JP4055228B2 - エリスリトールの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はエリスリトールの製造方法に関し、更に詳しくは、培地の主窒素源として硫酸アンモニウムを使用することにより、発酵法により工業的に有利にエリスリトールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エリスリトールの製造方法としては、トリゴノブシス属（Trigonopsis ）、キャンジダ属（Candida ）の酵母をグリセロールを炭素源とし、カゼイン加水分解物を窒素源とする培地に培養して製造する方法（特公昭４７−４１５４９号公報）、キャンジダ属（Candida ）、トルロプシス属（Torulopsis）、ハンゼヌラ属（Hansenula)の酵母を炭化水素などを炭素源とし、酵母エキス、尿素を窒素源とする培地に培養して製造する方法（特公昭５１−２１０７２号公報）が知られている。しかしながら、これらの方法は、炭素源として使用される原料が実際の工業的生産において適当でないため、未だ工業化されていない。
【０００３】
また、モニリエラ・トメントサ・バール・ポリニス（Moniliella tomentosa var. pollinis）をグルコースなどの糖質を炭素源とし、コーンスティープリカー、尿素、酵母エキスを窒素源とする培地に培養して製造する方法（特開昭６０−１１０２９５号公報など）、エリスリトール生産菌を酵母エキス、コーンスティープリカーを窒素源とする培地に培養して製造する方法（特開平１−１９９５８４号公報）も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
窒素源としては上記の様な種々のものが知られている。しかしながら、尿素は食添としては認可されておらず、食品としてのエリスリトールの製造方法には使用できない。酵母エキス、カゼイン加水分解物は非常に高価であり、工業的生産においては必ずしも有利な方法とはいえない。また、コーンスティープリカーを主窒素源とした場合は、グリセリンが副生したり、生産したエリスリトールが褐色に着色したり、多量の塩が混在するため、精製工程での負荷が大きくなり、経済的に不利である。そこで、本発明の目的は、食添認可品で安全かつ安価な窒素源を使用し、工業的生産に適したエリスリトールの製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、主窒素源として硫安を使用することにより目的が達成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の要旨は、発酵性糖質からエリスリトールを産生する能力を有する酵母を、発酵性糖質を主炭素源とする培地で培養し、培養物よりエリスリトールを採取するエリスリトールの製造方法において、培地の窒素原子換算の窒素源の５０〜８５％が硫酸アンモニウムであり、残余がコーンスティープリカーであることを特徴とするエリスリトールの製造方法に存する。
【０００６】
本発明の好ましい実施の態様によれば、酵母が、モニリエラ属(Moniliella)に属する酵母である上記の製造方法；酵母が、モニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)である
上記の製造方法；酵母が、イエロビア属(Yarrowia)に属する酵母である上記の製造方法；酵母が、イエロビア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)である上記の製造方法；酵母が、トリコスポロノイデス属(Trichosporonoides)に属する酵母である上記の製造方法；酵母がトリコスポロノイデス・オエドセファリス(Trichosporonoides oedocephalis)、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス(Trichosporonoides nigrescens)および／またはトリコスポロノイデス・メガチリエンシス(Tricosporonoidesmegachiliensis)である上記の製造方法；発酵性糖質が、グルコース、フルクトースおよび／またはグリセロールである上記の製造方法；培地中の窒素源濃度が、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）である上記の製造方法；培養液のｐＨを３．０〜７．０に保持することを特徴とする上記の製造方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明で用いる酵母としては、発酵性糖質からエリスリトールを産生する能力を有するものであればいかなる酵母であっても良い。具体的には、モニリエラ属（Moniliella）、イエロビア属（Yarrowia）、トリコスポロノイデス属（Trichosporonoides ）に属する酵母が挙げられ、モニリエラ属（Moniliella）に属する酵母としては、例えばモリニエラ・ポリニス（Moniliella pollinis ）、イエロビア属（Yarrowia）に属する酵母としては、例えばイエロビア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、トリコスポロノイデス属（Trichosporonoides ）に属する酵母としては、例えば、トリコスポロノイデス・オエドセファリス（Trichosporonoides oedocephalis ）、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Tricosporonoides megachiliensis）、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス（Trichosporonoides nigrescens ）が挙げられる。上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【０００８】
本発明の製造方法においては、上記微生物を１種あるいは２種以上が用いられる。
より具体的には、例えば、モニリエラ・ポリニスＣＢＳ４６１．６７の変異株ＭＣＩ３３７１、モニリエラ・ポリニスＭＣＩ３５５４の変異株であるモニリエラ・ポリニスＭＣＩ３５５５、イエロビア・リポリチカＡＴＣＣ８６６１、トリコスポラノイデス・オエドファリスＣＢＳ５６８．８５の変異株ＭＣＩ３４４０、トリコスポラノイデス・メガチリエンシスＣＢＳ５６７．８５の変異株ＭＣＩ３３６９、トリコスポラノイデス・ニグレッセンスＣＢＳ２６８．８１の変異株ＭＣＩ３４３７を挙げることができる。
【０００９】
イエロビア・リポリチカＡＴＣＣ８６６１を除く上記の菌株は、国際寄託機関であるオランダ国のCentraal Bureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）寄託されている菌株や発明者らが自然界から分離した菌株から紫外線照射、Ｎーメチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤処理により発泡性を低減させた変異株であり、ＭＣＩ３３６９、ＭＣＩ３３７１、ＭＣＩ３４３７、ＭＣＩ３４４０、ＭＣＩ３５５４、ＭＣＩ３５５５はそれぞれ工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６１７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７４、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７５、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７０、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７１として寄託されている。また、イエロビア・リポリチカＡＴＣＣ８６６１株はアメリカのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているが、工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６１６９としても寄託されている。ＭＣＩ３３６９、ＭＣＩ３３７１、ＭＣＩ３４３７、ＭＣＩ３４４０、ＭＣＩ３５５４およびＭＣＩ３５５５の菌学的性状は以下の通りである。
【００１０】
ＭＣＩ３３６９
ＭＣＩ３３６９株はＰＤＡ上、２４℃培養ではじめ白色、後にオリーブがかった灰色、２週間以上の古い培養ではオリーブ褐色に変色する。菌の生育は速く、酵母様の出芽により増殖する。酵母様の細胞ははじめ無色、後にはオリーブがかった褐色を呈する。栄養菌糸はよく発達し、隔壁を有し分枝する、幅２〜３．８μｍ、はじめ無色、後に若干厚膜化し褐色に変色する。気中菌糸の発達は旺盛で、気中菌糸の側面より出芽型分生子を形成する。栄養菌糸、気中菌糸は断片状に切れて分節型の分生子となる。分節型分生子は円筒形〜樽形、３．６〜２５μｍ×２．２〜４．３μｍ、はじめ無色、後に淡褐色になる。出芽型分生子は単一または３〜４個の連鎖となる。分生子は細長い楕円形、大きさは３．４〜７．５μｍ×１．９〜４．１μｍ（平均６．５±１．２μｍ×３．８±０．６μｍ）、はじめ無色、後にオリーブがかった褐色を呈する。
本菌株（ＭＣＩ３３６９）の形態学的性状は親株であるトリコスポロノイデスメガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis) ＣＢＳ５６７．８５の基準株の特徴によく一致した。従って、本菌株はトリコスポロノイデス メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis) と同定した。
【００１１】
ＭＣＩ３３７１
ＭＣＩ３３７１株はＰＤＡ上、２４℃培養で始め白色〜黄味白色、培地一週間後ににぶ黄色、さらに古い培養では黒褐色に変色する。菌の生育は速く、酵母様の出芽により増殖する。出芽細胞ははじめ薄膜でオリーブがかった褐色を呈する、後に厚膜化して着色する。酵母様の出芽と同時に栄養菌糸が伸長する。栄養菌糸は隔壁を有し、分枝する。幅２〜４．５μｍ、はじめ無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子となる、または菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽形、６〜３５μｍ×２．５〜５．０μｍ、はじめ無色、後に褐色になる。出芽型分生子は単一または２〜３個の連鎖となって形成される、卵形〜楕円形、あるいは亜球形、大きさは４．７〜９．４μｍ×３．１〜５．６μｍ（平均６．８±１．３μｍ×４．５±０．６μｍ）、はじめ無色、後にオリーブがかった褐色となる。
【００１２】
本菌株（ＭＣＩ３３７１）は分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、２）出芽型分生子は求頂的に形成され同調的に形成されない特徴を有する。これらの特徴に基づいてDe Hoog & Hermanides-Nijhof (1977)のモノグラフに従って属の検索を行ったところ、本菌株はモニリエラ（Moniliella) 属に帰属することが判明した。De Hoog (1979)の“The Black yeasts, II：Moniliella and Allied Genera”Studies in Mycology No.19,1 〜90によれば、モニリエラ（Moniliella）属にはモニリエラ スアベオレンス バー スアベオレンス（Moniliella suaveolens var. suaveolens)、モニリエラ スアベオレンス バー ニゲル（Moniliella suaveolens var. niger）、モニリエラ アセトアブテンス（Moniliel la acetoabutens ）およびモニリエラ ポリニス( Moniliella pollinis ）の３種２変種が知られている。これらの種や変種は主として出芽型分生子あるいは分節型分生子の形態学的特徴によって区別されている。本菌株の形態学的性状を精査した結果、本菌はモニリエラ ポリニス( Moniliella pollinis ）の記載によく合致した。従って本菌株はモニリエラ ポリニス( Moniliella pollinis ）と同定した。
【００１３】
ＭＣＩ３４３７
ＭＣＩ３４３７株はＬＣＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に黄褐色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は中程度、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は初め、薄膜でオリーブがかった褐色を呈する、後に厚膜化して、黒褐色に着色する、多極出芽により増殖する。１回から３〜４回出芽して増殖する。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸が伸長する。基底菌糸は隔壁を有し、分枝する、幅２〜４．５μｍ、初め無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、あるいは菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、幅は２．５〜５．０μｍ、初め無色、後に褐色になる。出芽型分生子は基底菌糸の側面及び先端に形成する、単一あるいは２、３の連鎖となって形成される、亜球形〜楕円形、４．３〜９．２×３．８〜６．５μｍ、褐色、厚膜化する。３７℃では生育しない。
【００１４】
本菌株（ＭＣＩ３４３７）は１）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、２）出芽型分生子は求頂的に形成され、同調的な形成をしない、特徴を有する。これらの特徴に基づいて、Trichosporonoides nigrescensの親株と対比すると共に、G. S. de Hoog （1979）のモノグラフ及びA.D. Hocking & J.I. Pitt（1981）の原記載に従って属および種の検索を行ったところ、本生産菌の性状はTrichosporonoides nigrescensの親株によく合致した。従って本菌株はT. nigrescens と同定した。
【００１５】
ＭＣＩ３４４０
ＭＣＩ３４４０株はＬＣＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に茶色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は速い、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は無色、多極出芽により増殖する。１回から３〜４回出芽して増殖する。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸及び気中菌糸が伸長する。基底菌糸と気中菌糸は隔壁を有し、分枝する、幅２〜４．５μｍ、無色。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、あるいは菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。ＬＣＡ及びＰＤＡ上で頂嚢は形成されない。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、幅は２．５〜５．０μｍ、無色。出芽型分生子は基底菌糸の側面及び先端に形成する、単一あるいは２、３の連鎖となって形成される、楕円形、４．７〜８．１×２．５〜３．４μｍ、無色。３７℃で生育する。
【００１６】
本菌株（ＭＣＩ３４４０）は１）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、２）出芽型分生子は基底菌糸及び気中菌糸上に求頂的に生じる特徴を有する。Oedocephalis -typeの頂嚢を形成しない性状を有す。Haskins & Spencer （1966）の原記載によれば、Trichosporonoides oedocephalisは主として頂嚢を持つことによって、他の種（T.spathulata、T.nigrescens、T.madida及びT.megachiliensis）から識別されている。本変異株（ＭＣＩ３４４０）はこの点がT. oedocephalis と異なっている。しかし、T. oedocephalis の親株と対比すると共に、G. S. de Hoog （1979）のモノグラフ及びR.H. Haskins &J.F.T.Spencer （1966）の原記載に従って属及び種の検索を行ったところ、Oedocephalis-type の頂嚢を欠損している以外の形態学的性状はT.oedocephalisの親株によく合致した。従って本菌株は暫定的にT.oedocephalisと同定した。
【００１７】
ＭＣＩ３５５４
１）形態学的特徴：
コロニーはＰＤＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に黄褐色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は中程度、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は初め、無色、後にやや厚膜化して、淡褐色を呈する、楕円形、卵形あるいは亜球形、３．８〜６．３×３．０〜５．０μｍ。１回から３〜４回出芽して増殖する、多極出芽。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸と気中菌糸が伸長する。基底菌糸および気中菌糸は幅２．２〜３．５μｍ、隔壁を有し、分枝する、初め無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、９．４〜１８．８μｍ×３．１〜４．１μｍ、初め無色、後に褐色になる。出芽型分生子は基底菌糸の側面および先端に形成される、単一あるいは２、３個の連鎖となって形成される、亜球形〜楕円形、５．９〜１０．９×３．８〜５．９μｍ、初め無色、後に褐色、やや厚膜化する。
【００１８】
２）生理学的特徴：
生育温度：９℃〜３７℃（ＰＤＡ上、１０日間培養）
最適生育温度：２７℃〜３０℃
生育ｐＨ：４〜９（ＬＣＡ液体培地上、１０日間培養）
最適生育ｐＨ：５〜６
炭素源の利用（表−１に示す。）
糖からの発酵性（表−２に示す。）
窒素源の利用（表−３に示す。）
【００１９】
３）分類学的考察
本菌株（ＭＣＩ３５５４）は1 ）コウボ状の出芽型細胞を有する、2 ）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、3 ）出芽型分生子は求頂的に形成され、同調的に形成されない、特徴を有す。これらの特徴に基づいて、G. S. de Hoog （1979）, ”The Black Yeasts, II: Moniliella and Allied Genera, Studies in Mycology No.19 , p1-36 ”のモノグラフの検索表およびG.S. de Hoog & E. Gueho （1984）, Deoxyribonucleic acid base cimposition and taxonomy of Moniliella and allied genera, Antonie van Leeuwenhook,135-141のMoniliel la属に属する種の記載に従って、属及び種の検索をしたところ、本生産菌の性状はMoniliella pollinis の記載によく合致した。さらにMoniliella pollinis のタイプストレイン（CBS 461.67）の性状と対比したところ、本生産菌の性状はタイプストレインの性状にもよく合致した。
従って本菌株はMoniliella pollinis と同定した。
【００２０】
ＭＣＩ３５５５
１）形態学的特徴：
本菌株（ＭＣＩ３５５５）はMoniliella pollinis MCI3554 に由来する変異株で、コロニーはＰＤＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に黄褐色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は中程度、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は初め、無色、後にやや厚膜化して、淡褐色を呈する、楕円形、卵形あるいは亜球形、４．０〜７．８×３．５〜６．２μｍ。１回から３〜４回出芽して増殖する、多極出芽。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸と気中菌糸が伸長する。基底菌糸及び気中菌糸は幅１．３〜４．１μｍ、隔壁を有し、分枝する、初め無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、１３．４〜３２．８μｍ×２．５〜４．１μｍ、初め無色、後に褐色になる。出芽型分生子は基底菌糸の側面および先端に形成される、単一あるいは２、３個の連鎖となって形成される、亜球形〜楕円形、５．０〜９．４×４．４〜６．３μｍ、初め無色、後に褐色、やや厚膜化する。
【００２１】
２）生理学的特徴：
生育温度：９℃〜３７℃（ＰＤＡ上、１０日間培養）
最適生育温度：２７℃〜３０℃
生育ｐＨ：４〜９（ＬＣＡ液体培地上、１０日間培養）
最適生育ｐＨ：５〜６
炭素源の利用（表−１に示す。）
糖からの発酵性（表−２に示す。）
窒素源の利用（表−３に示す。）
【００２２】
３）分類学的考察
本菌株（ＭＣＩ３５５５）は1 ）コウボ状の出芽型細胞を有する、2 ）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、3 ）出芽型分生子は求頂的に形成され、同調的に形成されない、特徴を有す。これらの特徴に基づいて、G. S. de Hoog （1979）, ”The Black Yeasts, II: Moniliella and Allied Genera, Studies in Mycology No.19 , p1-36 ”のモノグラフの検索表及びG.S. de Hoog & E. Gueho （1984）, Deoxyribonucleic acid base cimposition and taxonomy of Moniliella and allied genera, Antonie van Leeuwenhook,135-141のMoniliella属に属する種の記載に従って、属および種の検索をしたところ、本生産菌の性状はMoniliella pollinis の記載によく合致した。さらにMoniliella pollinis のタイプストレイン（CBS 461.67）の性状と対比したところ、本生産菌の性状はタイプストレインの性状にもよく合致した。
従って本菌株はMoniliella pollinis と同定した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
これらの酵母を培養するために使用される培地の主炭素源としては、発酵性糖質であれば特に限定されないが、グルコース、フルクトース、グリセロールなどの発酵性糖質が好ましく、特にグルコースが好ましい。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。使用濃度は特に限定されないが、エリスリトールの生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、好ましい濃度は２０〜５０％（Ｗ／Ｖ）、好ましく３５〜４０％（Ｗ／Ｖ）はの範囲内である。
【００２８】
窒素源としては、窒素原子換算で、窒素源の５０〜８５％が硫酸アンモニウムであり、残りの１５〜５０％は硫酸アンモニウム以外のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、コーンステープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が用いられるが、残りの１５〜５０％がコーンスティープリカーであることが好ましい。硫酸アンモニウムが５０％以下の場合はグリセリンが副生したり、生産したエリスリトールが褐色に着色したり、多量の塩が混在したりするため好ましくなく、また８５％以上の場合はエリスリトールの収率が落ちるので好ましくない。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビタミン、ヌクレオチド、アミノ酸などの酵母の生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養中の発泡を抑えるために市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００２９】
発酵の初めの培地はｐＨ３〜７、好ましくはｐＨ３〜４．５、特に好ましくはｐＨ３．５〜４．０に調整する。また、培養中の温度は２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃に調節する。
培養に際しては、斜面培養から菌体を直接培地に接種しても構わないが、液体培地で１日〜４日間の培養で得られる培養液を接種するほうが望ましい。また、培養は、通気撹拌、振とうなどによる好気的条件下で行う。培養時間は主炭素源が消費されるまで行われるのが望ましく、通常は３〜６日の間で行われる。なお、培養液中のエリスリトール生成量はガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの方法で測定することができる。
【００３０】
このようにして培養液中に蓄積したエリスリトールは常法に従って、培養物より分離・精製される。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂、活性炭により脱塩、脱色し、その溶液から結晶化することによりエリスリトールを分離・精製することができる。
【００３１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を更に具体的に述べるが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
培養液の組成
【００３２】
【表５】
【００３３】
上記表−４において、窒素源としての硫酸アンモニウムとコーンステープリカーの割合は、窒素原子換算で約４：１である。（コーンステープリカーの窒素含有率：平均３％）
【００３４】
実施例１〜３
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したＭＣＩ３４３７株、ＭＣＩ３４４０株、ＭＣＩ３５５５株をそれぞれ接種し、３０℃で３日間振とう培養した（種培液）。上記表−４に示す組成の培地５００ｍｌを入れた１リットル容発酵槽に、種培養液１０ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、回転数８００ｐｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトールおよびグリセリン濃度を高速液体クロマトグラフィーで、培養終了後のブロスの上清液の着色度は４２０ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。
その結果、各菌株のエリスリトール生産量とグリセリン生成量と培地の着色度は次の通りであった。
【００３５】
【表６】
【００３６】
実施例４
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したＭＣＩ３３６９株を１白金耳植菌し、３５℃で３日間振とう培養した（得られた種培養液を以下「種培養液Ａ」という）。グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、上記種培養液Ａ２ｍｌを接種し、３５℃で３日間振とう培養した（得られた種培養液を以下「種培養液Ｂ」という）。上記表−４に示す組成の培養液１５リットルを入れた３０リットル容発酵槽に、種培養液Ｂ３００ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇ、回転数３５０ｒｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトールおよびグリセリン濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した結果、エリスリトール：対グルコース収率４８．２％、グリセリン：対グルコース収率１．１％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３６７あった。
【００３７】
実施例５
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（王子コーンスターチ社製）３．７％、消泡剤０．１％を含む液体培地１５リットルを入れた３０リットル容発酵槽に、種培養液Ａ３００ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇ、回転数３３０ｒｐｍの条件で３日間培養した（得られた種培養液を以下「種培養液Ｃ」という）。上記表−４に示す組成の培養液１５リットルを入れた３０リットル容発酵槽に、種培養液Ｂ３００ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇ、回転数３３０ｒｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトール濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した結果、エリスリトール：対グルコース収率４７．２％、グリセリン：対グルコース収率０．９％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３９５であった。
【００３８】
実施例６
菌株をＭＣＩ３３７１株を用いた以外は実施例４と同様にしてエリスリトールを生産した。エリスリトールの対グルコース収率は４８．０％、グリセリンの対グルコース収率は４．５％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３５３であった。
【００３９】
実施例７
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したＡＴＣＣ８６６１株を植菌し、３０℃で３日間振とう培養した（種培液）。上記表１に示す組成の培地２．５リットルを入れた５リットル容発酵槽に、種培養液１００ｍｌを接種し、温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、回転数９００ｐｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇの条件で５日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトールおよびグリセリン濃度を高速液体クロマトグラフィーで、エリスリトール：対グルコース収率４３．９％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３６５であった。
【００４０】
実施例８〜１０及び比較例１〜２
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５０ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培地したＭＣＩ３５５５株を植菌し、３０℃で３日間振とう培養した（種培液）。
上記表−４に示す組成の内コーンスチープリカーと硫酸アンモニウムの表−６に示す量比に代えた培地５００ｍｌを入れた１リットル容発酵槽に、種培養液１０ｍｌを接種し、温度３５０℃、通気量０．５ｖｖｍ、回転数８００ｐｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。
【００４１】
【表７】
【００４２】
その結果、各菌株のエリスリトール生産量とグリセリン生成量と培地の着色度は次の通りであった。
【００４３】
【表８】
【００４４】
比較例３〜５の培地組成
【００４５】
【表９】
【００４６】
上記表−８において、窒素源はコーンステープリカーのみであり、この窒素量は上記表−４の組成の培養液中の窒素量と窒素原子換算で同量である。比較例３〜５では上記表−４に示す組成の培養液のかわりに、上記表−８に示す組成の培養液を使用する以外は実施例１〜３と同様にしてエリスリトールを生産した。エリスリトールの収率、グリセリン生成量、プロス上清の着色度は次の通りであった。
【００４７】
【表１０】
【００４８】
比較例６
上記表−４に示す組成の培養液のかわりに、上記表−８に示す組成の培養液を使用する以外は実施例４と同様にしてエリスリトールを生産した。エリスリトールの対グルコース収率は３９．８％、グリセリンの対グルコース収率は１９．５％であった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、食添認可品で安全かつ安価な窒素源を使用し、高収率で効率良くエリスリトールを製造することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明はエリスリトールの製造方法に関し、更に詳しくは、培地の主窒素源として硫酸アンモニウムを使用することにより、発酵法により工業的に有利にエリスリトールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エリスリトールの製造方法としては、トリゴノブシス属（Trigonopsis ）、キャンジダ属（Candida ）の酵母をグリセロールを炭素源とし、カゼイン加水分解物を窒素源とする培地に培養して製造する方法（特公昭４７−４１５４９号公報）、キャンジダ属（Candida ）、トルロプシス属（Torulopsis）、ハンゼヌラ属（Hansenula)の酵母を炭化水素などを炭素源とし、酵母エキス、尿素を窒素源とする培地に培養して製造する方法（特公昭５１−２１０７２号公報）が知られている。しかしながら、これらの方法は、炭素源として使用される原料が実際の工業的生産において適当でないため、未だ工業化されていない。
【０００３】
また、モニリエラ・トメントサ・バール・ポリニス（Moniliella tomentosa var. pollinis）をグルコースなどの糖質を炭素源とし、コーンスティープリカー、尿素、酵母エキスを窒素源とする培地に培養して製造する方法（特開昭６０−１１０２９５号公報など）、エリスリトール生産菌を酵母エキス、コーンスティープリカーを窒素源とする培地に培養して製造する方法（特開平１−１９９５８４号公報）も知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
窒素源としては上記の様な種々のものが知られている。しかしながら、尿素は食添としては認可されておらず、食品としてのエリスリトールの製造方法には使用できない。酵母エキス、カゼイン加水分解物は非常に高価であり、工業的生産においては必ずしも有利な方法とはいえない。また、コーンスティープリカーを主窒素源とした場合は、グリセリンが副生したり、生産したエリスリトールが褐色に着色したり、多量の塩が混在するため、精製工程での負荷が大きくなり、経済的に不利である。そこで、本発明の目的は、食添認可品で安全かつ安価な窒素源を使用し、工業的生産に適したエリスリトールの製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、主窒素源として硫安を使用することにより目的が達成されることを見い出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の要旨は、発酵性糖質からエリスリトールを産生する能力を有する酵母を、発酵性糖質を主炭素源とする培地で培養し、培養物よりエリスリトールを採取するエリスリトールの製造方法において、培地の窒素原子換算の窒素源の５０〜８５％が硫酸アンモニウムであり、残余がコーンスティープリカーであることを特徴とするエリスリトールの製造方法に存する。
【０００６】
本発明の好ましい実施の態様によれば、酵母が、モニリエラ属(Moniliella)に属する酵母である上記の製造方法；酵母が、モニリエラ・ポリニス(Moniliella pollinis)である
上記の製造方法；酵母が、イエロビア属(Yarrowia)に属する酵母である上記の製造方法；酵母が、イエロビア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)である上記の製造方法；酵母が、トリコスポロノイデス属(Trichosporonoides)に属する酵母である上記の製造方法；酵母がトリコスポロノイデス・オエドセファリス(Trichosporonoides oedocephalis)、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス(Trichosporonoides nigrescens)および／またはトリコスポロノイデス・メガチリエンシス(Tricosporonoidesmegachiliensis)である上記の製造方法；発酵性糖質が、グルコース、フルクトースおよび／またはグリセロールである上記の製造方法；培地中の窒素源濃度が、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）である上記の製造方法；培養液のｐＨを３．０〜７．０に保持することを特徴とする上記の製造方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明で用いる酵母としては、発酵性糖質からエリスリトールを産生する能力を有するものであればいかなる酵母であっても良い。具体的には、モニリエラ属（Moniliella）、イエロビア属（Yarrowia）、トリコスポロノイデス属（Trichosporonoides ）に属する酵母が挙げられ、モニリエラ属（Moniliella）に属する酵母としては、例えばモリニエラ・ポリニス（Moniliella pollinis ）、イエロビア属（Yarrowia）に属する酵母としては、例えばイエロビア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、トリコスポロノイデス属（Trichosporonoides ）に属する酵母としては、例えば、トリコスポロノイデス・オエドセファリス（Trichosporonoides oedocephalis ）、トリコスポロノイデス・メガチリエンシス（Tricosporonoides megachiliensis）、トリコスポロノイデス・ニグレッセンス（Trichosporonoides nigrescens ）が挙げられる。上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【０００８】
本発明の製造方法においては、上記微生物を１種あるいは２種以上が用いられる。
より具体的には、例えば、モニリエラ・ポリニスＣＢＳ４６１．６７の変異株ＭＣＩ３３７１、モニリエラ・ポリニスＭＣＩ３５５４の変異株であるモニリエラ・ポリニスＭＣＩ３５５５、イエロビア・リポリチカＡＴＣＣ８６６１、トリコスポラノイデス・オエドファリスＣＢＳ５６８．８５の変異株ＭＣＩ３４４０、トリコスポラノイデス・メガチリエンシスＣＢＳ５６７．８５の変異株ＭＣＩ３３６９、トリコスポラノイデス・ニグレッセンスＣＢＳ２６８．８１の変異株ＭＣＩ３４３７を挙げることができる。
【０００９】
イエロビア・リポリチカＡＴＣＣ８６６１を除く上記の菌株は、国際寄託機関であるオランダ国のCentraal Bureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）寄託されている菌株や発明者らが自然界から分離した菌株から紫外線照射、Ｎーメチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異誘起剤処理により発泡性を低減させた変異株であり、ＭＣＩ３３６９、ＭＣＩ３３７１、ＭＣＩ３４３７、ＭＣＩ３４４０、ＭＣＩ３５５４、ＭＣＩ３５５５はそれぞれ工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６１７２、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７３、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７４、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７５、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７０、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１７１として寄託されている。また、イエロビア・リポリチカＡＴＣＣ８６６１株はアメリカのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているが、工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−６１６９としても寄託されている。ＭＣＩ３３６９、ＭＣＩ３３７１、ＭＣＩ３４３７、ＭＣＩ３４４０、ＭＣＩ３５５４およびＭＣＩ３５５５の菌学的性状は以下の通りである。
【００１０】
ＭＣＩ３３６９
ＭＣＩ３３６９株はＰＤＡ上、２４℃培養ではじめ白色、後にオリーブがかった灰色、２週間以上の古い培養ではオリーブ褐色に変色する。菌の生育は速く、酵母様の出芽により増殖する。酵母様の細胞ははじめ無色、後にはオリーブがかった褐色を呈する。栄養菌糸はよく発達し、隔壁を有し分枝する、幅２〜３．８μｍ、はじめ無色、後に若干厚膜化し褐色に変色する。気中菌糸の発達は旺盛で、気中菌糸の側面より出芽型分生子を形成する。栄養菌糸、気中菌糸は断片状に切れて分節型の分生子となる。分節型分生子は円筒形〜樽形、３．６〜２５μｍ×２．２〜４．３μｍ、はじめ無色、後に淡褐色になる。出芽型分生子は単一または３〜４個の連鎖となる。分生子は細長い楕円形、大きさは３．４〜７．５μｍ×１．９〜４．１μｍ（平均６．５±１．２μｍ×３．８±０．６μｍ）、はじめ無色、後にオリーブがかった褐色を呈する。
本菌株（ＭＣＩ３３６９）の形態学的性状は親株であるトリコスポロノイデスメガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis) ＣＢＳ５６７．８５の基準株の特徴によく一致した。従って、本菌株はトリコスポロノイデス メガチリエンシス（Trichosporonoides megachiliensis) と同定した。
【００１１】
ＭＣＩ３３７１
ＭＣＩ３３７１株はＰＤＡ上、２４℃培養で始め白色〜黄味白色、培地一週間後ににぶ黄色、さらに古い培養では黒褐色に変色する。菌の生育は速く、酵母様の出芽により増殖する。出芽細胞ははじめ薄膜でオリーブがかった褐色を呈する、後に厚膜化して着色する。酵母様の出芽と同時に栄養菌糸が伸長する。栄養菌糸は隔壁を有し、分枝する。幅２〜４．５μｍ、はじめ無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子となる、または菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽形、６〜３５μｍ×２．５〜５．０μｍ、はじめ無色、後に褐色になる。出芽型分生子は単一または２〜３個の連鎖となって形成される、卵形〜楕円形、あるいは亜球形、大きさは４．７〜９．４μｍ×３．１〜５．６μｍ（平均６．８±１．３μｍ×４．５±０．６μｍ）、はじめ無色、後にオリーブがかった褐色となる。
【００１２】
本菌株（ＭＣＩ３３７１）は分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、２）出芽型分生子は求頂的に形成され同調的に形成されない特徴を有する。これらの特徴に基づいてDe Hoog & Hermanides-Nijhof (1977)のモノグラフに従って属の検索を行ったところ、本菌株はモニリエラ（Moniliella) 属に帰属することが判明した。De Hoog (1979)の“The Black yeasts, II：Moniliella and Allied Genera”Studies in Mycology No.19,1 〜90によれば、モニリエラ（Moniliella）属にはモニリエラ スアベオレンス バー スアベオレンス（Moniliella suaveolens var. suaveolens)、モニリエラ スアベオレンス バー ニゲル（Moniliella suaveolens var. niger）、モニリエラ アセトアブテンス（Moniliel la acetoabutens ）およびモニリエラ ポリニス( Moniliella pollinis ）の３種２変種が知られている。これらの種や変種は主として出芽型分生子あるいは分節型分生子の形態学的特徴によって区別されている。本菌株の形態学的性状を精査した結果、本菌はモニリエラ ポリニス( Moniliella pollinis ）の記載によく合致した。従って本菌株はモニリエラ ポリニス( Moniliella pollinis ）と同定した。
【００１３】
ＭＣＩ３４３７
ＭＣＩ３４３７株はＬＣＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に黄褐色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は中程度、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は初め、薄膜でオリーブがかった褐色を呈する、後に厚膜化して、黒褐色に着色する、多極出芽により増殖する。１回から３〜４回出芽して増殖する。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸が伸長する。基底菌糸は隔壁を有し、分枝する、幅２〜４．５μｍ、初め無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、あるいは菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、幅は２．５〜５．０μｍ、初め無色、後に褐色になる。出芽型分生子は基底菌糸の側面及び先端に形成する、単一あるいは２、３の連鎖となって形成される、亜球形〜楕円形、４．３〜９．２×３．８〜６．５μｍ、褐色、厚膜化する。３７℃では生育しない。
【００１４】
本菌株（ＭＣＩ３４３７）は１）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、２）出芽型分生子は求頂的に形成され、同調的な形成をしない、特徴を有する。これらの特徴に基づいて、Trichosporonoides nigrescensの親株と対比すると共に、G. S. de Hoog （1979）のモノグラフ及びA.D. Hocking & J.I. Pitt（1981）の原記載に従って属および種の検索を行ったところ、本生産菌の性状はTrichosporonoides nigrescensの親株によく合致した。従って本菌株はT. nigrescens と同定した。
【００１５】
ＭＣＩ３４４０
ＭＣＩ３４４０株はＬＣＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に茶色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は速い、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は無色、多極出芽により増殖する。１回から３〜４回出芽して増殖する。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸及び気中菌糸が伸長する。基底菌糸と気中菌糸は隔壁を有し、分枝する、幅２〜４．５μｍ、無色。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、あるいは菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。ＬＣＡ及びＰＤＡ上で頂嚢は形成されない。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、幅は２．５〜５．０μｍ、無色。出芽型分生子は基底菌糸の側面及び先端に形成する、単一あるいは２、３の連鎖となって形成される、楕円形、４．７〜８．１×２．５〜３．４μｍ、無色。３７℃で生育する。
【００１６】
本菌株（ＭＣＩ３４４０）は１）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、２）出芽型分生子は基底菌糸及び気中菌糸上に求頂的に生じる特徴を有する。Oedocephalis -typeの頂嚢を形成しない性状を有す。Haskins & Spencer （1966）の原記載によれば、Trichosporonoides oedocephalisは主として頂嚢を持つことによって、他の種（T.spathulata、T.nigrescens、T.madida及びT.megachiliensis）から識別されている。本変異株（ＭＣＩ３４４０）はこの点がT. oedocephalis と異なっている。しかし、T. oedocephalis の親株と対比すると共に、G. S. de Hoog （1979）のモノグラフ及びR.H. Haskins &J.F.T.Spencer （1966）の原記載に従って属及び種の検索を行ったところ、Oedocephalis-type の頂嚢を欠損している以外の形態学的性状はT.oedocephalisの親株によく合致した。従って本菌株は暫定的にT.oedocephalisと同定した。
【００１７】
ＭＣＩ３５５４
１）形態学的特徴：
コロニーはＰＤＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に黄褐色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は中程度、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は初め、無色、後にやや厚膜化して、淡褐色を呈する、楕円形、卵形あるいは亜球形、３．８〜６．３×３．０〜５．０μｍ。１回から３〜４回出芽して増殖する、多極出芽。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸と気中菌糸が伸長する。基底菌糸および気中菌糸は幅２．２〜３．５μｍ、隔壁を有し、分枝する、初め無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、９．４〜１８．８μｍ×３．１〜４．１μｍ、初め無色、後に褐色になる。出芽型分生子は基底菌糸の側面および先端に形成される、単一あるいは２、３個の連鎖となって形成される、亜球形〜楕円形、５．９〜１０．９×３．８〜５．９μｍ、初め無色、後に褐色、やや厚膜化する。
【００１８】
２）生理学的特徴：
生育温度：９℃〜３７℃（ＰＤＡ上、１０日間培養）
最適生育温度：２７℃〜３０℃
生育ｐＨ：４〜９（ＬＣＡ液体培地上、１０日間培養）
最適生育ｐＨ：５〜６
炭素源の利用（表−１に示す。）
糖からの発酵性（表−２に示す。）
窒素源の利用（表−３に示す。）
【００１９】
３）分類学的考察
本菌株（ＭＣＩ３５５４）は1 ）コウボ状の出芽型細胞を有する、2 ）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、3 ）出芽型分生子は求頂的に形成され、同調的に形成されない、特徴を有す。これらの特徴に基づいて、G. S. de Hoog （1979）, ”The Black Yeasts, II: Moniliella and Allied Genera, Studies in Mycology No.19 , p1-36 ”のモノグラフの検索表およびG.S. de Hoog & E. Gueho （1984）, Deoxyribonucleic acid base cimposition and taxonomy of Moniliella and allied genera, Antonie van Leeuwenhook,135-141のMoniliel la属に属する種の記載に従って、属及び種の検索をしたところ、本生産菌の性状はMoniliella pollinis の記載によく合致した。さらにMoniliella pollinis のタイプストレイン（CBS 461.67）の性状と対比したところ、本生産菌の性状はタイプストレインの性状にもよく合致した。
従って本菌株はMoniliella pollinis と同定した。
【００２０】
ＭＣＩ３５５５
１）形態学的特徴：
本菌株（ＭＣＩ３５５５）はMoniliella pollinis MCI3554 に由来する変異株で、コロニーはＰＤＡ上、２４℃培養で初め白色〜黄味白色、培養１週間後に黄褐色、２週間以上の古い培養では暗い黄茶色に変色する。菌の生育は中程度、コウボ様の出芽により増殖する。出芽細胞は初め、無色、後にやや厚膜化して、淡褐色を呈する、楕円形、卵形あるいは亜球形、４．０〜７．８×３．５〜６．２μｍ。１回から３〜４回出芽して増殖する、多極出芽。コウボ様の出芽と同時に基底菌糸と気中菌糸が伸長する。基底菌糸及び気中菌糸は幅１．３〜４．１μｍ、隔壁を有し、分枝する、初め無色、後に褐色になる。菌糸は断片状に切れて分節型の分生子になる、菌糸の側面あるいは先端部より出芽型の分生子を形成する。分節型分生子は円筒形〜樽型、長さは変化に富む、１３．４〜３２．８μｍ×２．５〜４．１μｍ、初め無色、後に褐色になる。出芽型分生子は基底菌糸の側面および先端に形成される、単一あるいは２、３個の連鎖となって形成される、亜球形〜楕円形、５．０〜９．４×４．４〜６．３μｍ、初め無色、後に褐色、やや厚膜化する。
【００２１】
２）生理学的特徴：
生育温度：９℃〜３７℃（ＰＤＡ上、１０日間培養）
最適生育温度：２７℃〜３０℃
生育ｐＨ：４〜９（ＬＣＡ液体培地上、１０日間培養）
最適生育ｐＨ：５〜６
炭素源の利用（表−１に示す。）
糖からの発酵性（表−２に示す。）
窒素源の利用（表−３に示す。）
【００２２】
３）分類学的考察
本菌株（ＭＣＩ３５５５）は1 ）コウボ状の出芽型細胞を有する、2 ）分節型分生子と出芽型分生子の二形性を有する、3 ）出芽型分生子は求頂的に形成され、同調的に形成されない、特徴を有す。これらの特徴に基づいて、G. S. de Hoog （1979）, ”The Black Yeasts, II: Moniliella and Allied Genera, Studies in Mycology No.19 , p1-36 ”のモノグラフの検索表及びG.S. de Hoog & E. Gueho （1984）, Deoxyribonucleic acid base cimposition and taxonomy of Moniliella and allied genera, Antonie van Leeuwenhook,135-141のMoniliella属に属する種の記載に従って、属および種の検索をしたところ、本生産菌の性状はMoniliella pollinis の記載によく合致した。さらにMoniliella pollinis のタイプストレイン（CBS 461.67）の性状と対比したところ、本生産菌の性状はタイプストレインの性状にもよく合致した。
従って本菌株はMoniliella pollinis と同定した。
【００２３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
これらの酵母を培養するために使用される培地の主炭素源としては、発酵性糖質であれば特に限定されないが、グルコース、フルクトース、グリセロールなどの発酵性糖質が好ましく、特にグルコースが好ましい。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。使用濃度は特に限定されないが、エリスリトールの生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、好ましい濃度は２０〜５０％（Ｗ／Ｖ）、好ましく３５〜４０％（Ｗ／Ｖ）はの範囲内である。
【００２８】
窒素源としては、窒素原子換算で、窒素源の５０〜８５％が硫酸アンモニウムであり、残りの１５〜５０％は硫酸アンモニウム以外のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、コーンステープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が用いられるが、残りの１５〜５０％がコーンスティープリカーであることが好ましい。硫酸アンモニウムが５０％以下の場合はグリセリンが副生したり、生産したエリスリトールが褐色に着色したり、多量の塩が混在したりするため好ましくなく、また８５％以上の場合はエリスリトールの収率が落ちるので好ましくない。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビタミン、ヌクレオチド、アミノ酸などの酵母の生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養中の発泡を抑えるために市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００２９】
発酵の初めの培地はｐＨ３〜７、好ましくはｐＨ３〜４．５、特に好ましくはｐＨ３．５〜４．０に調整する。また、培養中の温度は２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃に調節する。
培養に際しては、斜面培養から菌体を直接培地に接種しても構わないが、液体培地で１日〜４日間の培養で得られる培養液を接種するほうが望ましい。また、培養は、通気撹拌、振とうなどによる好気的条件下で行う。培養時間は主炭素源が消費されるまで行われるのが望ましく、通常は３〜６日の間で行われる。なお、培養液中のエリスリトール生成量はガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどの方法で測定することができる。
【００３０】
このようにして培養液中に蓄積したエリスリトールは常法に従って、培養物より分離・精製される。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂、活性炭により脱塩、脱色し、その溶液から結晶化することによりエリスリトールを分離・精製することができる。
【００３１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明を更に具体的に述べるが、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
培養液の組成
【００３２】
【表５】
上記表−４において、窒素源としての硫酸アンモニウムとコーンステープリカーの割合は、窒素原子換算で約４：１である。（コーンステープリカーの窒素含有率：平均３％）
【００３４】
実施例１〜３
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したＭＣＩ３４３７株、ＭＣＩ３４４０株、ＭＣＩ３５５５株をそれぞれ接種し、３０℃で３日間振とう培養した（種培液）。上記表−４に示す組成の培地５００ｍｌを入れた１リットル容発酵槽に、種培養液１０ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、回転数８００ｐｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトールおよびグリセリン濃度を高速液体クロマトグラフィーで、培養終了後のブロスの上清液の着色度は４２０ｎｍの吸光度を分光光度計で測定した。
その結果、各菌株のエリスリトール生産量とグリセリン生成量と培地の着色度は次の通りであった。
【００３５】
【表６】
実施例４
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したＭＣＩ３３６９株を１白金耳植菌し、３５℃で３日間振とう培養した（得られた種培養液を以下「種培養液Ａ」という）。グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、上記種培養液Ａ２ｍｌを接種し、３５℃で３日間振とう培養した（得られた種培養液を以下「種培養液Ｂ」という）。上記表−４に示す組成の培養液１５リットルを入れた３０リットル容発酵槽に、種培養液Ｂ３００ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇ、回転数３５０ｒｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトールおよびグリセリン濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した結果、エリスリトール：対グルコース収率４８．２％、グリセリン：対グルコース収率１．１％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３６７あった。
【００３７】
実施例５
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（王子コーンスターチ社製）３．７％、消泡剤０．１％を含む液体培地１５リットルを入れた３０リットル容発酵槽に、種培養液Ａ３００ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇ、回転数３３０ｒｐｍの条件で３日間培養した（得られた種培養液を以下「種培養液Ｃ」という）。上記表−４に示す組成の培養液１５リットルを入れた３０リットル容発酵槽に、種培養液Ｂ３００ｍｌを接種し、温度３５℃、通気量０．５ｖｖｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇ、回転数３３０ｒｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトール濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した結果、エリスリトール：対グルコース収率４７．２％、グリセリン：対グルコース収率０．９％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３９５であった。
【００３８】
実施例６
菌株をＭＣＩ３３７１株を用いた以外は実施例４と同様にしてエリスリトールを生産した。エリスリトールの対グルコース収率は４８．０％、グリセリンの対グルコース収率は４．５％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３５３であった。
【００３９】
実施例７
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培養したＡＴＣＣ８６６１株を植菌し、３０℃で３日間振とう培養した（種培液）。上記表１に示す組成の培地２．５リットルを入れた５リットル容発酵槽に、種培養液１００ｍｌを接種し、温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、回転数９００ｐｍ、内圧０．５Ｋｇ／ｃｍ2 Ｇの条件で５日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。培養液中のエリスリトールおよびグリセリン濃度を高速液体クロマトグラフィーで、エリスリトール：対グルコース収率４３．９％であった。また、培養終了後のブロスの上清液の着色度はＡ420 で０．３６５であった。
【００４０】
実施例８〜１０及び比較例１〜２
グルコース３０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（アサヒビール社製）１％を含む液体培地１００ｍｌを綿栓した５０ｍｌの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分間滅菌したものに、常法により斜面培地したＭＣＩ３５５５株を植菌し、３０℃で３日間振とう培養した（種培液）。
上記表−４に示す組成の内コーンスチープリカーと硫酸アンモニウムの表−６に示す量比に代えた培地５００ｍｌを入れた１リットル容発酵槽に、種培養液１０ｍｌを接種し、温度３５０℃、通気量０．５ｖｖｍ、回転数８００ｐｐｍの条件で４日間培養した。接種時の培地のｐＨは３．９〜４．０であり、培養中は３５％水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを３．５〜３．７に保った。
【００４１】
【表７】
その結果、各菌株のエリスリトール生産量とグリセリン生成量と培地の着色度は次の通りであった。
【００４３】
【表８】
比較例３〜５の培地組成
【００４５】
【表９】
上記表−８において、窒素源はコーンステープリカーのみであり、この窒素量は上記表−４の組成の培養液中の窒素量と窒素原子換算で同量である。比較例３〜５では上記表−４に示す組成の培養液のかわりに、上記表−８に示す組成の培養液を使用する以外は実施例１〜３と同様にしてエリスリトールを生産した。エリスリトールの収率、グリセリン生成量、プロス上清の着色度は次の通りであった。
【００４７】
【表１０】
比較例６
上記表−４に示す組成の培養液のかわりに、上記表−８に示す組成の培養液を使用する以外は実施例４と同様にしてエリスリトールを生産した。エリスリトールの対グルコース収率は３９．８％、グリセリンの対グルコース収率は１９．５％であった。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、食添認可品で安全かつ安価な窒素源を使用し、高収率で効率良くエリスリトールを製造することができる。
Claims (10)
- 発酵性糖質からエリスリトールを産生する能力を有する酵母を、発酵性糖質を主炭素源とする培地で培養し、培養物よりエリスリトールを採取するエリスリトールの製造方法において、培地の窒素原子換算の窒素源の５０〜８５％が硫酸アンモニウムであり、残余がコーンスティープリカーであることを特徴とするエリスリトールの製造方法。
- 酵母が、モニリエラ属に属する酵母である請求項１に記載の製造方法。
- 酵母が、モニリエラ・ポリニスである請求項１に記載の製造方法。
- 酵母が、イエロビア属に属する酵母である請求項１に記載の製造方法。
- 酵母が、イエロビア・リポリチカである請求項１に記載の製造方法。
- 酵母が、トリコスポロノイデス属に属する酵母である請求項１に記載の製造方法。
- 酵母がトリコスポロノイデス・オエドセファリス、トリコスポロノイデス・ニグレッセンスおよび／またはトリコスポロノイデス・メガチリエンシスである請求項１に記載の製造方法。
- 発酵性糖質が、グルコース、フルクトースおよび／またはグリセロールである請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
- 培地中の窒素源濃度が、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）である請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
- 培地のｐＨを３．０〜７．０に保持する請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
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