac ccccaccacc acgcagggta aatccgcctt 960
cgaatacctc ttcgaataca tctccacaac cgacgacacg ccctggctct gcgtccccgc 1020
ggccatgaaa ttccgaacgg aagtctgcgg cggcgaagac cgcatctacg cttacctgga 1080
gaccctagcc cgcgaggccg gggatatcgt tgcccgcgcc ctcgggacgg aagtcatgca 1140
ggaggctggg ctgaaggagg gagaggccag tcagcttagg aggtgtggga tggctactgt 1200
gcggttgccg attgctgtgt cttcttcttc tgatgctggg tctggtcgtg gaggggatgc 1260
tgttatgagg gtgcagggtg aggatgggac ttcgtatctg cggattcagg cgtctttggt 1320
ggcgacggtc agtaattggt ttcgggatac gttgtttgag aagtatgaga cgtttgtgcc 1380
ggtgtttcag catggggggt ggttgtggac cagactctgt gcgcaggttt atttggagaa 1440
aggggatttt gagtggttgg ggggtgtttt gagggagtgt tgtgagaggg ttgaggggga 1500
ggttggggtt tcttctgcga agatttga 1528
<210> 26
<211> 845
<212> PRT
<213> 米曲霉
<400> 26
Met Ser Pro Leu Ala Leu Ser Pro Lys Thr Val Asp Ile Val Asn Ile
1 5 10 15
Phe Gln Asn Asp Val Glu Phe Ser Leu Val Asn Glu Ile His Lys Gly
20 25 30
Ile Ser Pro Pro Ala Gly Val Arg Lys Ser Met Pro Thr Met Leu Leu
35 40 45
Tyr Asp Ala Asn Gly Leu Lys Leu Phe Glu Lys Ile Thr Tyr Val Lys
50 55 60
Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Glu Ile Glu Val Leu Glu Thr Asn Ser
65 70 75 80
Arg Arg Ile Val Glu Arg Ile Pro Asp Asn Ala Gln Leu Leu Glu Leu
85 90 95
Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Ile Glu Ile Leu Leu Arg Glu Phe Glu
100 105 110
Arg Val Gly Lys Arg Val Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Ser Leu Ser
115 120 125
Glu Leu Gln Arg Thr Phe Ala Glu Val Ser Ile Asp Asp Tyr Thr His
130 135 140
Val Gly Leu His Gly Leu His Gly Thr Tyr Asp Asp Ala Val Thr Trp
145 150 155 160
Leu Asn Ser Pro Glu Asn Arg Lys Arg Pro Thr Val Ile Met Ser Met
165 170 175
Gly Ser Ser Leu Gly Asn Phe Asp Arg Pro Gly Ala Ala Lys Phe Leu
180 185 190
Ser Gln Tyr Ala Ser Leu Leu Gly Pro Ser Asp Met Met Ile Ile Gly
195 200 205
Leu Asp Gly Cys Lys Asp Pro Gly Lys Val Tyr Arg Ala Tyr Asn Asp
210 215 220
Ser Glu Gly Val Thr Arg Gln Phe Tyr Glu Asn Gly Leu Val His Ala
225 230 235 240
Asn Val Val Leu Gly Tyr Glu Ala Phe Lys Pro Asp Glu Trp Glu Val
245 250 255
Val Thr Asp Tyr Asp Ala Val Glu Gly Arg His Trp Ala Ala Tyr Ser
260 265 270
Pro Arg Arg Asp Val Thr Ile Asn Gly Val Leu Leu Lys Lys Gly Glu
275 280 285
Lys Leu Phe Phe Glu Glu Ala Tyr Lys Tyr Gly Pro Glu Glu Arg Asp
290 295 300
Gln Leu Trp Arg Asp Ala Lys Leu Leu Gln Ser Thr Glu Val Gly Asn
305 310 315 320
Gly Ser Asp Asp Tyr His Leu His Leu Leu Thr Ser Ala Ala Leu Asn
325 330 335
Leu Pro Thr Ser Pro Ser Gln Tyr Ala Ala His Pro Ile Pro Ser Phe
340 345 350
Glu Glu Trp Gln Ser Leu Trp Thr Ala Trp Asp Asn Ala Thr Lys Ala
355 360 365
Met Val Pro Arg Glu Glu Leu Leu Ser Lys Pro Ile Lys Leu Arg Asn
370 375 380
Ser Leu Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Thr Phe Leu Asp Ile His
385 390 395 400
Leu Thr Arg Ala Leu Arg Gly Lys Leu Thr Glu Pro Lys Ser Tyr Lys
405 410 415
Leu Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp Asp Pro Gln Lys
420 425 430
Cys His Ser His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro Ala Leu Asp Asp
435 440 445
Ile Leu Asp Tyr Gln Glu Arg Val Arg Ser Arg Val Arg Ser Ile Tyr
450 455 460
Gln Ile Glu Gly Leu Ala Glu Asn Arg Ile Leu Gly Glu Ala Leu Trp
465 470 475 480
Ile Gly Phe Glu His Glu Val Met His Leu Glu Thr Phe Leu Tyr Met
485 490 495
Leu Ile Gln Ser Glu Arg Ile Leu Pro Pro Pro Ala Thr Glu Arg Pro
500 505 510
Asp Phe Lys Lys Leu Tyr Gln Asp Ala Arg Arg Ser Met Lys Thr Asn
515 520 525
Glu Trp Phe Ser Val Pro Glu Gln Thr Leu Thr Ile Gly Leu Asp Gly
530 535 540
Ala Asp Thr Asn Asp Val Pro Pro Thr Thr Tyr Gly Trp Asp Asn Glu
545 550 555 560
Lys Pro Ala Arg Thr Val Thr Val Pro Ala Phe Glu Ala Gln Gly Arg
565 570 575
Pro Ile Thr Asn Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Leu Gln Ala Asn Gln Ser
580 585 590
Arg Arg Arg Pro Ala Ser Trp Val Leu Thr His Ser Asp Glu Asn Tyr
595 600 605
Pro Ile Pro Met Ala Val Asn Gly Ser Ser Val Gly Ala Thr Gln Asp
610 615 620
Phe Met Ser Asn Phe Ala Val Arg Thr Val Phe Gly Pro Val Pro Leu
625 630 635 640
Glu Phe Ala Gln Asp Trp Pro Val Met Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ala
645 650 655
Glu Tyr Ala Glu Trp Val Gly Cys Arg Ile Pro Thr Phe Glu Glu Thr
660 665 670
Arg Ser Ile Tyr Leu His Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Gly Val
675 680 685
Asn His Asn Gly Glu Pro Asn Gly His Ser Val Asn Gly Tyr Leu Asn
690 695 700
Gly Met Asn Gly Asn Ser Tyr Ser Lys Ile Asn Pro Gly Lys Pro Arg
705 710 715 720
Thr Pro Asp His Gln Pro Val Gln Tyr Pro Ser Arg Asp Ala Leu Pro
725 730 735
Val Phe Leu Asp Leu Asp Gly Leu Asn Val Gly Phe Lys His Trp His
740 745 750
Pro Thr Pro Val Ile Gln Asn Gly Asp Arg Leu Ala Gly Gln Gly Glu
755 760 765
Leu Gly Gly Ala Trp Glu Trp Thr Ser Thr Pro Leu Ala Pro His Asp
770 775 780
Gly Phe Lys Ala Met Glu Ile Tyr Pro Gly Tyr Thr Ser Asp Phe Phe
785 790 795 800
Asp Gly Lys His Asn Ile Ile Leu Gly Gly Ser Trp Ala Thr His Pro
805 810 815
Arg Val Ala Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn Trp Tyr Gln His Asn Tyr
820 825 830
Pro Tyr Thr Trp Ala Gly Ala Arg Leu Val Arg Asp Leu
835 840 845
<210> 27
<211> 512
<212> PRT
<213> 米曲霉
<400> 27
Met Ser Asn Val Thr Gln Ser Ala Leu Arg Gln Ala Thr Arg Ala Tyr
1 5 10 15
Ala Arg Arg Leu Pro Ser Thr Gln His Gly Ser Phe Ala Ser Ala Leu
20 25 30
Pro Arg Arg Ala Leu Ala Thr Pro Tyr Arg Arg Phe Tyr Val Ser Glu
35 40 45
Thr Lys Ala Gly Asn Ala Gln Val Ser Val Asp Thr Ala Ile Lys Gln
50 55 60
Glu Gln Lys Glu Phe Met Lys Gln Thr Gly Val Gln Pro Gln Lys Val
65 70 75 80
Glu Leu Pro Ser Ser Gly Val Ser Gly Asp Ala Ser Met Ser Pro Ser
85 90 95
Ala Gly Ile Leu Lys Gln Ala Thr Val Met Asp Gln Gly Thr Arg Pro
100 105 110
Ile Tyr Leu Asp Met Gln Ala Thr Thr Pro Thr Asp Pro Arg Val Leu
115 120 125
Asp Ala Met Leu Pro Phe Leu Thr Gly Ile Tyr Gly Asn Pro His Ser
130 135 140
Arg Thr His Ala Tyr Gly Trp Glu Ser Glu Lys Ala Val Glu Gln Ser
145 150 155 160
Arg Glu His Ile Ala Lys Leu Ile Gly Ala Asp Pro Lys Glu Ile Ile
165 170 175
Phe Thr Ser Gly Ala Thr Glu Ser Asn Asn Met Ser Ile Lys Gly Val
180 185 190
Ala Arg Phe Phe Gly Arg Ser Gly Lys Lys Asn His Ile Ile Thr Thr
195 200 205
Gln Thr Glu His Lys Cys Val Leu Asp Ser Cys Arg His Leu Gln Asp
210 215 220
Glu Gly Tyr Glu Val Thr Tyr Leu Pro Val Gln Asn Asn Gly Leu Ile
225 230 235 240
Arg Met Glu Asp Leu Glu Ala Ala Ile Arg Pro Glu Thr Ala Leu Val
245 250 255
Ser Ile Met Ala Val Asn Asn Glu Ile Gly Val Ile Gln Pro Leu Glu
260 265 270
Gln Ile Gly Lys Leu Cys Arg Ser Lys Lys Ile Phe Phe His Thr Asp
275 280 285
Ala Ala Gln Ala Val Gly Lys Ile Pro Leu Asp Val Asn Lys Leu Asn
290 295 300
Ile Asp Leu Met Ser Ile Ser Ser His Lys Ile Tyr Gly Pro Lys Gly
305 310 315 320
Ile Gly Ala Cys Tyr Val Arg Arg Arg Pro Arg Val Arg Leu Asp Pro
325 330 335
Leu Ile Thr Gly Gly Gly Gln Glu Arg Gly Leu Arg Ser Gly Thr Leu
340 345 350
Ala Pro His Leu Val Val Gly Phe Gly Glu Ala Cys Arg Ile Ala Ala
355 360 365
Gln Asp Met Glu Tyr Asp Thr Lys His Ile Asp Arg Leu Ser Lys Arg
370 375 380
Leu Thr Asp Gly Leu Leu Ser Met Glu His Thr His Leu Asn Gly Asp
385 390 395 400
Pro Glu His His Tyr Pro Gly Cys Val Asn Val Ser Phe Ala Tyr Ile
405 410 415
Glu Gly Glu Ser Leu Leu Met Ala Leu Lys Asp Ile Ala Leu Ser Ser
420 425 430
Gly Ser Ala Cys Thr Ser Ala Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Val Leu Arg
435 440 445
Ala Leu Gly Ser Ser Asp Glu Ser Ala His Ser Ser Ile Arg Phe Gly
450 455 460
Ile Gly Arg Phe Thr Ser Asp Ser Glu Ile Asp Tyr Val Leu Lys Ala
465 470 475 480
Val Gln Asp Arg Val His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Pro Leu Trp Glu
485 490 495
Leu Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu Asn Thr Ile Glu Trp Ser Gln His
500 505 510
<210> 28
<211> 461
<212> PRT
<213> 米曲霉
<400> 28
Met Thr Thr Pro Phe Gly Ala Pro Met Arg Glu His Phe Leu Phe Asp
1 5 10 15
Thr Lys Phe Lys Asn Leu Asn His Gly Ser Phe Gly Thr Tyr Pro Arg
20 25 30
Ala Val Gln Thr Ala Leu Arg Gln His Gln His Ser Ala Glu Ala Arg
35 40 45
Pro Asp Leu Phe Tyr Arg Ile Thr Arg Gly Gln Gly Ile Asp Glu Ser
50 55 60
Arg Arg Ile Val Ala Asn Leu Leu Asn Ile Pro Val Asn Glu Cys Val
65 70 75 80
Phe Val Lys Asn Ala Thr Thr Gly Val Ala Thr Val Leu Arg Asn Leu
85 90 95
Val Phe Gln Lys Gly Asp Thr Val Val Tyr Phe Asp Thr Ile Tyr Gly
100 105 110
Ala Val Glu Lys Asn Val His Ser Ile Met Glu Ser Ser Pro Val Thr
115 120 125
Thr Arg Lys Val Glu Tyr Ala Leu Pro Val Ser His Glu Asp Leu Val
130 135 140
Lys Arg Phe Gln Asp Val Val Ser Arg Ala Arg Gly Glu Gly Leu Asn
145 150 155 160
Val Lys Val Ala Val Phe Asp Thr Ile Val Ser Met Pro Gly Val Arg
165 170 175
Phe Pro Phe Glu Ala Leu Val Glu Val Cys Arg Glu Glu Gly Ile Leu
180 185 190
Ser Leu Val Asp Gly Ala His Gly Ile Gly His Ile Pro Leu Asp Leu
195 200 205
Gly Ala Leu Arg Pro Asp Phe Phe Thr Ser Asn Leu His Lys Trp Leu
210 215 220
Phe Val Pro Arg Gly Cys Ala Val Leu His Val Pro Leu Arg Asn Gln
225 230 235 240
His Leu Ile Arg Thr Thr Phe Pro Thr Ser Trp Gly Tyr Ile Pro Pro
245 250 255
Pro Ser Ser Gly Glu Ile Thr Pro Thr Thr Thr Gln Gly Lys Ser Ala
260 265 270
Phe Glu Tyr Leu Phe Glu Tyr Ile Ser Thr Thr Asp Asp Thr Pro Trp
275 280 285
Leu Cys Val Pro Ala Ala Met Lys Phe Arg Thr Glu Val Cys Gly Gly
290 295 300
Glu Asp Arg Ile Tyr Ala Tyr Leu Glu Thr Leu Ala Arg Glu Ala Gly
305 310 315 320
Asp Ile Val Ala Arg Ala Leu Gly Thr Glu Val Met Gln Glu Ala Gly
325 330 335
Leu Lys Glu Gly Glu Ala Ser Gln Leu Arg Arg Cys Gly Met Ala Thr
340 345 350
Val Arg Leu Pro Ile Ala Val Ser Ser Ser Ser Asp Ala Gly Ser Gly
355 360 365
Arg Gly Gly Asp Ala Val Met Arg Val Gln Gly Glu Asp Gly Thr Ser
370 375 380
Tyr Leu Arg Ile Gln Ala Ser Leu Val Ala Thr Val Ser Asn Trp Phe
385 390 395 400
Arg Asp Thr Leu Phe Glu Lys Tyr Glu Thr Phe Val Pro Val Phe Gln
405 410 415
His Gly Gly Trp Leu Trp Thr Arg Leu Cys Ala Gln Val Tyr Leu Glu
420 425 430
Lys Gly Asp Phe Glu Trp Leu Gly Gly Val Leu Arg Glu Cys Cys Glu
435 440 445
Arg Val Glu Gly Glu Val Gly Val Ser Ser Ala Lys Ile
450 455 460
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
cgcaccacct tcaaaatgtc accgttggct ctttctcc 38
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
atgtactcct ggtacctaaa gatcccgcac taggcgtg 38
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
cgcaccacct tcaaaatgac cacacccttc ggagcc 36
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
atgtactcct ggtactcaaa tcttcgcaga agaaacccca acc 43
<210> 33
<211> 2890
<212> DNA
<213> 黑曲霉
<400> 33
atgtcaccct tatgtccggt cgtcaagggc gttgacatcg tcgatatccg tcaaaatgac 60
gtggagtttt ccctggtaaa tgatatccag cgaggtatag atcctccggc aggaacttgc 120
cgatccatgc ccacaatgct tctttacgat gctcaggggc tcaagctgtt cgaggacatt 180
acgtacctgg aggaatacta tctcacaaat gcggagattg acgttctacg gacacatgcg 240
aagaggattg ttgaacgcat cccggacaat gcgcaattac tggaactagg cagtgggtgc 300
gtcttccttc cgcttggagc atgtatagag tatagggtac agacacggga ttctaacata 360
cggtagcaat ctgcgcaaga ttgagatcct tctccaggaa ttcgaagcag cgagcaaaaa 420
agtggactac tatgccttgg atctgtcgct ctcagagttg gagcgcacat tctcggaagt 480
gtccctcgat caatatcaat atgtcaagct ccacggcctg catggcacgt acgacgacgc 540
cctcacctgg ctagaaaacc ccgcgaatcg aaaggtccca acggtgatca tgtcaatggg 600
ctcgtcgata ggaaattttg atcgtcctgc agcggcaaaa ttcttgtcgc aatttgccag 660
gctcttaggg ccgtcggatt tgatggtgct cggtttggat agttgcacgg actcggataa 720
agtgtacaag gcatacaatg attccaaggg tatcacacgg cagttctacg agaacgggtt 780
gttgcatgcg aacgctgtgc ttggatacga agcattcaaa ctcgatgaat gggatatcgt 840
gacggagtac gataacgtcg aagggcggca ccaggcgttc tacgcgccaa accgggacgt 900
gactataaac ggggtactac ttcagaaagg cgagaagcta atttttgagg aggcattcaa 960
atatgatccc gagcagtgcg atcagctctg gcatgatgcg ggtttaattg aggacgctga 1020
gtttggcaat gagtctgggg attaccgtat gtcatccttt ggcaatgtgc tactctgcat 1080
gtcatgttgc actgcattgt gtaaaaacat gttacaccag ttgagaccat catactaaca 1140
taatctgtcg agcagttatc cacgtgctct cttcggcttc tctcaacttt tcaacgagac 1200
catcacagta tgcggctcaa tctattccga gctttgagga attccagtca ctgtggacag 1260
catgggacat tgtcaccaag gccatggttc ctagagagga acttctttcg aagccaatca 1320
aattgcgcaa tgcattaatc ttctacctcg gtcacatacc tacgtttctc ggtcagtgtt 1380
ctgcttggct atttgtggag tgcaagtata ggggtcagca tattgacaag cgcagatgtt 1440
catttgaccc gagcattggg cgaaaagcca acgcacccca agtcatatcg actcattttc 1500
gaacgcggaa tcgaccccga tgtggatgac cccgaaaagt gccattctca cagcgagatt 1560
ccagacgaat ggcctgccct tggagacatc ttggactacc aagtgcgggt tcgaagtagg 1620
gtgaggtcca tttttcagaa gcataatgtg gctgagaata gggtgcttgg tgaagcactc 1680
tggatcgggt ttgagcatga agccatgcat ctggaaacgt tcctttacat gcttatccag 1740
agtgaaagaa cacttccgcc ccccgccgtt ccgcgccccg attttaggaa gtttttccac 1800
gatgcccggc aagagtcaag accaaacgag tggttttcga ttcccgagaa gacgctttcg 1860
gttggattac atgatgatgg acattcagtt cctcgtgact cttttggctg ggacaacgaa 1920
aagccccaga gaaagataac cgttaaagca ttcgaagctc aagcgcgacc aataacaaat 1980
ggagagtacg cgaagtatct acaggcgaat cagctgcccc agaagccaga gtcctgggtc 2040
ttgatcaagc ccgagacgta cccgacttgc aatggtgtca gtcaagacgg tagctacgct 2100
acgaatgaat tcatggcaca ctttgccgtt cgcactgtgt ttggctccgt cccgctcgag 2160
ctagcccagg actggccggt tatcgcgtcg tacgatgaat tggccaagta tgccaagtgg 2220
gtggactgca ggataccaac cttcgaagag gcaaagagta tctacgcgca tgcagctcgg 2280
ctgaaggaaa ctagccacgg cctgaacggt cacaggtaag cataccgctt ccactagatg 2340
cacaggactt actgtcatag tgaaacgaac ggagtcaacg ggcacgaaca tagcgagacc 2400
aaccccctac ggcctcgcac cccggaccac caaccggtac agcacccttc gcaagaatct 2460
ctgccggtgt ttgttgagct cgacaattgc aacgtcggct tcaaacactg gcaccctacc 2520
ccggtcatcc agaacggcga ccgactcgcc ggtcatggag agctgggagg cgtctgggag 2580
tggacgagca cggaacttgc accccacgaa gggttcgagg ccatgcaaat ctaccccgga 2640
tatacatgta agcttgctgt gtgagatata tgaacacaag ctaactgaga acagccgact 2700
tcttcgacgg aaaacacaat atcatcctcg gagggtcatg ggcgacgcat ccacggatcg 2760
ccggccgcac taccttgtaa gtccgtatgc aagactagcg ggttcatgag ctaatctgtt 2820
cagtgtcaat tggtaccagc ggaactaccc atacccctgg gctggtgccc ggctggtgcg 2880
ggatgtctga 2890
<210> 34
<211> 835
<212> PRT
<213> 黑曲霉
<400> 34
Met Ser Pro Leu Cys Pro Val Val Lys Gly Val Asp Ile Val Asp Ile
1 5 10 15
Arg Gln Asn Asp Val Glu Phe Ser Leu Val Asn Asp Ile Gln Arg Gly
20 25 30
Ile Asp Pro Pro Ala Gly Thr Cys Arg Ser Met Pro Thr Met Leu Leu
35 40 45
Tyr Asp Ala Gln Gly Leu Lys Leu Phe Glu Asp Ile Thr Tyr Leu Glu
50 55 60
Glu Tyr Tyr Leu Thr Asn Ala Glu Ile Asp Val Leu Arg Thr His Ala
65 70 75 80
Lys Arg Ile Val Glu Arg Ile Pro Asp Asn Ala Gln Leu Leu Glu Leu
85 90 95
Gly Ser Gly Asn Leu Arg Lys Ile Glu Ile Leu Leu Gln Glu Phe Glu
100 105 110
Ala Ala Ser Lys Lys Val Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Leu Ser Leu Ser
115 120 125
Glu Leu Glu Arg Thr Phe Ser Glu Val Ser Leu Asp Gln Tyr Gln Tyr
130 135 140
Val Lys Leu His Gly Leu His Gly Thr Tyr Asp Asp Ala Leu Thr Trp
145 150 155 160
Leu Glu Asn Pro Ala Asn Arg Lys Val Pro Thr Val Ile Met Ser Met
165 170 175
Gly Ser Ser Ile Gly Asn Phe Asp Arg Pro Ala Ala Ala Lys Phe Leu
180 185 190
Ser Gln Phe Ala Arg Leu Leu Gly Pro Ser Asp Leu Met Val Leu Gly
195 200 205
Leu Asp Ser Cys Thr Asp Ser Asp Lys Val Tyr Lys Ala Tyr Asn Asp
210 215 220
Ser Lys Gly Ile Thr Arg Gln Phe Tyr Glu Asn Gly Leu Leu His Ala
225 230 235 240
Asn Ala Val Leu Gly Tyr Glu Ala Phe Lys Leu Asp Glu Trp Asp Ile
245 250 255
Val Thr Glu Tyr Asp Asn Val Glu Gly Arg His Gln Ala Phe Tyr Ala
260 265 270
Pro Asn Arg Asp Val Thr Ile Asn Gly Val Leu Leu Gln Lys Gly Glu
275 280 285
Lys Leu Ile Phe Glu Glu Ala Phe Lys Tyr Asp Pro Glu Gln Cys Asp
290 295 300
Gln Leu Trp His Asp Ala Gly Leu Ile Glu Asp Ala Glu Phe Gly Asn
305 310 315 320
Glu Ser Gly Asp Tyr Leu Ile His Val Leu Ser Ser Ala Ser Leu Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Arg Pro Ser Gln Tyr Ala Ala Gln Ser Ile Pro Ser Phe
340 345 350
Glu Glu Phe Gln Ser Leu Trp Thr Ala Trp Asp Ile Val Thr Lys Ala
355 360 365
Met Val Pro Arg Glu Glu Leu Leu Ser Lys Pro Ile Lys Leu Arg Asn
370 375 380
Ala Leu Ile Phe Tyr Leu Gly His Ile Pro Thr Phe Leu Asp Val His
385 390 395 400
Leu Thr Arg Ala Leu Gly Glu Lys Pro Thr His Pro Lys Ser Tyr Arg
405 410 415
Leu Ile Phe Glu Arg Gly Ile Asp Pro Asp Val Asp Asp Pro Glu Lys
420 425 430
Cys His Ser His Ser Glu Ile Pro Asp Glu Trp Pro Ala Leu Gly Asp
435 440 445
Ile Leu Asp Tyr Gln Val Arg Val Arg Ser Arg Val Arg Ser Ile Phe
450 455 460
Gln Lys His Asn Val Ala Glu Asn Arg Val Leu Gly Glu Ala Leu Trp
465 470 475 480
Ile Gly Phe Glu His Glu Ala Met His Leu Glu Thr Phe Leu Tyr Met
485 490 495
Leu Ile Gln Ser Glu Arg Thr Leu Pro Pro Pro Ala Val Pro Arg Pro
500 505 510
Asp Phe Arg Lys Phe Phe His Asp Ala Arg Gln Glu Ser Arg Pro Asn
515 520 525
Glu Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Thr Leu Ser Val Gly Leu His Asp
530 535 540
Asp Gly His Ser Val Pro Arg Asp Ser Phe Gly Trp Asp Asn Glu Lys
545 550 555 560
Pro Gln Arg Lys Ile Thr Val Lys Ala Phe Glu Ala Gln Ala Arg Pro
565 570 575
Ile Thr Asn Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Leu Gln Ala Asn Gln Leu Pro
580 585 590
Gln Lys Pro Glu Ser Trp Val Leu Ile Lys Pro Glu Thr Tyr Pro Thr
595 600 605
Cys Asn Gly Val Ser Gln Asp Gly Ser Tyr Ala Thr Asn Glu Phe Met
610 615 620
Ala His Phe Ala Val Arg Thr Val Phe Gly Ser Val Pro Leu Glu Leu
625 630 635 640
Ala Gln Asp Trp Pro Val Ile Ala Ser Tyr Asp Glu Leu Ala Lys Tyr
645 650 655
Ala Lys Trp Val Asp Cys Arg Ile Pro Thr Phe Glu Glu Ala Lys Ser
660 665 670
Ile Tyr Ala His Ala Ala Arg Leu Lys Glu Thr Ser His Gly Leu Asn
675 680 685
Gly His Ser Glu Thr Asn Gly Val Asn Gly His Glu His Ser Glu Thr
690 695 700
Asn Pro Leu Arg Pro Arg Thr Pro Asp His Gln Pro Val Gln His Pro
705 710 715 720
Ser Gln Glu Ser Leu Pro Val Phe Val Glu Leu Asp Asn Cys Asn Val
725 730 735
Gly Phe Lys His Trp His Pro Thr Pro Val Ile Gln Asn Gly Asp Arg
740 745 750
Leu Ala Gly His Gly Glu Leu Gly Gly Val Trp Glu Trp Thr Ser Thr
755 760 765
Glu Leu Ala Pro His Glu Gly Phe Glu Ala Met Gln Ile Tyr Pro Gly
770 775 780
Tyr Thr Ser Asp Phe Phe Asp Gly Lys His Asn Ile Ile Leu Gly Gly
785 790 795 800
Ser Trp Ala Thr His Pro Arg Ile Ala Gly Arg Thr Thr Phe Val Asn
805 810 815
Trp Tyr Gln Arg Asn Tyr Pro Tyr Pro Trp Ala Gly Ala Arg Leu Val
820 825 830
Arg Asp Val
835
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
cgcaccacct tcaaaatgtc acccttatgt ccggtcgtca ag 42
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
atgtactcct ggtactcaga catcccgcac cagcc 35
<210> 37
<211> 2550
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成基因
<400> 37
gatatcatga gcccgctggc gctgagcccg aagaccgtgg acattgtgaa catttttcag 60
aacgacgtgg agtttagcct ggtgaacgag attcataaag gcatcagccc gccggcgggt 120
gttcgtaaaa gcatgccgac catgctgctg tacgatgcga acggtctgaa gctgttcgaa 180
aacattacct atgtgaaaga gtactatctg accaacgcgg agatcgaagt gctggaaacc 240
aacagccgtc gtatcgttga gcgtattccg gacaacgcgc agctgctgga actgggtagc 300
ggcaacctgc gtaagatcga gattctgctg cgtgagttcg aacgtgtggg caaacgtgtt 360
gattactatg cgctggacct gagcctgagc gaactgcaac gtacctttgc ggaagtgagc 420
attgacgatt acacccacgt tggtctgcac ggcctgcacg gtacctatga cgatgcggtt 480
acctggctga acagcccgga aaaccgtaag cgtccgaccg tgatcatgag catgggcagc 540
agcctgggta acttcgatcg tccgggtgcg gcgaaatttc tgagccaata tgcgagcctg 600
ctgggtccga gcgacatgat gatcattggc ctggatggtt gcaaggaccc gggtaaagtg 660
taccgtgcgt ataacgacag cgaaggcgtt acccgtcaat tctacgagaa cggtctggtg 720
cacgcgaacg tggttctggg ctatgaagcg tttaagagcg atgagtggga agtggttacc 780
gactacgata ccgttgaggg tcgtcactgg gcggcgtata gcccgaagaa agacgtgacc 840
attaacggcg ttctgctgaa gaaaggtgaa aagctgttct ttgaggaagc gtacaaatat 900
ggcccggagg aacgtgatca gctgtggcgt gacgcgaagc tgatccaaag caccgagatg 960
ggtaacggca gcgacgatta ccacctgcac ctgctgacca gcgcgaccct gaacctgccg 1020
accagcccga gccagtatgc ggcgcacccg attccgagct tcgaggaatg gcaaagcctg 1080
tggaccgcgt gggataacgc gaccaaagcg atggttccgc gtgaggaact gctgagcaag 1140
ccgatcaaac tgcgtaacag cctgatcttc tacctgggtc acattccgac ctttctggac 1200
atccacctga cccgtgcgct gcgtggcaag ctgaccgaac cgaagagcta taaactgatc 1260
tttgagcgtg gcattgaccc ggatgtggac gatccggaaa aatgccacag ccacagcgaa 1320
attccggatg agtggccggc gctggacgac atcctggact accaggagcg tgtgcgtagc 1380
cgtgttcgta gcatctatca aattgaaggt ctggcggaga accgtattct gggcgaagcg 1440
ctgtggatcg gtttcgagca cgaagtgatg cacctggaga cctttctgta catgctgatt 1500
caaagcgaac gtatcctgcc gccgccggcg accgagcgtc cggatttcaa gaaactgtat 1560
caggaagcgc gtcgtagcat gaaggcgaac gaatggttta gcgttccgga gcaaaccctg 1620
accatcggcc tggacggtgc ggataccaac gacgtgccgc cgaccaccta cggttgggac 1680
aacgaaaaac cggcgcgtac cgttaccgtt ccggcgtttg aagcgcaggg tcgtccgatt 1740
accaacggcg agtacgcgaa atatctgcag gcgaaccaaa gccgtcgtcg tccggcgagc 1800
tgggttctga cccacagcga cgaagattac gcgatcccga tggcggtgaa cggcagcagc 1860
gttggtgcga cccaggactt catgagcaac tttgcggtgc gtaccgtttt cggtccggtt 1920
ccgctggagt ttgcgcaaga ttggccggtg atggcgagct acgacgagct ggcggaatat 1980
gcggagtggg tgggctgccg tattccgacc ttcgaggaaa cccgtagcat ctacctgcac 2040
agcgcgctgc tgaaggaacg tggtggcgtt aaccacaacg gcgagccgaa cggtcacagc 2100
ctgaacggcg atctgaacgg tgtgaacggt aacggctaca gcaaaatcaa cccgggcaag 2160
ccgcgtaaac cggaccacca gccggttcaa tatccgagcc gtgatgcgct gccggtgttc 2220
ctggacctgc acggtctgaa cgttggtttt aaacactggc acccgacccc ggtgattcag 2280
aacggtgatc gtctggcggg tcaaggtgaa ctgggtggcg cgtgggagtg gaccagcacc 2340
ccgctggcgc cgcacgacgg cttcaaggcg atggagatct acccgggcta taccagcgat 2400
ttctttgacg gtaaacacaa catcattctg ggtggcagct gggcgaccca cccgcgtgtg 2460
gcgggtcgta ccacctttgt taactggtat caacacaatt atccgtacac ctgggcgggt 2520
gcgcgtctgg ttcgtgacct gtaaactagt 2550
<210> 38
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成基因
<400> 38
gatatcatga ccacgccgtt tggtgcgccg atgcgtgaac attttctgtt cgataccaac 60
ttcaaaaacc tgaatcacgg ttccttcggc acgtatccgc gtgcggtcca gaccgtgctg 120
cgtcagcatc aacactcagc agaagctcgc ccggacctgt tttatcgtat tacccgcggt 180
caaggcatcg acggttctcg tcgcattgtc gcgaacctgc tgaatatccc ggtgaacgaa 240
tgcgttttcg tcaaaaatgc caccacgggc gttgcaaccg tcctgcgtaa cctggtgttt 300
cagaaaggtg atgcagtggt ttatttcgac accatctacg gcgctgtgga gaaaaacgtt 360
cattctatta tggaagcaag tccggtcacc acgcgcaaag tggaatgtgc tctgccggtt 420
tctcatgaag atctggtcaa acgttttcgc gacgtcgtga gtcgtgcgcg cggtgaaggc 480
ctgcacgtga aagttgccgt cttcgatacg attgtgtcgg ttccgggcgt tcgttttccg 540
ttcgaaaccc tggtcggtgt gtgccgcgaa gaaggcattc tgagcctgat cgatggtgcg 600
catggtattg gccacattcc gctggatctg ggtaccctgc gtccggactt tttcacctct 660
aacctgcata aatggctgtt tgtgccgcgc ggttgtgccg tgctgcatgt tccgctgcgt 720
aatcagcacc tgatccgcac cacgttcccg accagttggg gttatattcc gccgccgagc 780
tctggcgaaa ttaccccgac ggcaacccag ggcaaatcgg cttttgaata cctgttcgaa 840
cacattagca ccacggatga tacgccgtgg ctgtgtgttc cggccgcaat gaaatttcgt 900
accgaagtgt gtggcggtga agatcgcatc tatgcatacc tggaaacgct ggcacgtgaa 960
gctggtgaca ttgttgcccg tgcactgggt accgaagtga tgcaggaacc gggtctgaaa 1020
gaaggcgaag ttagccaact gcgtcgctgc ggtatggcca ccgtgcgtct gccgatcgcc 1080
gttaccagtt cctcatcgag cgatagcggt agcggtaatg gcggtggcgc cgtcatgcgt 1140
gtgcagggtg aagacggctc tagttatctg cgcattcaaa cgtccctggt tggcaccgtc 1200
tcaaattggt ttcgcgatac gctgttcgac aaatatgaaa cctttgttcc ggtcttccag 1260
catggtggct ggctgtggac ccgtctgtcc gcacaagtgt acctggaaaa gggtgatttt 1320
gaatggctgg gtggcgttct gcgcgaatgc tgtgaacgtg tggaacgcga agtgggcgtt 1380
tcctcagcta aactgtaaac tagt 1404

Claims (12)

1.转化丝状菌，所述丝状菌中插入了编码以下(1)的酶的基因或者编码以下(1)和(2)的酶的基因，并且过量表达该插入的基因，
(1)在S-腺苷甲硫氨酸、铁(II)和氧的存在下，催化由组氨酸和半胱氨酸生成下列式[I]：
所示的组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应的酶；
(2)将5’-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应的酶。
2.根据权利要求1所述的转化丝状菌，其中，所述丝状菌为曲霉(Aspergillus)属微生物。
3.根据权利要求1所述的转化丝状菌，其中，所述丝状菌为选自酱油曲霉(Aspergillus sojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillus tamarii)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、白曲霉(Aspergillus kawachii)以及斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)中的曲霉属微生物。
4.根据权利要求1所述的转化丝状菌，其中，所述转化丝状菌是：编码所述(1)的酶的基因或者编码所述(1)和(2)的酶的基因的表达增强，使得与宿主丝状菌相比麦角硫因的量增加的转化丝状菌。
5.根据权利要求1所述的转化丝状菌，其中，所述转化丝状菌是：编码所述(1)和(2)的酶的基因的表达增强，使得与编码所述(1)的酶的基因的表达增强的转化丝状菌相比，麦角硫因的量增加的转化丝状菌。
6.根据权利要求1所述的转化丝状菌，其中，所述转化丝状菌是：编码所述(1)的酶的基因或者编码所述(1)和(2)的酶的基因的表达增强，使得利用适于宿主丝状菌生长的培养基将该转化丝状菌在30℃下培养3日时麦角硫因的量为每克质量的干燥菌体达到10.0mg以上的转化丝状菌。
7.根据权利要求1所述的转化丝状菌，其中，编码所述(1)的酶的基因选自具有序列表中SEQ ID NO:1所示的碱基序列的基因、具有序列表中SEQ ID NO:23所示的碱基序列的基因、以及具有序列表中SEQ ID NO:33所示的碱基序列的基因，或者所述(1)的酶是选自具有序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的酶、具有序列表中SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的酶、以及具有序列表中SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的酶。
8.根据权利要求1所述的转化丝状菌，其中，编码所述(2)的酶的基因选自具有序列表中SEQ ID NO:2所示的碱基序列的基因、具有序列表中SEQ ID NO:3所示的碱基序列的基因、具有序列表中SEQ ID NO:24所示的碱基序列的基因、以及具有序列表中SEQ ID NO:25所示的碱基序列的基因，或者所述(2)的酶选自具有序列表中SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的酶、具有序列表中SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的酶、具有序列表中SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的酶、以及具有序列表中SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的酶。
9.麦角硫因的制备方法，该制备方法包括：使组氨酸和胱氨酸作用于权利要求1-8中任一项所述的转化丝状菌而得到麦角硫因的工序。
10.高纯度麦角硫因含有物的制备方法，该制备方法包括：利用含有组氨酸和半胱氨酸的培养基培养权利要求1-8中任一项所述的转化丝状菌，从所得的培养物中得到纯度为5％以上的麦角硫因含有物的工序。
11.重组载体，该重组载体包含：选自编码所述(1)的酶的基因和编码上述(2)的酶的基因中的至少一种基因、以及异源基因，
(1)在S-腺苷甲硫氨酸、铁(II)和氧的存在下，催化由组氨酸和半胱氨酸生成下列式[I]：
所示的组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜的反应的酶；
(2)将5’-磷酸吡哆醛作为辅酶，催化由组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜生成麦角硫因的反应的酶。
12.根据权利要求11所述的重组载体，其中，编码所述(1)的酶的基因以及编码所述(2)的酶的基因是来源于应插入所述重组载体的宿主生物的基因，或者是为了在该宿主生物中表达而进行了最优化的基因。
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