CN1197957C - 一种棒杆菌属菌种以及发酵生产l－赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棒杆菌CGMCCNo.0785以及采用该菌种发酵生产L-赖氨酸的方法。该方法包括先培养棒杆菌CGMCCNo.0785，然后在培养基中进行发酵，然后从发酵液中收集L-赖氨酸，温度为25～35℃，pH为5.6～8.5。采用本发明的菌种生产赖氨酸，可使赖氨酸的产率、对糖转化率有较大幅度提高，从而显著降低赖氨酸的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种棒杆菌属菌种以及L-赖氨酸的生产方法，具体涉及一种通过微生物发酵的生产方法。
背景技术
L-赖氨酸是一种十分重要的氨基酸，主要用作于饲料添加剂、食品添加剂和制药工业原料。一般由微生物发酵法制造。
目前，已有许多专利和文献公开了采用微生物发酵法制造生产L-赖氨酸的方法，如日本专利申请55213/1967号公告所公开的技术，其利用的是一种S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(称之AEC)抗性细菌；如日本专利申请36888/1974号公告利用的是一种具有AEC抗性并L-亮氨酸、L-高丝氨酸营养缺陷型的变种；如日本专利申请19235/1981号公告利用的是一种γ-甲基赖氨酸抗性变种。
上述公开的技术均存在着一个十分明显的缺陷，其生产成本较高，难以规模化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是公开一种棒杆菌属，短杆菌属菌种；
本发明需要解决的技术问题之二是公开采用上述菌种发酵生产L-赖氨酸的方法，以克服现有技术存在的生产成本高的缺陷。
本发明的技术构思是这样的：
发明者对棒杆菌属并具有生产L-赖氨酸能力的细菌进行变异处理，然后从得到的变种中选择单氟醋酸(简称MF)抗性，α-噻唑-DL-丙氨酸(简称TA)抗性菌种，便可大大提高L-赖氨酸的生产率。
使用的微生物：
本发明用于生产L-赖氨酸的微生物是一种属于棒杆菌属的菌种，棒杆菌(拉丁文属名Corynebacterium glutamicum)[SNGBL 8(FH128菌株)]即为具有这种能力的菌种，以下简称SNGBL 8，该菌种已于2002年8月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为：CGMCCNo.0785。
本发明者对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)野生菌株进行变异处理，在得到的变种中选择具有高丝氨酸缺陷型，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性菌种(A111)，以A111菌种为亲本再变异处理，从变种中选择单氟醋酸(简称MF)、α-噻唑-DL-丙氨酸(简称TA)抗性菌株SNGBL8(FH128)，即上述的SNGBL 8菌株。
上述的菌种具有如下的性质：
1.形态特征：
用普通光学显微镜观察在肉汤斜面上培养12-24hr的染色培养物，细胞通常为短杆状，两端钝圆，不分枝，细胞呈单个、成对及“V”字形排列，细胞大小0.3-0.4×0.5-0.8μm，革兰氏染色细胞呈阳性反应，在显微镜下悬滴培养，未发现有运动能力，不形成芽孢，抗酸性等全为负反应。
2.在各种培养基上的特征
a.普通肉汤琼脂斜面
中间划直线培养，呈中度生长，菌苔线状，24小时呈浅黄色，表面光滑、湿润、无粘性。
b.普通肉汤琼脂平板
单菌落圆形，培养24-30小时，菌落为淡黄色，直径约1mm，48小时约2mm，表面湿润、光滑并有光泽，边缘整齐，无粘性。
c.普通肉汤琼脂穿刺
表面发育良好，沿穿刺线生长弱，并且不向四周扩散。
3.生理生化特征：
a.对氧要求：表现为好氧及兼性厌氧。
b.对温度关系：菌株的生长温度为20-35℃，26-33℃培养生长良好。
菌株在45、55、65、70、80℃条件下处理10分钟，迅速冷却后置于32℃培养48小时，发现65℃热处理10分钟菌体已全部死亡。
c.PH值的影响：菌体在pH5-9均能生长，在pH6-7.5时生长最好。
d.不水解油脂，不水解淀粉，不分解纤维素
e.不利用液体石蜡油为碳源。
f.V.P.试验，阴性反应。
g.M.R.试验，阳性反应。
h.H2S试验，阳性反应。
i.NO2试验，阳性反应。
j.必需生长因子
生物素
生物素浓度在30μg/L以下时，菌体生长量与生物素浓度呈正比。
L-高丝氨酸(或L-苏氨酸+L-蛋氨酸)
高丝氨酸(或L-苏氨酸+L-蛋氨酸)浓度在350μg/ml以下时，菌体生长与高丝氨酸的添加浓度呈正比。
k.对氨基酸结构类似物的耐性
在补充基本培养基C中分别添加以下氨基酸结构类似物(100μg/L)，菌体生长良好。
S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC) +
α-噻唑-DL-丙氨酸(TA) +
单氟乙酸(MF) +
4.碳源利用：
葡萄糖 + 蔗糖 +
果糖 + 麦芽糖 +
半乳糖 - 甘露糖 +
木糖 + 海藻糖 -
乳糖 - L-阿拉伯糖 -
淀粉 - 甘露糖醇 -
丙三醇 - 山梨糖醇 -
根据文献：“伯杰系统细菌学手册”，(Brrgey’s Manual of SystematicBacteriology)提供的鉴定方法和上述的试验结果表明，上述菌种属于棒杆菌属的菌种，但又与原棒杆菌属的菌种有明显的不同，其主要不同之处在于：
增加必需生长因子高丝氨酸；
在含有必需生长因子的基本培养基中添加一定浓度的AEC、MF、TA，菌体仍生长良好。
本发明的菌种是这样获得的：
采用的诱变剂为N-硝基-N’-甲基-N-亚硝基胍(NTG)；
采用的培养基为：
培养基A(完全培养基)：
蛋白胨 1％；牛肉膏 1％；NaCl 0.5％。pH7.0(固体培养基加2％琼脂粉)；
培养基B(基本培养基)：
葡萄糖 1％；硫酸铵 0.2％；K2HPO4 0.1％；KH2PO4 0.1％；MgSO4·7H2O 0.04％；生物素 50μg/L；B1·HCl 100μg/L；MnSO42mg/L；FeSO4 2mg/L。pH7.0(固体培养基加1.6％琼脂粉)。
培养基C(补充基本培养基)：
在培养基B中添加高丝氨酸150μg/ml(或L-苏氨酸、L-蛋氨酸各250μg/ml)；
诱变方法：
将亲本菌株新鲜斜面菌苔细胞一环移于20ml液体培养基A中，于30℃培养过夜，离心。菌体洗涤后用pH6.0缓冲液制成108个细菌浓度的悬浮液，用300μg/ml的NTG在30℃处理30～60分钟。处理后的菌液经离心、细胞洗涤后适当稀释，取0.1ml涂布于含有亲本菌株不能生长的浓度的TA、MF物质的固体培养基C上，于30℃培养5～7日。收集生长的菌落。MF浓度为300～600μg/ml；TA浓度为50～150μg/ml。
将亲本菌株和变种分别接种于各含不同浓度MF、TA的液体培养基C中，32℃培养24小时。观察其生长程度。结果如下：
化学物质 浓度(μg/ml) 菌株相对生长度
A111 SNGBL8
MF 0 100 100
50 17.2 100
100 0 100
500 0 100
1000 0 98
TA 0 100 100
50 0 100
100 0 100
500 0 100
1000 0 100
可采用常规的发酵方法，利用上述菌种产生L-赖氨酸。
作为培养基，可用含有不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。
作为碳源如：葡萄糖、淀粉类(包括：大米、玉米、木薯、甘薯等)水解物、废糖蜜等。
使用氮源包括：氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸氨等、各种其他无机酸铵盐、尿素和其他含氮化合物如玉米浆、毛发(人发、家畜发、家禽羽毛等)水解物、大豆粉(豆粕)水解物、酪蛋白水解物等。
根据需要适当添加无机离子如：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠等化合物。
如果需要，培养基中可以含有适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物。一般情况，这些营养物存在于上述的天然氮源中。
培养条件可以是常规的，最好在好气条件下进行培养。例如，用振荡或通气深层培养，温度范围一般在25～35℃，优选在28～33℃。发酵过程中pH一般在5.6～8.5范围，优选在6.5～7.5。对pH的调节，可以采用无机或有机的酸性或碱性物质，以及氨、脲、碳酸钙等。
发酵完成后，可以用常规方法从发酵液中收集L-赖氨酸。
培养结束后，采用有机或无机絮凝剂絮凝、离心机离心或膜分离等方法进行发酵液预处理，除去发酵液中细胞体和其他蛋白质。赖氨酸可以从上述清液中用离子交换、等电点法、浓缩结晶等方法回收。
采用本发明的菌种生产赖氨酸，可使赖氨酸的产率、对糖转化率有较大幅度提高，从而显著降低赖氨酸的生产成本。
具体实施方式
实施例1
在500ml三角瓶装入培养基30ml，该培养液中含175g/L葡萄糖、40g/L硫酸铵、10ml/L胱氨酸母液(毛发水解液)、5g/L玉米浆、1g/L磷酸二氢钾、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L尿素、50g/L碳酸钙(分消)，pH为7。
将该培养基于120℃灭菌15分钟。分别从培养基A斜面上取一环已预先培养24小时的亲本菌株和SNGBL 8菌接入上述培养基中，在32℃振荡培养68小时。结果如下表。
使用菌株 特性 产量(g/L)* 对糖转化率(％)
2305 野生型 1.4 0.8
A111 HS-、AECr 58.1 33.2
SNGBL8 HS-、AECr、MFr、82.6 47.2
TAr
*L-赖氨酸量以赖氨酸盐酸盐计
实施例2
玉米淀粉经双酶法水解，制成约25％水解糖液。部分水解糖液通过减压薄膜浓缩装置浓缩成55％糖液。
在二个体积为5L的三角瓶中，分别装入0.8L培养基，该培养基中含有30g/L玉米淀粉水解糖液、10g/L硫酸铵、3g/L尿素、1g/L磷酸二氢钾、1g/L磷酸氢二钾、0.4g/L硫酸镁、0.3g/L(以含氮量计)豆粕水解液、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.03mg/L生物素。将该培养基于120℃灭菌15分钟。分别从培养基A斜面上取一环已预先培养24小时的亲本菌株和SNGBL8菌接入上述培养基中，然后于32℃培养14小时。上述步骤用于种子培养。
在二只体积为16L的小型发酵罐中，每罐分别装入7.0L培养基，该培养基中含有140g/L玉米淀粉水解糖液、20g/L硫酸铵、1g/L磷酸二氢钾、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L硫酸镁、5g/L玉米浆、0.2g/L(以含氮量计)豆粕水解液、0.005g/L消泡剂，于120℃灭菌15分钟。冷却至32℃后，各发酵罐中加入上述的种子培养液0.8L，在下列条件下进行培养：温度32℃，空气流速为1.0VVM，搅拌转速500转/分。
发酵过程中以氨水调节pH，使pH控制在7.5。
当培养液中糖浓度降至15g/L，流加55g/L玉米淀粉水解糖液(连续或间歇)，以使培养液中糖浓度保持在15g/L。培养时间65小时，结果如下表：
菌株 L-赖氨酸产量(g/L) 对糖转化率(％)
A111 85.6 36.2
SNGBL8 128.2 44.8
二罐发酵液分别进行赖氨酸回收。
在发酵液中添加聚丙烯酰胺使菌体细胞和蛋白质沉淀，过滤。上清液用强酸型阳离子交换树脂吸附L-赖氨酸，然后用氨水洗脱。洗脱液浓缩结晶、离心，得湿晶体，然后分别于65℃干燥得到饲料级L-赖氨酸盐酸盐856.4克和1282.6克。
Claims (5)
1.一种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)野生菌株的变异株CGMCCNo.0785。
2.一种发酵生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，该方法包括先培养棒杆菌CGMCCNo.0785，然后在培养基中进行发酵，然后从发酵液中收集L-赖氨酸，温度为25～35℃，pH为5.6～8.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于温度为28～33℃。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于pH为6.5～7.5。
5.根据权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于培养结束后，先采用有机或无机絮凝剂絮凝、离心机离心或膜分离方法进行发酵液预处理，除去发酵液中细胞体和其他蛋白质，然后清液中用离子交换、等电点法或浓缩结晶方法收集赖氨酸。
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