JP7070570B2 - エルゴチオネインの製造方法 - Google Patents
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Description
エルゴチオネインの産生能を有する微生物については、非特許文献1および2に報告されている。これらの報告によると、細菌の多くはエルゴチオネインの産生能がないことや、真核生物の中にはエルゴチオネイン産生能を有するものも存在するが、これらの文献の中で報告されている例は極わずかである。
さらに、子嚢菌門の糸状菌であるアスペルギルス属に属する微生物を用いて、エルゴチオネインを合成する酵素をコードする遺伝子を過剰発現することで、野生株と比べてエルゴチオネインの産生能を向上させてエルゴチオネインを産生する方法も知られている(特許文献2)。
即ち、本発明は以下を要旨とする。
(1)モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物を、炭素源を含む培地において培養し、前記微生物にエルゴチオネインを産生させる工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
(2)前記培地が、炭素源を100g/L以上500g/L以下の濃度で含有する、上記(1)に記載の方法。
(3)モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物が、モニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)、モニリエラ・メガチリエンシス(Moniliella megachiliensis)、モニリエラ・アセトアブテンス(Moniliella acetoabutens)、モニリエラ・スアヴェオレンス・バール・ニグラ(Moniliella suaveolens var. nigra)およびモニリエラ・スアヴェオレンス・バール・スアヴェオレンス(Moniliella suaveolens var.suaveolens)からなる群から選ばれる少なくとも一種である、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物が、モニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)CBS461.67、モニリエラ・メガチリエンシス(Moniliella megachiliensis)CBS567.85、モニリエラ・スアヴェオレンス・バール・ニグラ(Moniliella suaveolens var. nigra)CBS223.32、モニリエラ・スアヴェオレンス・バール・ニグラ(Moniliella suaveolens var. nigra)CBS382.36、モニリエラ・スアヴェオレンス・バール・ニグラ(Moniliella suaveolens var. nigra)CBS223.79、モニリエラ・アセトアブテンス(Moniliella acetoabutens)CBS170.66、モニリエラ・アセトアブテンス(Moniliella acetoabutens)CBS171.66、モニリエラ・アセトアブテンス(Moniliella acetoabutens)CBS594.68、モニリエラ・スアヴェオレンス・バール・スアヴェオレンス(Moniliella suaveolens var. suaveolens)CBS101.20およびモニリエラ・スアヴェオレンス・バール・スアヴェオレンス(Moniliella suaveolens var. suaveolens)CBS127.42からなる群から選ばれる少なくとも一種である、上記(1)~(3)のいずれかに記載の方法。
(5)モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物が、モニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)MCI3554(受託番号 FERM BP-6170)、モニリエラ・ポリニスMCI3555(受託番号FERM BP-6171)、モニリエラ・ポリニスMCI3371(受託番号FERM BP-6173)およびモニリエラ・メガチリエンシス(Moniliella megachiliensis)MCI3369(受託番号FERM BP-6172)からなる群から選ばれる少なくとも一種またはその変異体である、上記(1)~(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記工程が、前記微生物にさらに糖アルコール、アルコールおよび有機酸からなる群から選ばれる少なくとも一種を産生させる工程を含む、上記(1)~(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記工程で得られた培養物からエルゴチオネインを回収する工程をさらに含む、上記(1)~(6)のいずれかに記載の方法。
(8)前記工程で得られた培養物から糖アルコール、アルコールおよび有機酸からなる群から選ばれる少なくとも一種を回収する工程をさらに含む、上記(1)~(7)のいずれかに記載の方法。
(9)前記糖アルコールがエリスリトールである、上記(6)~(8)のいずれかに記載の方法。
以下、上記の工程(1)および(2)について、順に説明する。
[工程(1)]
工程(1)は、モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物を、炭素源を含む培地において培養し、該微生物にエルゴチオネインを産生させる工程である。
工程(1)では、モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物を、炭素源を含む培地を用いて培養する。
培地に含まれる炭素源としては、グルコース、フルクトース、グリセロール等の発酵性糖質が利用される。これらの中でも、安価で容易に入手できるということから、グルコースまたはフルクトースであることが好ましく、グルコースであることが特に好ましい。これらの炭素源は、単独でも組み合わせても使用できる。
また、炭素源は、培養中に分割添加してもよい。炭素源から、本発明で用いる微生物によりエルゴチオネインが産生される。
培養温度については、特に制限はないが、通常25℃以上、好ましくは27℃以上であり、また、通常37℃以下、好ましくは35℃以下である。
培養時間については、特に制限はないが、炭素源が消費されるまで行うことが好ましい。具体的には、24時間~8日間培養することができるが、本発明の製造方法では、24時間~3日間といった従来よりも短い時間で、微生物にエルゴチオネインを産生させることができる。
上記の培養条件は、使用する微生物によって異なることが予想されるが、使用する微生物について条件を段階的に変化させて予備実験を行うことにより、好ましい条件を見出すことができる。
このようにして産生される菌体中のエルゴチオネイン生成量は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等のそれ自体既知の通常用いられる方法で、より具体的には実施例に記載の方法で測定できる。
本発明において、糖アルコールとしては、限定されるものではなく、例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトールなどが挙げられ、好ましくはエリスリトールである。また、アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール、1,3-プロパンジオール、1,2-プロパンジオール、1,4-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール、などが挙げられ、有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ピルビン酸、乳酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、2-オキソグルタル酸、クエン酸、イソクエン酸、アラニン、バリン、セリン、グルタミン酸、リジン、などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
工程(2)は、前記工程(1)で得られた培養物からエルゴチオネインを回収(例えば、分離、菌体破砕、熱処理、抽出、精製など)する工程である。
前記工程(1)で得られた培養物からエルゴチオネインを回収する方法は特に限定されない。
また、工程(1)で糖アルコール(例えばエリスリトール)産生能が高い微生物を選択し、微生物にエルゴチオネインに加えて糖アルコールも産生させた場合、工程(1)で得られた培養物を菌体画分とそれ以外の溶液画分に分離し、菌体画分からはエルゴチオネインを回収(例えば抽出)し、それ以外の溶液画分からは糖アルコールを回収することができる。このようにすると、廃棄となる菌体画分を有効に活用することができる。
溶媒を加えた後、適宜、菌体破砕処理を加えながらエルゴチオネインを抽出することが好ましい。
1.モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物によるエルゴチオネインの産生
[実施例1~3]
モニリエラ属に属する微生物について、エルゴチオネインの産生を確認した。
モニリエラ属に属する微生物として、実施例1ではモニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)(以下、「M.Pollinis」と称する場合がある。) MCI3554(受託番号 FERM BP-6170)を、実施例2ではM.Pollinis MCI3555(受託番号 FERM BP-6171)を、実施例3ではM.Pollinis MCI3371 (受託番号 FERM BP-6173)を用いた。M.pollinis MCI3555は、野生株であるM.pollinis MCI3554の変異株であり、M.pollinis MCI3371は、M.pollinis CBS461.67の変異株である。
酵母エキス(アサヒフードアンドヘルスケア社製ミーストP1G)100 g/Lの溶液とグルコース(日本食品化工社製 無水結晶ブドウ糖#300)333 g/Lの溶液を別々に120 ℃で20分間滅菌した後、同じく滅菌済みの500 mlバッフル付き三角フラスコに、それぞれの溶液を5 ml、45 ml加えたものに各菌株を植菌し、30 ℃、180rpmにて3日間培養した。培養終了後、培養液を5mlずつ分注し、4 ℃で8000×g、5分間遠心分離を行った。得られた菌体は0.9 wt%の生理食塩水で懸濁し、4 ℃で8000×g、5分間遠心分離を行い、再度生理食塩水により懸濁し、遠心分離を行い、菌体を回収した。回収した菌体は湿菌体重量として重量を測定した。また、得られた湿菌体サンプルのうち1本はオーバーナイトで凍結乾燥を実施し、乾燥菌体重量を測定した。
得られた湿菌体重量と乾燥菌体重量、含水率の測定結果を表1に示す。
上記の回収で得られた湿菌体を、湿菌体重量に対し、2倍量の水を加えて懸濁した後、95 ℃で20分間処理することで、菌体内のエルゴチオネインを抽出した。その後、室温で10000×g、5分間遠心分離を行い、上清を1 ml回収し、オーバーナイトで凍結乾燥を実施した。凍結乾燥によって得られた乾固物を500 μlの水で再溶解した後、室温で10000×g、5分間遠心分離を行い、上清を0.2 μmフィルターで濾過し、濾液についてエルゴチオネインの濃度を測定した。
実施例1~3の各菌株における、乾燥菌体重量あたりのエルゴチオネインの産生量を表2に示す。上述の培地で3日間培養した結果、すべての菌株でエルゴチオネインを産生することが認められた。
グルコース濃度を変更した条件下でのエルゴチオネインの産生試験
M.Pollinis MCI3554について、実施例1の条件において、フラスコ培養時の初期グルコース濃度を100~500 g/Lの間で変更した条件下でエルゴチオネインの産生能を比較した。
初期グルコース濃度以外は、実施例1と同様の条件で、M.Pollinis MCI3554を培養し、エルゴチオネイン産生を確認した結果を表3に示す。本実施例からは初期グルコースの濃度が300 g/Lのとき、エルゴチオネインの産生が最大となった。
(1)菌株
モニリエラ属に属する微生物として、実施例9では、モニリエラ・メガチリエンシス(Moniliella megachiliensis)(以下、「M.megachiliensis」と称する場合がある。)MCI3369(受託番号 FERM BP- 6172)を用いた。M.megachiliensis MCI3369は、M.megachiliensis CBS567.85の変異株である。
M.megachiliensis MCI3369 について、実施例4~8の条件と同様に、フラスコ培養時の初期グルコース濃度を100~500g/Lの間で変更した条件下でエルゴチオネインの生産能を比較した。M.megachiliensis MCI3369を培養し、エルゴチオネイン産生を確認したところ、いずれの濃度においても、エルゴチオネインの産生を確認した。
上記1.における各菌株の培養液の遠心分離後の上清を回収し、エリスリトールの濃度を測定した。
エリスリトール量は、MCI GELTM CK08EH(三菱ケミカル、8×300mm)を用いたHPLCで定量した。溶離液には1.175g/Lリン酸水溶液を用い、流速 0.6 ml/min、カラム温度50℃でエリスリトールを溶出し、示差屈折計(RI)を用いる検出により測定した。本測定条件では、エリスリトールは 13.02 minに溶出が認められた。
各菌株における、培養液中のエリスリトールの産生量を表4に示す。表4に示される通り、測定したすべての菌株がエリスリトールを産生することが認められた。
さらに、この結果により、本発明の方法においては、一つの培養液において、菌体からはエルゴチオネインを得ることができ、かつ、培養上清からは糖アルコール、アルコールおよび有機酸等の有機化合物を得ることができることが示された。
Claims (7)
- (1)モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物を、炭素源を含む培地において培養し、前記微生物にエルゴチオネインを産生させる工程、及び
(2)前記工程で得られた培養物からエルゴチオネインを回収する工程
を含む、エルゴチオネインの製造方法。 - 前記培地が、炭素源を100g/L以上500g/L以下の濃度で含有する、請求項1に記載の方法。
- モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物が、モニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)、モニリエラ・メガチリエンシス(Moniliella megachiliensis)、モニリエラ・アセトアブテンス(Moniliella acetoabutens)、モニリエラ・スアヴェオレンス・バール・ニグラ(Moniliella suaveolens var. nigra)およびモニリエラ・スアヴェオレンス・バール・スアヴェオレンス(Moniliella suaveolens var.suaveolens)からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項1または2に記載の方法。
- モニリエラ(Moniliella)属に属する微生物が、モニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)MCI3554(受託番号 FERM BP-6170)、モニリエラ・ポリニスMCI3555(受託番号FERM BP-6171)、モニリエラ・ポリニスMCI3371(受託番号 FERM BP-6173)およびモニリエラ・メガチリエンシス(Moniliella megachiliensis)MCI3369(受託番号FERM BP-6172)からなる群から選ばれる少なくとも一種またはその変異体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程が、前記微生物にさらに糖アルコール、アルコールおよび有機酸からなる群から選ばれる少なくとも一種を産生させる工程を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程で得られた培養物から糖アルコール、アルコールおよび有機酸からなる群から選ばれる少なくとも一種を回収する工程をさらに含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記糖アルコールがエリスリトールである、請求項5又は6に記載の方法。
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