JP2926991B2 - 発酵法によるｌ−リジン及びｌ−グルタミン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、発酵法によるＬ−リジン及びＬ−グルタミ
ン酸の製造方法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等と
して、Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用い
られている。

背景技術 従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸は、これらの
アミノ酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネ
バクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法に
より工業生産されている。この方法では、コリネ型細菌
は生育にビオチンを要求する一方、培地中に過剰量のビ
オチンが存在すると、Ｌ−グルタミン酸が蓄積しないこ
とが知られている。従って、従来のＬ−グルタミン酸の
製造法においては、ビオチン濃度を制限した培地で培養
するか、あるいはビオチンを充分量含有する培地を用い
る場合には、培養の初発または途上でビオチン作用抑制
物質として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地
に含有させて培養するかのいずれかの方法が採用されて
いる。

しかしながら、特に培地の炭素源として廃糖蜜等の安
価ではあるが過剰量のビオチンを含有する原料を使用す
る場合、培地に添加することが必要なビオチン作用抑制
物質が製造コスト高の原因となっていた。

一方、Ｌ−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に醗酵生
産する方法として、Ｌ−リジン生産菌をＬ−グルタミン
酸の生産条件下で培養するか、あるいはＬ−リジン生産
菌とＬ−グルタミン酸生産菌を混合培養する方法が知ら
れている（特開平５−3793号公報）。

しかしながら、Ｌ−リジン生産菌をＬ−グルタミン酸
生産条件下に培養しＬ−リジンとＬ−グルタミン酸を同
時に発酵生産する方法において、該Ｌ−グルタミン酸生
産条件は、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリ
ウム属に属するビオチン要求性細菌を低ビオチン培地で
培養するか、あるいはビオチンを充分量含有する培地で
培養の初発または途上で界面活性剤またはラクタム系抗
生物質を培地に含有させて培養するかのいずれかであ
り、特に培地の炭素源として廃糖蜜等の安価ではあるが
過剰量のビオチンを含有する原料を使用する場合、培地
に添加されるビオチン作用抑制物質としての界面活性剤
またはラクタム系抗生物質が製造コスト高の原因であっ
た。

また、Ｌ−リジン生産菌とＬ−グルタミン酸生産菌を
混合培養する方法においては、培養の制御が難しく発酵
成績が不安定であるという問題点があった。

発明の開示 本発明の目的は、培地の炭素源として廃糖蜜等の過剰
量のビオチンを含有する原料を用いる場合においてもビ
オチン作用抑制物質を添加することなく、安価かつ安定
にＬ−グルタミン酸を発酵生産する方法を提供すること
である。

本発明の他の目的は、培地の炭素源として廃糖蜜等の
過剰量のビオチンを含有する原料を用いる場合において
もビオチン作用抑制物質を添加することなく、安価かつ
安定にＬ−リジンとＬ−グルタミン酸を同時に発酵生産
する方法を提供することである。

本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討し
た結果、従来用いられているコリネ型Ｌ−グルタミン酸
生産菌にビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付
与することにより誘導された変異株が、過剰量のビオチ
ンを含有する培地においても界面活性剤や抗生物質を添
加することなくＬ−グルタミン酸を著量生成蓄積するこ
とを見いだした。さらに、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生
産菌に由来するＬ−リジン生産菌にビオチン作用抑制物
質に対する温度感受性を付与することにより誘導された
変異株が、過剰量のビオチンを含有する培地においても
界面活性剤や抗生物質を含有させることなくＬ−ジンと
Ｌ−グルタミン酸の両方を著量生成蓄積することを見い
だし、本発明を完成するに至った。

すなわち本願発明は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産
菌に由来し、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性
変異を有し、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビ
オチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生
産する能力を有する変異株を、液体培地に培養し、培地
中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを該培地か
ら採取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミ
ン酸酸の製造方法である。

本願の他の発明は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌
に由来し、Ｌ−リジン生産能を付与する変異、及びビオ
チン作用抑制物質に対する温度感受性変異を有し、過剰
量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物
質の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を生産
する能力を有する変異株を、液体培地に培養し、培地中
にＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、こ
れらを該培地から採取することを特徴とする発酵法によ
るＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の製造方法である。

また本発明は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由
来し、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を
有し、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン
作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産する
能力を有する変異株を提供する。以下、この変異株を、
「本発明の第１の変異株」ということがある。

さらに本発明は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に
由来し、Ｌ−リジン生産能を付与する変異、及びビオチ
ン作用抑制物質に対する温度感受性変異を有し、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の両方を
生産する能力を有する変異株を提供する。以下、この変
異株を、「本発明の第２の変異株」ということがある。

また本発明は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に、
ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与するこ
とを特徴とする、過剰量のビオチンを含有する培地中に
てビオチ作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を
生産する能力を有する変異株の育種方法を提供する。

さらに本発明は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌
に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性及びＬ−
リジン生産能を付与することを特徴とする、過剰量のビ
オチンを含有する培地中にビオチン作用抑制物質の非存
在下にてＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の両方を生産す
る能力を有する変異株の育種方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

＜１＞Ｌ−グルタミン酸生産菌のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異株の取得とＬ−グルタミン酸の
生産 〔１〕Ｌ−グルタミン酸生産菌のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異株の取得 コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由来する従来公知
のＬ−グルタミン酸生産菌は、10μg/L以上の過剰量の
ビオチンを含有する培地に培養した場合、培養の初発ま
たは途上で界面活性剤や抗生物質のようなビオチン作用
抑制物質を培地に含有させないと、培養液中にＬ−グル
タミン酸を実質的に生産しない。本発明の第１の変異株
は、過剰量のビオチンを含有する液体培値で培養しても
ビオチン作用抑制物質を培地に含有させることなくＬ−
グルタミン酸を生産する能力を有する。すなわち本発明
の第１の変異株は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に
由来し、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異
を有し、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチ
ン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産す
る能力を有する変異株である。

上記のような変異株は、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生
産菌に由来するグルタミン酸生産菌にビオチン作用抑制
物質に対する温度感受性を付与することにより誘導する
ことができる。ビオチン作用抑制物質としては、界面活
性剤及び抗生物質が挙げられる。

界面活性剤としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、ス
テアリン酸、パルミチン酸等の飽和脂肪酸、グリセロー
ル脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、シュク
ロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸
エステル、ポリエチレングリコール・ポリプロピレング
リコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン・ソルビ
タン脂肪酸エステル等の脂肪酸エステル型非イオン性界
面活性剤、及び、Ｎ−パルミトイルグリシン、Ｎ−パル
ミトイルアラニン、Ｎ−パルミトイルバリン、Ｎ−パル
ミトイルロイシン、Ｎ−パルミトイルスレオニン、Ｎ−
パルミトイルメチオニン、Ｎ−パルミトイルアスパラギ
ン酸、Ｎ−パルミトイルグルタミン酸、Ｎ−ミリストイ
ルグルタミン酸、Ｎ−ステアロイルグルタミン酸、N,
N′−ジパルミトイルオルニチン、N,N′−ジパルミトイ
ルリジン等のＮ−アシルアミノ酸が挙げられる。

また、抗生物質としては、ペニシリン、セファロリジ
ン等のラクタム系抗生物質が挙げられる。

一般に、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の生育はあ
る濃度以上のビオチン作用抑制物質の存在により阻害さ
れる。本発明においてビオチン作用抑制物質に対する温
度感受性とは、31.5℃（最適生育温度）の培養温度でビ
オチン作用抑制物質非存在下とほぼ同等の生育を示す最
大濃度のビオチン作用抑制物質の存在下において、33な
いし37℃、好ましくは34℃以上の培養温度ではビオチン
作用抑制物質非存在下に比べて生育が著しく阻害される
ような性質を意味する。具体的には、31.5℃と33ないし
37℃においてビオチン作用抑制抑制物質が生育に及ぼす
影響を調べ、各温度でビオチン作用抑制物質非存在下で
のそれぞれの生育を100とした時の各濃度でのビオチン
作用抑制物質存在下での相対生育度を算出し,31.5℃で
相対生育℃が80以上となる最大濃度を求めた場合、33な
いし37℃で当該最大濃度のビオチン作用抑制物質存在下
での相対生育度が50以下であるような性質をいう。

本発明でいうコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌とは、
従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリ
ネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（In
t.J.Syst.Bacteriol.,41,255（1981））、またコリネバ
クテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌
を含む。したがって、本発明で使用する変異株は、ブレ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属する下
記のようなコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌から誘導す
ることができる。尚、本明細書において、Ｌ−グルタミ
ン酸生産性に言及しない場合は、コリネバクテリウム属
細菌及びブレビバクテリウム属細菌を単にコリネ型細菌
ということがある。

上記のような菌株に紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照
射、変異誘起剤処理等の変異処理を施し、ビオチン作用
抑制物質を含有する寒天平板培地上でのレプリカ法によ
りビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を有する菌
株を得ることができる。すなわち、33ないし37℃、好ま
しくは34℃以上の培養温度において各濃度のビオチン作
用抑制物質存在下で親株の生育状態を観察し、生育が認
められるビオチン作用抑制物質の最大濃度を求め、同温
度でこの濃度のビオチン作用抑制物質の存在下では生育
できないか生育速度が著しく低下した変異株を分離すれ
ばよい。

以上のようにして、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌
に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与す
ることにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にて
ビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を
生産する能力を有する変異株を育種することができる。

〔２〕遺伝子組換えによるＬ−グルタミン酸生産菌のビ
オチン作用抑制物質に対する温度感受性変異株の取得 ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異株の取
得方法は、上記の変異処理による方法以外にも考えられ
る。例えば、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌からビオ
チン作用抑制物質に対する耐性に関与する遺伝子を取得
し、その遺伝子を試験管内で変異処理を行い、ビオチン
作用抑制物質に対する耐性の付与が温度感受性になった
変異型の遺伝子を取得する。次に、この変異型遺伝子
を、既に確率している相同組換えの手法により、染色体
上の野生型の同遺伝子と置換することによりビオチン作
用抑制物質に対して温度感受性になった変異株を取得す
ることができる。

以下、ビオチン作用抑制物質耐性に関する遺伝子とし
て、界面活性剤耐性に関与する遺伝子について説明す
る。コリネ型細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝
子を単離するには、 （１）界面活性剤に対する感受性が増したコリネ型細菌
に属する界面活性剤感受性変異株を取得し、 （２）野生型コリネ型細菌の染色体DNAの各種断片を、
コリネ型細菌で機能するベクターと連結して各種組換え
DNAを作成し、 （３）各種組換えDNAをコリネ型細菌に属する界面活性
剤感受性変異株に導入して形質転換を行い、 （４）形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた
株、すなわち界面活性剤耐性が増した株を選択し、 （５）上記界面活性剤感受性が失われた形質転換株より
組換えDNAを回収し、 （６）ベクターに連結されている野生型コリネ型細菌の
染色体DNA断片の構造を解析する。

こうして得られる野生型コリネ型細菌の染色体DNA断
片には、コリネ型細菌由来の界面活性剤耐性に関与する
遺伝子が含まれている。同遺伝子は、少なくとも、界面
活性剤を含む培地でコリネ型細菌がＬ−グルタミン酸を
生成する機構に関与するものである。同時に、ペニシリ
ン添加やビオチン制限によるＬ−グルタミン酸の生成に
も共通に関与する可能性もある。

上記（１）において「界面活性剤に対する感受性が増
したコリネ型細菌に属する界面活性剤感受性変異株」と
は、野生型のコリネ型細菌の生育に影響を与えない濃度
の界面活性剤が存在する培地中で、生育が悪くなったコ
リネ型細菌に属する変異株をいう。例えば界面活性剤が
ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノパルミテートの
場合、コリネ型細菌に属する界面活性剤感受性変異株は
0.1〜1mg/dlの濃度の上記界面活性剤が培地中に添加さ
れると、生育が野生株と比較して悪くなる。一方、野生
型のコリネ型細菌は0.1mg/dlの濃度の上記界面活性剤が
添加された培地中でも生育に変化はみられない。このよ
うな界面活性剤感受性変異株を培養し、界面活性剤を添
加してＬ−グルタミン酸を生成する場合において、Ｌ−
グルタミン酸生産に必要とされる界面活性剤の濃度は通
常の場合より低下している。界面活性剤感受性変異株の
細胞の状態は、野生株の細胞が界面活性剤にさらされて
いるときの状態に近いものと思われる。

界面活性剤感受性に関与する遺伝子の取得 コリネ型細菌に属する界面活性剤感受性変異株を取得
するには、特公昭52−24593号公報に記載される方法を
用いることができる。すなわち、コリネ型グルタミン酸
生産菌に、紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、変異誘
起剤処理等の変異誘導処理を施し、親株が生育する量の
界面活性剤を含有する寒天培地上で生育し得ないような
株を取得する。

コリネ型細菌に属する界面活性剤感受性変異株として
は、具体的には、特公昭59−10797号公報に記載された
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11060が
挙げられる。

野生型コリネ型細菌の染色体DNAの各種断片の調製法
は以下の通りである。すなわち、野生型コリネ型細菌を
液体培地に培養し、集めた細胞から斉藤らの方法（H.Sa
ito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta 72,619,（196
3））に従い染色体DNAを回収する。回収した染色体DNA
を制限酵素を用いて切断する。制限酵素として４塩基認
識型の酵素を用いてDNAを不完全分解する条件で反応を
行うことによって多様なDNA断片が調製できる。

前記コリネ型細菌で機能するベクターとは、例えばコ
リネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的
に例示すれば、以下のものがあげられる。

（１）pAM 330 特開昭58−67699号公報参照 （２）pHM 1519 特開昭58−77895号公報参照 （３）pAJ 655 特開昭58−192900号公報参照 （４）pAJ 611 同 上 （５）pAJ 1844 同 上 （６）pCG 1 特開昭57−134500号公報参照 （７）pCG 2 特開昭58−35197号公報参照 （８）pCG 4 特開昭57−183799号公報参照 （９）pCG 11 同 上 コリネ型細菌で機能するベクターと、野生型コリネ型
細菌の染色体DNAの各種断片とを連結して各種組換えDNA
を調製するには、あらかじめ、染色体DNAを切断すると
きに用いる制限酵素と同じ制限酵素、または染色体DNA
の各種断片の末端配列に相補的な末端配列を生じる制限
酵素を用いてベクターを切断する。切断されたベクター
と染色体DNAとの連結は、T4DNAリガーゼ等のリガーゼを
用いて行うのが普通である。

各種組換えDNAをコリネ型細菌に属する界面活性剤感
受性変異株に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ（大腸菌）Ｋ−12について報告されているよう
な、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過
性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol,53,
159（1790））や、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してDNAを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,
G.A.and Young,F.E.,Gene,１,153（1977））を用いるこ
とができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌
類および酵母について知られているような、DNA受容菌
の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラスト
またはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受
容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.G
en.,Genet.,168.111（1979）:Bibb,M.J.,Ward,J.M.and
Hopwood,O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hick
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751929
（1978））も応用できる。

プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスに
おいて使用されている方法でも充分高い頻度を得ること
ができるが、特開昭57−183799号公報に開示されるよう
に、コリネ型細菌細胞のプロトプラストをポリエチレン
グリコールまたはポリビニルアルコールの一方および二
価金属イオンに接触させた状態でDNAをとり込ませる方
法も利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリビ
ニルアルコールの代りに、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストラン、フィコール、ブルロニックF68（セ
ルバ社）などの添加によってもDNAのとり込みを促進さ
せることができる。本発明の実施例で用いた形質転換の
方法は、電気パルス法（特開平２−207791号公報参照）
である。

形質転換株の中から界面活性剤感受性が失われた株を
選択する方法を以下に示す。

コリネ型細菌の野生株の染色体DNAを制限酵素Sau3A I
で部分消化して得られる約４から6Kbpの大きさのDNA断
片を、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方で自立
増殖可能なプラスミドベクターと連結して組換えDNAを
製造し、これをエシェリヒア・コリDH5株等のコンピテ
ントセル（宝酒造（株）製）に導入する。形質転換株を
培養して、コリネ型細菌野生株の遺伝子ライブラリーと
する。

上記遺伝子ライブラリーに含まれる組換えDNAを用
い、界面活性剤感受性変異株AJ11060株を形質転換し、
得られる形質転換体を、一旦、界面活性剤を含まないＭ
−CM2G寒天プレート（グルコース5g,ポリペプトン10g,
酵母エキス10g、NaCl 5g,DL−メチオニン0.2g,寒天15g,
クロラムフェニコール4mgを純水11に含む。pH7.2）に塗
布して約４万コロニーを形成させる。当該コロニーを30
mg/Lの界面活性剤（Tween40）を含むＭ−CM2Gプレート
にレブリカし、界面活性剤含有Ｍ−CM2Gプレート上で良
好な成育を示すものを取得することにより、界面活性剤
感受性を失った株を取得できる。

界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換えDN
Aを回収する方法は、野生型コリネ型細菌の染色体DNAの
調製方法と同じである。すなわち、形質転換株を液体培
地に培養し、集めた細胞から斉藤らの方法（H.Saito an
d K.Miura Bicchem.Biophys.Acta 72,619,（1963））の
方法に従い組換えDNAを回収できる。

ベクターに連結されている野生型コリネ型細菌の染色
体DNA断片の構造解析は、例えば以下のようにして行
う。塩基配列決定の常法であるダイデオキシ法により染
色体DNA断片の全塩基配列を決定し、DNAの構造解析を行
い、エンハンサー、プロモーター、オペレーター、SD配
列、リーダーペプチド、アテニュエーター、開始コド
ン、終始コドン、オープン・リーディング・フレームな
どの存在位置を決定する。

後記実施例３で、上記のようにして得られたコリネ型
細菌由来の界面活性剤耐性に関与する遺伝子の１つを、
dtsＲ遺伝子と命名した。このdtsＲ遺伝子は、配列表の
配列番号１に示される塩基配列の467〜469番目のATGか
ら1985〜1987番目のCTGにいたる配列を少なくとも有す
る。この遺伝子によりコードされ得るアミノ酸配列を、
配列表の配列番号１及び２に示す。前記467〜469番目の
ATGの上流にさらにATG（ヌクレオチド番号359〜361）が
同一フレームで存在し、このATGが開始コドンである可
能性は否定できないが、この遺伝子の上流領域に存在す
るコンセンサス配列の解析から前記467〜469番目のATG
が開始コドンであると推定される。すなわち、dtsＲ遺
伝子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうちアミ
ノ酸番号37〜543からなるアミノ酸配列を有するペプチ
ドをコードしていると推定される。このペプチドをDTSR
蛋白と命名した。本願明細書及び請求の範囲においてDT
SR蛋白のアミノ酸配列及びdtsＲ遺伝子の塩基配列につ
いて言及している場合、これらは467〜469番目のATGを
開始コドンとして記載されていることがあるが、359〜3
61番目のATGが開始コドンである可能性も考慮された
い。例えば、コリネバクテリウム属細菌にdtsＲ遺伝子
を導入してその発現を強化しようとする場合、配列番号
１に示す塩基配列のうちヌクレオチド番号467〜1987か
らなる配列を発現させればよいと考えられるが、ヌクレ
オチド番号359〜466を含めて配列番号１に示す塩基配列
のコード領域及び上流領域をコリネバクテリウム属細菌
に導入すれば、いずれのATGが開始コドンであってもDTS
R蛋白を正しく発現させることができることは当業者に
容易に理解されるであろう。尚、dtsＲ遺伝子が菌体内
で発現する際、開始コドンによってコードされるＮ末端
のMetはアミノペプチダーゼによって切断される場合も
ある。

後記実施例３に示すように、DTSR蛋白のアミノ酸配列
は、すでに報告済みの蛋白質と相同性があることが判明
した。当該蛋白質はProc.Nati.Acad.Sci.USA vol.83（1
986）8049−8053;Proc.Nati.Acad.Sci.USA vol.83（198
6）4864−4868;Gene vol.122（1992）199−202におい
て、プロピオニルコエー（CoA）カルボキシレース（PC
C）蛋白質βサブユニットとして記載されている。尚、
これらの文献のいずれにも当該蛋白質がグルタミン酸生
産性に関与することを示唆する記載はない。

プロピオニルコエー カルボキシレースは、αケトグ
ルタレートを２−ハイドロキシグルタレート、プロピオ
ニルコエー、Ｄ−メチルマロニルコエー、Ｌ−メチルマ
ロニルコエーを経てスクシニルコエーに変換する代謝経
路のうちの１反応を触媒する酵素であり、同代謝経路は
TCAサイクルにおいてαケトグルタレートデヒドロゲネ
ースに触媒される反応をバイパスする経路のようであ
る。また、プロピオニルコエー カルボキシレースはビ
オチンを補酵素とする酵素である。これらのことから、
プロピオニルコエー カルボキシレースが触媒する反
応、さらにはこの反応を含む上記代謝経路又はその一部
が、界面活性剤耐性に関与していることが示唆される。
したがって、界面活性剤耐性に関する遺伝子には、dts
Ｒ遺伝子以外にも、プロピオニルコエー カルボキシレ
ース αサブユニット、あるいは上記代謝経路の各反応
を触媒する他の酵素もしくはそのサブユニットをコード
する遺伝子が含まれる可能性が高い。また、本発明者ら
はDTSRタンパク欠損株が培養にオレイン酸を必要とする
ことを見出しており、ビオチンを補酵素とするアセチル
コエー カルボキシレースがプロピオニルコエー カル
ボキシレースに構造が類似していることから、脂肪酸代
謝経路の各反応を触媒する酵素もしくはそのサブユニッ
トをコードする遺伝子も、界面活性剤耐性に関与してい
る可能性がある。本発明の「ビオチン作用抑制物質に対
して温度感受性を示す変異」には、そのような遺伝子に
おける変異も含まれ得る。

遺伝子置換による変異型dtsR遺伝子導入株の作製 上記のようにして得られたdtsＲ遺伝子遺伝子に代表
される、界面活性剤耐性に関与する遺伝子に変異を生じ
させることによって、界面活性剤に対する温度感受性変
異を付与することもできる。すなわち、取得した遺伝子
に試験管内で変異を導入し、遺伝子産物の機能が温度感
受性になった変異型の遺伝子を作製し、遺伝子相同組換
え法により染色体上に存在する野生型遺伝子を変異型遺
伝子で置換すればよい。相同組換えによる遺伝子置換は
既に確立しており直鎖DNAを用いる方法や温度感受性プ
ラスミドを用いる方法などが利用できる。

dtsＲ遺伝子の変異型遺伝子への改変は、具体的に
は、部位特異的変異法（Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth
ods in Enzymology,154,350（1987））や、次亜硫酸ナ
トリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理
（Shortle,D.and Nathans,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,75,270（1978））によって、dtsＲ遺伝子のコーディ
ング領域又はプロモーター領域の塩基配列の中に１つ又
は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を起
こさせることにより行われる。

部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用い
る方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の
置換、欠失、挿入、付加又は逆位を導入できる手法であ
る。この方法を利用するには、まず、クローン化され、
DNA塩基配列が決定されているdtsＲ遺伝子を持つプラス
ミドを変性させて一本鎖DNAを調製する。次に、変異を
起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを
用いるが、この合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的
な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加又は
逆位を持つようにしておく。前記一本鎖DNAと任意の塩
基置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ合成オリゴヌ
クレオチドをアニールさせ、さらにDNAポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントとT4リガーゼを用いて完全な２
本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリの
コンピテントセルに導入する。このようにして得られた
形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、
付加又は逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持
っている。遺伝子の変異を導入する同様な手法には、リ
コンビナントPCR法（PCR Technology,Stockton press
（1989））がある。

また、化学薬剤処理を用いる方法は、目的の遺伝子を
含むDNA断片を直接次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシア
ミン等で処理することによりDNA断片中にランダムに塩
基の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ変異を導入
する方法である。

このようにして取得した、変異が導入された遺伝子を
コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の染色体上の正常な遺
伝子と置換する方法としては、相同性組換えを利用した
方法（Experiments in Molecular Genetics,Cold Sprin
g Harbor Laboratory press（1972）;Matsuyama,S.and
Mizushima,S.,J.Bacteriol.,162,196（1985））があ
る。相同性組換えは、染色体上の配列と相同性を有する
配列を持つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある
頻度で相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導
入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。こ
の後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換
えを起こすと、プラスミドが染色体上から抜け落ちる
が、この時組換えを起こす位置により変異が導入された
遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子が
プラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることもあ
る。このような菌株を選択することにより、塩基の置
換、欠失、挿入、付加又は逆位を持つ変異が導入された
遺伝子が染色体上の正常な遺伝子と置換された菌株を取
得することができる。

〔３〕グルタミン酸生合成系遺伝子の強化による界面活
性剤温度感受性変異株のＬ−グルタミン酸生産性の向上 Ｌ−グルタミン酸生産菌の界面活性剤温度感受性変異
株において、グルタミン酸生合成系遺伝子の発現を強化
することにより、Ｌ−グルタミン酸生産性を向上させる
ことができる。細胞中で強化されたグルタミン酸生合成
系遺伝子の例としては、解糖系のホスフォフルクトキナ
ーゼ（PFK、特開昭63−102692号）、アナプレロティッ
ク経路のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（PEPC、特開昭60−87788号、特開昭62−55089号）、TC
A回路のクエン酸合成酵素（CS、特開昭62−201585号、
特開昭63−119688号）、アコニット酸ヒドラターゼ（AC
O、特開昭62−294086号）、イソクエン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ICDH、特開昭62−166890号、特開昭63−214189
号）、アミノ化反応を触媒するグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ（GDH、特開昭61−268185号）等がある。

上記の遺伝子を取得するためには以下に示す様な方法
が考えられる。

（１）目的遺伝子に変異が起こり特徴的な形質を示す変
異株であって、目的遺伝子を導入することによりその形
質が消失するような変異株を取得し、その変異株の形質
を相補するような遺伝子をコリネ型細菌の染色体から取
得する方法。

（２）目的遺伝子が他の生物において既に取得され塩基
配列が明らかになっている場合、相同性の高い領域のDN
Aをプローブとしてハイブリダイゼーションの手法によ
り目的の遺伝子を取得する方法。

（３）目的遺伝子の塩基配列がかなり詳細に判明してい
る場合は、目的遺伝子を含む遺伝子断片を、コリネ型細
菌の染色体を鋳型としPCR法（ポリメラーゼ・チェーン
・リアクション法）により取得する方法。

ここで用いる染色体は、前述した斉藤らの方法（H.Sa
ito and K.Miura Biochem.Biophys.Acta 72,619,（196
3））により取得することができる。また、宿主−ベク
ター系としては、コリネ型細菌で利用可能なものであれ
ばよく、上記ですでに述べたものが用いられる。後述の
本発明の実施例においては塩基配列が既に明らかになっ
ている場合に有効である、上記（３）の方法を用いた。

また、上記（２）及び（３）の方法で遺伝子を取得す
る場合、目的遺伝子が独自のプロモーターを持たない場
合には、コリネ型細菌でプロモーター活性を持つDNA断
片を目的遺伝子の上流に挿入することにより目的遺伝子
を発現させることができる。目的遺伝子の発現を強化す
るには、強力なプロモーターの下流に目的遺伝子を連結
することが考えられる。コリネ型細菌の細胞内で機能す
るピロモーターのうち強力なものとしては、エシェリヒ
ア・コリのlacプロモーター、tacプロモーター、trpプ
ロモーター等がある（Y.Morinaga,M.Tsuchiya,K.Miwa a
nd K.Sano,J.Biotech.,5,305−312（1987））。また、
コリネ型細菌のtrpプロモーターも好適なプロモーター
である（特開昭62−195294号公報）。後述の本発明の実
施例においては、PEPC遺伝子の発現にコリネ型細菌のtr
pプロモーターを用いた。

〔４〕Ｌ−グルタミン酸生産菌の界面活性剤温度感受性
変異株によるＬ−グルタミン酸の生産 本発明のＬ−グルタミン酸の製造方法は、上記のよう
にして得られるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の界面
活性剤温度感受性変異株を、液体培地に培養し、培地中
にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これを該培地から
採取することを含むものである。

本発明において上記変異株の培養に用いられる液体培
地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子等を
含有する通常の栄養培地が用いられる。本発明の変異株
は、過剰量のビオチンを含有する液体培地で培養しても
ビオチン作用抑制物質を培地に含有させることなくＬ−
グルタミン酸を生産する能力を有する。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュク
ロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の炭水化物、エタノ
ール、グリセロール等のアルコール類、酢酸等の有機酸
類が使用される。窒素源としては、硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウム、アンモニア、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・
リカー等が使用される。栄養要求性を有する変異株を用
いる場合には、それらの要求物質を標品もしくはそれを
含有する天然物として添加する。

発酵は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気条件
下にて、培養液のpHを５〜９の間に保持しつつ２〜７日
間行う。pHの調節には、尿素、炭酸カルシウム、アンモ
ニアガス、アンモニア水等を用いる。培養温度は24〜37
℃であるが、31.5℃付近で培養を開始し、培養の途中で
33〜40℃、好ましくは37℃付近に温度を上昇させること
によりさらに良好な結果が得られる。すなわち、生育至
適温度付近にて菌を十分増殖させた後、培養途中で温度
を上昇させることにより、ビオチン作用抑制物質を添加
することなく、Ｌ−グルタミン酸の生産が開始され、培
養液中にＬ−グルタミン酸が著量、生成蓄積される。

尚、本発明者らは、DTSRタンパク欠損株が、過剰量の
ビオチンを含有する液体培地で培養してもビオチン作用
抑制物質を培地に含有させることなくＬ−グルタミン酸
を生産する能力を有することを見出している。このDTSR
タンパク欠損株は、培養にオレイン酸を必要とするが、
界面活性剤温度感受性変異株は、通常の温度、すなわち
31.5℃付近で培養する場合にはオレイン酸の添加を必要
としない。

培養液中に生成蓄積したＬ−グルタミン酸を採取する
方法は常法によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂
法、晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グ
ルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させる
か、または中和晶析させればよい。

＜２＞Ｌ−リジン生産性を有する界面活性剤温度感受性
変異株の取得とＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の生産 コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由来する従来公知
のＬ−リジン生産菌も、上記Ｌ−グルタミン酸生産菌と
同様に、10μg/L以上の過剰量のビオチンを含有する培
地に培養した場合、培養の初発または途上で界面活性剤
や抗生物質のようなビオチン作用抑制物質を培地に含有
させないと、培養液中にＬ−リジンのみを生成蓄積しＬ
−グルタミン酸を実質的に生産しない。本発明で使用さ
れる変異株は、過剰量のビオチンを含有する液体培地で
培養してもビオチン作用抑制物質を培地に含有させるこ
となくＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の両方を生産する
能力を有する。このような変異株は、前記Ｌ−グルタミ
ン酸生産菌の界面活性剤温度感受性変異株の性質に加え
て、さらにＬ−リジン生産性を有するものである。すな
わち、本発明の第２の変異株は、コリネ型Ｌ−グルタミ
ン酸生産菌に由来し、Ｌ−リジン生産能を付与する変
異、及びビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異
を有し、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチ
ン作用抑制物質の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタ
ミン酸の両方を生産する能力を有する変異株である。

Ｌ−リジン生産性は、通常、Ｓ−（２−アミノエチ
ル）−Ｌ−システイン（以下、「AEC」と略すことがあ
る）に対する耐性変異により付与することができる（特
公昭48−28078号公報）。その他のＬ−リジン生産性変
異株としては、その生育にＬ−ホモセリン等のアミノ酸
を必要とする変異株（特公昭56−6499号）、AECに耐性
を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロ
リン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ
−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第37
08395号及び第3825472号）、DL−α−アミノ−ε−カプ
ロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラ
ギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロ
イルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキ
ザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸
系酵素阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開
昭50−53588号、特開昭50−31039、特開昭52−102498
号、特開昭53−9394号、特開昭53−86089号、特開昭55
−9783号、特開昭55−9759号、特開昭56−32995号、特
開昭56−39778号、特公昭53−43591号、特公昭53−1833
号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生
産変異株（特開昭55−9784号、特開昭56−8692号）、フ
ルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性
を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55−9783号、特開
昭53−86090号）、エチレングリコールに耐性を示すＬ
−リジン生産変異株（米国特許第4411997号）等が挙げ
られる。

本発明の第２の変異株は、例えば、コリネ型Ｌ−グル
タミン酸生産菌に由来するＬ−リジン生産菌に界面活性
剤や抗生物質のようなビオチン作用抑制物質に対する温
度感受性を付与することにより誘導することができる。

温度感受性の付与は、上記＜１＞に記載した、本発明
の第１の変異株への温度感受性の付与と同様にして行う
ことがでる。すなわち、Ｌ−リジン生産性を有するコリ
ネ型グルタミン酸生産菌に、紫外線照射、Ｘ線照射、放
射線照射、変異誘起剤処理等の変異処理を施し、ビオチ
ン作用抑制物質を含有する寒天平板培地上でのレプリカ
法によりビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を有
する菌株を得ることができる。すなわち、33ないし37
℃、好ましくは34℃以上の培養温度において各濃度のビ
オチン作用抑制物質存在下で親株の生育状態を観察し、
生育が認められるビオチン作用抑制物質の最大濃度を求
め、同温度でこの濃度のビオチン作用抑制物質の存在下
では生育できないか生育速度が著しく低下した変異株を
分離すればよい。また、＜１＞〔２〕に示したように、
遺伝子組換えによりビオチン作用抑制物質に対する温度
感受性変異株を取得してもよい。

また、本発明で使用する第２の変異株は、上記に示し
た方法の他、先にコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌から
ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異株を誘導
した後、該変異菌株にＬ−リジン生産能を付与すること
によっても取得することができる。

以上のようにして、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌
に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性及びＬ−
リジン生産能を付与することにより、過剰量のビオチン
を含有する培地中にビオチン作用抑制物質の非存在下に
てＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の両方を生産する能力
を有する変異株を育種することができる。

さらに、＜１＞〔３〕に記載したように、本発明の第
２の変異株において、上記したようにグルタミン酸生合
成系遺伝子を強化することによって、Ｌ−グルタミン酸
の生産性を向上させることができる。また同様に、リジ
ン生合成系遺伝子を強化することによって、Ｌ−リジン
生産性を向上させることができる。

細胞中で強化されたリジン生合成系遺伝子の例として
は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィ
ードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナー
ゼαサブユニット蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコ
ードする遺伝子（WO94/25605国際公開パンフレット）、
コリネホルム細菌由来の野生型ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子（特開昭60−87788号公
報）、コリネホルム細菌由来の野生型ジヒドロジピコリ
ン酸合成酵素をコードする遺伝子（特公平６−55149号
公報）等が知られている。

本発明の第２の変異株の培養に用いられる液体培地と
しては、前記第１の変異株の培養に用いられるのと同様
の炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子等を含有する通
常の栄養培地が用いられる。本発明の第２の変異株は、
過剰量のビオチンを含有する液体培地で培養してもビオ
チン作用抑制物質を培地に含有させることなくＬ−リジ
ン及びＬ−グルタミン酸を生産する能力を有する。

発酵は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気条件
下にて、培養液のpHを５〜９の間に保持しつつ２〜７日
間行う。pHの調節には、尿素、炭酸カルシウム、アンモ
ニアガス、アンモニア水等を用いる。培養温度は24〜37
℃であるが、31.5℃付近で培養を開始し、培養の途中で
33〜40℃、好ましくは34℃付近に温度を上昇させること
によりさらに良好な結果が得られる。すなわち、31.5℃
付近では種としてＬ−リジンを生成するが、培養途中で
温度を上昇させることによりＬ−グルタミン酸の生成さ
れる割合が増加する。これを利用して最終的に得られる
培養液中のＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の比率を望ま
しいものに制御することができる。

培養液中に生成蓄積したＬ−リジンとＬ−グルタミン
酸を採取する方法は常法でよく、例えばイオン交換樹脂
法、晶析法等によることができる。イオン交換樹脂法で
は、培養液からまず陽イオン交換樹脂によりＬ−リジン
を吸着、分離させ、ついでＬ−グルタミン酸は陰イオン
交換樹脂により吸着、分離させるかまたは中和晶析させ
る。Ｌ−リジンとＬ−グルタミン酸を混合物として用い
る場合にはもちろんこれらのアミノ酸を相互に分離する
ことは不要である。

図面の簡単な説明 図１は、31.5℃及び35℃においてPESPがブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ13029とその親株ATCC1
3869の生育に影響を及ぼす影響を示す図。

図２は、dtsＲ遺伝子を含むプラスミドを導入したブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11060の界
面活性剤に対する耐性を示す図。

図３は、31.5℃と34℃においてPESPがブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム AJ12993の生育に及ぼす
影響を示す図。

発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明す
る。

実施例１ コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌のビオチン
作用抑制物質に対する温度感受性変異株の取得 1.L−グルタミン酸生産菌のビオチン作用抑制物質に対
する感受性のレプリカ法により測定 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869のポリオキシエチレン・ソルビタン・モノパルミテ
ート（PESP）に対する感受性を以下のようにレプリカ法
により測定した。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869を表１に示す組成のCM2B寒天平板培地上で31.5℃で
一晩培養して菌体を得た。これを滅菌した生理食塩水に
懸濁し、同寒天平板培地に播種し、31.5℃にて20〜30時
間培養してコロニーを形成させた。これを各濃度のPESP
を添加したCM2B寒天培地にレプリカし、35℃にて20〜30
時間培養し、生育状態を観察した。

この結果、表２に示す通り、35℃においてPESP濃度が
3mg/dl近辺に生育可能な濃度の閾値があることが確認さ
れた。

2.ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を示す変異
株の誘導 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869をブイヨン寒天培地上にて31.5℃、24時間培養して
菌体を得た。得られた菌体を250μg/mlのＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの水溶液で30
℃、30分間処理した後、生存率１％の当該菌体の懸濁液
をCM2B寒天平板培地に播種し、31.5℃、20〜30時間培養
しコロニーを形成させた。これをCM2B寒天培地及び3mg/
dlのPESPを添加したCM2B寒天培地にそれぞれレプリカ
し、35℃、20〜30時間培養し、CM2B培地上では生育する
が3mg/dlのPESPを含むCM2B培地上では生育が認められな
かった菌株を採取した。かくして約10,000個のコロニー
から720株を得た。得られた各菌株について、3mg/dlのP
ESPを含むCM2B寒天平板培地での35℃における生育の有
無を再確認し、明らかに感受性が見られない株を除外し
て感受性を示す株435株を得た。

3.ビオチン作用抑制物質に対して温度感受性を示す変異
株によるＬ−グルタミン酸の生産能の確認 上記項目2.で得られた435株の変異株及びその親株で
あるATCC13869株について、Ｌ−グルタミン酸の生産能
を以下のようにして確認した。

ATCC13869株及び各変異株をそれぞれCM2B寒天培地上
にて31.5℃、20〜30時間培養して得た菌体を表３のＡ培
地に示す組成の液体培地に接種し、31.5℃で振とう培養
を開始した。約22時間後、最終濃度が表３のＢ培地に示
す濃度になるように新たに培地を添加し、31.5℃で、又
は培養温度を35℃または37℃にシフトさせ、その後約24
時間培養を行った。培養終了後、旭化成社製バイオテッ
クアナライザーを用いてＬ−グルタミン酸の生成の有無
を調べた。その結果、435株の変異株のうち106株がグル
タミン酸を生成していることが確認された。

これらの変異株の代表株及びATCC13869株の各温度で
のＬ−グルタミン酸の蓄積量を表４に示す。

4.ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性の確認 前記項目3.により得られた変異株のPESPに対する温度
感受性を液体培養により以下のようにして確認した。

各変異株及びその親株をCM2B寒天平板培地上にて31.5
℃、24時間培養して菌体を得た。得られた菌体をCM2B液
体培地及び3mg/dl濃度のPESPを含むCM2B液体培地に接種
し、31.5℃及び37℃にて24時間振とう培養した。得られ
た培養液の660nmにおける濁度を測定し、各温度でPESP
を添加しない培地での生育を100とした時のPESP添加培
地での相対生育度を求めた。結果を表５に示す。

この表に示された通り、親株であるブレバクテリウム
・ラクトファーメンタム ATCC13869は、37℃において3
mg/dlのPESP存在下での相対生育度は85であったのに対
し、各変異株はいずれもPESP存在下での相対生育度が40
以下であり、明らかに3mg/dl濃度のPESPに対して感受性
を有していた。

上記項目3.で得られた変異株のうちNo.21とその親株A
TCC13869について、31.5℃及び35℃における各濃度のPE
SP存在下での相対生育度を図１に示す。

なお、変異株のうちNo.21はブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタム AJ13029と命名され、平成６年９
月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受
託番号FERM P−14501として寄託され、1995年８月１日
にブダペプト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番
号FERM BP−5189が付与されている。

実施例２ Ｌ−グルタミン酸の製造 1.培養温度シフト時期の検討 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869またはAJ13029を表６に示す組成の種培養培地に接種
し、31.5℃で24時間振とう培養して種培養を得た。表６
に示す組成の本培養培地を500ml容ガラス製ジャーファ
ーメンターに30mlずつ分注し加熱殺菌した後、上記種培
養を40ml接種した。撹拌速度を800〜1300rpm、通気量を
1/2〜1/1vvmとし、培養温度31.5℃にて培養を開始し
た。培養液のpHはアンモニアガスで7.5に維持した。培
養を開始してから８、12または16時間後に培養温度を37
℃にシフトした。培養温度のシフトを行わず、31.5℃の
まま培養を継続した場合を比較対象とした。

いずれも20〜40時間でグルコースが完全に消費された
時点で培養を終了し、培養液中に生成蓄積されたＬ−グ
ルタミン酸の量を測定した。結果を表７に示す。

この結果から、AJ13029株は31.5℃から37℃へ培養温
度をシフトさせることにより過剰量のビオチンを含有す
る培地においてもビオチン作用抑制物質の非存在下にて
Ｌ−グルタミン酸を生産すること、培養温度シフトの時
期が早い程Ｌ−グルタミン酸の生成量が大きくなること
がわかる。これに対し、親株であるATCC13869は培養温
度をシフトさせても、Ｌ−グルタミン酸の生成はほとん
ど認められかなった。

培養を開始してから８時間後に温度シフトを行った培
養の培養終了液1Lから、遠心分離により菌体を除去し、
得られ上清液からイオン交換樹脂を用いる常法に従って
Ｌ−グルタミン酸を分離し精製した。得られたＬ−グル
タミン酸ナトリウムの結晶は64.3gであった。

2.シフト温度の検討 500ml容ガラス製ジャーファーメンターを用いて上記
1.と同様に31.5℃にてブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ATCC13869びAJ13029の培養を開始した。培
養開始してから８時間後に培養温度を34℃、37℃または
39℃にシフトした。培養温度のシフトを行わず、31.5℃
のまま培養を継続した場合を比較とした。いずれも20〜
40時間でグルコースが完全に消費された時点で培養を終
了し、培養液注に生成蓄積されたＬ−グルタミン酸の量
を測定した。結果を表８に示す。

この結果から、AJ13029株を培養し培養温度をシフト
する際、シフト後の温度が高い程Ｌ−グルタミン酸の生
成量が大きくなる傾向があることがわかる。

実施例３ 遺伝子組換えによるコリネ型Ｌ−グルタミン
酸生産菌のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変
異株の取得 1.ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869（コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌の野生株）の染
色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869をＴ−Ｙ培地（Bacto−tryptone（Difco）１％、Bac
to−yeast extract（Difco）0.5％、NaCl 0.5％（pH7.
2））100mlに接種し、温度31.5℃で８時間培養し、培養
物を得た。この培養物を3,000r.p.mで15分間、遠心分離
処理し湿潤菌体0.5gを得た後、該菌体から斎藤、三浦の
方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619（1963））により
染色体DNAを得た。次いで、この染色体DNA 60μｇ及び
制限酵素Sau3A I、３ユニットを10mMトリス−塩酸緩衝
液（50mM NaCl、10mM MgSO₄及び1mM ジチオスレイトー
ル含有（pH7.4））におのおの混合し、温度37℃で30分
間反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽
出処理し、エタノール沈澱処理してSau3A Iで消化され
たブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869の染色体DNA断片50μｇを得た。

2.プラスミドベクターDNAを利用したブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム ATCC13869の遺伝子ライブ
ラリーの作製 エシェリヒア・コリとコリネバクテリウム属細菌の双
方の細胞に導入可能な遺伝子ライブラリーを調製するた
めに、双方の細胞内で自律複製可能なプラスミドを調製
した。具体的には、既に取得されているコリネ型細菌で
自律複製可能なプラスミドpHM1519（Agric.Biol.Chem,4
8,2901−2903（1984））由来の複製起点を持つプラスミ
ドpHK4（特開平５−7491号）を制限酵素BamH I及びKpn
Iで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得ら
れた断片をDNA平滑末端化キット（宝酒造（株）製、Blu
nting kit）を用い平滑末端化した後、Salリンカー（宝
酒造（株）製）を用い、プラスミドクターpHSG399（宝
酒造（株）製）のSal I部位に挿入し、pSAC4を作製し
た。尚、pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB101は、
エシェリヒア・コリ AJ13136と命名され、1995年８月
１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号FERM BP−5186として寄託されている。

上記のようにして作製されたpSAC 20μｇ及び制限酵
素BamH I200ユニットを50mMトリス−塩酸緩衝液（100mM
NaCl及び10mM硫酸マグネシウム含有（pH7.4））に混合
し、温度37℃で２時間反応させて消化液を得、該液を常
法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理した。
この後、プラスミドベクター由来のDNAフラグメントが
再結合することを防止するため、Molecular Cloning 2n
d editon（J.Sambrook,E.F.Fritsch and T.Maniatis,Co
ld Spring Harbor Laboratory Press,pl.56（1989））
の方法でバクテリアルカルカリホスファターゼ（Bacter
ial Alkaline Phosphatase）処理により、DNA断片の脱
リン酸化を行い、常法によりフェノール抽出処理し、更
にエタノール沈澱処理を行った。

このBamH Iで消化されたpSAC4を１μｇ、項目1.で得
られたSau3A Iで消化されたブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ATCC13869の染色体DNA断片を１μ
ｇ、及び２ユニットのT4DNAリガーゼ（宝酒造（株）
製）を、66mM塩化マグネシウム、10mMジチオスレイトー
ル及び10mM ATPを含有する66mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）に添加し、温度16℃で16時間反応し、DNAを連結さ
せた。次いで該DNA混合物で、常法によりエシェリヒア
・コリ DH5を形質転換し、これを170μg/mlのクロラム
フェニコールを含むＬ寒天培地上にまき、約20,000個の
コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。

3.ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11060
の形質転換 上述で述べた約20,000個のコロニーより、組換えDNA
の回収を行なった。回収の方法は上記に示した斎藤、三
浦の方法に従った。

50のバッチに分けた組換えDNA混合物を電気パルス法
を用いた形質転換の常法（特開平２−207791号公報）に
従い、界面活性剤に対する感受性が上昇した変異株AJ11
060株に導入した。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ
培地上に接種し、31.5℃で静置培養を行ない、約20,000
個の形質転換体を出現させた。次にこれらの形質転換体
を界面活性剤30mg/lを含む同プレートにレプリカし、こ
の中で界面活性剤に対して耐性を示し上記プレート上で
生育可能であった株を数株得た。

4.dtsR遺伝子を多コピーで保持する株の界面活性剤に対
する耐性の検定 生育した数株からそれぞれ組変えDNAを抽出し、同DNA
を用いてAJ11060株を再形質転換した。ここでも界面活
性剤に対して耐性を示した株を得た。この株が保持して
いた組変えDNAをpDTR6と命名し、それらのプラスミドが
運ぶ界面活性剤に耐性を与える遺伝子をdtsＲ遺伝子と
命名した。このプラスミドを導入したAJ11060菌は、3g/
Lの界面活性剤を添加した液体培地（グルコース80g、KH
₂PO₄ 1g、MgSO₄・7H₂O 0.4g、（NH₄）₂SO₄ 30g、FeSO₄
・7H₂O 0.1g、MnSO₄・7H₂O 0.01g、大豆加水分解液15m
l、サイアミン塩酸塩200μｇ、ビオチン300μｇ、クロ
ラムフェニコール4mg、ポリオキシエチレンソルビタン
モノパルミテート3.0g及びCaCO₃50gを純水1L中に含む培
地（KOHを用いてpHは8.0に調整されている））での生育
阻害が抑制されている（図２）。

5.プラスミドDNAの調製 上記で得られた組換えDNAを含有するAJ11060/pDTR6か
ら常法に従いプラスミドを調製し、エシェリヒア・コリ
JM109に導入した。得られたエシェリヒア・コリJM109/p
DTR6をトリプトン１％、酵母エキス0.5％NaCl0.5％から
なる培地20mlに温度37℃で24時間前培養し、得られた培
養液20mlを上記と同じ組成の培地1lに接種し、温度37℃
で３時間培養したのち、0.2gのクロラムフェニコールを
添加し、更に同一温度で20時間培養を行い、培養液を得
た。次いで、この培養液を3,000r.p.m.で10分間遠心処
理して湿潤菌体2gを得、これを20mlの25％ショ糖を含有
する350mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）に懸濁したの
ち、更にこれにリゾチーム（シグマ社製）10mg、0.25M
EDTA溶液（pH8.0）8ml及び20％ドデシル硫酸ナトリウム
溶液8mlを各々添加し、温度60℃で30分間保温処理し、
溶菌液を得た。この溶菌液に、5M NaCl溶液13mlを添加
し、温度４℃で16時間処理した後、15,000r.p.m.で30分
間遠心分離した。得られた上清液を、常法によりフェノ
ール抽出処理及びエタノール沈澱処理を行いDNAを沈澱
させた。

この沈澱物を減圧乾燥処理した後、1mM EDTAを含有す
る10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）6mlに溶解し、さら
にこれに塩化セシウム6g及びエチジウムブロマイド（19
mg/ml）0.2mlを添加し、39,000r.p.m.で42時間超遠心分
離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、DNAを
単離した。又更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウ
ムブロマイドを除去した後、1mM EDTAを含有する10mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.5）に対して透析を行い純化さ
れた組換えDNA pDTR6を約500μｇを得た。なお、エシェ
リヒア・コリ JM09/pDTR6には、プアイベートナンバー
AJ12967が付与されている。同株は1994年２月22日に通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号
FERM P−14168として寄託され、1995年２月９日にブダ
ペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM
BP−4994が付与されている。

6.dtsR遺伝子を含有するDNAの塩基配列の解析 項目5.で得られた組換えDNAを用い塩基配列の決定を
行った。塩基配列の決定は、Taq DyeDeoxy Terminator
Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオケミカル社
製）を用いSangerの方法に従って行った。得られたdts
Ｒ遺伝子を含むDNAの塩基配列は配列表の配列番号１に
示す通りである。この配列中に存在する最も長いオープ
ン・リーディング・フレームは、配列番号１に示す塩基
配列のうち359番目のＡから1987番目のＧまでの塩基配
列であったが、この遺伝子の上流領域に存在するコンセ
ンサス配列の解析から467〜469番目のATGが開始コドン
であると推定された。359番目のＡから1987番目のＧま
でのオープン・リーディング・フレームによりコードさ
れ得るアミノ酸配列を塩基配列とともに配列表配列番号
１に示した。さらに、アミノ酸配列のみを配列表配列番
号２に示す。467〜1987番目の塩基配列によりコードさ
れる蛋白質をDTSR蛋白とした。

蛋白質のＮ末端にあるメチオニン残基は翻訳後ペプチ
ダーゼの働きにより除去されることがよく知られてい
る。これは、Ｎ末端のメチオニンは翻訳開始コドンであ
るATGに由来するため、蛋白質本来の機能とは無関係で
あることが多いためである。本願発明のDTSR蛋白の場合
にもメチオニン残基の除去が生じている可能性がある。

塩基配列、アミノ酸配列おのおのについて既知の配列
との相同性比較を行った。用いたデータベースはEMBL及
びSWISS−PROTである。その結果、配列表配列番号１に
示される遺伝子及びそれにコードされる蛋白質は新規で
あることが確認された。ただし、すべてに報告済みの蛋
白質と相同性があることが判明した。当該蛋白質はPro
c.Nati.Acad.Sci.USA vol.83（1986）8049−8053;Proc.
Nati.Acad.Sci.USAV vol.83（1986）4864−4868;Gene v
ol.122（1992）199−202において、プロピオニルコエー
（CoA）カルボキシレース（PCC）蛋白質βサブユニット
として記載されている。

7.変異型dtsR遺伝子の取得 温度感受性変異型DTSR蛋白をコードするdtsＲ遺伝子
を、以下の方法で取得した。pDTR6プラスミドを、文献S
hortle,D.and Nathans,D.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,
75,270（1978）に記載の方法に従い、試験管内でヒドロ
キシルアミン処理し、これをAJ11060に上記の電気パル
ス法を用いて導入した。形質転換体約20000株をＭ−CM2
G寒天培地に25℃にて30時間培養しコロニーを形成させ
た。これを30mg/lの界面活性剤を含む同プレート培地に
２枚ずつレプリカし31.5℃および35℃において20時間培
養した。その後、31.5℃では生育するが35℃では生育し
なかった株を２株取得した。この２株から常法によりプ
ラスミドを抽出し、pDTR6−11、pDTR6−77を取得した。

8.遺伝子置換による変異型dtsR遺伝子導入株の作製 変異型dtsＲ遺伝子置換株は、特開平５−7491号に示
される温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法によ
り取得した。具体的には上記のpDTR6−11およびpDTR6−
77をXba I及びKpn Iにより消化してdtsＲ遺伝子を含む
断片を取得し、pHSG398（宝酒造（株）製）をXba Iおよ
びKpn I切断処理したものと、上記の方法で結合させ、
それぞれpHSGX−Ｋ−11およびpHSGX−Ｋ−77を取得し
た。

次に、コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミドから
取得した自己複製能が温度感受性になった変異型の複製
起点を持つプラスミドpHSC4（特開平５−7491号）を制
限酵素BamH I及びKpn Iで消化し、複製起点を含む遺伝
子断片を取得し、得られたDNA断片をDNA平滑末端化キッ
ト（宝酒造（株）製、Blunting kit）を用いて平滑末端
化した後、Kpn Iリンカー（宝酒造（株）製）を用い
て、pHSGX−Ｋ−11およびpHSGX−Ｋ−77のKpn I認識部
位に導入し、プラスミドpKTCX−Ｋ−11およびpKTCX−Ｋ
−77を作製した。尚、pHSC4を保持するエシェリヒア・
コリ AJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P−11763
として寄託され、1991年８月26日にブダペスト条約に基
づく国際寄託に移管され、FERM BP−3524の受託番号で
寄託されている。

この２つのプラスミドを、各々ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタムATCC13869に電気パルス法を用い
て導入し、特開平５−7491号に記載の方法で染色体上の
dtsＲ遺伝子を変異型に置換した。具体的には、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869/pKTCX
−Ｋ−11およびATCC13869/pKTCX−Ｋ−77をＭ−CM2G液
体培地で25℃にて６時間振とう培養した後、５μg/mlの
クロラムフェニコールを含むＭ−CM2G培地上に撒き、34
℃でコロニーを形成した株をプラスミド組み込み株とし
て取得した。次にこの株から34℃でクロラムフェニコー
ルに対して感受性になった株をレプリカ法により取得し
た。この感受性株から34℃において界面活性剤に対する
耐性を失った株としてNo.11株およびNo.77株を取得し
た。これらの株は染色体上のdtsＲ遺伝子が変異型に置
換されている。プラスミドpHSGX−Ｋ−11を鋳型とし、N
o.11株の変異型dtsＲ遺伝子を含む領域をPCR法により増
幅して得たDNA断片を、プラスミドpHSG299（宝酒造
（株）製）のHinc II認識部位に挿入してプラスミドpHS
GDTSR11を作製した。プラスミドpHSGDTSR11を導入した
エシェリヒア・コリJM109は、AJ13137と命名され、1995
年８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号FERM BP−5187として寄託されてい
る。No.11株の変異型dtsＲ遺伝子は、プラスミドpHSGDT
SR11を制限酵素Sph I及びKpn Iで消化することにより得
ることができる。

9.No.11株およびNo.77株のＬ−グルタミン酸生産性 上記項目8.で取得したNo.11株およびNo.77株につい
て、実施例２と同様にしてＬ−グルタミン酸の生産性を
評価した。具体的には、実施例２と同様の培地を用い、
培養８時間目に37℃に培養温度をシフトした。その結
果、表９に示すように変異型遺伝子を持つ株のＬ−グル
タミン酸収率は上昇していた。

実施例４ Ｌ−グルタミン酸生産菌の界面活性剤温度感
受性変異株におけるグルタミン酸生合成系遺伝子の強化 1.gdh、gltA及びicd遺伝子のクローニング ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのgdh
（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）、gltA（クエ
ン酸合成酵素遺伝子）及びicd（イソクエン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子）をPCR法でクローニングした。PCR法に
用いるプライマーは、既に報告されているコリネバクテ
リウム・グルタミカムのgdh遺伝子（Molecular Microbi
ology,6（３）,317−326（1992））、gltA遺伝子（Micl
obiology,140,1817−1828（1994））及びicd遺伝子（J.
Bacteriol.（1995）,177,774−782）の配列をもとに合
成した。gdh遺伝子の増幅用のプライマーとしては、配
列表配列番号３（５′側）と配列番号４（３′側）に示
すオリゴヌクレオチド、gltA遺伝子増幅用プライマーと
しては、配列番号５（５′側）と配列番号６（３′側）
に示すオリゴヌクレオチド、icd遺伝子増幅用プライマ
ーとしては、配列番号７（５′側）と配列番号８（３′
側）に示すオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成し使用し
た。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869から実施例３の方法により染色体DNAを調製し、これ
を鋳型とし上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いPCRを行った。得られた増幅産物の両末端を市販のD
NA末端平滑化キット（宝酒造（株）製、Blunting kit）
を用い平滑末端化した後、ベクタープラスミドpHSG399
（宝酒造（株）製）のSma I部位にそれぞれクローニン
グし、プラスミドpHSG−gdh、pHSG−gltA及びpHSG−icd
を得た。

2.ppc遺伝子のクローニング 実施例３の方法によりブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム ATCC13869の染色体DNAを調製し、これを
鋳型としてPEPC（ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ）をコードするppc遺伝子を含む約3.4KbpのDNA断
片をPCR法を用いて取得した。PCR法に用いるプライマー
は、既に報告されているコリネバクテリウム・グルタミ
カムのppc遺伝子の配列（Gene,77,237−251（1989））
をもとに合成し、PCR反応は上記と同様にして行った。
プライマーの配列を配列番号９（５′側）と配列番号10
（３′側）に示す。

PCR反応の増幅産物を制限酵素Sal I（宝酒造（株）
製）を用いて消化し、プラスミドpHSG399のSal I部位に
挿入したプラスミドpHSG−ppc′を取得した。pHSG−pp
c′のppc遺伝子はpHSG399のlacプロモーターと逆向きに
挿入されている。

次に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムで
機能するプローモーターとして知られているトリプトフ
ァンオペロンのプロモーター（Gene,53,191−200（198
7））をpHSG−ppc′上のppc遺伝子の上流に挿入した。
このプロモーターは配列表配列番号11に示す塩基からな
る配列で活性を示すことが知られている。このプロモー
ター活性を持つ51塩基対を含み、かつ両端が制限酵素Kp
n I及びXba Iによる切断断片と一致するような２本鎖DN
Aが得られる様に、配列番号11に示す配列を持つヌクレ
オチド鎖及びこれの相補鎖となる配列番号12の配列を持
つヌクレオチド鎖を合成した。

合成した両DNAを約10pmol/μｌずつの濃度になるよう
に混合し、100℃、10分加熱した後、室温で放冷しアニ
ーリングさせた。pHSG−ppc′を制限酵素Kpn I及びXba
I（宝酒造（株）製）により消化し、上記のプロモータ
ーと結合させた。結合反応は宝酒造（株）製ライゲーシ
ョンキットを用いて行った。これにより、ppc遺伝子の
上流にトリプトファンオペロンのプロモーターが１コピ
ー挿入されたプラスミドpHSG−ppcを得た。

3.gdh、gltA及びicdの３種類の遺伝子を組み込んだプラ
スミドの作製 gdh、gltA及びicdの３種類の遺伝子を連結したプラス
ミドを作製した。具体的には、プラスミドpHSG−gdhを
制限酵素EcoR Iで消化し、市販のDNA末端平滑化キット
（宝酒造（株）製、Blunting kit）を用い平滑末端化し
たものに上記の両末端を平滑末端化したgltA遺伝子のPC
R増幅産物を連結し、プラスミドpHSG−gdh＋gltAを取得
した。更に、プラスミドpHSG−gdh＋gltAを制限酵素Kpn
Iで消化し、同様にて平滑末端化したものに上記の両末
端を平滑末端化したicd遺伝子のPCR増幅産物を連結し、
プラスミドpHSG−gdh＋gltA＋icdを取得した。

4.gdh、gltA及びppcの３種類の遺伝子を組み込んだプラ
スミドの作製 gdh、gltA及びppcの３種類の遺伝子を連結したプラス
ミドを作製した。具体的にはプラスミドpHSG−gdh＋glt
Aを制限酵素Kpn Iで消化し、プラスミドpHSG−ppcを制
限酵素Kpn I及びSal Iで消化し、上流にトリプトファン
オペロンのプロモーターを持つppc遺伝子断片を取得
し、得られた断片をDNA平滑末端化キット（宝酒造
（株）製、Blunting kit）を用い平滑末端化した後、Kp
n Iリンカー（宝酒造（株）製）を用いてプラスミドpHS
G−gdh＋gltAのKpn I部位に挿入し、プラスミドpHSG−g
dh＋gltA＋ppcを取得した。

5.上記プラスミドへのコリネ型細菌での複製起点の導入 pHSG−gdh、pHSG−gltA、pHSG−ppc、pHSG−icd、pHS
G−gdh＋gltA＋icd及びpHSG−gdh＋gltA＋ppcをコリネ
型細菌細胞内で自律複製可能にするために、既に取得さ
れているコリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドpHM1
519（Agric.Biol.Chem.,48,2901−2903（1984））由来
の複製起点を、pHSG−gdh、pHSG−gltA、pHSG−ppc、pH
SG−icd、pHSG−gdh＋gltA＋icd及びpHSG−gdh＋gltA＋
ppcに導入した。

具体的には、pHM1519由来の複製起点を持つプラスミ
ドpHK4（特開平５−7491号）を制限酵素BamH I及びKpn
Iで消化し、複製起点を含む遺伝子断片を取得し、得ら
れた断片をDNA平滑末端化キット（宝酒造（株）製、Blu
nting kit）を用い平滑末端化した後、Kpn Iリンカー
（宝酒造（株）製）を用いてpHSG−gdh、pHSG−gltA、p
HSG−ppc及びpHSG−icdのKpn I部位にそれぞれ挿入し、
pGDH、pGLTA、pPPC及びpICDを取得した。また、pHSG−g
dh＋gltA＋icd及びpHSG−gdh＋gltA＋ppcには、そのSal
I部位に同様にSal Iリンカー（宝酒造（株）製）を用
い、pHM1519由来の複製起点をそれぞれ挿入し、pGDH＋G
LTA＋ICD及びpGDH＋GLTA＋PPCを取得した。

6.pGDH、pGLTA、pPPC、pICD、pGDH＋GLTA＋ICD及びpGDH
＋GLTA＋PPC上に含まれる各遺伝子の発現の確認 pGDH、pGLTA、pPPC、pICD、pCDH＋GLTA＋ICD及びpGDH
＋GLTA＋PPC上の各遺伝子がブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムの細胞内で発現し、これらのプラスミ
ドが遺伝子増幅の機能を果たしていることの確認を行っ
た。

具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム ATCC13869に、電気パルス法（特開平２−207791
号）によりそれぞれのプラスミドを導入した。得られた
形質転換体は４μg/mlのクロラムフェニルアルコールを
含むCM2Gプレート培地（ポリペプトン10g、酵母エキス1
0g、グルコース5g、NaCl 5g及び寒天15gを純水1Lに含
む。pH7.2）にて選択した。得られた形質転換体をCM2G
寒天培地上にて培養し、グルコース80g、KH₂PO₄ 1g、Mg
SO₄・7H₂O 0.4g、（NH₄）₂SO₄ 30g、FeSO₄・7H₂O 0.01
g、MnSO₄・7H₂O 0.01g、大豆加水分解液15ml、サイアミ
ン塩酸塩200μｇ、ビオチン300μｇ及びCaCO₃50gを純水
1L中に含む培地（KOHを用いてpHは8.0に調整されてい
る）に接種し、31.5℃にて16時間培養した。該培養液を
常法に従って遠心分離し、菌体を集めた。

この菌体を破砕して得た粗抽出液を用いて、ATCC1386
9/pGDH、ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD及びATCC13869/pGD
H＋GLTA＋PPCのGDH（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）
活性を、Molecular Microbiology,6（３）,317−326（1
992）記載の方法に従い測定したところ、これらの形質
転換体では、各々、対象のATCC13869/pSAC4に比べて約1
3倍のGDH活性を有することが分かった（表10）。

また、ATCC13869/pGLTA及びATCC13869/pGDH＋GLTA＋I
CD及びATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPCのCS（クエン酸合成
酵素）活性は、Miclobiology,140,1817−1828（1994）
に、ATCC13869/pICD及びATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICDのI
CDH（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ）活性は、J.Bacte
riol.,177,774−782（1995）に、ATCC13869/pPPC及びAT
CC13869/pGH＋GLTA＋PPCのPEPC活性は、Gene,77,237−2
51（1989）に記載された方法に従って、各々測定した。
測定結果を表11〜13に示す。いずれの形質転換体も目的
の酵素について、対照のATCC13869/pSAC4に比べて約２
〜20倍の活性を有することが分かった。このことから、
pGDH、pGLTA、pPPC、pICD、pGDH＋GLTA＋ICD及びpGDH＋
GLTA＋PPC上の各遺伝子はブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム細胞内で発現しその機能を果たしている
ことが確認された。

7.AJ13029株と、gdh、gltA、ppc及びicd遺伝子を増幅し
たAJ13029株のＬ−グルタミン酸生産 グルコース60g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄・7H₂O 0.4g、（NH
₄）₂SO₄ 30g、FeSO₄・7H₂O 0.01g、MnSO₄・7H₂O 0.01
g、大豆加水分解液15ml、サイアミン塩酸塩200μｇ及び
ビオチン450μｇを純水1L中に含む培地300mlを1l容ジャ
ーファーメンターに入れ加熱殺菌した。これにCM2G寒天
培地上にて培養して得た各菌株の菌体を接種し、31.5℃
にて、pHをアンモニアガスで7.0に制御しながら30時間
培養した。

培養後の菌体濃度、及び培地中に蓄積されたＬ−グル
タミン酸の量を上記と同様に測定した。結果を表14に示
す。

実施例５ Ｌ−リジン生産性を有するコリネ型Ｌ−グル
タミン酸生産菌のビオチン作用抑制物質に対する温度感
受性変異株の取得 1.L−リジン生産菌のビオチン作用抑制物質に対する感
受性のレプリカ法による測定 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13
869より変異誘導されたAEC耐性のＬ−リジン生産菌、ブ
レビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ11446
（特公昭62−24073号公報）のポリオキシエチレン・ソ
ルビタン・モノパルミテート（PESP）に対する感受性を
以下のようにレプリカ法により測定した。

ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ1144
6を表15に示す組成のMCM2G寒天平板培地上で31.5℃で一
晩培養して菌体を得た。これを滅菌した生理食塩水に懸
濁し、同寒天平板培地に播種し、31.5℃にて20〜30時間
培養してコロニーを形成させた。これを各濃度のPESPを
添加したMCM2G寒天培地にレプリカし、34℃にて20〜30
時間培養し、生育状態を観察した。

この結果、表16に示す通り、この条件下においてPESP
濃度が3mg/dl近辺に生育の閾値があることが確認され
た。

2.ビオチン作用抑制物質に対して温度感受性を示す変異
株の誘導 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ1144
6をブイヨン寒天培地上にて31.5℃、24時間培養して菌
体を得た。得られた菌体を250μg/mlのＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの水溶液で30
℃、30分間処理した後、生存率１％の当該菌体の懸濁液
をMCM2G寒天平板培地に播種し、31.5℃、20〜30時間培
養しコロニーを形成させた。これをMCM2G寒天培地及び3
mg/dlのPESPを添加したMCM2G寒天培地にそれぞれレプリ
カし、34℃、20〜30時間培養し、MCM2G培地上では生育
するが3mg/dlのPESPを含むMCM2G培地上では生育が認め
られなかった菌体株を採取した。かくして約10,000個の
コロニーから250株を得た。得られた各菌株について、3
m/dlのPESPを含むMCM2G寒天平板培地での34℃における
生育の再確認し、明らかに感受性が見られない株を除外
して温度感受性を示す株166株を得た。

3.ビオチン作用抑制物質に対して温度感受性を示す変異
株によるＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の同時生産能の
確認 上記項目2.で得られた166株の変異株及びその親株で
あるAJ11446株について、Ｌ−リジンとＬ−グルタミン
酸の生産能を以下のようにして確認した。

AJ11446株及び各変異株をそれぞれMCM2G寒天培地上に
て31.5℃、20〜30時間培養して得た菌体を表17に示す組
成の液体培地に接種し、31.5℃で振とう培養を開始し
た。16時間後、培養温度を34℃にシフトさせ、そのまま
計48時間培養を行った。培養終了後、薄層クロマトグラ
フィーによりＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の生成の有
無を調べた。その結果、166株の変異株のうち31株が２
つのアミノ酸を同時に生成していることが確認された。
また、この31株について培養温度のシフトを行わず、3
1.5℃で48時間培養を行ったところ、３株にＬ−リジン
とＬ−グルタミン酸の同時生産が認められた。

これら変異株の代表株及びAJ11446株のＬ−リジンと
Ｌ−グルタミン酸の蓄積量を表18に示す。

4.ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性の確認 上記項目3.で得られたＬ−リジンとＬ−グルタミン酸
の同時生産菌のPESPに対する温度感受性を液体培養によ
り以下のようにして確認した。

各変異株及びその親株をMCM2G寒天平板培地上にて31.
5℃、24時間培養して菌体を得た。得られた菌体をMCM2G
液体培地及び1mg/dl濃度のPESPを含むMCM2G液体培地に
接種し、31.5℃及び34℃にて24時間振とう培養した。得
られた培養液の660nmにおける濁度（O.D.）を測定し、P
ESPを添加しない培地での生育を100とした時のPESP添加
培地での相対生育度を求めた。結果を表19に示す。

この表に示された通り、各変異株はいずれも1mg/dlの
PESP存在下での相対生育度が31.5℃では80以上であった
のに対し、34℃では50以下であり、明らかにPESPに対し
て温度感受性を有していた。

上記項目3.得られた変異株のうちEK−112について、3
1.5℃と34℃においてPESPが生育に及ぼす影響を図３に
示す。31.5℃においては1mg/dl以下の濃度のPESP存在下
ではPESP非存在下と同低度の生育が認められるが、34℃
では1mg/dlのPESP存在下での生育がPESP非存在下での生
育に比べて著しく阻害されており、本変異株が温度感受
性を有していることが示される。

なお、変異株のうちEK−112はブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム AJ12993と命名され、平成６年
６月３日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、
受託番号FERM P−14348で寄託され。1995年８月１日に
ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、寄託番号
FERM BP−5188が付与されている。

実施例６ 同時発酵によるＬ−リジン及びＬ−グルタミ
ン酸の製造 1.培養温度シフト時期の検討 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ1144
6またはAJ12993を前記表６に示す組成の種培養培地に接
種し、31.5℃で24時間振とう培養して種培養を得た。表
６に示す組成の本培養培地を500ml容ガラス製ジャーフ
ァーメンターに300mlずつ分注し加熱殺菌した後、上記
種培養を40ml接種した。撹拌速度を800〜1300rpm、通気
量を1/2〜1/1vvmとし、培養温度31.5℃にて培養を開始
した。培養液のpHはアンモニアガス7.5に維持した。培
養を開始してから８、12または16時間後に培養温度を34
℃にシフトした。培養温度のシフトを行わず、31.5℃の
まま培養を継続した場合を比較とした。

いずれも40〜50時間でグルコースが完全に消費された
時点で培養を終了し、培養液中に生成蓄積されたＬ−リ
ジンとＬ−グルタミン酸の量を測定した。結果を表20に
示す。

この結果から、AJ12993株は31.5℃から34℃へ培養温
度をシフトさせることにより過剰量のビオチンを含有す
る培地においてもビオチン作用抑制物質の非存在下にて
Ｌ−リジンとＬ−グルタミン酸の両方を生産すること、
培養温度シフトの時期が早い程Ｌ−グルタミン酸の割合
が大きくなり、遅いほどＬ−リジンの割合が大きくなる
傾向があることがわかる。これに対し、親株であるAJ11
446株は培養温度をシフトさせてもＬ−リジンのみ生成
し、Ｌ−グルタミン酸の生成は認められなかった。

培養を開始してから８時間後に温度シフトを行った培
養の培養終了液1lから、遠心分離により菌体を除去し、
得られた上清液からイオン交換樹脂を用いる常法に従っ
てＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を分離し精製した。
得られたＬ−リジン塩酸塩の結晶は31.7g、Ｌ−グルタ
ミン酸ナトリウムの結晶は13.9gであった。

2.シフト温度の検討 500ml容ガラス製ジャーファーメンターを用いて上記
項目1.と同様に31.5℃にてブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム AJ11446及びAJ12993の培養を開始し
た。培養開始してから８時間後に培養温度を33℃、34℃
または35℃にシフトした。培養温度のシフトを行わず、
31.5℃のまま培養を継続した場合を比較とした。いずれ
も40〜50時間で培養を終了し、培養液中に生成蓄積され
たＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の量を測定した。結果
を表21に示す。

この結果から、AJ12993株を培養し培養温度をシフト
する際、シフト後の温度が高い程Ｌ−グルタミン酸の割
合が大きくなり、低い程Ｌ−リジンの割合が大きくなる
傾向があることがわかる。

産業上の利用可能性 本発明によれば、コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に
ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与するこ
とにより、炭素源として過剰量のビオチンを含有する原
料を用いた場合でも、安価かつ安定してＬ−グルタミン
酸を発酵生産することができる。

また、さらにＬ−リジン生産性を付与することによ
り、炭素源として過剰量のビオチンを含有する原料を用
いた場合でも、安価かつ安定してＬ−リジンとＬ−グル
タミンを同時に発酵生産することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） 早期審査対象出願 (72)発明者 井上 寿美男 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (72)発明者 河原 義雄 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (72)発明者 吉原 康彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (72)発明者 中松 亘 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 生産技術研究所内 (56)参考文献 特開 昭50−64486（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−6234（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−1889（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−356194（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−44171（ＪＰ，Ａ) 欧州公開780477（ＥＰ，Ａ１) Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，Ｖｏｌ．42，Ｎｏ．10（1978）, ｐ．1911−1917 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，Ｖｏｌ．43，Ｎｏ．３（1979）, ｐ．491−495 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 C12N 1/20 - 1/21 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由来
   し、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を有
   し、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作
   用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産する能
   力を有する変異株を、液体培地に培養し、培地中にＬ−
   グルタミン酸を生成蓄積させ、これを該培地から採取す
   ることを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸の製
   造方法。
2. 【請求項２】ビオチン作用抑制物質がポリオキシエチレ
   ン・ソルビタン・モノパルミテートである請求項１記載
   のＬ−グルタミン酸の製造方法。
3. 【請求項３】グルタミン酸デヒドロナーゼ遺伝子、クエ
   ン酸合成酵素遺伝子及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ
   遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子の発現が強化
   された請求項１又は２記載のＬ−グルタミン酸の製造方
   法。
4. 【請求項４】コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由来
   し、Ｌ−リジン生産能を付与する変異、及びビオチン作
   用抑制物質に対する温度感受性変異を有し、過剰量のビ
   オチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非
   存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を生産する能
   力を有する変異株を、液体培地に培養し、培地中にＬ−
   リジン及びＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、これらを
   該培地から採取することを特徴とする発酵法によるＬ−
   リジン及びＬ−グルタミン酸の製造方法。
5. 【請求項５】ビオチン作用抑制物質がポリオキシエチレ
   ン・ソルビタン・モノパルミテートである請求項４記載
   のＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の製造方法。
6. 【請求項６】コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由来
   し、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を有
   し、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作
   用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産する能
   力を有する変異株。
7. 【請求項７】ビオチン作用抑制物質がポリオキシエチレ
   ン・ソルビタン・モノパルミテートである請求項６記載
   の変異株。
8. 【請求項８】コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に由来
   し、Ｌ−リジン生産能を付与する変異、及びビオチン作
   用抑制物質に対する温度感受性変異を有し、過剰量のビ
   オチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非
   存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸の両方を生産
   する能力を有する変異株。
9. 【請求項９】ビオチン作用抑制物質がポリオキシエチレ
   ン・ソルビタン・モノパルミテートである請求項８に記
   載の変異株。
10. 【請求項１０】コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に、ビ
    オチン作用抑制物質に対する温度感受性を付与すること
    を特徴とする、過剰量のビオチンを含有する培地中にて
    ビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を
    生産する能力を有する変異株の育種方法。
11. 【請求項１１】コリネ型Ｌ−グルタミン酸生産菌に、ビ
    オチン作用抑制物質に対する温度感受性及びＬ−リジン
    生産能を付与することを特徴とする、過剰量のビオチン
    を含有する培地中にビオチン作用抑制物質の非存在下に
    てＬ−リジンとＬ−グルタミン酸の両方を生産する能力
    を有する変異株の育種方法。