CN1193343A - 通过发酵制备l－谷氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于通过增加埃希氏杆菌属微生物中缬氨酸耐受野生型菌株L－谷氨酸产率而经济有效地制备L－谷氨酸的方法。被赋予缬氨酸敏感性且磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性及柠檬酸合酶活性被放大的一种埃希氏杆菌属菌株于液体培养基中孵育从而于培养基中积累的L－谷氨酸得以进行。

Description

通过发酵制备L-谷氨酸的方法
技术领域
本发明涉及通过发酵制备L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是作为食物、药物制品等一种重要氨基酸。
背景技术
L-谷氨酸主要用短杆菌属、棒状杆菌属或微杆菌属的所谓棒状产L-谷氨酸菌株或其突变体通过发酵而制备(氨基酸发酵，Gakkai Shuppan中心，195-215页，1986)。其它已知通过发酵制备L-谷氨酸的方法使用杆菌属、链霉菌属、青霉属的微生物(美国专利No 3,220,929)，及假单胞菌属、节杆菌属、沙雷氏菌属或假丝酵母属的微生物(美国专利No 3,563,857)。L-谷氨酸产率通过常规方法被显著地增加。然而，为了达到未来增加的需求，更为廉价而有效的产L-谷氨酸方法的开发已属必要。
存在这样一种可能，即由于其高的生长速度和深入的基因分析，埃希氏杆菌属细菌在将来将用作极好的L-谷氨酸制备菌株。到目前为止仅报导了大肠杆菌W野生型菌株的突变体仅积累2.3g/升L-谷氨酸(生物化学杂志.，50卷，164-165页，1961)。然而，最近，已表明其中的α-酮戊二酸脱氢酶(这里简称为“α-KGDH”)活性缺失或降低的大肠杆菌K-12突变体显示出高的L-谷氨酸产率[日本公开的专利申请(Kokai)No.244,970/1993]。埃希氏杆菌属野生型菌株包括具有优于大肠杆菌K-12及其突变体特性的菌株。例如，已报导大肠杆菌B较大肠杆菌K-12及其突变体显示出更快的生长速度并产生较高的基于消耗葡萄糖的生物量产率(生物技术杂志，2卷，191-206页，1985；和应用环境微生物学.，56卷，1004-1011页，1990)。
通过繁殖埃希氏杆菌属的产L-谷氨酸菌株而提供经济有效的制备L-谷氨酸方法是本发明的目的。
发明内容
本发明人用埃希氏杆菌属细菌艰苦地进行关于制备L-谷氨酸方法的研究，且因此发现通过在缬氨酸敏感菌株中放大柠檬酸合酶(以下简称为“CS”)活性和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(以下简称为“PPC”)活性而获得的菌株具有高的L-谷氨酸产率。此发现导致本发明的完成。
即，本发明如下。
发明1.一种埃希氏杆菌属的微生物，其显示缬氨酸敏感性，并具有放大的柠檬酸合酶活性和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性且具有产L-谷氨酸的能力。
发明2.根据发明1的微生物，其中的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或降低。
发明3.根据发明1和2中任何一个属于大肠杆菌的微生物。
发明4.根据发明3的属于大肠杆菌B菌菌株的微生物。
发明5.根据发明3的属于大肠杆菌K-12菌株的微生物。
发明6.通过发酵制备L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养根据发明1-5中任何一个的微生物，在培养基中积累L-谷氨酸，和回收所述的L-谷氨酸。
附图简述
图1为显示质粒pMWCP构建的图示。
完成本发明的最佳实施方案
(1)缬氨酸敏感突变体的分离
为了繁殖本发明的菌株，缬氨酸敏感性突变子首先被分离用作埃希氏杆菌属显示缬氨酸抗性野生型菌株的母本菌株或其突变体。这样的野生型菌株的具体实例如下：
大肠杆菌B(ATCC 11303)
大肠杆菌W(ATCC 9637)
缬氨酸敏感性突变体分离自埃希氏杆菌属并以下面的方法显示缬氨酸抗性的菌株。
首先，上面提到的缬氨酸抗性菌株通过常规的方法加以突变，例如，其中的菌株以X-射线或紫外线照射或以诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(以下简称“NG”)处理的方法。
或者，所需的突变可通过基因工程方法如转导、基因重组等而有效地导入。
缬氨酸敏感性菌株按如下通过转导而获得。即，大肠杆菌K-12已知显示缬氨酸敏感性(氨基酸：生物合成和遗传调节，Klaus M.Herrman和Ronald L. Somerville编，Addison-Wesley出版公司.，250-251页，1983)。因此，源自大肠杆菌K-12的缬氨酸敏感性可用通过P1噬菌体感染大肠杆菌K-12而获得的噬菌体裂解液而转导入缬氨酸抗性菌株。
经母本菌株突变或其转导而导入缬氨酸敏感性以后，所需的缬氨酸敏感性菌株可作为突变体而分离，其不能够在含缬氨酸的基本培养基上生长或生长速度显著减慢。
这样获得的缬氨酸敏感性菌株的具体实例为大肠杆菌B11。
大肠杆菌B11为经过突变源自大肠杆菌B的缬氨酸敏感性菌株。据认为在此突变体中，从丙酮酸至缬氨酸的代谢流由生物合成的缬氨酸所抑制，结果是丙酮酸至乙酰辅酶A的代谢流增强。
如果具有此特征的别的菌株已可得到，那么获得新的属于埃希氏杆菌属并具缬氨酸敏感性的菌株是不必要的。该菌株的实例包括大肠杆菌K-12菌株，大肠杆菌W3110菌株等。在日本公开的专利申请(Kokai)No 244,970/1993中公布的大肠杆菌AJ12624和大肠杆菌AJ12628是源自大肠杆菌W3110菌株并且它们的α-KGDH活性缺失或降低。其中的α-KGDH活性缺失或降低的菌株提高了L-谷氨酸的产率且因此可优选成为本发明的微生物。
(2)PPC活性和CS活性的放大
在后面待述的实例中，属于埃希氏杆菌属并具有放大的PPC活性和CS活性的菌株被获得用作埃希氏杆菌属缬氨酸敏感性菌株的宿主。进行繁殖也是可能的从而使具有放大PPC活性和CS活性的菌株用埃希氏杆菌属缬氨酸抗性菌株作为宿主菌而获得并且缬氨酸敏感性然后被赋予到那里。
因此，作为用于繁殖具有放大PPC活性和CS活性菌株的宿主菌，被赋予缬氨酸敏感性的埃希氏杆菌属突变体、具有缬氨酸抗性的埃希氏杆菌属野生型菌株或其突变子被使用。这样的宿主菌具体实施例如下。
大肠杆菌B11
大肠杆菌K-12(ATCC 10798)
大肠杆菌B(ATCC 11303)
大肠杆菌W(ATCC 9637)
为了放大PPC活性和CS活性，编码PPC和CS的基因克隆于适当的载体上，并且上述的宿主菌以这样获得的重组载体转化。由于转化子中编码PPC和CS基因(以下分别简称为“PPC基因”和“gltA基因”)的拷贝数增加，故PPC活性和CS活性然后被放大。作为上述提到载体的实例有合适的质粒载体，噬菌体载体，转座子，载体等。
PPC基因和gltA基因可用其中的PPC活性或CS活性缺失的突变体并分离弥补它们营养缺陷的基因而获得。由于这些大肠杆菌基因的核苷酸序列已经报导(生物化学杂志.，95卷，909-916页，1984；和生物化学，22卷，5243-5249页，1983)，故引物根据各自的核苷酸序列合成且基因通过用染色体DNA作为模板的PCR而获得也是可能的。
只要能在埃希氏杆菌属细菌中复制任何质粒可用于基因克隆。质粒的具体实例包括pBR322，pTWV228，pMW119和pUC19。
PPC基因和gltA基因通过克隆于单个载体上或分别克隆于两种共存载体上而导入上述作为宿主菌的起始母本菌株中。
通过连接PPC基因和gltA基因与同一质粒载体或不同质粒载体，将获得的重组质粒导入上述宿主菌并使该质粒保留于宿主中可使PPC活性和CS活性放大。PPC活性和CS活性也可通过造成PPC基因和gltA基因的额外拷贝存在于上述宿主菌的染色体DNA中而被放大。PPC基因和gltA基因的额外拷贝用存在于染色体DNA中的序列作为靶子通过同源重组转导入埃希氏杆菌属微生物的染色体DNA中。作为存在于染色体NDA中的序列，以多拷贝存在的序列是优选的并且，例如，存在于倒位序列或转座子末端的重复DNA及反向重复可以使用。或者，如在日本公开的专利申请(Kokai)No.109,985/1990，中所公布的，ppc基因和gltA基因克隆于转座子上并将此转座子转座到染色体中也是可能的。在两种方法中，PPC基因和glt基因的拷贝数在转化子中被增加，并且PPC活性和CS活性因此被放大。
除了上述的基因扩增以外，PPC活性和CS活性也可通过以强的启动子替代ppc基因和gltA的启动子而放大。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、PR启动子及λ噬菌体的PL启动子为已知的强启动子。这两个基因的启动子以这些启动子替代，结果ppc基因和gltA基因的表达增加从而放大了PPC活性和CS活性。
已有报导通过以下方法提高L-谷氨酸产率，即通过赋予菌株低能力的降解L-谷氨酸及苹果酸合酶-异柠檬酸裂合酶-异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶操纵子(以下简称为“ace操纵子”)的组成型表达[日本公开的专利申请(Kokai)No.244,970/1933]。很容易认为当本发明的产L-谷氨酸菌株具有这些特性时，L-谷氨酸产率被优先提高。
不用说，从提高L-谷氨酸产率的立场看，本发明的产L-谷氨酸菌株进一步具有营养缺陷药物抗性、药物敏感性及目前已知有效用于提高产L-谷氨酸菌株产率的药物依赖性是优越的。
(3)用本发明的菌株制备L-谷氨酸
用埃希氏杆菌属具有缬氨酸敏感性并具有放大PPC活性和CS活性的菌株制备L-谷氨酸可在普通营养培养基中通过标准的培养方法而进行，该培养基中含有碳源、氮源、无机盐和任选的有机微量养料如氨基酸、维生素等。只要这些来源可被待培养的菌株利用任何碳源及氮源可被使用。
碳源的实例包括碳水化合物如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物及糖蜜。此外，有机酸如醋酸及柠檬酸用作唯一碳源或与其它碳源联合使用。
氮源的实例包括氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵和磷酸铵及硝酸盐。
有机痕量营养的实例包括氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物及含有相同成分的大豆蛋白水解物。当使用需要氨基酸等用于生长的营养缺陷突变体时，所需的营养成分不得不补充。
无机盐的实例包括磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐及锰盐。
培养在20～45℃的发酵温度有氧进行并同时控制pH在5和9之间。当pH在培养过程中降低时，以碳酸钙或诸如氨气的碱调节pH。培养以此种方式进行10小时至4天以在培养基中积累相当数量的L-谷氨酸。
培养结束后可通过已知的方法从培养基中回收L-谷氨酸，如通过这样的方法，即从培养基中去除细胞，然后浓缩并结晶或者通过离子交换层析方法。
实施例
本发明将参照下面的实施例更加具体地加以说明。
(1)从大肠杆菌B中分离缬氨酸敏感性突变体
源自大肠杆菌K-12的大肠杆菌B和W3110细胞悬液(105个细胞/m1)5μl点滴于含有各种浓度缬氨酸的M9基本琼脂培养基上(细菌遗传学短期教程，冷泉港实验室出版社，J.Miller，p.437，1992)，并于37℃培养过夜。然后检查细胞的生长。结果，大肠杆菌B可生长于含5g/升缬氨酸的M9基本培养基上，但大肠杆菌W3110甚至不能在含50mg/升缬氨酸的M9基本培养基中生长。顺便说一下，两种菌株均可良好地生长于无缬氨酸的M9基本培养基上。
与源自大肠杆菌B的W3110具有相同缬氨酸敏感性的突变体的分离。
大肠杆菌B于含有16g/升细菌培养用胰蛋白胨、10g/升细菌培养用酵母提取物和5g/升NaCl的2YT液体液体培养基中于37℃培养过夜，然后重新接种于2YT液体培养基中，并于37℃培养。收集对数生长期的细胞，以50mM的磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗，悬浮于含200μg/ml NG的磷酸盐缓冲液中并于37℃孵育30分钟。之后，收集细胞并从磷酸盐缓冲液洗。部分细胞接种于2YT液体培养基，并于37℃培养过夜。然后收集细胞，并以磷酸盐缓冲液洗。部分细胞接种于含100mg/升缬氨酸的M9基本液体培养基并于37℃培养2小时。随后，以200单位/毫升的量加入青霉素，并进一步培养过夜以浓缩缬氨酸敏感性突变体。然后，将培养物适当稀释，并计数活细胞数量。根据活细胞数目用同样方法稀释培养物，铺板于M9基本琼脂培养基，并于37℃培养过夜。形成的菌落转接至含100mg/升缬氨酸的M9基本琼脂培养基上，并于37℃培养过夜。分离不能生长于含缬氨酸的培养基上被认为是缬氨酸敏感性的菌株。在单菌落分离以后，检查这些菌株在含有各种浓度的M9基本琼脂培养基中的生长。因此，不能在含50mg/升缬氨酸的M9基本琼脂培养基上生长的3个缬氨酸敏感性突变体被分离。
大肠杆菌B和这样获得的3个缬氨酸敏感菌株接种于50毫升的大试管中，每管中含5ml培养基，其成分列于表1，并培养于往复式摇床(115rpm)直到培养基中的葡萄糖在37℃被消耗。培养结束时，积累于培养上清中L-谷氨酸的量通过Asahi化工公司生产的Biotech分析仪加以测定。结果，大肠杆菌B和三个缬氨酸敏感菌株没有一个在培养基中积累L-谷氨酸。同时，在每个培养上清中缬氨酸的积累通过薄层层析及其与茚三酮的反应加以检测。大肠杆菌B中缬氨酸斑点略微可见，但在缬氨酸敏感菌株中没有观察到缬氨酸斑点。
分离的缬氨酸敏感性典型菌株命名为大肠杆菌11。
                              表1
    成分     浓度(g/l)
    葡萄糖(NH4)2SO4KH2PO4MgSO4·7H2OFeSO4·7H2OMnSO4·5H2O酵母提取物盐酸硫胺素CaCO3     4020110.010.0120.0120
(2)大肠杆菌W3110gltA基因的克隆
大肠杆菌gltA基因的核苷酸序列已有报导(生物化学，22卷，52435249页，1983)。序列表中序列序号1和2的引物根据报导的核苷酸序列而合成，并且gltA基因通过用大肠杆菌W3110染色体DNA作为模板的PCR而扩增。只要-331位碱基G以C替代且向其中插入限制性核酸内切酶PstI的识别序列，则合成的引物序列号1相应于《生物化学》，22卷，5246页，1983中描述的gltA基因核苷酸序列表的-342碱基至323位碱基的序列。只要2070位碱基A以G替代并向其中插入限制性核酸内切酶EcoRI的识别序列，则其序列号2相应于《生物化学》，22卷，5247页，1983中描述gltA基因核苷酸序列表的2060位碱基至2079位碱基的序列。在由序列号2所代表的核苷酸序列中，在《生物化学》，22卷，5247页，1983中所示的2060位碱基至2079位碱基核苷酸序列的反向链从5′端描述。
大肠杆菌W3110的染色体DNA通过标准的方法(Seibutsu KohgakuZikken-sho，日本发酵及生物工程学会编，97-98页，Baifukan，1992)制备。在PCR中，使用了《PCR技术》(Henry A.Ehlich编，Stockton出版社，1989)中描述的标准反应条件。
PCR产物通过标准方法纯化，并且然后以限制性核酸内切酶PstI和EcoRI酶切。该片段用连接试剂盒(购自Takara Shuzo)与以PstI和EcoRI酶切的pTWV228(购自Takara Shuzo)连接。大肠杆菌JM109感受态细胞(购自Takara Shuzo)被从这样获得的连接产物转化，并铺板于L培养基(pH7.2)，其含有10g/升细菌培养用胰蛋白胨，5g/升细菌培养用酵母提取物，5g/升NaCl，15g/升琼脂，10μg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)，40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)及100μg/ml的氨苄青霉素，并培养过夜。然后，挑出出现的白色菌落。
通过碱法(Seibutsu Kohgaku Zikken-sho，日本发酵及生物工程学会编，105页，Baifukan，1992)从转化子菌株中制备质粒。然后，构建插入到载体中DNA片段的限制性核酸内切酶图谱，并与报导的gltA基因的限制性核酸内切酶图谱作比较。具有相同限制性核酸内切酶图谱的插入其中片段的质粒命名为pTWVC。
此外，为了证实gltA基因表达与否，将pTWVC导入通过氯化铷方法(Saishin Nohgaku Zikken no Kiso，Tohoku大学农业系，软科学K.K编，157页，1990)制备的gltA-缺陷菌株ME8330(gltA6，fur：：Tn5，galK30，pyrD36，relAl，rpsL129，thi-1，SupE44，λ-)的感受态细胞中。核查获得转化子的营养缺陷，并确证了pTWVC弥补了ME8330 gltA6的缺陷。此ME8330获自国家遗传学研究所，遗传贮藏研究中心。gltA缺陷的ME8330需要L-谷氨酸用于其生长并可生长于含有硫胺素，尿嘧啶和L-谷氨酸的M9基本培养基。
通过Weitzman等方法(酶学方法，13卷，22-26页，1969)测定W3110、gltA缺陷型ME8330及含有pTWVC的ME8330的CS活性。因此，如表2所示，ME8330不具有CS活性。同时，含有pTWVC的ME8330显示出约4倍于野生型菌株W3110的CS活性。
                        表2
    菌株   CS活性(单位/毫克·蛋白)
    W3110ME8330ME8330/pTWVC     0.6902.71
(3)具有ppc基因和gltA基因质粒的构建
含有ppc基因和gltA基因质粒pMWCP的构建显示于图1。
首先，以SalI酶切质粒pS2，在pS2中含有的源自大肠杆菌K-12的ppc基因整个区域的4.4kb SalI片段插入到pBR322的SalI位点(生物化学杂志，95卷，909-916页，1984)。含有ppc基因的4.4kb的SalI片段通过琼脂糖凝胶电泳制备，并插入到pMW119(购自NipponGene)的SalI位点。此质粒命名为pMWP。另一方面，具有gltA基因的pTWVC从PstI酶切，并将其两个末端变成平末端。此片段进一步以EciRI酶切。这样获得的DNA片段与SmaI和EcoRI酶切的pMWP混合，并将混和物进行连接。ME8330以这样连接的DNA样品转化，并挑选丧失L-谷氨酸营养缺陷的氨苄青霉素抗性转化子菌株。从该菌株中制备质粒，并将ME8330重新以此质粒转化。丧失L-谷氨酸营养缺陷的转化子得以鉴定。此外，构建限制性核酸内切酶图谱，并确证ppc基因和gltA基因存在于此质粒中。此质粒命名为pMWCP。转化用氯化铷方法进行。
(4)将pMWCP导入大肠杆菌B及缬氨酸敏感性突变体B11中并对培养物进行评价
大肠杆菌B及其缬氨酸敏感性突变体以质粒pMWCP通过氯化铷方法转化。独立获得的每种类型的三个转化子接种于含有5ml培养基的50毫升大试管中，培养基具有列于表1的成分，然后以往复式摇床于37℃培养直至培养基中的葡萄糖被消耗。此外，以pMWP或pMWC转化的转化子，B11也进行上述的培养。pMWC通过连接从pTWVC制备的含有gltA基因的PstI-EcoRI片段与以PstI及EcoRI酶切的pMW119而构建。在转化子培养过程中，加入100μg/ml氨苄青霉素以稳定地维持质粒。
培养结束时，测量积累于培养基中L-谷氨酸的量，并将结果列于表3。在转化子培养结果中，L-谷氨酸的量以三个转化子量的平均值表示。在用缬氨酸抗性大肠杆菌B作为宿主菌而获得的并具有放大CS活性和PPC活性的菌株中，L-谷氨酸没有积累。然而，在用缬氨酸敏感性B11作为宿主菌而获得的并具有放大CS活性PPC活性的菌株中，积累了相当多量的L-谷氨酸。在通过将pMWP导入B11而获得的并仅具有放大PPC活性的菌株中，L-谷氨酸没有积累。然而，在通过将pMWC导入B11而获得的并仅具有放大CS活性的菌株中，积累了L谷氨酸，但此菌株中积累的L-谷氨酸量少于既具有放大CS活性又具有放大PPC活性菌株中积累的L-谷氨酸的量。
                                表3
    菌株     宿主菌特性 积累的L-谷氨酸量(g/升)
  B/pMWCPB11/pMWCPB11/pMWPB11/pMWC   缬氨酸抗性缬氨酸敏感性缬氨酸敏感性缬氨酸敏感性     09.803.6
以上述的结果，发现缬氨酸敏感性突变和CS活性及PPC活性放大的联合对从缬氨酸抗性野生型菌株如大肠杆菌B中繁育产L-谷氨酸的菌株是必不可少的。通过导入具有gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP至B11中而获得的菌株命名为AJ13138。
大肠杆菌B的缬氨酸敏感性突变体B11通过整合入(curring)保藏的AJ13138中的质粒获得而不损害宿主细胞。质粒有时自然丢失或可被矫正(细菌学综述.，36卷，361-405页，1972)。在质粒整合方法中，AJ13138于L-培养基中40℃培养过夜。然后，将培养物适当稀释，并铺盘于无氨苄青霉素的L-培养基上。培养物于37℃孵育过夜之后，形成的菌落转接至含100μg/m1氨苄青霉素的L-培养基，并且然后分离出氨苄青霉素敏感性菌落。这样获得的氨苄青霉素敏感性菌株为B11。
(5)将pMWCP导入大肠杆菌K-12并对培养物进行评估
大肠杆菌W3110sucA：：Kmr以质粒pMWP、pMWC和pMWCP通过氯化铷方法转化以获得三种转化子。独立获得的每种转化子中的4个接种于500毫升大Sakaguchi容量瓶中，其中含有20ml培养基，其成分列于表4，并在往复式摇床上37℃培养25小时直到培养基中的葡萄糖被消耗。在转化子培养过程中，加入100μg/ml氨苄青霉素以稳定地维持质粒。大肠杆菌W3110sucA：：Kmr公开于发表的欧洲专利申请0 670 370并且由于sucA基因的破坏而为α-KGDH缺陷型的。
                            表4
    成分     浓度(g/升)
    葡萄糖(NH4)2SO4KH2PO4MgSO4·7H2OFeSO4·7H2OMnSO4·5H2O酵母提取物盐酸硫胺素CaCO3     2020110.010.0120.013
培养结束时，测量培养基中积累的L-谷氨酸的量，并将结果列于表5。在转化子培养的结果中，L-谷氨酸的量以4个转化子量的平均值来表示。在用源自缬氨酸敏感性大肠杆菌K-12的α-KGDH缺陷性菌株作为宿主菌而获得并具有放大CS活性和PPC活性的菌株的结果中，积累了相当多数量的L-谷氨酸。
                              表5
    菌株   积累的L-谷氨酸产量(％)
    W3110sucA：：KmrW3110sucA：：Kmr/pMWPW3110sucA：：Kmr/pMWCW3110sucA：：Kmr/pMWCP     41.142.344.547.3
工业上的可用性
根据本发明方法，可增加埃希氏杆菌属缬氨酸抗性野生型菌株的L-谷氨酸产率，并且L-谷氨酸可以低代价有效地制备。
大肠杆菌AJ12624于1991年7月24日保藏于工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERM P-12379。该菌株于1992年5月15日根据布达佩斯条约转为国际保藏且得到登记号FERM BP-3853。
大肠杆菌AJ12628于1991年7月24日保藏于工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERM P-12380。该菌株于1992年5月15日根据布达佩斯条约转为国际保藏并得到登记号FERM BP-3854。
大肠杆菌AJ13138于1995年8月17日保藏于工业技术院国立生命科学和人体技术研究所(日本茨城县筑波市东1丁目1番3号)，保藏号为FERMP-15115。该菌株于1996年6月7日根据布达佩斯条约转为国际保藏且得到登记号FERM BP-5565。
序列表：
序列1
序列长度：20
序列类型：核酸
链型：单链
拓扑学：线性
序列类型：合成的DNA
序列特征：
用于扩增大肠杆菌gltA基因的引物
序列：
TCTGTTACCT  GCAGACGTCG    20
序列2
序列长度：  20
序列类型：核酸
链型：单链
拓扑学：线性
序列类型：合成的DNA
序列特征：
用于扩增大肠杆菌gltA基因的引物
序列：
AAGTGAATTC  CGCCAGAACC    20

Claims (6)

1.一种埃希氏杆菌属的微生物，其显示缬氨酸敏感性，并具有放大的柠檬酸合酶活性和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性并具有L-谷氨酸产力。
2.根据权利要求1的微生物，其中的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或降低。
3.根据权利要求1和2的任意的微生物，其属于大肠杆菌。
4.根据权利要求3的微生物，其属于大肠杆菌B菌株。
5.根据权利要求3的微生物，其属于大肠杆菌K-12菌株。
6.一种通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其中包括在液体培养基中培养根据权利要求1～5中任何一个的微生物，在培养基中积累L-谷氨酸，并回收所述的L-谷氨酸。
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