CN1169946C - 一种生产l-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l-精氨酸的方法 - Google Patents
一种生产l-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l-精氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1169946C CN1169946C CNB031128963A CN03112896A CN1169946C CN 1169946 C CN1169946 C CN 1169946C CN B031128963 A CNB031128963 A CN B031128963A CN 03112896 A CN03112896 A CN 03112896A CN 1169946 C CN1169946 C CN 1169946C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- arginine
- resistance
- bacterial strain
- strain
- histidine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法，涉及L-精氨酸的发酵法生产。本发明采用本实验室筛选并保藏的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)为亲株，按常规方法进行物理化学诱变处理，并经多重结构类似物抗性筛选，得到突变株SDNN403(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性)，在优化条件下培养生产L-精氨酸，产酸水平达到30-35g/l。本发明菌株具有遗传稳定性好，产量性状稳定，L-精氨酸产量保持较高的水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。
Description
技术领域
一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法，本发明涉及以葡萄糖、硫酸铵为主要原料，利用钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)突变株发酵生产L-精氨酸的方法。
背景技术
L-精氨酸是人体和动物的一种半必需氨基酸，具有重要的生化和生理学意义，因此被广泛应用于食品和医药工业中，尤其在医药工业领域，其作为提高人体免疫力，防治心血管疾病以及增强男性精子活性等治疗用药已受到人们的关注。
L-精氨酸的制备方法有提取法(中国专利CN1161959)和发酵法，提取法操作费时，收率低，环境污染严重，不适于大规模生产。发酵法生产L-精氨酸，有采用棒杆菌或短杆菌属的微生物，如谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌，经过诱变，筛选精氨酸结构类似物突变株，以解除精氨酸作为产物的反馈抑制和阻遏，提高L-精氨酸的产量。关于选择精氨酸结构类似物的方法，例如：培养有2-噻唑基氨基丙酸抗性的L-精氨酸生产菌的方法(日本专利JP60083593)；培养有半胱氨酸或半胱氨酸类似物抗性的L-精氨酸生产菌的方法(美国专利US5034319)。上述方法采用的诱变方法及结构类似物往往比较单一，容易造成高产L-精氨酸的突变株遗传稳定性差，在大生产中产生回复突变，从而造成L-精氨酸产量性状下降。发酵法生产L-精氨酸，也有采用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌通过基因改造，导入关键酶的基因或增加关键酶的拷贝数，从而提高获得的重组菌的L-精氨酸的产量(中国专利CN1276421和美国专利US4430430)，但上述方法所获的重组菌株的外源质粒很容易在生产中丢失或者需要加入一定的选择性压力，使得采用这类重组菌来生产L-精氨酸时很难进行工艺放大，难以实现产业化。
从工业化角度看，要求生产L-精氨酸的菌株遗传稳定性好，且产生的杂酸少，L-精氨酸产量达一定水平，工艺放大较为容易，这样才能适合于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产L-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产L-精氨酸的方法，其中包括筛选具有多重结构类似物抗性的突变株以及在适宜条件下培养该突变菌株大量生产L-精氨酸。
在本发明中，用于筛选的出发菌株为实验室筛选的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5；用于筛选的抗性标记药物有磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸。
本发明所述的一种生产L-精氨酸的菌株，该菌株为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SDNN403，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.0890。
该菌株具有以下遗传特性：组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性，且磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸抗性、高精氨酸抗性、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。
用于本发明的L-精氨酸生产菌株可以这样得到：出发菌株进行多重物理、化学因子逐级诱变，并经多重结构类似物抗性筛选获得。选用紫外线，硫酸二乙酯和N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(简称亚硝基胍，下同)多次诱变处理，将诱变后的微生物涂布在含一定量磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸的基础琼脂筛选培养基上，挑出在此培养基上生长的菌落进行摇瓶筛选。突变菌株诱变谱系见附图1。
该菌株的诱变方法：
(1)出发菌株：钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYA5(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)。
(2)逐级诱变
紫外线诱变，得诱变菌株SUV67-18(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性)；
硫酸二乙酯诱变，得诱变菌株SUD18-80(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性)；
再经硫酸二乙酯诱变，得诱变菌株SD100-28(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性)；
亚硝基胍诱变，得诱变菌株SDN28(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性)；
再经亚硝基胍诱变，得诱变菌株SDNN403(组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性)。
(3)培养和结构类似物抗性筛选
种子培养
种子培养基：葡萄糖30-50g/l，玉米浆10-20g/l，(NH4)2SO4 5-20g/l，KH2PO4 1-5g/l，MgSO4·7H2O 0.5-2g/l，尿素1.5-5g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
种子培养时装液量为30ml/250ml三角瓶，培养温度方30℃-35℃，摇瓶转速为90-120转/分。
筛选培养
筛选培养基：葡萄糖10-30g/l，(NH4)2SO4 3-15g/l，KH2PO4 1-5g/l，MgSO4·7H2O 0.5-2g/l，FeSO4·7H2O 0.02-0.15g/l，MnSO4·H2O 0.02-0.15g/l，生物素30-50μg/l，硫胺素200-250μg/l，组氨酸500-1000μg/l，磺胺胍1-5mg/ml、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸各15-25mg/ml，琼脂20g/l，PH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
筛选培养条件为30℃-35℃培养1-5天。
利用该菌株生产L-精氨酸的方法：
发酵培养基：葡萄糖100～120g/l，玉米浆5～15g/l，(NH4)2SO4 40～60g/l，KH2PO4 1.0～2.0g/l，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/l，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/l，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/l，L-组氨酸0.5-1mg/l，生物素0.08-0.15mg/l，CaCO3 30g/l，初始PH7.0～7.2。
按照本发明，可以用通风发酵的方式培养合适的微生物进行L-精氨酸的生产。作为培养基需要有适当的碳源、氮源、无机物及所需的痕量其它营养物质和无机盐。将菌株以10～15％(W/W)接种量转接到发酵培养基中，培养在通气条件下进行，如摇瓶培养和搅拌式发酵罐通风培养，培养温度30℃～35℃左右，摇床转速90～120转/分，培养pH6-8范围内，pH值中性左右。可选用碳酸钙、氨、无机酸碱溶液调节pH值。通常培养3～5天后，L-精氨酸在发酵液中积累。
本发明的有益效果是采用了本实验室筛选得到的钝齿棒杆菌SYA5为亲株，按常规方法进行物理、化学诱变处理和结构类似物抗性筛选，得到突变株钝齿棒杆菌SDNN403，该突变株具有以下遗传特性：组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性，且磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸抗性、高精氨酸抗性、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。
在优化条件下发酵生产L-精氨酸，产酸水平达到30～35g/L。现有技术提供筛选的结构类似物多比较单一，而本发明提供筛选的结构类似物呈现多样性，这样就大大提高了高产L-精氨酸突变株的遗传稳定性。本发明菌株具有遗传稳定性好、产量性状稳定，L-精氨酸产量保持较高水平，且产生的杂酸少，工艺放大较为容易，适合于工业化生产。
附图说明
图1为生产L-精氨酸菌株的诱变谱系图。
生物材料样品保藏
一种生产L-精氨酸的菌株，该菌株为钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)SDNN403，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0890，保藏日期为2003年2月10日。
具体实施方式
实施例1
制备对磺胺胍、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸有抗性的突变株及发酵生产L-精氨酸。
将出发菌株SYA5经紫外诱变、硫酸二乙酯诱变后获得SD100-28菌株，继续进行亚硝基胍诱变，将SD100-28菌株接入种子培养基，培养到对数生长中后期再以50％的接种量转接到新鲜种子培养基中培养5小时使细胞达到同步培养。将培养液无菌离心，收集菌体，用0.1mol/l，pH6.0的磷酸缓冲液洗涤2～3次，转入带玻璃珠的三角烧瓶中打散，得菌悬液，细胞浓度控制在108个/ml左右。称取少量亚硝基胍溶解在少量丙酮中，再加入磷酸缓冲液，制成浓度为1.0mg/ml的亚硝基胍溶液。取2mL的菌悬液中加入2mL亚硝基胍溶液，30℃振荡反应30分钟，诱变结束后快速离心终止反应，用0.1mol/lpH6.0的磷酸缓冲液洗涤2～3次，加入新鲜的种子培养基中进行后培养8小时。最后取培养液按梯度稀释涂布筛选培养基平板，31℃恒温培养3-5天后挑选大菌落在发酵培养基中进行摇瓶筛选。
种子培养基组成为：
葡萄糖30g/l，玉米浆20g/l，(NH4)2SO4 20g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，尿素1.5g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟，装液量30ml/250ml。
筛选培养基组成为：
葡萄糖10g/l，(NH4)2SO4 3g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，FeSO4·7H2O 0.02g/l，MnSO4·H2O 0.02g/l，生物素30μg/l，硫胺素200μg/l，组氨酸500μg/l，磺胺胍1.2mg/ml、D-精氨酸、高精氨酸和甲基半胱氨酸各15mg/ml，琼脂20g/l，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
发酵培养基组成为：
葡萄糖120g/l，硫酸铵50g/l，玉米浆12g/l，KH2PO4 1g/l，MgSO4·7H2O 0.6g/l，FeSO4·7H2O 0.01g/l，MnSO4·H2O 0.01g/l，L-组氨酸0.5mg/l，生物素0.08mg/l，CaCO3 30g/l，初始pH7.0-7.2。
用以下方法比较突变株与母株的L-精氨酸的发酵生产能力。
将突变株与母株分别接种到种子培养基中，在31℃下96转/分摇瓶培养16小时，将形成的种子培养物以10％的接种量接入发酵培养基中，在31℃下摇瓶培养96小时。
培养结束后，用氨基酸色谱仪测定所发酵培养基中积累的L-精氨酸的量，结果见表1。
表1
突变菌株编号 L-精氨酸产量
(g/l)
SYA5 4.5
SUV67-18 6.2
SUD18-80 8.1
SD100-28 9.6
SDN28 15.0
SDNN403 32.8
Claims (3)
1.一种生产L-精氨酸的菌株，其分类命名为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SDNN403，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.0890。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征是该菌株具有以下遗传特性：组氨酸缺陷型，磺胺胍抗性，D-精氨酸抗性，高精氨酸抗性，甲基半胱氨酸抗性，磺胺胍抗性浓度为1mg/ml～5mg/ml，D-精氨酸、高精氨酸、甲基半胱氨酸抗性浓度分别为15mg/ml～25mg/ml。
3.一种利用权利要求1或2所述菌株生产L-精氨酸的方法，其特征是发酵培养基为：葡萄糖100～120g/l，玉米浆5～15g/l，(NH4)2SO4 40～60g/l，KH2PO4 1.0～2.0g/l，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/l，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/l，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/l，L-组氨酸0.5-1mg/l，生物素0.08-0.15mg/l，CaCO330g/l，初始pH7.0-7.2，将菌株以10～15％(w/w)接种量转接到发酵培养基中，在通气条件下，以摇瓶培养或搅拌式发酵罐通风培养，pH6～8；培养温度30～35℃，培养时间为72～120小时，摇床转速90～120转/分钟，L-精氨酸在发酵液中积累。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB031128963A CN1169946C (zh) | 2003-02-25 | 2003-02-25 | 一种生产l-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l-精氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB031128963A CN1169946C (zh) | 2003-02-25 | 2003-02-25 | 一种生产l-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l-精氨酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1441055A CN1441055A (zh) | 2003-09-10 |
| CN1169946C true CN1169946C (zh) | 2004-10-06 |
Family
ID=27770360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB031128963A Expired - Fee Related CN1169946C (zh) | 2003-02-25 | 2003-02-25 | 一种生产l-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l-精氨酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1169946C (zh) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1724514B (zh) * | 2004-07-19 | 2010-06-09 | 上海依福瑞实业有限公司 | 一种l－高精氨酸盐酸盐的制备方法 |
| GB2485862B (en) * | 2010-11-29 | 2013-09-04 | Guangdong Huanxi Biolog Technology Co Ltd | Preparation process of L-arginine-alpha-ketoglutarate by direct crystallization from fermentation broth |
| CN102154160B (zh) * | 2010-12-29 | 2012-05-09 | 广东环西生物科技股份有限公司 | 一种产l-精氨酸的菌株和利用该菌株生产l-精氨酸的方法 |
| CN104450816A (zh) * | 2014-05-08 | 2015-03-25 | 江南大学 | 以酵母粉代替玉米浆发酵提高钝齿棒杆菌的l-精氨酸生产能力的方法 |
| CN105432935A (zh) * | 2014-09-05 | 2016-03-30 | 辽宁威兰生物技术有限责任公司 | 一种水产畜禽用功能性氨基酸腐植酸微生态制剂的生产方法 |
| CN105176941A (zh) * | 2015-08-24 | 2015-12-23 | 江南大学 | 一种来源于钝齿棒杆菌的2,3-丁二醇脱氢酶或乙偶姻还原酶 |
| CN105087628A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-11-25 | 江南大学 | 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-鸟氨酸的方法 |
| CN105112437A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-12-02 | 江南大学 | 一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产l-鸟氨酸的方法 |
| CN105238732A (zh) * | 2015-10-28 | 2016-01-13 | 江南大学 | 一种利用重组钝齿棒杆菌全细胞转化生产l-瓜氨酸的方法 |
| CN105238811A (zh) * | 2015-11-23 | 2016-01-13 | 江南大学 | 一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-精氨酸重组菌中的应用 |
| WO2017088095A1 (zh) * | 2015-11-23 | 2017-06-01 | 江南大学 | 一种信号肽及其在利用魔芋粉合成l-精氨酸及其高值化的应用 |
| CN105274129B (zh) * | 2015-11-23 | 2019-01-04 | 江南大学 | 一种信号肽及其在利用淀粉产l-精氨酸重组菌中的应用 |
| CN106035988B (zh) * | 2016-06-28 | 2021-03-12 | 战晓燕 | 一种畜禽用精氨酸活性肽粉的生产方法 |
| CN106191152B (zh) * | 2016-07-20 | 2019-04-16 | 江南大学 | 一种通过增强氨同化作用促进l-精氨酸合成的方法 |
| CN105969748B (zh) * | 2016-07-20 | 2019-10-18 | 江南大学 | 一种提高γ-谷氨酰转肽酶表达量的方法 |
| CN106190942B (zh) * | 2016-07-26 | 2019-11-26 | 江南大学 | 一种通过敲除黄素还原酶提高l-精氨酸产量的方法 |
| CN106544311A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-03-29 | 江南大学 | 利用钝齿棒杆菌全细胞转化葡萄糖合成乙偶姻和乳酸 |
| CN109370975B (zh) * | 2018-12-05 | 2020-10-09 | 江南大学 | 一种提高钝齿棒杆菌合成l-精氨酸产量的方法 |
| CN110628793B (zh) * | 2019-09-20 | 2021-03-30 | 江南大学 | 一种利用生物传感器筛选精氨酸高产菌株的方法 |
| CN111718936B (zh) * | 2020-06-30 | 2021-09-24 | 江南大学 | 一种铵盐诱导型启动子及其在调控目的基因表达中的应用 |
| CN111676182B (zh) * | 2020-07-02 | 2022-05-24 | 江南大学 | 一种利用重组钝齿棒杆菌发酵生产精酮合剂的方法 |
| CN113061562B (zh) * | 2021-03-22 | 2022-09-27 | 江南大学 | 一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法 |
| CN113735282B (zh) * | 2021-09-18 | 2022-11-22 | 江南大学 | 一种老黄酶oye2蛋白及其在铬污染中的应用 |
| CN116355814B (zh) * | 2023-05-18 | 2023-07-25 | 欧铭庄生物科技(天津)有限公司滨海新区分公司 | 一株大肠埃希氏菌及其在发酵生产l-精氨酸中的应用 |
-
2003
- 2003-02-25 CN CNB031128963A patent/CN1169946C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1441055A (zh) | 2003-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1169946C (zh) | 一种生产l-精氨酸的菌株及其诱变方法与利用该菌株生产l-精氨酸的方法 | |
| CN102154160B (zh) | 一种产l-精氨酸的菌株和利用该菌株生产l-精氨酸的方法 | |
| WO2011143800A1 (zh) | 用于制备l-乳酸的凝结芽孢杆菌及其应用方法 | |
| JP3966583B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| CN101037661A (zh) | 假交替单胞菌及其用途 | |
| CN1926232A (zh) | 含有与色氨酸的生物合成有关的突变基因的大肠杆菌突变体和用所述突变体生产色氨酸的方法 | |
| CN1269951C (zh) | 枯草芽孢杆菌及其用于制备γ－聚谷氨酸的方法 | |
| CN1710066A (zh) | 一株可高产谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌 | |
| CN103361289A (zh) | 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法 | |
| CN1092467A (zh) | 通过发酵制备l-谷氨酸的方法 | |
| CN100360661C (zh) | 干酪乳杆菌改组菌株及发酵生产l-乳酸 | |
| CN1844357A (zh) | 谷氨酸棒杆菌突变株及在发酵法生产l－色氨酸中的应用 | |
| CN100455670C (zh) | 一株产l-丝氨酸的菌株及用该菌株生产l-丝氨酸的方法 | |
| CN1225552C (zh) | 生产核黄素的微生物和利用其生产核黄素的方法 | |
| CN1140761A (zh) | L-亮氨酸的生产方法 | |
| CN107058173B (zh) | 一株发酵生产(3r)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN1117869C (zh) | 发酵生产l－赖氨酸的方法 | |
| CN1030616C (zh) | 发酵生产l-赖氨酸的方法 | |
| CN114456980A (zh) | 一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用 | |
| CN1766090A (zh) | 一株苜蓿根瘤菌及其发酵培养方法与应用 | |
| CN1223674C (zh) | 生产核黄素的微生物和利用其生产核黄素的方法 | |
| CN1218043C (zh) | 连续发酵生产l－谷氨酸的方法 | |
| CN1162538C (zh) | 生产l-苯丙氨酸的方法 | |
| CN1367827A (zh) | 突变细菌株的l－赖氨酸生产 | |
| CN116987614B (zh) | 寡养单胞菌及其在制作窖泥中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |