CN87108329A - 制备l-缬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物学，更具体地说涉及特别需要的氨基酸——L-缬氨酸的制备方法。
制备L-缬氨酸的方法是在含碳源、氮源、无机盐和生长激素的培养基上培养对异羟肟酸L-精氨酸稳定的短杆菌属微生物或者培养在L-白氨酸存在下既对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定又对α-丁氨酸稳定的短杆菌属微生物，然后从培养液中分离所生成的L-缬氨酸并提纯。
Description
本发明涉及微生物工业，更具体地是关于制备氨基酸的方法，更确切地是关于制备L-缬氨酸的方法。
本申请发明可用于医学、化学、食品和烟草工业。
通过培养对α-丁氨酸稳定的粘质沙雷氏菌类（Serratia marcescens）微生物途径制备L-缬氨酸的方法是已知的。在含有易吸收的碳源、氮源、无机盐和生长激素的培养基中培养时，这些微生物能够积累L-缬氨酸（“Bacteriology”）杂志，No5，1971年5月，Kisumi M.等人“用粘质沙雷氏菌类的抗丁氨酸突变株积累缬氨酸”p、493-499）。
使用这种方法时，L-缬氨酸的最高产量为9～10克/升。
基于使用棒状杆菌属（Corynebacterium）和短杆菌属（Brevibacterium）微生物（该微生物对2-噻唑丙氨酸是稳定的，同时需要在L-白氨酸、L-异白氨酸或L-苏氨酸中）制备L-缬氨酸的方法是已知的（JP，B-58-2678）。用这种方法L-缬氨酸的最高产量达25克/升。
基于使用对S-氨基乙基半胱氨酸具有稳定性的棒状杆菌属和短杆菌属微生物作为产生L-缬氨酸的微生物以制备L-缬氨酸的方法也是已知的（JP，B-58-2678）。这个方法保证在培养液中L-缬氨酸的积累量达30.5克/升。
基于使用短杆菌属微生物（该微生物需要在L-异白氨酸中生长，同时或者对D-核糖，或者对嘌呤核糖核酸多糖，或者对嘧啶核糖核酸多糖具有稳定性）发酵制备L-缬氨酸的方法也是已知的（JP，B，58-32594）。
在上述微生物也对2-噻唑丙氨酸具有稳定性的条件下，L-缬氨酸的最高产量达35克/升。
本发明的任务是使用新的微生物以制备L-缬氨酸的方法，并且要提高目的产品的产率。
这个任务是通过下述途径解决：根据本发明，在制备L-缬氨酸的方法中使用短杆菌属微生物，该微生物对异羟肟酸L-精氨酸盐是稳定的，或者在L-白氨酸存在下即对异羟肟酸L-精氨酸盐是稳定的，又对α-丁氨酸也是稳定的，具体的实施步骤是在含促进细菌生长的碳源，氮源、无机盐和有机化合物的培养基中培养短杆菌属微生物，然后从培养液中分离和提纯所生成的目的产物。
由于本申请发明的结果，L-缬氨酸的产量达到55克/升。
按照本申群的发明，使用寄存于全苏工业微生物遗传和育种科学研究所的黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）微生物是合适的：
黄色短杆菌 AA52菌株，1986年4月21日寄存，寄存号B-3713;
黄色短杆菌 AA53菌株，1986年4月21日寄存，寄存号B-3714;
黄色短杆菌 AA54菌株，1986年4月21日寄存，寄存号B-3715。
按照本申请的发明，使用对异羟肟胺L-精氨酸盐稳定的黄色短杆菌，AA52菌株是合适的。
此外，按照本申请的发明，使用在L-白氨酸中既对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定也对α-丁氨酸稳定的黄色短杆菌AA53菌株或者黄色短杆菌AA54菌株是合适的。
本申请发明的其他的目的和优点由下面的制备L-缬氨酸的方法和实施本方法的实施例的详述中就会清楚。
在本申请的发明中所提出的发酵制备L-缬氨酸的方法是基于使用在培养基中培养的产生L-缬氨酸的微生物。
建议使用对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定的短杆菌属微生物。这种微生物的具体例子是产生L-缬氨酸的黄色短杆菌AA52菌株，1986年4月21日寄存于全苏工业微生物遗传和育种科学研究所，寄存号B-3713。
按照本申请的发明，也建议使用在L-白氨酸存在下同时对异羟肟酸L-精氨酸盐和α-丁氨酸都稳定的短杆菌属微生物。这种微生物的例子是产生L-缬氨酸的黄色短杆菌AA53菌株或者黄色短杆菌AA54菌株，1986年4月21日寄存于全苏工业微生物遗传和育种科学研究所，相应的寄存号为B-3714、B-3715。
黄色短杆菌AA52、AA53和AA54菌株都需要在L-异白氨酸中生长。
用任何已知方法（例如，用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理或者紫外照射）借助于细菌诱变能使得在L-白氨酸存在下对高浓度α-丁氨酸的稳定性和对异羟肟酸L-精氨酸盐的稳定性产生变异和使得L-异白氨酸营养缺陷性产生变异。
用遗传和育种方法从黄色短杆菌ATCC14067菌株（1969年1月16日寄存于全苏工业微生物遗传和育种科学研究所，寄存号B-4216）可得到上述新菌株。
然而，可以使用任何属于短杆菌属的微生物菌株作为培育本发明的的上述菌株的母菌株。
下面列出产生L-缬氨酸的菌株的具体培育简图。
ATCC 14067
（母系，产生L-缬氨酸达2克/升）
ATCC 14067ile-
（异白氨酸的营养缺陷体，产生L-缬氨酸达4.5克/升）用
AA52
（对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定的异白氨酸营养缺陷体，产生L-缬氨酸达17克/升）
/毫升）稳定的突变株
AA53和AA54
（在L-白氨酸存在下，对异羟肟酸L-精氨酸盐和高浓度α-丁氨酸稳定的异白氨酸营养缺陷体，产生L-缬氨酸52～55克/升）
AA52、AA53、AA54、菌株按其自身的特性（除在L-白氨酸存在下对异羟肟酸L-精氨酸盐，α-丁氨酸的稳定性和L-异白氨酸营养缺陷性和产生L-缬氨酸能力以外）与黄色短杆菌ATCC14067母菌株无差别。
所用的产生L-缬氨酸的黄色短杆菌AA52、AA53、AA54菌株具有下列培养形态学的特性。
形态特征：长1.7～2.5微米的椭园形的、无孢子的、不活动的、革兰氏阳性的细胞。
培养特征：于28℃在肉胨琼脂培养基表面生长两昼夜生成直径3～4毫米的具有光滑边缘的园形菌落，中心稍隆起呈园椎形，表面光滑，有光泽，淡黄-奶油色。
在肉胨琼脂培养基上划线接种：适度生长两昼夜，边缘光滑，表面是有光泽的，致密的，呈淡黄-奶油色。
在肉胨琼脂培养基内适度生长，基本上是在培养基表面上。
无机培养基组成（毫克/毫升）：葡萄糖-20;Na2So4-2;K2Hpo4-3;KH2po4-1;NH4cl-3;NH4No3-1;MgSo4·7H2o-0.1;MnSo4·5H2O-1×10-4;生物素-5×10-5;氯化硫胺素-1×10-4;L-异白氨酸-0.2;FeSo4·7H2O-1×10-4，pH7.4，生长需要生物素、硫胺素和L-异白氨酸。于28℃生长两昼夜生成直径1毫米的菌落，呈浅奶油色。两昼夜的划线生长是适度的，致密的、呈浅奶油色。
在马铃薯上生长则生成带黄色色调的色素。不稀释凝胶。
关于碳源：在葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露糖上生长良好，在半乳糖、鼠李糖、山梨糖醇、醋酸的铵和钠盐、乙醇上生长较差，不用乳糖。
关于氮源：吸收（NH4）2SO4、NH4cl和尿素。
用下述方法制取黄色短杆菌AA52菌株。
于30℃，充气下将黄色短杆菌ATCC14067菌株在肉胨汤中培养至达到滴定度109细胞/毫升。用离心分离方法除去细胞上的肉胨并重新悬浮在pH5.5的柠檬酸盐的缓冲剂中。在所得的悬浮体中加入N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍至最终浓度达300毫克/毫升为止，于30℃下充气培养20分钟。然后用凉肉胨汤洗去细胞上的诱变剂，并转入有10毫升肉胨汤的试管，于30℃充气培养18小时，然后在1号培养基上接种，Ⅰ号培养基的组成是（毫克/毫升）：葡萄糖-20、Na2So4-2、K2Hpo4-3、KH2po4-1、NH4cl-3、NH4No3-1、FeSO4·7H2O-1×10-4、MgSO4·7H2O-0.1、MnSO4·5H2O-10-4、生物素-5×10-5、氯化硫胺素-1×10-4、L-异白氨酸-0.2、琼脂-20、pH7.4。在这种培养基上于30℃培养48小时生长出来的菌落中挑出突变株，这种突变株在不含L-异白氨酸的1号培养基上是不能生长的。用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍将所得异白氨酸营养缺陷体再进行诱变，并在含有浓度为10毫克/毫升的异羟肟酸L-精氨酸盐的1号培养基上接种。生长在这培养基上的菌落经72小时培养后取出并检查其产生缬氨酸的能力。用这种方法选择的能产生L-缬氨酸的一种诱变株命名为黄色短杆菌AA52。
用下述方法制备黄色短杆菌AA53、AA54菌株。
用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱变AA52菌株并在2号培养基上接种，其组成为（毫克/毫升）：葡萄糖-10、Na2SO4-2、K2Hpo4-3、KH2pO4-1、NH4cl3-3、NH4No3-1、Mgso4·7H2O-0.1、MnSO4·5H2O-1×10-4、FeSO4·7H2O-1×10-4、生物素-5×10-5、氯化硫胺素-1×10-4L-异白氨酸-0.2、L-白氨酸-0.2、α-丁氨酸-55和琼脂-20。洗净长出的菌落并检查其产生缬氨酸的能力。这种能使L-缬氨酸量增加的诱变株中的二个，被命名为黄色短杆菌AA53和黄色短杆菌AA54。
可用任何已知方法制备为随后发酵所需的产生菌株的接种物。这种方法如在含有保证细菌生长的易吸收的碳源、氮源、无机盐和有机物的固体琼脂培养基表面或液体培养基中培养。
属于有机物的有维生素（生物素、硫胺素），如果在为具体的产生菌株生长所必需的情况下，还可以有其他化合物，其中包括氨基酸。
含有促进微生物生长和L-缬氨酸积累的易消化的碳源、氮源、无机盐和有机物的任何培养基都可用作为培养本发明所用的短杆菌属微生物的发酵培养基。
用作易吸收碳源的可以是以下的碳水化合物如：蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉、淀粉水解物和糖蜜、多元醇如甘油和山梨醇;有机酸如甲酸、乙酸、乳酸、富马酸、马来酸、丙酸;醇如甲醇和乙醇。上述的碳源既可以单独使用，也可以以不同重量比互相配合使用。碳源的总量可以在发酵开始时投入，也可以在发酵过程中分若干次投入。
用作易吸收氮源的既可以是有机铵盐，也可是无机铵盐，例如，硫酸铵、氯化铵、碳酸铵、醋酸铵、硝酸铵、磷酸铵、乳酸铵;尿素;各种天然的含氮化合物，如胨、酵母水解物，肉的提出物和植物蛋白水解物。
用作无机盐的可以是磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、氯化钠、铁盐和锰盐、碳酸钙。
用作上述微生物生长所必需的有机物可以是硫胺素（如，以氯氢化物或溴化物形式存在）;生物素或其代用品（如，脱硫生物素、生物胞素（ьuouuH）7，8-二氨基壬酸），如果微生物生长必需也可以是氨基酸，如，L-异白氨酸。如果在培养基的其他组分中有足够量的有机物存在的情况下，以纯净形式加入这些有机化合物就没有必要。
发酵培养基的具体成份实例可以如下：
蔗糖或葡萄糖 100～200克/升
硫酸铵 40～80克/升
硫酸镁 0.5～10克/升
一取代磷酸钾 0.5～10克/升
L-异白氨酸 0.1～0.4克/升
也可以有硫酸铁、硫酸锰、生物素、硫胺素。发酵开始后6～8小时观察到L-缬氨酸的积累。而随着碳源和能量完全消耗（取决于所用碳源的浓度和能量，于发酵开始后要26小时或更多时间），使得在培养液中的L-缬氨酸达到最高水平。
用纸色谱法和茚三酮染色法或者用氨基酸测定器测定在培养液和其他溶液中的L-缬氨酸含量。
可以用任何已知方法从培养液中分离积累的L-缬氨酸，例如，用离心或过滤的方法以除去微生物和其他不溶颗粒，在离子交换树脂上吸附L-缬氨酸，然后洗脱，浓缩和结晶L-缬氨酸。
实施例1
用下述方法制备黄色短杆菌AA54菌株的接种物。在有10毫升pH7.5的无菌肉胨汤试管内以无菌操作加入在肉胨琼脂培养表面上长出的培养物AA54，在晃动下培养16小时。
在容积为500毫升的几个发酵瓶中无菌操作下分别倒入15毫升灭菌后的发酵培养基，其组成如下（克/升）：蔗糖-150、（NH4）2So4-55、KH2po4-0.1、MgSO4·7H2O-1、Caco3-50、Feso4·7H2O-0.01、MnSo4·5H2O-0.01、生物素-0.0005、氯化
胺素-0.0005、L-异白氨酸-0.25、pH7.5。
在发酵瓶中加入1毫升黄色短杆菌AA45菌株的接种物，并在30℃下晃动（220循环/分）培养95小时。发酵结束后，培养液中所得的L-缬氨酸的含量为55.3克/升。将250毫升所得的含有13.8克L-缬氨酸的黄色短杆菌AA54菌株的培养液进行离心（20分钟，5000转/分）以除去细菌和其他不溶颗粒。所得上清液以从下向上的方式通过H+型离子交换树脂柱，流速为每一小时在1体积树脂上流过0.6体积溶液。用水洗涤树脂柱，并用3.5%的氨水溶液洗脱所吸附的L-缬氨酸将所得洗脱液真空浓缩至出现结晶，在+5℃下，经3小时完成L-缬氨酸的进一步结晶。用滤纸从溶液中滤出晶体，在真空下干燥。不计算母液中的含量，L-缬氨酸的产量为8.7克，以培养液中含量计，总产率为63%。
根据纸色谱的数据，产物的纯度为96.6%。
实施例2
操作是在相似于实施例1中所示的条件下进行，只是使用黄色短杆菌AA53菌株作为L-缬氨酸产生菌株，而在发酵培养基中蔗糖的浓度为120克/升。
经72小时培养后，培养液中的L-缬氨酸含量为41.7克/升。
按实施例1中所示进行进一步的提纯。
实施例3
操作是在相似于实施例2中所示的条件下进行，只是使用黄色短杆菌AA54菌株作为L-缬氨酸产生菌株。
经72小时培养后，培养液中的L-缬氨酸含量为43.5克/升。按实施例1中所示进行进一步的提纯。
实施例4
操作是在相似于实施例1中所示的条件下进行，只是使用黄色短杆菌AA53菌株作为L-缬氨酸产生菌株。
培养液中L-缬氨酸的产量为52.7克/升。按实施例1中所示进行进一步的提纯。
实施例5
在相似于实施例1中所示的条件下进行制备L-缬氨酸，但是使用黄色短杆菌AA52菌株作为L-缬氨酸产生菌株。
培养液中L-缬氨酸的含量是17.2克/升。按实施例1中所示进行进一步的提纯。
Claims (2)
1、在含有促进微生物生长的碳源、氮源、无机盐和有机化合物的培养基中培养短杆菌属微生物，然后从培养液中分离和提纯所生成的目的产物而制备L-缬氨酸的方法，其特征在于使用对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定的短杆菌属微生物，或使用在L-白氨酸存在下既对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定又对α-丁氨酸稳定的短杆菌属微生物。
2、按照权利要求1的方法，其特征在于，使用寄存于全苏工业微生物遗传和育种科学研究所的黄色短杆菌微生物：
对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定的黄色短杆菌AA52菌株，1986年4月21日寄存，寄存号B-3713，
在L-白氨酸存在下既对异羟肟酸L-精氨酸盐稳定又对α-丁氨酸稳定的黄色短杆菌AA53菌株，1986年4月21日寄存，寄存号B-3714和黄色短杆菌AA54菌株，1986年4月21日寄存，寄存号B-3715。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |