CN1162538C - 生产l-苯丙氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

生产L-苯丙氨酸的一种方法，其包括以下步骤：在培养物中培养能够生成L-苯丙氨酸并且对苯丙氨酸类似物具有抗性属于嗜甲基菌属的细菌从而在培养物中生成并富集L-苯丙氨酸，和从所述培养物中回收L-苯丙氨酸。

Description

生产L-苯丙氨酸的方法
本发明涉及生产L-苯丙氨酸的方法，具体而言，涉及属于嗜甲基菌属并且能够生产L-苯丙氨酸的细菌以及采用属于嗜甲基菌属的细菌生产L-苯丙氨酸的方法。
作为采用微生物发酵来生产L-苯丙氨酸的方法，那些采用属于埃希氏菌属的重组细菌的方法(日本专利申请公开号56-1890，57-170184，58-103398，61-92565和1-104160以及国际公开号WO87/00202)已为人熟知。作为生产L-苯丙氨酸或L-酪氨酸的方法，人们采用属于棒杆菌属的突变体(日本专利申请公开号61-128897)，并且那些采用属于棒杆菌属的重组细菌的方法(日本专利申请公开号60-34197，60-24192，61-260892和61-124375)已为人熟知。
然而，通过使用属于嗜甲基菌属的细菌来生产L-苯丙氨酸则不为人所知。
本发明的一个目标是提供能够生产L-苯丙氨酸的细菌以及通过使用所述细菌来生产L-苯丙氨酸的方法。
本发明人发现：对苯丙氨酸类似物具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌在生产L-苯丙氨酸方面具有很强的能力。基于这个发现，实现了本发明。
本发明提供属于嗜甲基菌属的细菌，它能生产L-苯丙氨酸并且对苯丙氨酸类似物具有抗性(此后也称为“本发明细菌”)。
优选本发明细菌对苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸具有抗性。
优选本发明细菌对DL-对-氟苯丙氨酸具有抗性。
本发明细菌优选通过从属于嗜甲基菌属的细菌中选择对苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得，其中对于每种苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。
更优选本发明细菌对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸具有抗性。
更优选本发明细菌通过从属于嗜甲基菌属的细菌中选择对DL-对-氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得，其中对于每种DL-对-氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。
优选本发明细菌对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂酸和L-苯丙氨酸具有抗性。
更优选本发明细菌通过从属于嗜甲基菌属的细菌中选择对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂酸和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得，其中对于每种DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂酸和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。
本发明细菌优选为食甲基嗜甲基菌。
本发明还提供生产L-苯丙氨酸的方法，其包括以下步骤：
在培养基中培养本发明细菌从而在培养物中生成并富集L-苯丙氨酸，和
从所述培养物中回收L-苯丙氨酸(此后也称为“本发明方法”)。
<1>本发明细菌
本发明细菌为属于嗜甲基菌属的细菌，它能够生成L-苯丙氨酸并且对苯丙氨酸类似物，优选对苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸具有抗性。
属于嗜甲基菌属的细菌包括食甲基嗜甲基菌。
在培养基中培养所述细菌时，生成L-苯丙氨酸的能力是指在所述培养基中富集大量L-苯丙氨酸的能力。通常它指在如下面实例所述的条件下富集不小于0.5克/升L-苯丙氨酸的能力。
苯丙氨酸类似物的实例有DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、β-氨基-β-苯基丙酸、邻-氟苯丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、β-3-噻吩丙氨酸、β-2-呋喃丙氨酸、β-3-呋喃丙氨酸、邻氨基苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、间氨基苯丙氨酸、α-氨基-β-苯基乙磺酸盐、β-2-吡咯丙氨酸、1-环戊烯-1-丙氨酸、1-环己烯-1-丙氨酸、β-4-吡啶丙氨酸、β-4-吡唑丙氨酸、对硝基苯丙氨酸、环己基丙氨酸、邻-氯苯丙氨酸、间-氯苯丙氨酸、对-氯苯丙氨酸、邻-溴苯丙氨酸、间-溴苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、β-4-噻唑丙氨酸等。
对苯丙氨酸类似物具有抗性是指在一定量的苯丙氨酸类似物的存在下(此时野生类型的菌株如菌株AS-1不能生长)所述细菌能够生长。所述量取决于苯丙氨酸类似物的种类。在DL-对-氟苯丙氨酸的情况下，在如下所述实施例描述的条件下它通常为2克/升，在间氟苯丙氨酸的情况下，在如下所述实施例描述的条件下它通常为1克/升。
优选本发明细菌对至少两种苯丙氨酸类似物具有抗性。例如，优选它对DL-对-氟苯丙氨酸和间-氟苯丙氨酸具有抗性。
对L-苯丙氨酸具有抗性是指在一定量L-苯丙氨酸的存在下(其量使野生类型的菌株(如菌株AS-1)不能生长)，所述细菌可以生长。在下述实施例的所述条件下其量通常为8克/升。
优选本发明细菌对较高浓度(如0.1M)的L-苯丙氨酸具有抗性。
本发明细菌可以通过依次赋予属于嗜甲基菌属的细菌所需的抗性来获得。赋予苯丙氨酸类似物抗性和L-苯丙氨酸抗性的次序不受限制并且可以任意次序实施所述赋予。
获得对苯丙氨酸类似物具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌和对L-苯丙氨酸具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌的方法将在以下进行解释说明。
通过在含有生长抑制浓度的苯丙氨酸类似物的基本培养基中培养属于嗜甲基菌属的细菌和选择生长菌株，可以获得对苯丙氨酸类似物具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌。
采用一种苯丙氨酸类似物或更多种苯丙氨酸类似物可以实施对苯丙氨酸类似物具有抗性的菌株的选择。可以对一种苯丙氨酸类似物进行一次或多次菌株选择。
加入所述培养基的苯丙氨酸类似物的量取决于苯丙氨酸类似物的类型，但对于DL-对-氟苯丙氨酸而言，优选不小于2克/升。在选择前可以对属于嗜甲基菌属的细菌进行突变处理。可以通过紫外线照射或通过用通常用于人工诱变的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等进行处理来实施突变。
通过在含有生长抑制浓度的L-苯丙氨酸的基本培养基中培养属于嗜甲基菌属的细菌和选择生长菌株，可以获得对L-苯丙氨酸具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌。此处的生长抑制是指慢速生长或停止生长。可以一次或多次选择菌株。培养基中L-苯丙氨酸的浓度没有特别的限制，但就举例而言不小于0.05M，优选不小于0.1M。在进行选择前，可以如上述相同的方法对属于嗜甲基菌属的细菌进行突变处理。
由上面获得的对L-苯丙氨酸具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌，可以在L-苯丙氨酸(其浓度使得亲株不能生长)的存在下进行生长。
优选本发明细菌对肉桂酸具有抗性。
对肉桂酸具有抗性是指细菌在野生菌株(如菌株AS-1)不能生长的肉桂酸量的存在下可以生长。在下述实施例所述的条件下其量通常为50毫克/升。
对肉桂酸具有抗性的属于嗜甲基菌属的细菌可以通过与对苯丙氨酸类似物具有抗性的细菌的相似的方式来获得。赋予肉桂酸抗性、苯丙氨酸抗性和L-苯丙氨酸抗性的次序没有限制并且可以任意次序进行赋予。
L-苯丙氨酸涉及L-苯丙氨酸生物合成的几个调整步。因此引起L-苯丙氨酸抗性的单突变可能有利于提高L-苯丙氨酸的生产率，然而，优选通过两次或更多次的突变使更多的调整脱敏。尽管L-苯丙氨酸的生产率较低，但具有单变突的属于嗜甲基菌属的细菌可以用作繁殖L-苯丙氨酸生产菌株的起始源。
本发明细菌可以通过常规突变处理或基因工程技术来提高用于L-苯丙氨酸生物合成路线的一种或多种酶的活性。
例如，通过在属于嗜甲基菌属的细菌中提高丙酮酸磷酸烯酯的生产能力可以改进L-苯丙氨酸的生物合成(国际公开号WO97/08333)。
通过改进脱敏的分支酸酯变位酶-预苯酸酯脱水酶基因(日本专利申请公开5-236947和62-130693)，和/或脱敏的3-脱氧-D-阿拉伯-hepturosonic acid 7-磷酸酯合酶基因(日本专利申请公开5-236947和61-124375)来提高L-苯丙氨酸的生产率。
<2>本发明方法
本发明方法是用来生产L-苯丙氨酸的方法，其包括在培养基中培养本发明细菌，从而在培养物中生成并富集L-苯丙氨酸，并从培养物回收L-苯丙氨酸。
本发明细菌的培养可以通过通常用于培养甲醇同化的微生物的方法来实施。用于本发明的培养基可以为合成培养基或天然培养基，只要所述培养基包括碳源和矿质营养素，以及其它有机微量营养素(如果需要的话)。
如果将甲醇用作主要的碳源，可以较便宜地生产L-苯丙氨酸。如果将甲醇用作主要的碳源，甲醇通常以0.001-30％(重量)的量加入培养基。作为氮源，可以通过加入培养基来使用硫酸铵。此外，可以使用少量的矿质营养素如磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。
通常可以在需氧条件下(如摇动培养物、通风和搅拌培养物，pH5-9，温度20-40℃)实施所述培养。它通常在24-120小时内完成。
所述培养物包括细胞和培养基，并且优选培养基。
根据已知方法的组合如离子交换树脂法和沉淀法，从所述培养物回收L-苯丙氨酸。
实施例
参考实施例对本发明进行详细描述。用于下面实施例的培养食甲基嗜甲基菌和分析L-苯丙氨酸的方法如下所示：
<1>试管培养
1.接种培养
采用含有1％甲醇的121(Fe2)-培养基琼脂，使所述菌株在30℃的平板或斜面上生长48-72小时。随后将所述菌株接种至容量40毫升试管中的121(Fe2)-培养基(含有2％的甲醇，用作接种培养基)。将所述接种培养物在37℃的旋转摇床中培养18小时。
2.试管内发酵
在37℃、40毫升容量试管中的5毫升121(Fe2)-培养基(含有2％的甲醇和3％的碳酸钙)中实施L-苯丙氨酸生产者的培养。培养开始后经过24小时，将另一份2％的甲醇加入并在37℃的旋转摇床中继续所述培养48小时。
含有2％的甲醇和3％的碳酸钙的121(Fe2)-培养基(1升)的组成如下：
K2HPO4.3H2O                   1.57g
KH2PO4                          0.62g
(NH4)2SO4                     3g
NaCl                              0.1g
MgSO4.7H2O                      0.2g
CaCl2                            0.025g
EDTA-Na2                         5mg
FeSO4.7H2O                      3mg
MnSO4.5H2O                      0.01mg
ZnSO4.7H2O                      0.07mg
Na2MoO4.2H2O                   0.01mg
H3BO3                           0.01mg
CoCl2.6H2O                      0.005mg
CuSO4.5H2O                      0.005mg
甲醇                              20ml(过滤灭菌)
CaCO3                  30g
                        pH 7.0
发酵管中培养基的初始体积：5ml
接种物量：10％
温度：37℃
搅拌：250rpm摇床。
<2>发酵肉汤中的L-苯丙氨酸的分析
1.样品制备
将发酵肉汤的样品在5415C型microfuge(Eppendorf)中离心15分钟以除去细胞和碎屑。将上层清液用于高效液相色谱(HPLC)分析。
2.色谱测定L-苯丙氨酸
色谱系统包括30型HPLC泵(Gilson)和操作波长设为245nm的2151型可变波长检测器(LKB)。采用带有1μl的内部样品环(internalsample loop)(Rheodyne)的7410型注射器将样品注入。采用实验室水浴恒温器使所述柱恒温在45℃。
包括装填5μm的Separon C18吸着剂(Tessek)的150mm×3.9mm玻璃柱的I.D.玻璃柱系统用于所有分离。洗脱液包括0.001M硫酸铜的水/乙腈溶液(80/20(体积/体积))。
将发酵肉汤样品以13000×g离心5分钟并注入而不经进一步制备。
采用960型界面和Nelson PC积分软件(PE Nelson)的IBM PC/AT兼容数据站处理所述数据。采用外标法对峰进行计算。
实施例1形成能生产L-苯丙氨酸的食甲基嗜甲基菌突变菌株
<1>对DL-对氟苯丙氨酸、芳族氨基酸类似物具有抗性的突变体的诱变和选择
对食甲基嗜甲基菌AS-1(NCIB 10515；ATCC 53528)菌株的DL-对氟苯丙氨酸(一种芳族氨基酸类似物)的敏感性进行测试。在含有不同浓度的DL-对氟苯丙氨酸的121(Fe2)-琼脂培养基中测试敏感性。平板培养108c.f.u./ml的食甲基嗜甲基菌并在30℃下生长3天。1毫克/毫升的DL-对氟苯丙氨酸完全抑制了所述细菌菌苔的生长。为了选择抗所述类似物的突变体，将108的食甲基嗜甲基菌菌株接种至含有2毫克/毫升DL-对氟苯丙氨酸的平板上。将一些N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(此后缩写为NG)诱变剂晶体置于板的中央。在30℃下经过4-5天后，对板进行分析。靠近NG诱变剂的细菌没有生长，但距其3-4厘米处，抗所述类似物的突变体菌落生长。收集大的菌落并在采用类似物DL-对-氟苯丙氨酸的相同培养基中进行纯化。如上所述，培养食甲基嗜甲基菌的DL-对-氟苯丙氨酸抗性(此后缩写为pFpR)突变体并对发酵培养基中L-苯丙氨酸的浓度进行测量。最佳的食甲基嗜甲基菌的pFpR突变体第227号生成30毫克/升的L-苯丙氨酸，接近1克/升的L-缬氨酸和0.2克/升的L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-丙氨酸。薄层色谱证实了HPLC分析的结果。
<2>在生长培养基中对高浓度的L-苯丙氨酸具有抗性的食甲基嗜甲基菌突变体的诱变和选择
食甲基嗜甲基菌的DL-对-氟苯丙氨酸抗性突变体生成L-苯丙氨酸，但是对高浓度的L-苯丙氨酸敏感(如果它存在于所述培养基中)。如果加入琼脂化的121-培养基，0.1M的L-苯丙氨酸完全抑制食甲基嗜甲基菌的pFpR突变体第227号的生长。
为了消除这种敏感性和增加菌株的生产率，对存在于生长培养基中的高浓度L-苯丙氨酸具有抗性的突变体进行选择。作为用来选择L-苯丙氨酸抗性突变体(此后缩写为pheR)的亲株，采用产生极少量L-苯丙氨酸(30毫克/升)的食甲基嗜甲基菌第227号(pFpR突变菌株)。所选的培养基为含有1％的甲醇和0.05M的L-苯丙氨酸的121(Fe2)-琼脂培养基。如上所述实施由NG引起的诱变。在相同的培养基中对L-苯丙氨酸抗性突变体菌落纯化几次并随后在没有0.05M的L-苯丙氨酸的培养基中纯化。突变体中的pheR标记被稳定遗传并且在没有选择压力下不会丢失。如上所述培养所选的食甲基嗜甲基菌的pFpRpheR突变体并且测量发酵培养基中L-苯丙氨酸的浓度。具有对高浓度L-苯丙氨酸有抗性的突变的最佳食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR突变体第227-16号产生0.4克/升的L-苯丙氨酸。因此，作为在食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR突变体第227-16号中的第二次突变的pheR-突变使L-苯丙氨酸的生产率提高了10倍以上：pFpR突变体(第227号)产生30毫克/升的L-苯丙氨酸，双pFpR pheR突变体(第227-16号)产生400毫克/升L-苯丙氨酸。
人们还发现：食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR突变体菌株第227-16号除了对2克/升的DL-对-氟苯丙氨酸和0.05M的L-苯丙氨酸具有抗性外，还对0.5克/升的间氟苯丙氨酸具有抗性。然而菌株第227-16号表明在1克/升的间氟苯丙氨酸中只有轻微的生长。如上所述，经过NG诱变后，将对1克/升间氟苯丙氨酸具有抗性的新突变体(此后缩写为mFpR)从菌株第227-16号中分离出来。所得新的食甲基嗜甲基菌pFpR pheR mFpR突变体菌株第227-16-10号产生如其前辈相同量的L-苯丙氨酸(0.4克/升)。
经NG诱变后，如上所述将对更高浓度的L-苯丙氨酸(0.1M)具有抗性的新的食甲基嗜甲基菌的pFpR pheR mFpR pheRR突变体菌株第227-16-10-11号(此后缩写为pheRR)从菌株第227-16-10号中分离出来。pheRR突变体菌株在试管中产生0.5-0.7克/升的L-苯丙氨酸、0.3克/升的L-缬氨酸、0.2克/升的L-亮氨酸和小于0.1克/升的L-异亮氨酸、L-丙氨酸和L-谷氨酸。
经NG诱变后，如上所述将对肉桂酸(50毫克/升)(化学结构类似L-苯丙氨酸)具有抗性的新的食甲基嗜甲基菌的pFpR-pheR-mFpR-pheRR-cinR突变体菌株第227-16-10-11-cin8号(此后缩写为cinR)从菌株第227-16-10-11号中分离出来。所述cinR突变体菌株在试管中产生0.8-0.9克/升的L-苯丙氨酸和0.6克/升的L-缬氨酸。
菌株第227，227-16，227-16-10，227-16-10-11和227-16-10-11-cin8号已于2000年2月10日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(根据布达佩斯协议条款于2000年7月18日转变为保藏)，其登记号分别为VKPM B-7909、VKPM B-7910、VKPM B-7911、VKPMB-7912和VKPM B-7913。

Claims (9)

1.一种嗜甲基菌属的细菌，其能够产生L-苯丙氨酸并且对苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸具有抗性。
2.根据权利要求1的细菌，其对DL-对-氟苯丙氨酸具有抗性。
3.根据权利要求1的细菌，其通过从嗜甲基菌属的细菌中选择对苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得，其中对每种苯丙氨酸类似物和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。
4.根据权利要求1的细菌，其对DL-对-氟苯丙氨酸和间-氟苯丙氨酸具有抗性。
5.根据权利要求4的细菌，其通过从嗜甲基菌属的细菌中选择对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得，其中对每种DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。
6.根据权利要求1的细菌，其对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸和肉桂酸具有抗性。
7.根据权利要求6的细菌，其通过从嗜甲基菌属的细菌中选择对DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂酸和L-苯丙氨酸具有抗性的菌株来获得，其中对每种DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸、肉桂酸和L-苯丙氨酸，以任意次序至少实施一次所述选择。
8.根据权利要求1-7中任一项的细菌，其为食甲基嗜甲基菌。
9.生产L-苯丙氨酸的方法，其包括以下步骤：
在培养基中培养如权利要求1的细菌从而在培养物中生成并富集L-苯丙氨酸，和
从所述培养物回收L-苯丙氨酸。
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