DE69530306T2

DE69530306T2 - Verfahren zur herstellung von l-lysin und l-glutaminsäure durch fermentation

Info

Publication number: DE69530306T2
Application number: DE69530306T
Authority: DE
Inventors: Yoko Asakura; Sumio Inoue; Yoshio Kawahara; Eiichiro Kimura; Tsuyoshi Nakamatsu; Akinori Uehara; Yasuhiko Yoshihara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-08-19
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 2003-12-11
Anticipated expiration: 2015-08-10
Also published as: CN1161059A; BR9508730A; WO1996006180A1; PE27597A1; EP1293560A2; DE69530306D1; EP0780477B1; EP0780477A1; JP2926991B2; CN1079836C; EP1293560A3; EP0780477A4; ES2191710T3; US5846790A; DE69535643D1; EP1293560B1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von L-Lysin und L-Glutaminsäure durch Fermentierung. L-Lysin wird verbreitet als Futteradditiv, etc. verwendet und L-Glutaminsäure wird umfassend als Material für Gewürzmittel etc. verwendet.

Stand der Technik

Bisher wurden L-Lysin und L-Glutaminsäure industriell durch Fermentierverfahren unter Verwendung von coryneformen Bakterien mit Fähigkeiten diese Aminosäuren zu produzieren, hergestellt, die zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium gehören. Von diesen Verfahren ist bekannt, daß coryneforme Bakterien Biotin für ihr Wachstum benötigen, während L-Glutaminsäure nicht akkumuliert wird, wenn eine exzessive Menge an Biotin in einem Medium vorhanden ist. Deswegen wurde jedes der folgenden Verfahren an die konventionelle Methode zum Herstellen von L-Glutaminsäure angepaßt. Insbesondere wird eine Kultivierung in einem Medium durchgeführt, in dem die Konzentration an Biotin beschränkt ist, oder im Fall einer Verwendung eines Mediums, das eine ausreichende Menge an Biotin enthält, wird eine Kultivierung durchgeführt, bei der ein Tensid oder ein Lactam-Antibiotikum als ein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel in einem Medium bei einem Anfangs- oder Zwischenstadium der Kultivierung enthalten ist.
Wenn jedoch insbesondere ein Material wie Abfallmelassen, das billig ist, aber eine exzessive Menge Biotin enthält als Kohlenstoff-Quelle in einem Medium verwendet wird, ist das Biotinwirkung unterdrückende Mittel dessen Hinzufügen zum Medium benötigt ist, der Grund für einen Anstieg der Produktionskosten gewesen.
Andererseits sind die folgenden Verfahren für die simultane Produktion von L-Lysin und L-Glutaminsäure durch Fermentierung bekannt. Insbesondere wird ein L-Lysin- produzierendes Bakterium unter einer Bedingung für die L-Glutaminsäure-Produktion kultiviert, oder ein L-Lysin- produzierendes Bakterium und ein L-Glutaminsäureproduzierendes Bakterium werden gemischt und kultiviert (japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 5-3793).
Bei einem Verfahren, bei dem ein L-Lysin-produzierendes Bakterium jedoch unter der Bedingung für die L-Glutaminsäure- Produktion kultiviert wird, um durch Fermentierung gleichzeitig L-Lysin und L-Glutaminsäure zu produzieren, ist die Bedingung für die L-Glutaminsäure-Produktion entweder, daß ein Biotin-auxotrophes Bakterium, das zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium gehört, in einem Medium, das eine niedrige Konzentration an Biotin enthält, kultiviert wird, oder, daß es so kultiviert wird, daß ein Tensid oder ein Lactam-Antibiotikum in einem Medium bei einem anfänglichen oder Zwischenschritt der Kultivierung enthalten ist, für den Fall, daß das Medium eine ausreichende Menge an Biotin enthält. Insbesondere wenn ein Material wie Abfallmelassen, das billig ist aber eine exzessive Menge an Biotin enthält, als Kohlenstoffquelle in einem Medium verwendet wird, war das Tensid oder das Lactam-Antibiotikum als Biotinwirkung unterdrückendes Mittel, das zum Medium hinzugegeben werden muß, die Ursache für einen Anstieg der Produktionskosten.
EP-A-0 054 311 beschreibt die Verwendung einer Mikroorganismenmutante, wobei die Mutante mit Oleinsäure temperatursensitiv heilbar ist.
Außerdem hat es ein Problem im Verfahren gegeben, in dem ein L-Lysin-produzierendes Bakterium ein L-Glutaminsäure- produzierendes Bakterium gemischt und kultiviert werden, bei dem die Kontrolle der Kultivierung schwierig ist, und die Fermentierungsergebnisse unstabil sind.

Offenbarung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zum gunstigen und stabilen Herstellen von L-Glutaminsäure durch Fermentieren zur Verfügung zu stellen, bei dem kein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel hinzugegeben wird, selbst wenn ein Material wie Abfallmelassen als Kohlenstoff- Quelle in einem Medium verwendet wird, das eine exzessive Menge an Biotin enthalt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum günstigen und stabilen Herstellen von L-Lysin und L-Glutaminsäure durch Fermentierung zur Verfügung zu stellen, bei dem keine die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel hinzugegeben wird, selbst wenn ein Material wie Abfallmelassen als Kohlenstoff-Quelle in einem Medium verwendet wird, das eine exzessive Menge an Biotin enthalt.
Als Ergebnis intensiver Forschungen, um die die oben erwähnten Ziele zu erreichen, habe die vorstelligen Erfinder einen coryneformen bakteriellen Mutantenstamm gefunden, der die Fähigkeit hat, L-Glutaminsäure in Abwesenheit jedes die Biotinwirkung-unterdruckenden Mittels in einem Medium zu produzieren, das nicht weniger als 10 ug/l an Biotin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß es eine temperatursensitive Mutation gegenüber einem Biotinwirkung-unterdruckenden Mittel hat und durch ein Verfahren erhältlich ist, das die Schritte umfaßt:
a) Aussetzen von coryneformen L-Glutaminsäure-produzierenden Bakterien gegenüber einer Mutationsbehandlung;
b) Selektionieren von Kolonien des coryneformen bakteriellen Mutantenstamms, der durch die Mutationsbehandlung a) erhalten wurde, der bei einer Kultivierungstemperatur von 33 bis 37ºC in einem Medium, das nicht weniger als 10 ug/l an Biotin enthalt, ein reduziertes oder nicht beobachtbares Wachstum in Gegenwart einer Schwellenwertkonzentration des Biotinwirkungunterdrückenden Mittels aufweist, verglichen mit dem Wachstum in Abwesenheit des Mittels unter ansonsten identischen Bedingungen, wobei die Schwellenwertkonzentration bestimmt wird durch das Züchten des coryneformen L-Glutaminsäureproduzierenden Bakterien bei einer Biotin-Konzentration und Temperaturschritte in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Biotinwirkung unterdrückenden Mittels und der Bestimmung der Schwellenwertkonzentration des Mittels bei dem noch Wachstum erkannt wird.
Außerdem haben die vorstelligen Erfinder einen coryneformen bakteriellen Mutantenstamm mit der Fähigkeit gefunden, sowohl L-Lysin und L-Glutaminsäure in Abwesenheit von jedem, die Biotinwirkung-unterdruckenden Mittel in einem Medium zu produzieren, das nicht weniger als 10 ug/l an Biotin enthalt, dadurch gekennzeichnet, daß er eine temperatursensitive Mutation gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel hat und erhältlich ist mit einem Verfahren, das die Schritte umfaßt:
a) Unterwerfen coryneformer L-Glutaminsäure- und L-Lysin- produzierender Bakterien gegenüber einer Mutationsbehandlung;
b) Auswählen von Kolonien des coryneformen bakteriellen Mutantenstamms, der durch die Mutationsbehandlung (a) erhalten wurde, welcher bei einer Kultivierungstemperatur von 33 bis 37ºC in einem Medium, das nicht weniger als 10 ug/l an Biotin enthält, ein reduziertes oder nicht zu beobachtendes Wachstum in Gegenwart einer Schwellenwertkonzentration eines die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels zeigt, verglichen mit dem Wachstum in Abwesenheit dieses Mittels bei ansonsten identischen Bedingungen, wobei diese Schwellenkonzentration bestimmt wird durch das Zuchten der coryneformen L-Glutaminsäure-produzierenden und L-Lysin-produzierenden Bakterien in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels und dem Bestimmen der Schwellenwertkonzentration des Mittels, bei der ein Wachstum noch erkannt wird.
Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Insbesondere liegt die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure durch Fermentierung, das die Schritte des Kultivierens eines Mutantenstamms in einem Flüssigmedium umfaßt, im Produzieren und Anhaufen von L-Glutaminsäure in dem Medium und dem Absammeln davon aus dem Medium, wobei der Mutantenstamm von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt, das eine temperatursensitive Mutation gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel hat und die Fähigkeit besitzt, L-Glutaminsäure in Abwesenheit jeder Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in jedem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält produzieren zu können.
In einem weiteren Aspekt liegt die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zum Herstellen von L-Lysin und L-Glutaminsäure durch Fermentierung, das die Schritte des Kultivierens eines Mutantenstammes in einem Flüssigmedium umfaßt, das Herstellen und Anhaufen von L-Lysin und L-Glutaminsäure in dem Medium, und dem Absammeln davon aus dem Medium, wobei der Mutantenstamm von einem coryneformen L-Glutaminsäure-produzierenden Bakterium mit einer Mutation stammt, um L-Lysin-Produktionsfähigkeit zu geben, und einer temperatursensitiven Mutation gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel mit einer Fähigkeit L-Lysin und L-Glutaminsäure in Abwesenheit jedes die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in jedem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, zu produzieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Mutantenstamm gemäß einem Anspruch zur Verfügung gestellt, der von einem coryneformen L-Glutaminsäureproduzierenden Bakterium, mit temperatursensitiver Mutation gegenüber einem Biotinwirkung unterdrückenden Mittel abstammt und mit einer Fähigkeit L-Glutaminsäure in Abwesenheit jedes die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in einem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, zu produzieren. Dieser Mutantenstamm wird manchmal unten als "erste Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung" bezeichnet.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Mutantenstamm gemäß Anspruch 2 zur Verfügung gestellt, der von einem coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt, mit einer Mutation, um eine L-Lysin- Produktionsfähigkeit zu ermöglichen, und einer temperatursensitive Mutation gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel und mit einer Fähigkeit sowohl L-Lysin und L-Glutaminsäure in Abwesenheit jedes die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in einem Medium zu produzieren, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält. Dieser Mutantenstamm wird manchmal unten als "zweiter erfindungsgemäßer Mutantenstamm" bezeichnet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Züchten von Mutantenstämmen zur Verfügung gestellt, die eine Fähigkeit haben, L-Glutaminsäure in Abwesenheit jedes die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in einem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, zu produzieren, umfassend dem Induzieren einer Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel in einem coryneformen L-Glutaminsäureproduzierenden Bakterium.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, Mutantenstämme mit einer Fähigkeit züchten, sowohl L-Lysin und L-Glutaminsäure in Abwesenheit jedes die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in einem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, zu produzieren, umfassend dem Erzeugen einer Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel und L-Lysin-Produktivität in einem coryneformen L-Glutaminsäure-produzierenden Bakterium.
Die vorliegende Erfindung wird im Detail unten erklärt.

< 1> Herstellung eines Mutantenstamms, der temperatursensitiv gegenüber die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels ist, der von einem L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium stammt, und die Herstellung von L-Glutaminsäure

[1] Herstellung eines Mutantenstamms der von einem L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt, der temperatursensitiv gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels ist.

Konventionelle und bekannte L-Glutaminsäure-produzierende Bakterien die von coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterien abstammen, produzieren wenn sie in einem Medium kultiviert werden, das eine überschüssige Menge an Biotin von nicht weniger als 10 ug/l enthält, im wesentlichen keine L-Glutaminsäure in einer Kulturflüssigkeit, bis einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel, wie einem Tensid oder Antibiotika ermöglicht wird, in dem Medium in einem anfänglichen oder Zwischenschritt der Kultivierung enthalten zu sein. Der erste Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung hat die Fähigkeit L-Glutaminsäure selbst dann zu produzieren, wenn er in einem Flüssigmedium kultiviert wird, der eine überschüssige Menge an Biotin enthält, ohne irgendeinem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel zu ermöglichen in dem Medium enthalten zu sein. Insbesondere ist der erste Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung ein Mutantenstamm, der von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt, mit einer temperatursensitiven Mutation gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel, um mit einer Fähigkeit L-Glutaminsäure in Abwesenheit von irgendeinem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel in einem Medium zu produzieren, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält. Der Mutantenstamm, der oben beschrieben wurde, kann induziert werden, indem eine temperatursensitive Mutation gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel in einem Glutaminsäure produzierenden Bakterium erzeugt wird, das von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt.
Das die Biotinwirkung unterdrückende Mittel schließt beispielsweise Tenside und Antibiotika ein.
Die Tenside schließen beispielsweise eine gesättigte Fettsäure wie Laurinsäure, Myristinsäure, Stearinsäure und Palmitinsäure ein; Fettsäureester-Typ nichtionische Tenside wie Glycerolfettsäureester, Sorbitanfettsäureester, Sucrosefettsäureester, Polyethylenglykolfettsäureester, Polyethylenglykolpolypropylenglykolfettsäureester und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester; und N-Acylaminosäuren wie beispielsweise N-Palmitoylglycin, N-Pylmitoylalanin, N-Palmitoylvalin, N-Palmitoylleucin, N-Palmitoylthreonin, N-Palmitoylmethionin, N-Palmitoylasparatinsäure, N-Palmitoylglutaminsäure, N-Myristoylglutaminsäure, N-Stearoylglutaminsäure, N,N'-Dipalmitoylorithin und N,N'-Dipalmitoyllysin.
Die Antibiotika schließen beispielsweise Lactam-Antibiotika wie Penicillin und Cephalolysin ein.
Im allgemeinen wird das Wachstum der coryneformen L-Glutaminsäure-produzierenden Bakterien durch das Vorhandensein eines die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei einer bestimmten Konzentration oder mehr gehemmt. In der vorliegenden Erfindung bedeutet die Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel eine Eigenschaft, bei der das Wachstum markant gehemmt ist, verglichen mit dem in Abwesenheit des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei einer Kultivierungstemperatur von 33 bis 37ºC, bevorzugt nicht weniger als 34ºC, in Gegenwart des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei einer Maximumkonzentration, bei der ungefähr gleiches Wachstum wie das in Abwesenheit des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei 31,5ºC beobachtet wird (optimale Wachstumstemperatur). Insbesondere wird eine Eigenschaft wie folgt definiert beabsichtigt. D. h., wenn der Einfluß, der durch das die Biotinwirkung unterdrückende Mittel bei einer Temperatur von 31,5ºC und bei 33 bis 37ºC untersucht wird, wird ein Grad relativen Wachstums in Gegenwart des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei jeder Konzentration ausgerechnet, vorausgesetzt, daß jedes Wachstum in Abwesenheit des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei jeder Temperatur als 100 betrachtet wird, und eine Maximumkonzentration bei der der Grad relativen Wachstums bei 31.5ºC als nicht weniger als 80 bestimmt wird, so daß der Grad des relativen Wachstums bei einer Temperatur von 33 bis 37ºC nicht mehr als 50 in Gegenwart des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei der maximalen Konzentration.
Das coryneforme L-Glutaminsäure-produzierende Bakterium, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, schließen Bakterien ein, die bisher in den Genus Brevibacterium eingeordnet wurden, aber als Bakterien zusammengefaßt werden, die gegenwärtig zu dem Genus Corynebacterium gehören (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), und Bakterien einschließen, die zum Genus Brevibacterium gehören, der dem Genus Corynebacterium nahe verwandt ist. Deswegen kann der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mutantenstamm von den folgenden coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterien, die zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium gehören, induziert werden. In dieser Beschreibung werden die Bakterien, die zu den Genera Corynebacterium und Brevibacterium gehören, solange kein Bezug auf ihre L-Glutaminsäure- Produktionsfähigkeit genommen wird, einfach als "coryneforme Bakterien" bezeichnet.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020
(Brevibacterium lactofermenttum) ATCC 13869
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) Der bakterielle Stamm mit Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel kann durch Anwenden einer Mutationsbehandlung erhalten werden wie beispielsweise ultravioletter Lichtbestrahlung, Röntgenstrahlenbestrahlung, radioaktiver Bestrahlung und Behandlung mit mutagenen Mitteln bei einem Bakterienstamm, der oben beschrieben wurde, gefolgt von dem Durchführen des Replikaverfahrens auf einem Agarplattenmedium, das das die Biotinwirkung unterdrückende Mittel enthält. Insbesondere das Wachstumsstadium des Parentalstamms in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels wird bei einer Kultivierungstemperatur von 33 bis 37ºC, bevorzugt nicht weniger als 34ºC, beobachtet, um eine maximale Konzentration des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels zu bestimmen, bei der Wachstum erkannt wird. Ein Mutantenstamm, der nicht wachsen kann oder eine markant gesenkte Wachstumsgeschwindigkeit in Gegenwart des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei maximaler Konzentration bei der gleichen Temperatur aufweist wie oben verwendet, kann ausgesondert werden.
Die Temperatursensitivität gegenüber dem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel wird dem coryneformen L-Glutaminsäureproduzierendem Bakterium vermittelt wie oben beschrieben. So kann ein Mutantenstamm gezüchtet werden, der die Fähigkeit hat, L-Glutaminsäure in Abwesenheit des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in einem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, zu produzieren.

[2] Herstellung eines Mutantenstamms, der temperatursensitiv gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels ist, der von einem L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt, mittels genetischer Rekombination.

Alternative Verfahren zum Erhalten mutanter Stämme, die gegenüber dem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel temperatursensitiv sind, können vorhanden sein, die anders als das Verfahren sind, das auf einer Mutationsbehandlung beruht, die oben beschrieben wurde. Beispielsweise kann ein Gen, das für eine Resistenz gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel relevant ist, von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium erhalten werden und das Gen wird in vitro einer Mutationsbehandlung unterworfen, um ein Gen vom Mutanten-Typ zu erhalten, das einer Resistenz gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel in einer temperatursensitiven Weise vermittelt. Als nächstes wird ein entsprechendes Wildtyp-Gen auf einem Chromosom durch das Gen vom mutierten Typ unter Verwendung einer bereits bekannten Technik für die homologe Rekombination ersetzt. Auf diese Weise kann ein Mutantenstamm, der gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel temperatursensitiv ist, erhalten werden.
Ein Gen, das für eine Tensidresistenz relevant ist, wird unten als ein Gen bezeichnet, das für die Resistenz gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel relevant ist. Ein Gen, das für eine Tensidresistenz relevant ist, die von einem coryneformen Bakterium abstammt, kann isoliert werden durch:
(1) Erhalten eines tensidsensitiven Mutantenstamms, der zu den coryneformen Bakterien gehört, die eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem Tensid haben;
(2) Ligieren zahlreicher chromosomaler DNA-Fragmente eines coryneformen Wildtyp-Bakteriums mit einem Vektor, der in der Lage ist, in den coryneformen Bakterien zu funktionieren, um zahlreiche rekombinante DNAs herzustellen;
(3) Einschleusen der zahlreichen rekombinanten DNAs in den tensidsensitiven Mutantenstamm, der zu den coryneformen Bakterium gehört, um eine Transformation durchzuführen;
(4) Auswählen eines Stamms, mit verlorengegangener Tensidsensitivität, d. h. ein Stamm mit erhöhter Tensidresistenz von transformierten Stämmen;
(5) Gewinnen einer rekombinanten DNA von dem transformierten Stamm mit der verlorengegangenen Tensidsensitivität und
(6) Analysieren der Struktur eines chromosomalen DNA- Fragments des Wildtyp-coryneformen Bakteriums, das mit dem Vektor ligiert ist.
Das so erhaltene chromosomale DNA-Fragment des Wildtypcoryneformen Bakteriums enthält das Gen, das für die Tensidresistenz relevant ist, das von dem coryneformen Bakterium stammt. Dieses Gen betrifft mindestens einen Mechanismus des coryneformen Bakteriums, L-Glutaminsäure in einem Medium, das ein Tensid enthält zu produzieren. Gleichzeitig gibt es auch die Möglichkeit eines allgemeinen Bezugs zur Herstellung von L-Glutaminsäure mit Hilfe der Zugabe von Penicillin oder einer Beschränkung an Biotin.
In dem oben beschriebenen Punkt (1) betrifft der "tensidsensitive Mutantenstamm, der zu den coryneformen Bakterium mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber einem Tensid gehört" einen Mutantenstamm, der zu den coryneformen Bakterien mit einem abweichenden Wachstum in einem Medium gehört, in dem ein Tensid in einer Konzentration vorhanden ist, bei der kein Einfluß auf das Wachstum der coryneformen Wildtyp-Bakterien ausgeübt wird. Wenn beispielsweise Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat als Tensid verwendet wird, weist der tensidsensitive Mutantenstamm, der zu den coryneformen Bakterien gehört, verglichen mit dem Wildtyp- Stamm ein schlechtes Wachstum auf, wenn das Tensid zu dem Medium in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/dl hinzugegeben wird. Andererseits weist das coryneforme Wildtyp-Bakterium keine beobachtbare Veränderung des Wachstum auf, selbst in einem Medium, in dem das Tensid in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mg/dl hinzugegeben wird. Die Konzentration des für die L-Glutaminsäure-Produktion benötigen Tensids sinkt, verglichen mit dem Normalfall ab, wenn so ein tensidsensitiver Mutantenstamm kultiviert wird, um L-Glutaminsäure durch Hinzugabe des Tensids zu kultivieren. Es wird postuliert, daß Zellen des tensidsensitiven Mutantenstamms einen Zustand haben, der sich dem Stadium der Zellen des Wildtyp-Stamms annähert, die dem Tensid ausgesetzt sind.
Herstellung eines Gens, das für die Tensidresistenz relevant ist
Um einen tensidsensitiven Mutantenstamm zu erhalten, der zu den coryneformen Bakterien gehört, kann ein Verfahren, das in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 52-24593 beschrieben ist, verwendet werden. Insbesondere wird eine Mutationen erzeugende Behandlung wie einer Bestrahlung mit ultravioletter Strahlung, Röntgenbestrahlung, Strahlenbestrahlung und Behandlungen mit mutagenen Mitteln gegenüber einem coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterium angwendet, um einen Stamm zu erhalten, der auf einem Agarmedium wachsen kann, der ein Tensid in einer Menge enthält bei der Parentalstamm wächst.
Der tensidsensitive Mutantenstamm, der zu den coryneformen Bakterien gehört, wird spezifisch durch Brevibacterium lactofermentum AJ11060 dargestellt, der in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 59-10797 offenbart ist.
Das Verfahren zum Herstellen zahlreicher chromosomaler DNA- Fragmente des coryneformen Wildtyp-Bakteriums wird wie folgt durchgeführt. So wird das coryneforme Wildtyp-Bakterium in einem Flüssigmedium kultiviert, und chromosomale DNA wird von den gesammelten Zellen nach dem Verfahren von Saito et al. gewonnen (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)). Gewonnene chromosomale DNA wird mit einem Restriktionsenzym verdaut. Eine Anzahl an DNA-Fragmenten kann hergestellt werden, indem eine Umsetzung unter einer Bedingung durchgeführt wird, bei der DNA unvollständig zersetzt wird, indem ein Enzym vom Vier-Nukleotid- Erkennungssequanztyp als Restriktionsenzym verwendet wird.
Der Vektor, der in der Lage ist in den coryneformen Bakterien zu arbeiten, ist beispielsweise ein Plasmid, das der autonomen Replikation in den coryneformen Bakterien fähig ist. Insbesondere können die folgenden beispielhaft angegeben werden.
(1) pAM330 (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 58-67699)
(2) pHM1519 (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 58-77895)
(3) pAJ655 (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 58-192900)
(4) pAJ611 (siehe oben)
(5) pAJ1844 (siehe oben)
(6) pCG1 (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 57-134500)
(7) pCG2 (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 58-35197)
(8) pCG4 (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 57-183799)
(9) pCG11 (siehe oben)
Um den Vektor, der in der Lage ist in coryneformen Bakterien zu arbeiten mit zahlreichen chromosomalen DNA-Fragmenten des coryneformen Wildtyp-Bakteriums zu ligieren, um zahlreiche rekombinante DNAs herzustellen, wird der Vektor mit dem gleichen Restriktionsenzym wie das Restriktionsenzym, das für den Verdau chromosomaler DNA verwendet wurde oder mit einem Restriktionsenzym, das terminale Sequenzen erzeugt, die komplementär zu den Endsequenzen der zahlreichen chromosomalen DNA-Fragmente sind, verdaut. Der verdaute Vektor wird für gewöhnlich mit den chromosomalen DNA- Fragmenten unter Verwendung einer Ligase, wie beispielsweise der T4-DNA-Ligase, ligiert.
Um die zahlreichen rekombinanten DNAs in den tensidsensitiven Mutantenstamm, der zu den coryneformen Bakterien gehört, einzuschleusen, kann ein Verfahren durchgeführt werden, das mit konventionellen und beschriebenen Transformationsmethoden übereinstimmt. Beispielsweise ist es möglich, ein Verfahren zu verwenden, in dem die Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität von DNA zu erhöhen, wie für Escherichia coli K-12 berichtet (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), und ein Verfahren, in dem kompetente Zellen von Zellen in einem proliferierendem Stadium hergestellt werden, um DNA einzuschleusen, wie für Bacillus subtillis berichtet (Duncan, C. H., Wilson, G. A. und Yound, F. E., Gene, 1, 153 (1977)). Alternativ dazu ist es auch möglich, ein Verfahren anzuwenden, in dem DNA- Empfängerzellen in einem Protoplasten- oder Sphäroplastenzustand umgewandelt werden, welcher leicht rekombinante DNA aufnimmt, um rekombinante DNA in die DNA- Empfänger einzuschleusen, wie für Bacillus subtilis, Actinomycetes, und Hefe bekannt (Chang, S. und Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. und Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. und Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).
Hinsichtlich des Protoplastenverfahrens kann eine ausreichend hohe Frequenz erhalten werden, indem sogar das Verfahren, das für Bacillus subtilis oben beschrieben wurde, verwendet wird. Wie jedoch in der japanischen Patentveröffentlichungsschrift Nr. 57-183799 offenbart ist, ist es auch möglich, ein Verfahren zu benutzen, in dem DNA in einem Stadium eingeschleust wird, in dem Protoplasten coryneformer bakterieller Zellen mit divalenten Metallionen und entweder Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol kontaktiert werden. Die Einschleusung der DNA kann auch durch Zugabe von Carboxymethylcellulose, Dextran, Ficoll, Pluronic F68 (Serva) und ähnliche, anstelle von Polyethylenglykol oder Polyvinylalkohol erleichtert werden. Ein elektrisches Pulsverfahren (siehe japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 2-207791) wurde in dem erfindungsgemäßen Beispiel als Transformationsmethode verwendet.
Eine Methode zum Auswählen von Stämmen mit verlorener Tensidsensitivität aus transformierten Stämmen wird unten beschrieben.
DNA-Fragmente mit Größen von ungefähr 4 bis 6 Kbp, die durch teilweises Verdauen chromosomaler DNA von einem Wildtyp-Stamm eines coryneformen Bakteriums erhalten wurden, mit einem Restriktionsenzym Sau3AI werden mit dem Plasmidvektor ligiert, der zur autonomen Proliferation sowohl in Escherichia coli und coryneformen Bakterien in der Lage ist, um rekombinante DNAs zu erzeugen, die in kompetente Zellen des Escherichia coli DH5-Stamms (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) oder ähnliche eingeschleust werden. Transformierte Stämme werden kultiviert, um eine Genbibliothek des Wildtyp- Stamms des coryneformen Bakteriums zu konstruieren.
Der tensidsensitive Mutantenstamm AJ11060 wird mit rekombinanten DNAs, die in der oben beschriebenen Genbibliothek enthalten sind, transformiert. Erhaltene Transformanten werden einmal auf M-CM2G-Agar-Platten (enthaltend 5 g Glucose, 10 g Polypepton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 0,2 g DL-Methionin, 15 g Agar und 4 mg Chloramphenicol in 1 l reinem Wasser, pH 7,2) ausgestrichen, der kein Tensid enthält, um 40 000 Kolonien zu bilden. Die Kolonien werden auf M-CM2G-Platten repliziert, die 30 mg/l eines Tensids enthalten (Tween 40), um die zu erhalten, die ein gutes Wachstum auf den M-CM2G-Platten zeigen, die dieses Tensid enthalten. So können Stämme mit verlorener Tensidsensitivität erhalten werden.
Das gleiche Verfahren wie das Verfahren zum Herstellen chromosomaler DNA des Wildtyp-coryneformen Bakteriums kann verwendet werden, um rekombinante DNA von einem transformierten Stamm mit verlorener Tensidsensitivität zu gewinnen. So wird der transformierte Stamm in einem Flüssigmedium kultiviert und die rekombinante DNA kann aus den gesammelten Zellen in Übereinstimmung mit einer Methode von Saito et al. gewonnen werden (H. Saito und K. Miura, Biochem., Biophys. Acta, 72, 619 (1963)).
Die Struktur des chromosomalen DNA-Fragments vom Wildtypcoryneformen Bakterium, das mit dem Vektor ligiert ist, wird beispielsweise wie folgt analysiert. Die Gesamtnukleotidsequenz des chromosomalen DNA-Fragments wird mit Hilfe der Didesoxy-Methode bestimmt, welche ein gewöhnliches Verfahren zum Nukleotidsequenzieren ist. Die Struktur der DNA wird analysiert, um bestehende Positionen des Enhancers, Promotors, Operators, SD-Sequenz, Leader- Peptids, Attenuatoren, Initiations-Codons, Terminations- Codons, open reading frame usw. zu bestimmen.
Eines der Gene, die für die Tensidresistenz, die von einem coryneformen Bakterium stammt, das wie oben beschrieben erhalten wurde, wird in Beispiel 3 unten beschrieben und wurde als "dtsR-Gen" bezeichnet. Dieses dtsR-Gen hat mindestens eine Sequenz vom 467. bis 469. AT6 bis zum 1985- 1987 CTG der Nukleotidsequenz, die in der SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste aufgeführt ist. Eine Aminosäuresequenz, die durch dieses Gen codiert werden kann, wird in den SEQ ID NOS: 1 und 2 in der Sequenzliste gezeigt. Ein weiterer ATG (Nukleotide Nrn. 359 bis 361) ist im gleichen Leserahmen an einer Upstream-Position des zuvor erwähnten 467-469 ATG vorhanden. Es ist unmöglich, zu verneinen, daß die Möglichkeit besteht, daß der zusätzliche ATG der Initiationscodon ist. Es wird jedoch postuliert, daß der zuvor erwähnte 467-469 ATG der Initiationscodon ist, entsprechend der Analyse einer Konsensus-Sequenz, die in einer Region upstream dieses Gens besteht. So wird postuliert, daß das dtsR-Gen für ein Peptid, mit einer Aminosäuresequenz, die die Aminosäuren Nrn. 37-543 in der Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist. Dieses Peptid wurde als dtsR-Protein bezeichnet. Wenn auf die Aminosäuresequenz des dtsR-Proteins und die Nukleotidsequenz des dtsR-Gens in der Beschreibung und den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, dann können sie im allgemeinen unter Verwendung des 467-469 ATG als Initiationscodon beschrieben werden. Die Möglichkeit des 359- 361 ATG als Initiationscodon sollte auch in Betracht gezogen werden. Wenn man beispielsweise beabsichtigt, das dtsR-Gen in ein Bakterium einzuschleusen, das zu dem Genus Corynebacterium gehört, um seine Expression zu steigern, wird vermutet, daß eine Sequenz, die die Nukleotide Nrn. 467-1987 in der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, exprimiert werden kann. Vom Fachmann wird jedoch leicht verstanden, daß das dtsR-Protein unabhängig jedes ATG als Initiationscodon korrekt exprimiert werden kann, wenn eine codierende Region und eine Upstream-Region der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotidsequenz einschließlich der Nukleotide Nrn. 359-466 in das Bakterium eingeschleust werden, das zum Genus Corynebacterium gehört. Wenn das dtsR- Gen in bakteriellen Zellen exprimiert wird, wird Met am N-terminalen Ende, das durch den Initiationscodon codiert wird, gelegentlich durch eine Aminopeptidase abgeschnitten.
Wie im unten beschriebenen Beispiel 3 gezeigt, wurde herausgefunden, daß die Aminosäuresequenz des dtsR-Proteins eine Homologie mit einem Protein hat, von dem bereits berichtet worden ist. Das Protein wird als β-Untereinheit einer Propionyl-CoA-carboxylase (PPC) Protein beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986) 8049-8053; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986) 4864-4868; und Gene, Bd. 122 (1992) 199-202. Keines dieser Dokumente enthält irgendeine Beschreibung, die vermuten läßt, daß das Protein mit Glutaminsäure-Produktionsfähigkeit zusammenhängt.
Propionyl-CoA-carboxylase ist ein Enzym, das eine Reaktion in einem metabolischen Pfad katalysiert, um α-Ketoglutarat in Succinyl-CoA durch 2-Hydroxyglutarat, Propionyl-CoA, D-Methylmalonyl-CoA und L-Methylmalonyl-CoA umzuwandeln. Dieser Stoffwechselpfad ist möglicherweise ein Weg, eine Reaktion zum Gen, die durch die α-Ketoglutaratdehydrogenase in dem TCA-Zyklus katalysiert wird. Außerdem ist Propionyl- CoA-carboxylase ein Enzym, das Biotin als Coenzym verwendet. Aufgrund dieser Tatsachen wird vermutet, daß die Reaktion, die durch die Propionyl-CoA-carboxylase katalysiert wird und der zuvor erwähnte Stoffwechselweg oder ein Teil davon die Reaktion einschließen, die mit der Tensidresistenz zusammenhängt. Deswegen ist es sehr wahrscheinlich, daß die Gene, die für die Tensidresistenz relevant sind, Gene einschließen, die für die α-Untereinheit der Propionyl-CoA- carboxylase oder andere Enzyme oder Untereinheiten davon zum katalysieren jeder dieser Reaktionen des zuvor erwähnten Stoffwechselweges zusätzlich zu dem dtsR-Gen einschließen. Außerdem haben die vorstelligen Erfinder herausgefunden, daß ein dtsR-Protein-defizienter Stamm Oleinsäure für die Kultivierung benötigt. Acetyl-CoA-carboxylase, das Biotin als Coenzym verwendet hat, hat eine ähnliche Struktur wie die der Propionyl-CoA-carboxylase. Daher betreffen Gene, die für Enzyme oder Untereinheiten davon zum Katalysieren jeder Reaktion des Fettsäure-Stoffwechselweges wahrscheinlich ebenfalls mit der Tensidresistenz zusammen. Die erfindungsgemäße "Mutation, um Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotin-Wirkung unterdrückenden Mittel auszuüben" könnte auch eine Mutation in diesen Genen einschließen.

Herstellung eines Mutanten-Typ-dtsR-Gen eingeschleusten Stammes durch Gen-Substituierung

Die temperatursensitive Mutation gegenüber Tensiden kann auch durch das Erzeugen einer Mutation im Gen, das für die Tensidresistenz relevant ist, erzeugt werden, das durch das oben beschriebene dtsR-Gen erhalten wurde. So kann ein Verfahren durch Einschleusen einer Mutation in vitro in das erhaltene Gen durchgeführt werden, um einen Mutanten-Gentyp herzustellen, der einen temperatursensitive Funktion seines Genprodukts ermöglicht, und dem Substituieren des Wildtyp- Gens, das auf dem Chromosom existiert mit den Mutanten-Gentyp durch homologe Gen-Rekombination. Gen-Substituierung durch homologe Rekombination ist bereits etabliert worden. Es ist möglich beispielsweise ein Verfahren unter Verwendung linearer DNA oder ein Verfahren unter Verwendung eines temperatursensitiven Plasmids zu verwenden.
Insbesondere wird die Modifizierung des dtsR-Gens in einen Mutanten-Gentyp durch Verursachen einer Substituierung, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines oder mehrerer Nukleotide in einer Nukleotidsequenz einer codierenden Region oder eine Promotorregion des dtsR-Gens mit Hilfe einer lokalisiert spezifischen Mutagenesemethode (Kramer, W. und Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), oder einer Behandlung mit einem chemischen Mittel wie Natriumhypochlorit und Hydroxylamin (Shortle, D. und Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 270 (1978)).
Die lokalisiert spezifische Mutagenese-Methode ist eine Methode unter Verwendung synthetische Oligonukleotide, welche eine Technik ist, um die Einschleusung einer optionalen Substituierung, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion nur in optionalen und beschränkten Basenpaaren zu ermöglichen. Wenn dieses Verfahren verwendet wird, wird zuerst ein Plasmid mit einem klonierten dtsR-Gen mit einer bestimmten Nukleotidsequenz denaturiert, um einzelsträngige DNA herzustellen. Als nächstes wird ein synthetisches Oligonukleotid, das komplementär zu einem Teil ist, das für eine Mutation verursacht werden soll, verwendet. Jedoch wird dem synthetischen Oligonukleotid nicht ermöglicht, eine komplett komplementäre Sequenz zu haben, sondern eine optionale Basensubstituierung, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion. Die einzelsträngige DNA wird mit dem synthetischen Oligonukleotid mit einer optionalen Basensubstituierung, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion verknüpft. Ein vollständiges doppelsträngiges Plasmid wird unter Verwendung der T4-Ligase und des Klenow- Fragments der DNA-Polymerase I synthetisiert und wird in kompetente Zellen von Escherichia coli eingeschleust. Einige Transformanten, die so erhalten werden, haben Plasmide, die Gene enthalten in denen eine optionale Basensubstituierung, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion festgelegt ist. Ähnliche Techniken, um eine Gen-Mutation einzuschleusen schließen eine rekombinante PCR-Methode (PCR Technology, Stockton press (1989)) ein.
Die Methode der Verwendung einer chemischen Reaktionsmittelbehandlung ist ein Verfahren, in dem eine Mutation mit einer Basensubstituierung, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion zufallsgemäß in ein DNA-Fragment, durch das Behandeln des DNA-Fragments, das ein Zielgen enthält, direkt mit Natriumhypochlorit, Hydroxylamin oder ähnlichen eingeschleust wird.
Das Verfahren zum Substituieren eines normalen Gens auf einem Chromosom eines coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakteriums durch ein Gen mit eingeschleuster Mutation, das sc erhalten wurde, schließt ein Verfahren ein, das die homologe Rekombination verwendet (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. und Mizushima, S., J. Bacteriol., 162; 1196 (1985)). In der homologen Rekombination, wenn ein Plasmid oder ähnliches, das eine Sequenz mit Homologie zu einer Sequenz auf dem Chromosom hat in eine bakterielle Zelle eingeschleust wird, findet eine Rekombinierung in einer bestimmten Frequenz an der Stelle der Sequenz mit Homologie statt, und das gesamte eingeschleuste Plasmid wird in das Chromosom inkorporiert. Wenn außerdem danach eine Rekombination, an einer Position der Sequenz mit Homologie zum Chromosom stattfindet, fällt das Plasmid vom Chromosom ab. Zu diesem Zeitpunkt wird das Gen mit der eingeschleusten Mutation manchmal in Abhängigkeit von der Position an der die Rekombination stattgefunden hat, bevorzugt auf dem Chromosom fixiert, und das originale normale Gen fällt zusammen mit dem Plasmid aus dem Chromosom. Durch Selektionieren eines solchen bakteriellen Stamms ist es möglich, einen bakteriellen Stamm zu erhalten, in dem das normale Gen auf dem Chromosom durch das Gen mit eingeschleuster Mutation mit einer Basensubstituierung, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion substituiert ist.

[3] Verbesserung der L-Glutaminsäure-Produktionsfähigkeit eines Tensid-temperatursensitiven Mutantenstamm durch Verbesserung von Genen des Glutaminsäure-Biosynthesesystems

Die L-Glutaminsäure-Produktionsfähigkeit des Tensidtemperatursensitiven Mutantenstammes des L-Glutaminsäureproduzierenden Bakteriums kann durch Optimierung von Genen des Glutaminsäure-Biosynthesesystems verbessert werden. Die Gene des Glutaminsäure-Biosynthesesystems, die in Zellen verbessert wurden, schließen beispielsweise Phosphofructokinase des glycolytischen Wegs (PFK, japanische Offenlegungsschrift Nr. 63-102692), Phosphoenolpyruvatcarboxylase eines anaplerotischen Weges (PEPC, japanische Patent-Offenlegung Nrn. 60-87788 und 62- 55089), Citrat-Synthase des TCA-Zyklus (CS, japanische Patent-Offenlegungs-Nrn. 62-201585 und 63-119688), Acinitathydratase (ACO, japanische Offenlegungs-Nr. 62- 294086), Isocitratdehydrogenase (ICDH, japanische Patent- Offenlegungs-Nrn. 62-166890 und 63-214189), und Glutamatdehydrogenase, die die Aminierungsreaktion katalysiert (GDH, japanische Patent-Offenlegungs-Nr. 61-268185) ein.
Verschiedene Verfahren, die unten beschrieben werden, können möglich sein, um die zuvor erwähnten Gene zu erhalten.
(1) Ein Mutantenstamm wird erhalten, indem eine charakteristischer Eigenschaft als Ergebnis des Auftretens einer Mutation eines Zielgens gezeigt wird und diese Eigenschaft verschwindet durch das Einschleusen des Zielgens. Ein Gen, das die Eigenschaft des Mutantenstamms komplementiert, wird vom Chromosom eines coryneformen Bakteriums erhalten.
(2) Wenn ein Zielgen bereits von einem anderen Organismus erhalten wurde, und seine Nukleotidsequenz schon aufgeklärt wurde, dann wird das Zielgen mit Hilfe einer Hybridisierungstechnik unter Verwendung von DNA als Probe in einer Region mit hoher Homologie benutzt.
(3) Wenn eine Nukleotidsequenz eines Zielgens kaum detailliert aufgeklärt worden ist, dann wird ein Genfragment, das das Zielgen enthält, mit Hilfe der PCR-Methode (Polymerase-Kettenreaktionsmethode) unter Verwendung des Chromosoms eines coryneformen Bakteriums als Matrize verwendet.
Das hier verwendete Chromosom kann nach dem Verfahren von Saito et al., das oben beschrieben wurde, erhalten werden (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)). Jedes Wirt-Vektorsystem, das in coryneformen Bakterien erhältlich ist, kann verwendet werden, und die oben beschriebenen können benutzt werden. Das Verfahren in dem zuvor erwähnten Punkt (3), das wirksam ist, wenn die Nukleotidsequenz aufgeklärt worden ist, wurde in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung unten beschrieben.
Wenn ein Gen nach den Methoden der Punkte (2) und (3) die oben beschrieben wurden, erhalten wird, hat ein Zielgen gelegentlich nicht nur einen einzigartigen Promotor. In solch einem Fall kann das Zielgen durch Insertion eines DNA- Fragments mit Promotoraktivität in den coryneformen Bakterien in einer Position upstream des Zielgens exprimiert werden. Um die Expression eines Zielgens zu steigern, kann es möglich sein, daß das Zielgen in einer Position downstream eines starken Promotors ligiert wird. Starke Promotoren unter den Promotoren, die in Zellen der coryneformen Bakterien arbeiten, schließen beispielsweise den lac-Promotor, den tac- Promotor und den trp-Promotor von Escherichia coli (Y. Morinaga, M. Tsuichiya, K. Miwa und K. Sano, J. Biotech., 5, 305-312 (1987)) ein. Außerdem ist der trp-Promotor der coryneformen Bakterien auch ein bevorzugter Promotor (japanische Offenlegungs-Nr. 62-195294). Der trp-Promotor der coryneformen Bakterien wurde zur Expression des PEPC-Gens in dem unten beschriebenen Beispiel der vorliegenden Erfindung verwendet.

[4] Produktion von L-Glutaminsäure durch einen Tensidtemperatursensitiven Mutantenstamm, der von einem L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt

Das Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Kultivieren des Tensidtemperatursensitiven Mutantenstamms, der von einem L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt, der wie oben beschrieben in einem Flüssigmedium erhalten wurde, das Produzieren und Akkumulieren von L-Glutaminsäure in dem Medium und das Absammeln aus dem Medium.
Es wird ein gewöhnliches Nährmedium, das eine Kohlenstoff- Quelle, eine Stickstoff-Quelle, anorganische Salze, Wachstumsfaktoren etc. enthält als Flüssigmedium für die Kultivierung des oben erwähnten Mutantenstamms gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Der Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung hat die Fähigkeit L-Glutaminsäure zu produzieren, ohne daß irgendein Biotinwirkung unterdrückendes Mittel in einem Medium enthalten sein muß - selbst im Fall einer Kultivierung in irgendeinem Flüssigmedium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält.
Kohlenwasserstoffe wie Glucose, Fructose, Sucrose, Abfallmelassen, Stärkehydrolysate; Alkohole wie Ethanol und Glycerol; und organische Säuren wie Essigsäure, können als Kohlenstoff-Quelle verwendet werden. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat, Harnstoff, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Getreideweicheflüssigkeit, etc. können als Stickstoff-Quelle verwendet werden. Wenn ein Mutantenstamm mit Auxotrophie verwendet wird, wird eine benötige Substanz als Präparat oder als natürliches Material, das dieses enthält, hinzugegeben.
Die Fermentierung wird für 2 bis 7 Tage unter aeroben Bedingungen durchgeführt, die durch Schüttelkultivierung, Belüftung und Agitationskultivierung oder ähnliche erreicht wird, während der pH der Kulturflüssigkeit bei 5 bis 9 bewahrt wird. Der pH wird unter Verwendung von Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniumgas, wäßriges Ammonium und ähnliche eingestellt. Die Kultivierungstemperatur beträgt 24 bis 37ºC. Ein besseres Ergebnis wird jedoch durch das Initiieren einer Kultivierung bei ungefähr 31,5ºC, und das Erhöhen der Temperatur auf 33 bis 40ºC, bevorzugt ungefähr 37ºC in einem Zwischenstadium der Kultivierung erreicht. D. h., daß das Bakterium ausreichend in der Nähe eines Wachstumstemperaturoptimums proliferiert, und die Temperatur dann während der Kultivierung erhöht wird. So wird die Produktion von L-Glutaminsäure ohne die Zugabe irgendeines die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels initiiert und L-Glutaminsäure wird produziert und in einer beträchtlichen Menge in einer Kulturflüssigkeit akkumuliert.
Die vorstelligen Erfinder haben herausgefunden, daß der DTSR- Protein-defiziente Stamm eine Fähigkeit hat, L-Glutaminsäure zu produzieren ohne irgendein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel in einem Medium, selbst in dem Fall der Kultivierung in einem Flüssigmedium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, enthalten zu haben. Der dtsR-Protein-defiziente Stamm benötigt Oleinsäure für seine Kultivierung. Der Tensid-temperatursensitive Stamm benötigt jedoch nicht die Zugabe von Oleinsäure, wenn er bei einer gewöhnlichen Temperatur, nämlich ungefähr 31,5ºC kultiviert wird.
Das Einsammeln von L-Glutaminsäure, die produziert und in dem Kulturmedium akkumuliert wurde, kann nach einem gewöhnlichen Verfahren durchgeführt werden. So kann beispielsweise ein Verfahren mittels Ionenaustauschharz, ein Verfahren zur Kristallisierung etc. verwendet werden. Spezifisch wird hier die L-Glutaminsäure adsorbiert und unter Verwendung eines Anionaustauschharzes getrennt, oder durch Neutralisierung kristallisiert.

< 2> Herstellung eines Tensid-temperatursensitiven Mutantenstamms mit L-Lysin-Produktionsfähigkeit und Herstellung von L-Lysin und L-Glutaminsäure

Wenn ein konventionelles und bekanntes L-Lysin-produzierendes Bakterium, das von einem coryneformen L-Glutaminsäureproduzierenden Bakterium abstammt in einem Medium kultiviert wird, das eine übermäßige Menge an Biotin von nicht weniger als 10 ug/l enthält, produziert und akkumuliert es nur L-Lysin in der Kulturflüssigkeit und stellt im wesentlichen keine L-Glutaminsäure auf die gleiche Weise wie das L-Glutaminsäure-produzierende Bakterium, das oben beschrieben wurde, her, solange nicht ein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel wie Tenside oder Antibiotika in dem Medium enthalten sind, in einem anfänglichen oder Zwischenstadium der Kultivierung. Der Mutantenstamm, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat die Fähigkeit sowohl L-Lysin und L-Glutaminsäure zu produzieren ohne daß ein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel in einem Medium enthalten ist, selbst wenn es in irgendeinem Flüssigmedium kultiviert wird, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält. Ein solcher Mutantenstamm hat L-Lysin-Produktivität zusätzlich zur Eigenschaft zum Tensid-temperatursensitiven Mutantenstamm des L-Glutaminsäure produzierenden Bakteriums, der oben beschrieben wurde. So ist der zweite Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung ein Mutantenstamm, der von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt mit einer Mutation, die L-Lysin-Produktionsfähigkeit ermöglicht, und einer temperatursensitiven Mutation gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel sowie der Fähigkeit sowohl L-Lysin und L-Glutaminsäure in Abwesenheit jeglichen die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels in einem Medium zu produzieren, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält.
Die L-Lysin-Produktionsfähigkeit kann für gewöhnlich unter Verwendung einer resistenten Mutation gegen S-(2-Aminoethyl)- L-cystein erreicht werden (nachfolgend manchmal als "AEC" bezeichnet) (japanische Patentveröffentlichung Nr. 48-28078). Weitere L-Lysin-produzierende Mutantenstämme schließen beispielsweise einen Mutantenstamm ein, der eine Aminosäure wie beispielsweise L-Homoserin für sein Wachstum benötigt (japanische Patentveröffentlichung Nr. 56-6499); ein Mutantenstamm, der eine Resistenz gegenüber AEC aufweist und Aminosäuren benötigt wie beispielsweise L-Leucin, L-Homoserin, L-Prolin, L-Serin, L-Arginin, L-Alanin und L-Valin (United States Patent Nrn. 3 708 695 und 3 825 472); eine L-Lysin-produzierender Mutantenstamm, der eine Resistenz gegen DL-α-Amino-&epsi;-caprolactam aufweist, α-Amino- lauryllactam, Apsartat-Analog, Sulfadrug, Chinoid, N-Lauroylleucin; ein L-Lysin-produzierender Mutantenstamm, der eine Resistenz gegenüber Inhibitoren der Oxyaloacetatdecarboxylase oder Enzymen des Atmungssystems aufweist (japanische Patent-Offenlegungsschrift Nrn. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 und 56-39778 und japanische Patentveröffentlichung Nrn. 53-43591 und 53-1833); ein L-Lysin-produzierender Mutantenstamm, der Inositol oder Essigsäure benötigt (japanische Patent-Offenlegungs-Nrn. 55-9784 und 56-8692); ein L-Lysin-produzierender Mutantenstamm, der eine Sensitivität gegen Fluorpyruvatsäure oder eine Temperatur nicht weniger als 34ºC aufweist (japanische Patent-Offenlegungs-Nrn. 55-9783 und 53-86090); und ein L-Lysin produzierender Mutantenstamm (United States Patent Nr. 4 441 997).
Der zweite Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch das Erzeugen einer Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel, wie beispielsweise Tensiden und Antibiotika in einem L-Lysin-produzierenden Bakterium, das von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium abstammt, induziert werden.
Die Temperatursensitivität kann auf die gleiche Weise wie die Einschleusung der Temperatursensitivität in den ersten Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, wie in Punkt < 1> oben beschrieben worden ist. So kann der bakterielle Stamm mit Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel durch Anwenden einer Mutationsbehandlung erhalten werden, wie beispielsweise ultravioletter Lichtbestrahlung, Röntgenstrahlen-Bestrahlung, radioaktiver Bestrahlung, und Behandlung mit Mutagen-Mitteln bei einem coryneformen Glutaminsäure produzierenden Bakterium mit L-Lysin-Produktionsfähigkeit, gefolgt vom Durchführen einer Replika-Methode auf einem Agarplatten-Medium, das ein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel enthält. So wird das Wachstumsstadium eines Parentalstamms in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei einer Kultivierungstemperatur von 33 bis 37ºC, bevorzugt nicht weniger als 34ºC beobachtet, um die maximale Konzentration des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels zu bestimmen, bei der Wachstum erkennbar ist. Ein Mutantenstamm, der nicht wachsen kann oder eine auffällig gesenkte Wachstumsgeschwindigkeit in Gegenwart des die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels bei der maximalen Konzentration, bei der gleichen Temperatur wie die oben verwendete, aufweist, kann abgetrennt werden. Alternativ dazu kann ein Mutantenstamm, der gegenüber den die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel temperatursensitiv ist, wie in Punkt < 1> [2] gezeigt, durch genetische Rekombination erhalten werden. Alternativ dazu kann der zweite Mutantenstamm, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird auch durch das vorherige Induzieren eines Mutantenstamms, der temperatursensitiv gegenüber dem Biotinwirkung unterdrückenden Mittel ist, von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium erhalten werden, gefolgt durch das Erzeugen einer L-Lysin- Produktionsfähigkeit bei dem bakteriellen Mutantenstamm.
Die Temperatursensitivität gegenüber dem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel und die L-Lysin-Produktionsfähigkeit werden in dem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium wie oben beschrieben erzeugt. So kann ein Mutantenstamm gezüchtet werden, der die Fähigkeit hat, sowohl L-Lysin und L-Glutaminsäure in Abwesenheit von jedem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel in einem Medium zu produzieren, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält.
Wie unter Punkt < 1> [3] beschrieben, kann die Produktionsfähigkeit von L-Glutaminsäure beim zweiten Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung durch das Verbessern von Genen des Glutaminsäure-Biosynthesesystems verbessert werden, wie oben beschrieben. Auf die gleiche Weise kann die L-Lysin-Produktionsfähigkeit durch das Verbessern von Genen des L-Lysin-Biosystems verbessert werden.
Bekannte Beispiele der Gene des L-Lysin-Biosynthesesystems, die in Zellen verbessert worden sind, schließen ein Gen ein, das für ein Aspartokinase-α-Untereinheit-Protein oder β-Untereinheit-Protein codiert, indem die konzertierte Inhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im wesentlichen desensibilisiert ist (WO 94/25605 International Publication Pamphlet), eine Wildtyp-Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen, das von einem coryneformen Bakterium stammt (japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 60-87788), ein Gen, das für eine Wildtyp-Dihydrodipicolinat-Synthetase codiert, die aus einem coryneformen Bakterium stammt (japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-55149), etc. Ein gewöhnliches Nährmedium, das ein Kohlenstoff-Quelle, eine Stickstoff-Quelle, anorganische Salze, Wachstumsfaktoren etc. enthält, das ähnlich dem ist, das für die Kultivierung des ersten Mutantenstamms, welcher oben beschrieben wurde, verwendet wird, wird als Flüssigmedium für die Kultivierung des zweiten Mutantenstamms der vorliegenden Erfindung verwendet. Der zweite Mutantenstamm der vorliegenden Erfindung hat die Fähigkeit L-Lysin und L-Glutaminsäure herzustellen, ohne daß ein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel in einem Medium enthalten sein muß, sogar im Falle einer Kultivierung in irgendeinem Flüssigmedium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält.
Eine Fermentierung wird für 2 bis 7 Tage unter aeroben Konditionen, was durch eine Schüttelkultur, Agitations- und Belüftungskultivierung oder ähnliche erreicht wird während der pH der Kulturflüssigkeit bei 5 bis 9 gehalten wird. Der pH wird unter Verwendung von Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniumgas, wäßrigem Ammonium und ähnlichem eingestellt. Die Kultivierungstemperatur beträgt 24 bis 37ºC. Ein besseres Ergebnis wird jedoch durch das Beginnen der Kultivierung bei ungefähr 31,5ºC erhalten, und dann das Erhöhen der Temperatur auf 33 bis 40ºC, bevorzugt ungefähr 37ºC bei einem Zwischenstadium der Kultivierung. So wird L-Lysin hauptsächlich bei ungefähr 31,5ºC produziert, aber die Rate der L-Glutaminsäure-Produktion wird durch das Steigern der Temperatur während der Kultivierung erhöht. Durch das Verwenden dieses Phänomens ist es möglich, das Verhältnis von L-Lysin zu L-Glutaminsäure in einer Kulturflüssigkeit, die schlußendlich wie gewünscht erhalten wird, zu kontrollieren.
Ein gewöhnliches Verfahren kann zum Einsammeln von L-Lysin und L-Glutaminsäure verwendet werden, die in der Kulturflüssigkeit produziert und akkumuliert wurden. Beispielsweise kann ein Ionenaustauschharzverfahren, ein Kristallisierungsverfahren, etc. verwendet werden. Wenn ein Ionenaustauschharzverfahren verwendet wird, wird L-Lysin zuerst adsorbiert und von der Kulturflüssigkeit unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes getrennt, und dann wird L-Glutaminsäure adsorbiert und unter Verwendung einen Anionenaustauscherharzes abgetrennt, oder durch Neutralisierung kristallisiert. Wenn L-Lysin und L-Glutaminsäure als Gemisch verwendet werden, ist es natürlich nicht notwendig diese Aminosäuren voneinander zu trennen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt Einflüsse, die durch PESP auf das Wachstum von Brevibacterium lactofermentum AJ13029 und seinen Parentalstamm ATCC 13869 ausgeübt werden bei 31,5ºC und 35ºC.
Fig. 2 zeigt eine Tensidresistenz von Brevibacterium lactofermentum AJ11060 mit einem eingeschleusten Plasmid, das das dtsR-Gen enthält.
Fig. 3 zeigt Einflüsse, die durch PESP auf das Wachstum von Brevibacterium lactofermentum AJ12993 bei 31,5ºC und 34ºC ausgeübt werden.

Beste Art der Durchführung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird spezieller unten mit Bezug auf die Beispiele erklärt.

Beispiel 1: Herstellung eines Mutantenstamms, der temperatursensitiv gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel ist und vom coryneformen

1. Messung der Sensitivität des L-Glutaminsäureproduzierenden Bakteriums gegenüber den die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel durch das Replikaverfahren

Die Sensitivität von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 gegenüber Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat (PESP) wurde wie folgt gemäß der Replikamethode gemessen.
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde über Nacht bei 31,5ºC auf einem CM2B-Agarplatten-Medium mit einer Zusammensetzung kultiviert, die in der Tabelle 1 gezeigt ist, um bakterielle Zellen zu erhalten. Sie wurden in sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, auf dem zuvor erwähnten Agarplatten-Medium ausgesät und bei 31,5ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert, um Kolonien zu bilden. Sie wurden auf einem CM2B-Agarmedium, das mit einer entsprechenden Konzentration an PESP versetzt war, repliziert und bei 35ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert, um das Wachstumsstadium zu beobachten.

Tabelle 1

Inhaltsstoff Konzentration
Polypepton (hergestellt von Nihon Pharmaceutical) 1,0%
Hefeextrakt (produziert von Difco) 1,0%
NaCl 0,5%
D-Biotin 10 ug/l
Agar 1,5%
pH 7,2
Im Ergebnis wurde bestätigt, daß die wachstumerlaubende Konzentration einen Schwellenwert in der Nähe von 3 mg/dl der PESP-Konzentration bei 35ºC hat, wie in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

2. Induzierung eines Mutantenstamms der eine Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel aufweist

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde auf einem Bouillon-Agarmedium bei 31,5ºC für 24 Stunden kultiviert, um bakterielle Zellen zu erhalten. Die erhaltenen bakteriellen Zellen wurden bei 30ºC für 30 Minuten mit einer wäßrigen Lösung aus 250 ug/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt. Eine Suspension der bakteriellen Zellen bei einer Überlebensrate von 1% wurde dann auf CM2B Agarplatten-Medium ausgesät und bei 31,5ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert, um Kolonien zu bilden. Sie wurden auf einen CM2B Agarmedium repliziert und mit einem CM2B-Agarmedium, das mit 3 mg/dl an PESP versetzt war, und bei 35ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert. Bakterielle Stämme wurde erhalten, die auf dem CM2B-Medium wuchsen, aber keine beobachtbares Wachstum auf den CM2B-Medium enthaltend 3 mg/dl an PESP. So wurden 720 Stämme aus ungefähr 10 000 Kolonien erhalten. Jede der erhaltenen bakteriellen Stämme wurde auf das Vorhandensein oder auf die Abwesenheit von Wachstum bei 35ºC auf der CM2B Agarplatte rückbestätigt, die 3 mg/dl an PESP enthält. Stämme, die offensichtlich keine Sensitivität aufwiesen, wurden ausgeschlossen, und 435 Stämme, die eine Sensitivität aufwiesen, wurden erhalten.

3. Bestätigung der L-Glutaminsäure-Produktionsfähigkeit von Mutantenstämmen, die eine Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel aufweisen

Die L-Glutaminsäure-Produktionsfähigkeit wurde wie folgt bei den 435 erhaltenen Mutantenstämmen aus dem oben beschriebenen Punkt 2 und ihrem Parentalstamm ATCC 13869 bestätigt.
ATCC 13869-Stamm und jeder der Mutantenstämme wurde auf dem CM2B-Agarmedium bei 31,5ºC für 20 bis 20 Stunden kultiviert, um bakterielle Zellen zu erhalten, die in ein Flüssigmedium eingesät wurden, das eine Zusammensetzung aus Medium A in Tabelle 3 hat, um die Kultivierung unter Schütteln bei 31,5ºC zu starten. Nach ungefähr 22 Stunden wurde Medium neu hinzugegeben, so daß die Endkonzentrationen wie in Medium B in Tabelle 3 gezeigt waren, gefolgt vom Durchführen einer Kultivierung für ungefähr 24 Stunden bei 31,5ºC oder nach dem Wechseln der Kultivierungstemperatur auf 35ºC bis 37ºC. Nach Beendigung der Kultivierung wurde das Vorhandensein oder die Abwesenheit von L-Glutaminsäure-Produktion unter Verwendung eines Biotech Analysers untersucht, der von Asahi Chemical Industry hergestellt wird. Im Ergebnis wurde bestätigt, daß 106 Stämme der 435 Mutantenstämme Glutaminsäure produzierten. Tabelle 3
pH 7,0 (eingestellt mit KOH)
Die akkumulierten Mengen L-Glutaminsäure bei jeder Temperatur werden in Tabelle 4 für die entsprechenden Stämme der Mutantenstämme und ATCC 13869-Stamm gezeigt. Tabelle 4 Akkumulierung von Glutaminsäure durch die Mutantenstämme (g/dl)

4. Beständigkeit der Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel

Die Temperatursensitivität gegenüber PESP der Mutantenstämme, die unter Punkt 3 erhalten wurden, wie oben beschrieben wurde, wurde wie folgt mit Hilfe einer Flüssigkultur bestätigt.
Jeder der Mutantenstämme und ihr Parentalstamm wurden auf dem CM2B-Agarplattenmedium bei 31,5ºC für 24 Stunden kultiviert, um bakterielle Zellen zu erhalten. Die erhaltenen bakteriellen Zellen wurden in ein CM2B-Flüssigmedium inokuliert sowie in ein CM2B-Flüssigmedium, das PESP bei einer Konzentration von 3 mg/dl enthält, um eine Kultivierung unter Schütteln bei 31,5ºC und 37ºC für 24 Stunden durchzuführen. Die optischen Dichten der erhaltenen Kulturflüssigkeiten wurden bei 660 nm gemessen. Der relative Wachstumsgrad in dem PESP-suplementierten Medium wurde bestimmt unter der Maßgabe, daß das Wachstum in dem Medium ohne Zugabe von PESP bei jeder Temperatur als 100 betrachtet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
Wie in dieser Tabelle gezeigt wird, hat Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 als Parentalstamm einen relativen Wachstumsgrad von 85 bei 37ºC in Gegenwart von 3 mg/dl an PESP, während jeder der Mutantenstämme einen relativen Wachstumsgrad von 40 oder weniger in Gegenwart von PESP aufweist, also klar eine Sensitivität gegenüber PESP bei einer Konzentration von 3 mg/dl hat.
Der relative Wachstumsgrad bei 31,5ºC und 35ºC in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an PESP wird in Fig. 1 für den Mutantenstamm Nr. 21 aus den in Punkt 3 oben beschriebenen erhaltenen Mutantenstämmen und seinem Parentalstamm ATCC 13869 gezeigt.
Von den Mutantenstämmen wurde Nr. 21 als Brevibacterium lactofermentum AF13029 bezeichnet, und am 2. September 1994 am National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-14501 hinterlegt, in eine internationale Hinterlegung, die auf dem Budapester Vertrag vom 1. August 1995 beruht, überführt und mit der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5189 ausgezeichnet.

Beispiel 2: Herstellung von L-Glutaminsäure

1. Untersuchung des Kultivierungstemperaturwechsel-timings

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 oder AJ13029 wurden in ein Saatkulturmedium mit einer in Tabelle 6 gezeigten Zusammensetzung inokuliert, und unter Schütteln bei 31,5ºC für 24 Stunden kultiviert, um eine Saatkultur zu erhalten. Ein Medium für eine Full-scale-Kultivierung mit einer Zusammensetzung, die in Tabelle 2 gezeigt ist, wurde jeweils in einer Menge von 300 ml verteilt und in einen Fermentierbottich aus Glas mit einem Volumen von 500 ml geschüttet, und durch Erwärmen sterilisiert. Anschließend wurden 40 ml der Saatkultur hierein inokuliert. Die Kultivierung wurde unter Verwendung einer Rührgeschwindigkeit von 800 bis 1300 Upm, einer Belüftungsmenge von 1/2 bis 1/l vvm, und einer Kultivierungstemperatur von 31,5ºC gestartet. Die Kulturflüssigkeit wurde bewahrt, um unter Verwendung von Ammoniumgas einen pH-Wert von 7,5 zu haben. Die Kultivierungstemperatur wurde 8, 12 oder 16 Stunden nach dem Start der Kultivierung auf 37ºC gewechselt. Eine Kontrolle zum Vergleich wurde zur Verfügung gestellt, in der die Kultivierungstemperatur nicht gewechselt wurde und eine Kultivierung bei genau 31,5ºC wurde fortgesetzt. Tabelle 6
In jedem Experiment wurde die Kultivierung zu einem Zeitpunkt von 20 bis 40 Stunden beendet, bei dem die Glucose komplett konsumiert war. Die Menge an L-Glutaminsäure, die hergestellt und in der Flüssigkultur akkumuliert wurde, wurde gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7
Anhand der Ergebnisse wird verständlich, daß der AJ13029- Stamm L-Glutaminsäure in Abwesenheit jedes die Biotinwirkung unterdrückenden Mittels selbst in einem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, produziert, indem die Kultivierungstemperatur von 31,5ºC auf 37ºC gewechselt wird, und daß die Menge an L-Glutaminsäure proportional zum frühen Zeitpunkt des Wechseltimings der Kultivierungstemperatur ansteigt. Im Gegensatz dazu wurde im Fall von ATCC 13869 als Parentalstamm nur eine geringe Produktion an L-Glutaminsäure beobachtet, selbst wenn die Kultivierungstemperatur gewechselt wurde.
Die bakteriellen Zellen wurden nach beendeter Kultivierung durch Zentrifugieren aus 1 l an Kulturflüssigkeit, die einem Temperaturwechsel 8 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung unterworfen wurde, entfernt. Die L-Glutaminsäure wurde abgetrennt und aus dem erhaltenen Überstand gemäß einem gewöhnlichen Verfahren unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes getrennt und gereinigt. Die Kristalle des erhaltenen Natrium-L-glutamats betrugen 64,3 g.

2. Untersuchung der Wechseltemperatur

Die Kultivierung von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und AJ13029 wurde bei 31,5ºC gestartet, indem ein Fermentierbottich mit einem Volumen von 500 ml, der aus Glas hergestellt war, auf gleiche Weise wie unter Punkt 1 oben gestartet. Die Kultivierungstemperatur wurde von 34ºC, 37ºC oder 39ºC 8 Stunden nach dem Beginn der Kultivierung gewechselt. Eine Kontrolle zum Vergleich wurde gegeben, indem die Kultivierungstemperatur nicht gewechselt wurde, um die Kultivierung exakt bei 31,5ºC fortzusetzen. In jedem Experiment wurde die Kultivierung zu einem Zeitpunkt nach 20 bis 40 Stunden beendet, bei dem die Glucose vollständig konsumiert war. Die Menge an L-Glutaminsäure, die in der Kulturflüssigkeit hergestellt und akkumuliert wurde, wurde gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8
Aus den Ergebnissen wird verständlich, daß es eine Tendenz gibt, daß die Menge an L-Glutaminsäure ansteigt, wenn die Temperatur nach dem Wechsel hoch ist, wenn der AJ13029-Stamm kultiviert wird und die Kultivierungstemperatur gewechselt wird.

Beispiel 3: Herstellung eines temperatursensitiven Mutantenstamms mittels genetischer Kombination, der von einem coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakterium stammt, gegen ein die Biotinwirkung unterdrückendes Mittel

1. Herstellung von chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (Wildtyp-Stamm des coryneformen L-Glutaminsäure produzierenden Bakteriums)

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde in 100 ml T-Y- Medium (Bacto-Trypton (Difco) 1%, Bacto-Hefeextrakt (Difco) 0,5%, NaCl 0,5% (pH 7,2)) inokuliert, und bei einer Temperatur von 31,5ºC für 8 Stunden kultiviert, um eine Kulturpräparation zu erhalten. Die Kulturpräparation wurde durch Zentrifugation bei 3000 Upm für 15 Minuten behandelt, um 0,5 g feuchter bakterieller Zellen zu erhalten. Chromosomale DNA wurde dann aus den bakteriellen Zellen in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Saito und Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) erhalten. Danach wurden 60 ug der chromosomalen DNA und 3 Einheiten eines Restriktionsenzyms Sau3AI jeweils mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 50 mM NaCl, 10 mM MgSO&sub4; und 1 mM Dithiothreitol (pH 7,4)) gemischt, und bei einer Temperatur von 37ºC für 30 Minuten umgesetzt. Die Lösung wurde nach Beendigung der Reaktion einer Phenol-Extraktion und Ethanol-Präzipitation einem gewöhnlichen Verfahren unterworfen, um 50 ug chromosomaler DNA-Fragmente von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, die mit Sau3AI verdaut waren, zu erhalten.

2. Konstruktion einer Gen-Bibliothek aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 unter Verwendung von Plasmid- Vektor-DNA

Um eine Gen-Bibliothek herzustellen, die in der Lage ist, sowohl in Escherichia coli und in Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, eingeschleust werden kann, wurde ein Plasmid, das sich in Zellen dieser beiden autonom repliziert, hergestellt. Spezifisch wurde das Plasmid pHK4 (japanische Patent-Offenlegungs-Nr. 5-7491) mit einem Replikationsursprung von einem bereits erhaltenen Plasmid pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), das autonom in coryneformen Bakterium replizierbar ist, mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI verdaut, um ein Genfragment zu erhalten, das den Replikationsursprung enthält. Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung eines DNA-blunt-ended-Bildungskits (hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit) blunt-endgeschnitten und dann in eine SalI- Schnittstelle eines Plasmid-Vektors pHSG399 (hergestellt von Takara Shuzo) unter Verwendung eines SalI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, um pSAC4 herzustellen. Escherichia coli HB101, die pHK4 beinhalten, wurden als Escherichia coli AJ13136 bezeichnet und am 1. August 1995 im National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5186 hinterlegt.
pSAC4 (20 ug), das wie oben beschrieben, konstruiert wurde und das Restriktionsenzym BamHI (20 Einheiten) wurden mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 100 mM NaCl und 10 mM Magnesiumsulfat (pH 7,4)) gemischt, und bei einer Temperatur von 37ºC für 2 Stunden umgesetzt, um eine verdaute Lösung zu erhalten. Die Lösung wurde Phenol-Extraktions- und Ethanol- Präzipitationsbehandlungen in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren unterworfen. Danach wurden die DNA- Fragmente unter Verwendung einer Behandlung mit bakterieller alkaliner Phosphatase in Übereinstimmung mit einem Verfahren aus Molecular Cloning 2. Ausgabe, (J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl. 56 (1989)) dephosphoryliert, gefolgt von Behandlungen einer Phenol-Extraktion und einer Ethanol-Präzipitation in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren, um zu verhindern, daß DNA-Fragmente, die aus diesem Plasmid-Vektor stammen, religieren.
pSAC4 (1 ug) verdaut mit BamHI, die chromosomalen DNA- Fragmente (1 ug) von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 verdaut mit Sau3AI, die unter Punkt 1 erhalten worden sind und T4 DNA-Ligase (2 Einheiten) (hergestellt von Takara Shuzo) wurden zu 66 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gegeben, der 66 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol und 10 mM ATP enthält und bei einer Temperatur von 16ºC für 16 Stunde eingesetzt, um die DNA zu ligieren. Danach wurde die DNA- Mischung verwendet, um Escherichia coli DH5 in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren zu transformieren, welche auf einem L-Agar-Medium ausgebreitet wurden, das 170 ug/ml an Chloramphenicol enthält. Ungefähr 20 000 Kolonien wurden erhalten. Dadurch wurde eine Gen- Bibliothek konstruiert.

3. Transformation von Brevibacterium lactofermentum AJ11060

Die rekombinante DNA wurde aus den ungefähr 20 000 oben beschriebenen Kolonien gewonnen. Das Gewinnen wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Saito und Miura, das oben beschrieben wurde, durchgeführt.
Die rekombinante DNA-Mischung wurde in 50 Batches geteilt, die in den Mutantenstamm AJ11060 mit einer erhöhten Tensid- Sensitivität in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren zur Transformation unter Verwendung von elektromagnetischen Impulsen (japanische Patentoffenlegungs- Nr. 2-207791) eingeschleust wurden. Die Transformanten wurden in ein Glucose-suplementiertes L-Agar-Medium inokuliert, und stationär bei 31,5ºC kultiviert. Dadurch traten ungefähr 20 000 Transformanten auf. Diese Transformanten wurden dann auf einer Platte repliziert, die 30 mg/l eines Tensid enthält. Mehrere Stämme, die eine Resistenz gegenüber dem Tensid aufwiesen, und in der Lage waren auf der zuvor genannten Platte zu wachsen, wurden aus diesen erhalten.

4. Untersuchung der Tensidresistenz des Stamms, der mehrere Kopien des dtsR-Gens enthält

Rekombinante DNA wurde jeweils aus mehreren gezüchteten Stämmen extrahiert und der AJ11060-Stamm wurde unter Verwendung dieser DNA retransformiert. Ein Stamm, der auch in diesem Experiment eine Tensidresistenz aufwies, wurde erhalten. Rekombinante DNA, die in diesem Stamm enthalten war, wurde als "pDTR6" bezeichnet und das Gen, das Tensidresistenz vermittelt, das von dem Plasmid getragen wurde, wurde als "dtsR" bezeichnet. AJ11060-Stamm, in dem das Plasmid eingeschleust worden ist, wurde in seinem Wachstum in einem Flüssigmedium unterdrückt (80 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 g von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4;·7H&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat, 200 ug Thiaminhydrochlorid, 300 ug Biotin, 4 mg Chloramphenicol, 3,0 g Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat und 50 g CaCO&sub3; in einem Liter reinen Wasser (wobei der pH des Mediums mit KOH auf 8,0 eingestellt worden ist)) zu dem 3 g/l eines Tensid hinzugegeben wurde (Fig. 2).

5. Präparation der Plasmid-DNA

Das Plasmid wurde nach einem Standardverfahren aus AJ11060/pDTR6 präpariert, das die erhaltene rekombinante DNA wie oben beschrieben enthält, und in Escherichia coli JM109 eingeschleust. Die erhaltenen Escherichia coli JM109/pDTR6 wurden vorübergehend bei einer Temperatur von 37ºC für 24 Stunden in 20 ml eines Mediums kultiviert, das umfaßt 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt und 0,5% NaCl. Die erhaltene Kulturflüssigkeit (20 ml) wurde in ein Medium (1 l) mit der gleichen Zusammensetzung inokuliert, wie oben beschrieben, um eine Kultivierung bei einer Temperatur von 37ºC für 3 Stunden durchzuführen, gefolgt von der Zugabe von Chloramphenicol (0,2 g). Eine Kultivierung wurde außerdem bei der gleichen Temperatur für 20 Stunden durchgeführt, um eine Kulturflüssigkeit zu erhalten. Als nächstes wurde die Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren bei 3 000 Upm für 10 Minuten behandelt, um jeweils 2 g feuchter Bakterienzellen zu erhalten, die in 350 mmol Tris-HCl-Puffer (20 ml, pH 8,0) suspendiert wurden, der 25% Sucrose enthält. Lysozym (hergestellt von Sigma) 10 mg, 0,25 M EDTA-Lösung (8 ml, pH 8,0) und 20% Natriumdodecylsulfat-Lösung (8 ml) wurden dann jeweils dazugegeben. Eine Behandlung bei gleichbleibender Temperatur wurde bei einer Temperatur von 60ºC für 30 Minuten durchgeführt, um eine bakterielle Lysat- Lösung zu erhalten. Eine Lösung von 5 M NaCl (13 ml) wurde zu der bakteriellen Lysat-Lösung hinzugegeben, um eine Behandlung bei einer Temperatur von 4ºC für 16 Stunden durchzuführen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 15 000 Upm über 30 Minuten. Der erhaltene Überstand wurde Behandlungen einer Phenol-Extraktion und Ethanol- Präzipitation in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren zur Präzipitierung von DNA unterworfen.
Das Präzipitat wurde unter reduziertem Druck getrocknet, und dann in 10 mM Tris-HCl-Puffer (6 ml, pH 7,5) enthaltend 1 mM EDTA gelöst. Cäsiumchlorid (8 g) und Ethidiumbromid (0,2 ml, 19 mg/ml) wurden dazugegeben. Eine Äquilibirum- Dichtegradienten-Zentrifugation wurde bei 39 000 Upm über 42 Stunden unter Verwendung einer Ultrazentrifuge durchgeführt, um die DNA zu isolieren. Ethidiumbromid wurde unter Verwendung von n-Butan entfernt, gefolgt von einer Dialyse gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 1 mM EDTA, um 500 ug pDTR6 als gereinigte rekombinante DNA zu erhalten. Den Escherichia coli JM109/pDTR6 wird die eigene Nummer AJ12967 gegeben. Dieser Stamm wurde am 22. Februar 1994 im National Institue of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-14168 hinterlegt, und zu einer internationalen Hinterlegung auf Grundlage des Budapester Vertrags vom 9. Februar 1995 übertragen und mit der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-4994 ausgezeichnet.

6. Analyse der Nukleotidsequenz der DNA, die das dtsR-Gen enthält

Die Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung der rekombinanten DNA, die unter Punkt 5 erhalten wurde, bestimmt. Die Nukleotidsequenz wurde in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Sanger unter Verwendung des Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (hergestellt von Applied Biochemical) bestimmt. Die erhaltene DNA, die das dtsR-Gen enthält, hat eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt. Der längste offene Leserahmen, der in dieser Sequenz existiert, ist eine Nukleotidsequenz vom 359. A bis zum 1987. G in der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
Es wurde jedoch postuliert, daß 467-469 ATG auch ein Initiations-Codon sein könnte, entsprechend der Analyse einer Konsensussequenz, die in einer Region upstream dieses Gens vorhanden ist. Eine Aminosäuresequenz, die durch den offenen Leserahmen von 359 A bis 1987 G codiert, ist in der Sequenzliste zusammen mit seiner Nukleotidsequenz gezeigt. Die Aminosäuresequenz ist einzeln in SEQ ID NO: 2 der Sequenzliste gezeigt. Ein Protein, das durch eine Nukleotidsequenz, die die Nukleotide 467-1987 umfaßt, codiert wird, wurde als "DTSR-Protein" angesehen.
Es ist gut bekannt, daß der Methionin-Rest, der am N-Terminus eines Proteins vorhanden ist nach der Translation unter Einwirkung einer Peptidase entfernt wird. Das aufgrund der Tatsache, daß das Methionin am N-Terminus vom ATG als Translationsinitiations-Codon dient, und daher oft keine Bedeutung für eine wesentliche Funktion des Proteins besitzt. Es ist wahrscheinlich, daß das Entfernen des Methionin-Rests auch im Fall des DTSR-Rests der vorliegenden Erfindung auftreten kann.
Die Nukleotidsequenz bzw. die Aminosäuresequenz wurden mit bekannten Sequenzen hinsichtlich ihrer Homologie verglichen. EMBL UND SWISS-PROT wurden als Datenbanken verwendet. Im Ergebnis wurde bestätigt, daß das Gen, das in SEg ID NO: 1 der Sequenzliste gezeigt ist und das Protein, das dadurch codiert wird, neu sind. Es wurde jedoch herausgefunden, daß es eine Homologie zu einem bereits beschriebenen Protein gibt. Dieses Protein ist als β-Untereinheit der Propionyl- CoA-carboxylase (PPC)-Protein in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986) 8049-8053; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986) 4864-4868; und Gene, Bd. 122 (1992) 199-202 beschrieben.

7. Herstellung eines Mutanten-Typs der dtsR-Gens

Das dtsR-Gen, das für ein temperatursensitives Mutanten-Typ- DTSR-Protein codiert, wurde nach der folgenden Methode erhalten. pDTR6 Plasmid wurde einer Hydroxylamin-Behandlung in vitro in Übereinstimmung mit einem Verfahren unterworfen, das in der Literatur beschrieben ist, Shortle, D. und Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 75, 270 (1978) und es wurde unter Verwendung der elektrischen Pulsmethode, die oben beschrieben wurde, in die AJ11060 eingeschleust. Ungefähr 20 000 Transformantenstämme wurden auf einem M-CM2G- Agarmedium bei 25ºC für 30 Stunden kultiviert, um Kolonien zu bilden. Die Kolonien jeder Platte wurden auf zwei Medienplatten repliziert, die 30 mg/l an Tensid enthalten, gefolgt von einer Kultivierung bei 31,5ºC und 35ºC über 20 Stunden. Danach wurden zwei Stämme erhalten, die bei 31,5ºC wuchsen, aber nicht bei 35ºC. Plasmide wurden von diesen zwei Stämmen mittels eines gewöhnlichen Verfahrens extrahiert. So wurden pDTR6-11 und pDTR6-77 erhalten.

8. Konstruktion von Stämmen, in die ein mutantes Typ-dtsR-Gen durch Gen-Substituierung eingeschleust wurde

Muntante-Typ dtsR-Gen-substituierte Stämme wurden nach einem homologen Rekombinationsverfahren unter Verwendung eines temperatursensitiven Plasmids, wie in der japanischen Patent- Offenlegung 5-7491 beschrieben, erhalten. Genauer wurden pDTR6-11 und pDTR6-77, die oben beschrieben wurden, mit XbaI und KpnI verdaut, und die erhaltenen Fragmente, die das dtsR- Gen darin enthalten, wurden mit pHSG398 (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, das mit XbaI und KpnI unter Verwendung des Verfahrens, das oben beschrieben wurde, verdaut wurde, um pHSGX-K-11 und pHSGX-K-77 zu erhalten.
Als nächstes wurde das Plasmid pHSC4 (japanische Patent- Offenlegungs-Nr. 5-7491) mit einem Replikationsursprung vom Mutanten-Typ mit seiner temperatursensitiven autonomen Replikationsfähigkeit, das von einem Plasmid erhalten wurde, das in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI verdaut, um ein Gen- Fragment zu erhalten, das den Replikationsursprung enthält. Das erhaltene DNA-Fragment wurde unter Verwendung eines DNAblunt end formation kit (hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit) blunt-endgeschnitten, und dann in die KpnI- Erkennungsstellen von pHSGX-K-11 und pHSGX-K-77 unter Verwendung eines KpnI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, um die Plasmide pKTCX-K-11 und pKTCX-K-77 zu konstruieren. Escherichia coli AJ12571, das pHSC4 beinhaltet, ist am 11. Oktober 1990 am National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-11763 hinterlegt worden, übertragen für eine internationale Hinterlegung auf der Grundlage des Budapester Vertrages am 26. August 1991 und unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3524 hinterlegt.
Die beiden Plasmide wurden jeweils in Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 unter Verwendung des elektrischen Pulsverfahrens eingeschleust, und das dtsR-Gen auf dem Chromosom wurde mit einem Mutanten-Typ nach einem Verfahren substituiert, das in der japanischen Patent-Offenlegungs-Nr. 5-7491 beschrieben ist. Genauer wurden Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869/pKTCX-K-11 und ATCC 13869/pKTCX-K-77 unter Schütteln in einem M-CM2G Flüssigmedium bei 25ºC über 6 Stunden kultiviert und dann auf einem M-CM2G Flüssigmedium bei 25ºC über 6 Stunden kultiviert, und dann auf einem M-CM2G-Medium ausgebreitet, das 5 ug/ml an Chloramphenicol enthält. Stämme, die Kolonien bei 34ºC bildeten, wurden als Plasmid-inkorporierende Stämme erhalten. Als nächstes wurden Stämme, die gegenüber Chloramphenicol bei 34ºC sensitiv sind aus den Plasmidinkorporierenden Stämmen unter Verwendung eines Replikaverfahrens erhalten. Stamm Nr. 11 und Stamm Nr. 77 als Stämme mit verlorener Tensidresistenz bei 34ºC wurden von diesen sensitiven Stämmen erhalten. In diesen Stämmen ist das dtsR-Gen auf dem Chromosom substituiert mit einem Mutanten- Typ. Ein DNA-Fragment, das durch Amplifizieren der Region erhalten wurde, die das dtsR-Gen vom Mutanten-Typ des Stammes Nr. 11 enthält mittels PCR-Verfahren unter Verwendung von Plasmid pHSGX-K-11 als Matrize, das in die HincII- Erkennungsstelle des Plasmids pHSG299 (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert wurde, um das Plasmid pHSGDTSR11 zu erhalten. Escherichia coli JM109, in das das Plasmid pHSGDTSR11 eingeschleust worden war, wurde als AJ13137 bezeichnet und am 1. August 1995 bei National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5187 hinterlegt. Das dtsR-Gen vom Mutanten-Typ des Stammes Nr. 11 kann durch Verdauen des Plasmids pHSGDTSR11 mit den Restriktionsenzymen SphI und KpnI erhalten werden.

9. L-Glutaminsäure-Produktsfähigkeit von Stamm Nr. 11 und Stamm Nr. 77

Die Produktionsfähigkeit von L-Glutaminsäure wurde bei dem Stamm Nr. 11 und Stamm Nr. 77, die unter Punkt 8 oben beschrieben wurden auf die gleiche Weise untersucht wie in Beispiel 2 ermittelt. So wurden die gleichen Medien, wie die in Beispiel 2 verwendet, und die Kultivierungstemperatur wurde in der 8. Stunde nach dem Beginn der Kultivierung auf 37ºC geändert. Im Ergebnis wurde die Ausbeute an L-Glutaminsäure der Stämme mit dem Gen vom Mutanten-Typ verbessert, wie in Tabelle 9 gezeigt.

Tabelle 9

Bakterienstamm L-Glutaminsäure (g/dl)
ATCC 13869 0,5
Nr. 11 7,5
Nr. 77 6,9

Beispiel 4: Verbesserung der Gene der Glutaminsäure- Biosynthesesystems in einem Tensid-temperatursensitiven Mutantenstamm, der von einem L-Glutaminsäure psroduzierenden Bakterium abstammt

1. Klonierung von gdh-, gltA- und icd-Genen

gdh (Glutamatdehydrogenase-Gen), gltA (Citratsynthase-Gen) und icd (Isocitratdehydrogenase-Gen) aus Brevibacterium lactofermentum wurden mittels PCR-Verfahren kloniert. Die in dem PCR-Verfahren verwendeten Primer wurden auf der Grundlage bereits berichteter Sequenzen des gdh-Gens (Molecular Microbiology, 6(3), 317-326 (1992)), des gltA-Gen (Micobiology, 140, 1817-1828 (1994)) und des icd-Gen (J. Bacteriol., 177, 774-782 (1995)) des Corynebacterium glutamicum synthetisiert. Die Oligonukleotide, die in SEQ ID NO: 3 (5'-Seite) und SEQ ID NO: 4 (3'-Seite) in der Sequenzliste als Primer zum Amplifizieren des gdh-Gens, die Oligonukleotide, die in SEQ ID NO: 5 (5'-Seite) und SEQ ID NO: 6 (3'-Seite) als Primer für das Amplifizieren des gltA- Gens, und die Oligonukleotide, die in SEQ ID NO: 7 (5'-Seite) und SEQ ID NO: 8 (3'-Seite) als Primer zum Aplifizieren des icd-Gens wurden jeweils synthetisiert und verwendet.
Aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurden nach dem Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben wurden, chromosomale DNA präpariert, welche als Matrize zum Durchführen einer PCR unter Verwendung der oben genannten Nukleotide als Primer verwendet wurde. Beide Enden der erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen DNA blunt end formation kits (hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit) bluntendgeschnitten, gefolgt vom Klonieren in eine Smal-Stelle des Vektor-Plasmids pHSG399 (hergestellt von Takara Shuzo) um jeweils die Plasmide pHSG-gdh, pHSG-gltA und pHSG-icd zu bekommen.

2. Klonierung des ppc-Gens

Chromosomale DNA aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, welche als Matrize verwendet wurde, wurde nach dem Verfahren, unter Verwendung des PCR-Verfahrens das in Beispiel 3 beschrieben wurde hergestellt um ein DNA-Fragment von ungefähr 3, 4 Kpb zu erhalten, das das ppc-Gen enthält, das für PEPC (Phosphoenolpyruvatcarboxylase) codiert. Die zu verwendenden Primer für das PCR-Verfahren wurden auf Grundlage einer bereits beschriebenen Sequenz des ppc-Gens für Corynebacterium glutamicum (Gene, 77, 237-251 (1989)) synthetisiert. Die PCR-Reaktion wurde auf die gleiche Weise durchgeführt wie oben beschrieben. Die Sequenzen der Primer werden in SEQ ID NO: 9 (5'-Seite) und SEQ ID NO: 10 (3'- Seite) gezeigt.
Das Amplifikationsprodukt der PCR-Reaktion wurde mit einem Restriktionsenzym SalI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und in eine SalI-Schnittstelle des Plasmids pHSG399 insertiert, um ein Plasmid pHSG-ppc' zu erhalten. Das ppc-Gen in pHSG-ppc' wird in entgegengesetzter Richtung zu dem des lac-Promotors in pHSG399 insertiert.
Als nächstes wurde ein Promotor eines Tryptophan-Operons, der als Promotor bekannt ist, der in Brevibacterium lactofermentum arbeiten kann (Gene, 53, 191-200 (1987)) in einer Position upstream des ppc-Gens in pHSG-ppc' insertiert.
Von diesem Promotor ist bekannt, daß seine Aktivität mit einer Sequenz, die 51 Nukleotide der SEQ ID NO: 11 Sequenzliste umfaßt, zusammenhängt. Ein Nukleotidstrang mit der Sequenz, die in SEQ ID NO: 11 gezeigt ist, und ein Nukleotidstrang mit der Sequenz aus SEQ ID NO: 12 als komplementärer Strang wurden synthetisiert, um doppelsträngige DNA zu erhalten, die 51 Basenpaare mit der Promotoraktivität enthält mit beiden Enden coinciding mit den eines verdauten Fragments des Restriktionsenzyms KpnI und XbaI.
Die beiden synthetisierten DNA wurden bei einer Konzentration von ungefähr 10 pmol/ul für jedes davon gemischt, auf 100ºC für 10 min erhitzt, und dann stehengelassen und auf Raumtemperatur abgekühlt, um eine Anlagerung zu erreichen. pHSG-ppc' wurden mit den Restriktionsenzymen KpnI und XbaI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und mit dem oben genannten Promotor ligiert. Die Ligationsreaktion wurde unter Verwendung eines Ligations-Kits durchgeführt, der von Takara Shuzo hergestellt wird. So wurde das Plasmid pHSG-ppc erhalten, in dem eine Kopie des Promotors des Tryptophan- Operons in eine Position upstream des ppc-Gens insertiert war.

3. Konstruktion eines Plasmids, das mit drei Arten von Genen gdh, gltA und icd inkorporiert ist

Drei Arten von Genen gdh, gltA und icd wurden ligiert, um ein Plasmid zu konstruieren. So wurde das Plasmid pHSG-gdh mit einem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und unter Verwendung des kommerziell erhältlichen DNA blunt end formation kits (hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit) bluntendgeschnitten mit dem das PCR-amplifizierte Produkt des gltA-Gens mit beiden blut-endgeschnittenen Enden, wie oben beschrieben, ligiert wurde, um das Plasmid pHSG-gdh+gltA zu erhalten. Weiter wurde das Plasmid pHSG-gdh+gltA mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut, und auf gleiche Art bluntendgeschnittenen, mit dem das PCR-amplifizierte Produkt des icd-Gens mit beiden bluntendgeschnittenen Enden, wie oben beschrieben, ligiert wurde, um das Plasmid PHSG-gdh+gltA+icd zu erhalten.

4. Konstruktion des Plasmids, das drei Arten von Genen - gdh, gltA und ppc - enthält

Drei Arten von Genen gdh, gltA und ppc wurden ligiert, um ein Plasmid zu konstruieren. So wurde das Plasmid pHSG-gdh+gltA mit einem Restriktionsenzym KpnI verdaut. Das Plasmid pHSG-ppc wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und SalI verdaut, um das ppc-Gen-Fragment mit dem Promotor des Tryptophanoperons in einer Upstream-Position zu erhalten. Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung eines DNA blunt end formation kits (hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit) blunt-endgeschnitten, und dann unter Verwendung eines KpnI- Linkers (hergestellt von Takara Shuzo) in die KpnI-Stelle des Plasmids pHSG-gdh+gltA insertiert, um das Plasmid pHSG-gdh+gltA-ppc zu erhalten.

5. Einschleusung des Replikationsursprungs für coryneformes Bakterium in die oben genannten Plasmide

Um pHSG-gdh, pHSG-gltA, pHSG-ppc, pHSG-icd, pHSG-gdh+gltA+icd und pHSG-gdh+gltA+ppc in Zellen coryneformer Bakterien autonom replizierbar zu machen, wurde ein bereits erhaltener Replikationsursprung, der von einem Plasmid pHM1519 stammt (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), der in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, in pHSG-gdh, pHSG-gltA, pHSG-ppc, pHSG-icd, pHSG-gdh+gltA+icd und pHSG-gdh+gltA+ppc eingeschleust.
So wurde das Plasmid pHK4 (japanische Patent-Offenlegungs-Nr. 5-7491) mit dem Replikationsursprung von pHM1519 mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI verdaut, um das Genfragment zu erhalten, das den Replikationsursprung enthält. Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung eines DNA blunt end formation kits (hergestellt von Takara Shuzo, Blunting kit) blunt-endgeschnitten und dann in die KpnI- Stelle von pHSG-gdh, pHSG-gltA, pHSG-ppc bzw. pHSG-icd unter Verwendung eines KpnI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, um pGDH, pGLTA, pPPC und pICD zu erhalten. Der Replikationsursprung von pHM1519 wurde in pHSG-gdh+gltA-icd und pHSG-gdh+gltA+ppc an ihren SalI-Schnittstellen auf die gleiche Weise unter Verwendung des SalI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo) insertiert, um pGDH+GLTApICD und pGDH+GLTA+PpC zu erhalten.

6. Bestätigung der Expression aller Gene, die in pGDH, pGLTA, pPPC, pICD, pGDH+GLTA+ICD, und pGDH+GLTA+PPC enthalten sind

Es wurde besättigt, das jedes der Gene auf pGDH, pGLTA, pPPC, pICD, pGDH+GLTA+ICD und pGDH+GLTA+PPC in Brevibacterium lactofermentum-Zellen exprimiert wurde, und daß diese Plasmide die Funktion der Gen-Amplifizierung erfüllen.
So wurde jedes der Plasmide unter Verwendung eines elektrischen Pulsverfahrens (japanische Offenlegungs-Nr. 2- 207791) in Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 eingeschleust. Die erhaltenen Transformanten wurden auf einem CM2G Plattenmedium, enthaltend 4 ug/ml an Chloramphenicol (enthaltend 10 g, Polypepton, 10 g Hefeextrakt, 5 g Glucose, 5 g NaCl und 15 g Agar je 1 l reinen Wassers, pH 7,2) selektioniert. Die erhaltenen Transformanten wurden auf dem CM2G Agar-Medium kultiviert, in ein Medium inokuliert, das 80 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 g FeSO&sub4;,7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4;·7H&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat-Lösung, 100 ug Thiaminhydrochlorid, 300 ug Biotin und 50 g CaCO&sub3; je 1 l reinem Wassers (mit der pH, der mit KOH auf 8,0 eingestellt wurde) enthält, und bei 31,5ºC für 16 Stunden kultiviert. Die Kulturflüssigkeit wurde nach einem gewöhnlichen Verfahren zum Sammeln bakterieller Zellen zentrifugiert.
Rohextrakte, die durch das Zerstören der bakteriellen Zellen erhalten wurden, wurden verwendet, um die DGD (Glutamatdehydrogenase)-Aktivität von ATCC 13869/pGDH, ATCC 13869/pGDH+GLTA+ICD, und ATCC 13869/pGDH+GLTA+PPC nach einem Verfahren, das in Molecular Microbiology (6(3), 317-326 (1992) beschrieben ist, zu messen. Im Ergebnis wurde herausgefunden, daß jede der Transformanten eine GDH- Aktivität hat, die ungefähr 13-mal größer ist als die von ATCC 13869/pSAC4 als Kontrolle (Tabelle 10).
Die CS (Citratsynthase)-Aktivität von ATCC 13869/pGLTA, ATCC 13869/pGDH+GLTA+ICD, und ATCC 13869/pGDH+GLTA+PPC wurde in Übereinstimmung mit einem Verfahren, das in Microbiology, 140, 1817-1828 (1994) beschrieben ist, gemessen. Die ICDH (Isocitratdehydrogenase)-Aktivität von ATCC 13869/pICD und ATCC 13869/pGDH+GLTA+ICD wurde in Übereinstimmung mit einem Verfahren gemessen, das in J. Bacteriol. 177, 774-782 (1995) beschrieben ist. Die PEPC-Aktivität von ATCC 13869/pPPC und ATCC 13869/pGDH+GLTA+PPC wurde in Übereinstimmung mit einem Verfahren gemessen, das in Gene, 77, 237-251 (1989) beschrieben ist. Die Meßergebnisse werden in den Tabelle 11 bis 13 gezeigt. Es wurde herausgefunden, daß jede Transformante die Aktivität jedes der Zielenzyme hatte, die ungefähr 2- bis 20-mal stärker war als die von ATCC 13869/pSAC4 als Kontrolle. Nach dieser Tatsache wurde bestätigt, daß jedes der Genen auf pGDH, pGLTA, pPPC, pICD, pGDH+GLTA+ICD, und pGDH+GLTA+PPC in Brevibacterium lactofermentum-Zellen exprimiert wurde und die Funktionen davon erfüllte.

Tabelle 10

Bakterienstamm GDH-Aktivität (ΔAbs/min/mg Protein)
ATCC 13869/pGDH 1,36
ATCC 13869/pGDH+GLTA+ICD 1,28
ATCC 13869/pGDH+GLTA+PPC 1,33
ATCC 13869/pSAC4 0,11

Tabelle 11

Bakterienstamm CS-Aktivität (umol/min/mg Protein)
ATCC 13869/pGLTA 5,5
ATCC 13869/pGDH+GLTA+ICD 4,8
ATCC 13869/pGDH+GLTA+PPC 4,8
ATCC 13869/pSAC4 0,7

Tabelle 12

Bakterienstamm PEPC-Aktivität (Einheiten/min/mg Protein)
ATCC 13869/pPPC 1,12
ATCC 13869/pGDH+GLTA+PPC 1,04
ATCC 13869/pSAC4 0,11

Tabelle 13

Bakterienstamm ICDH-Aktivität (Einheiten/min/mg Protein)
ATCC 13869/pICD 3,5
ATCC 13869/pGDH+GLTA+ICD 2,8
ATCC 13869/pSAC4 1,0

7. L-Glutaminsäure-Produktion durch den AJ13029-Stamm und die AJ13029-Stämme mit dem amplifizierten gdh-, gltA-, ppc- und icd-Genen

Ein Medium (300 ml) enthaltend 60 g Glucose, 1 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,01 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,01 g MnSO&sub4;·zH&sub2;O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat-Lösung, 200 ug Thiamhydrochlorid und 450 ug Biotin je 1 l reinen Wassers wurden in einen Fermentierbottich mit einem Volumen von 1 l geschüttet und durch Erwärmen sterilisiert. Bakterielle Zellen jedes dieser Stämme, die durch Kultivierung auf einem CM2G-Agar-Medium erhalten wurden, wurden darin inokuliert, und bei 31,5ºC für 30 Stunden kultiviert, während der pH auf 7,0 mit Ammoniumgas kontrolliert wurde.
Die bakterielle Zelldichte und die Menge an L-Glutaminsäure, die in dem Medium nach der Kultivierung akkumulierte, wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 14 dargestellt. Tabelle 14

Beispiel 5: Herstellung eines Mutantenstamms, der temperatursensitiv gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel ist aus einem L-Lysin-produzierenden Stamm, der von einem coryneformen L-Glutaminsäureproduzierenden Bakterium stammt

1. Messung der Sensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel auf einen L-Lysin-produzierenden Stamm mittels Replikaverfahren

Die Sensitivität eines L-Lysin-produzierenden Stammes mit AEC-Resistenz, Brevibacterium lactofermentum AJ11446 (japanische Patentveröffentlichung Nr. 62-24073) induziert durch Mutation in Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 gegenüber Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat (PESP) wurde wie folgt in Übereinstimmung mit einem Replikaverfahren gemessen.
Brevibacterium lactofermentum AJ11446 wurde über Nacht bei 31,5ºC auf einem MCM2G Agarplatten-Medium mit einer Zusammensetzung, die in Tabelle 15 gezeigt ist, kultiviert, um bakterielle Zellen zu erhalten. Sie wurden in sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, auf dem oben genannten Agarplatten-Medium ausgesät und bei 31,5ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert, um Kolonien zu bilden. Sie wurden auf einem MCM2G Agarmedium repliziert, mit jeder Konzentration an PESP versetzt, und bei 34ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert, um das Wachstumsstadium zu beobachten.

Tabelle 15

Bestandteil Konzentration
Glucose 0,5%
Polypepton (hergestellt von Nihon Pharmaceutical) 1,0%
Hefeextrakt (hergestellt von Difco) 1,0%
NaCl 0,5%
DL-Methionin 0,02%
Agar 1,5%
pH 7,2
Im Ergebnis wurde bestätigt, daß das Wachstum unter dieser Bedingung einen Schwellenwert in der Nähe einer PESP- Konzentration von 3 mg/dl, wie in Tabelle 16 gezeigt, hat. Tabelle 16

2. Induzierung eines Mutantenstamms, der eine Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel aufweist

Brevibacterium lactofermentum AJ11446 wurde auf einem Bouillon-Agarmedium bei 31,5ºC für 24 Stunden kultiviert, um bakterielle Zellen zu erhalten. Die erhaltenen bakteriellen Zellen wurden bei 30ºC für 30 Minuten mit einer wäßrigen Lösung aus 250 ug/ml an N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt. Eine Suspension der bakteriellen Zellen bei einem Überlebensverhältnis von 1% wurde dann auf MCM2G Agarplatten-Medium ausgesät und bei 31,5ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert, um Kolonien zu bilden. Sie wurden auf einem MCM2G Agar-Medium und einem MCM2G Agar-Medium suplementiert mit 3 mg/dl an PESP, jeweils repliziert und bei 34ºC für 20 bis 30 Stunden kultiviert. Die bakteriellen Stämme, die auf dem MCM2G-Medium wuchsen, wurden gesammelt, aber kein beobachtbares Wachstum auf dem MCM2G-Medium erzeugten, das 3 mg/dl an PESP enthält. So wurden 250 Stämme aus ungefähr 10 000 Kolonien erhalten. Jeder der erhalten bakteriellen Stämme wurde auf das Vorhandensein oder Nicht- Vorhandensein von Wachstum bei 34ºC auf dem MCM2G- Agarplatten-Medium enthaltend 3 mg/dl PESP, rückbestätigt. Stämme, die offensichtlich keine Sensitivität aufwiesen wurden ausgeschlossen und 166 Stämme, die eine Temperatursensitivität aufwiesen, wurden erhalten.

3. Bestätigung einer Co-Produktionsfähigkeit von L-Lysin- und L-Glutaminsäure in Mutantenstämmen, die eine Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel aufweisen

Die Produktionsfähigkeit an L-Lysin und L-Glutaminsäure wurde wie folgt bei den 166 Mutantenstämmen, die unter Punkt 2. oben erhalten wurden und bei ihren Parentalstamm AJ11446 bestätigt.
Der AJ11446-Stamm und jeder der Mutantenstämme wurden auf dem MCM2G Agarmedium bei 31,5ºC für jeweils 20 bis 30 Stunden kultiviert, um bakterielle Zellen zu erhalten, die in ein Flüssigmedium mit einer Zusammensetzung eingesät wurden, das in Tabelle 17 gezeigt ist, um bei 31,5ºC eine Kultivierung unter Schütteln zu starten. Nach 16 Stunden wurde die Kultivierungstemperatur auf 34ºC gewechselt, um eine Kultivierung für insgesamt genau 48 Stunden durchzuführen. Nach Beendigung der Kultivierung wurde das Vorhandensein oder das Nicht-Vorhandensein von L-Lysin- und L-Glutaminsäure- Produktion unter Verwendung der Dünnschichtchromatographie untersucht. Im Ergebnis wurde bestätigt, daß 31 Stämme von den 166 mutanten Stämmen gleichzeitig die zwei Aminosäuren herstellten. Wenn man die beiden Stämme bei 31,5ºC über 48 Stunden ohne Wechseln der Kultivierungstemperatur kultiviert, wurde eine Co-Produktion von L-Lysin und L-Glutaminsäure in drei Stämmen beobachtet.

Tabelle 17

Bestandteil Konzentration
Glucose 10 g/dl
KH&sub2;PO&sub4; 0,1 g/dl
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,4 g/dl
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,001 g/dl
MnSO&sub4;·4H&sub2;O 0,001 g/dl
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2 g/dl
Sojabohnenproteinhydrolysat-Lösung 3 ml/dl
DL-Alanin 0,35 g/dl
Nicotinsäureamid 5 mg/l
Thiaminhydrochlorid 0,2 mg/l
Biotin 0,3 mg/l
Antischaummittel 0,05 ml/l
CaCO&sub3; 5 g/dl
pH 7,0
Die akkumulierten Mengen L-Lysin und L-Glutaminsäure werden in Tabelle 18 für die jeweiligen Stämme der Mutantenstämme und den AJ11446-Stamm gezeigt. Tabelle 18

4. Bestätigung der Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel

Die Temperatursensitivität der Bakterien gegenüber PESP zum gleichzeitigen Produzieren von L-Lysin und L-Glutaminsäure, die unter Punkt 3, der oben beschrieben wurde, erhalten wurden, wurde wie folgt mit Hilfe einer Flüssigkultur bestätigt.
Jeder der Mutantenstämme und ihr Parentalstamm wurden auf dem MCM2G-Agarplattenmedium bei 31,5ºC über 24 Stunden kultiviert, um bakterielle Zellen zu erhalten. Die erhaltenen bakteriellen Zellen wurden in ein MCM2G-Flüssigmedium inokuliert und in ein MCM2G-Flüssigmedium, das PESP bei einer Konzentration von 1 mg/dl enthält, um eine Kultivierung unter Schütteln bei 31,5ºC und 34ºC für 24 Stunden durchzuführen. Die optischen Dichten (O. D.) der erhaltenen Kulturflüssigkeiten wurden bei 660 nm gemessen. Der relative Wachstumsgrad in dem PESP-ergänzten Medium wurde unter der Voraussetzung bestimmt, daß das Wachstum in dem Medium ohne Suplementierung mit PESP als 100 betrachtet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 19 gezeigt. Tabelle 19
Wie in dieser Tabelle gezeigt wird, hat jeder der Mutantenstämme bei 31,5ºC einen relativen Wachstumsgrad von. 80 oder mehr, aber 50 oder weniger bei 34ºC in Gegenwart von 1 mg/dl an PESP, und dadurch haben sie klar eine Sensibilität gegenüber PESP.
Die Einflüsse, die durch PESP auf das Wachstum bei 31,5ºC und bei 34ºC ausgeübt werden, werden in Fig. 3 bei EK-112 aus den Mutanten-Stämmen, die unter den oben beschriebenen Punkt 3 erhalten wurden, gezeigt. Das Wachstum, das ungefähr äquivalent dem in Abwesenheit von PESP war, wurde in Gegenwart von PESP bei einer Konzentration von nicht mehr als 1 mg/dl bei 31,5ºC beobachtet. Jedoch war das Wachstum in Gegenwart von 1 mg/dl an PESP bei 34ºC markant gehemmt, verglichen mit dem Wachstum in Abwesenheit von PESP. So wurde gezeigt, daß dieser Mutantenstamm eine Temperatursensitivität besitzt.
Von den Mutantenstämmen wurde EK-112 als Brevibacterium lactofermentum AJ12993 gekennzeichnet, hinterlegt am 3. Juni 1994 im National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-14348, übertragen in eine internationale Hinterlegung, basierend auf dem Budapester Vertrag am 1. August 1995 und mit der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5188 ausgezeichnet.

Beispiel 6: Produktion von L-Lysin und L-Glutaminsäure durch Co-Fermentierung

1. Untersuchung des Kultivierungstemperatur-Wechseltimings

Brevibacterium lactofermentum AJ11446 oder AJ12993 wurden in das Saatkulturmedium mit der in Tabelle 6 oben beschriebenen Zusammensetzung inokuliert und unter Schütteln bei 31,5ºC für 24 Stunden kultiviert, um eine Saatkultur zu erhalten. Das Medium für eine full-scale-Kultivierung mit der in Tabelle 6 gezeigten Zusammensetzung wurde in entsprechenden Mengen von 300 ml dispergiert und in einem Fermentierbottich aus Glas mit einem Volumen von 500 ml geschüttet und durch Erwärmen sterilisiert. Danach wurden 40 ml der Saatkultur inokuliert. Eine Kultivierung wurde unter Verwendung einer Rührgeschwindigkeit von 800 bis 1300 Upm, einer Belüftungsmenge von 1/2 bis 1/1 vvm und einer Kultivierungstemperatur von 31,5ºC gestartet. Die Kulturflüssigkeit wurde unter Verwendung von Ammoniumgas stabilisiert um einen pH von 7,5 zu haben. Die Kultivierungstemperatur wurde nach 8, 12 oder 16 Stunden vom Beginn der Kultivierung auf 34ºC gewechselt. Eine Kontrolle für einen Vergleich wurde zu Verfügung gestellt bei der die Kultivierungstemperatur nicht gewechselt wurde, und eine Kultivierung bei genau 31,5ºC fortgesetzt wurde.
In jedem Experiment wurde die Kultivierung zu einem Zeitpunkt innerhalb von 40 bis 50 Stunden beendet, bei dem die Glucose vollständig aufgebraucht war. Die Mengen an L-Lysin und L-Glutaminsäure, die in der Kulturflüssigkeit produziert und akkumuliert wurden, wurden gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 20 gezeigt. Tabelle 20
Aus den Ergebnissen wird verständlich, daß der AJ12993-Stamm sowohl L-Lysin und L-Glutaminsäure in Abwesenheit von jedem der die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel produziert, selbst in einem Medium, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, in dem die Kultivierungstemperatur von 31,5ºC auf 34ºC geändert wird, daß die Rate der L-Glutaminsäure proportional zur Frühzeitigkeit des Wechseltimings der Kultivierungstemperatur ansteigt, und daß die Rate an L-Lysin proportional zum späten Zeitpunkt davon ansteigt. Im Gegensatz dazu wurde im Fall vom AJ11446-Stamm als Parentalstamm L-Lysin produziert und eine Produktion von L-Glutaminsäure wurde selbst beim Wechseln der Kultivierungstemperatur nicht beobachtet.
Die bakteriellen Zellen wurden durch Zentrifugieren aus 1 l endkultivierter Kulturflüssigkeit, die 8 Stunden nach Beginn der Kultivierung einem Temperaturwechsel unterworfen wurde. L-Lysin und L-Glutaminsäure wurden getrennt und von dem erhaltenen Überstand nach einem gewöhnlichen Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen getrennt und gereinigt. Die Kristalle des erhaltenen L-Lysinhydrochlorids betrugen 31,7 g und die Kristalle des erhaltenen Natrium-L-glutamats betrugen 13,9 g.

2. Untersuchung der Wechseltemperatur

Die Kultivierung von Brevibacterium lactofermentum AJ11446 und AJ12993 wurde bei 31,5ºC unter Verwendung eines Fermentierbottichs aus Glas mit einem Volumen von 500 ml auf die gleiche Weise wie in dem oben beschriebenen Punkt 1 gestartet. Die Kultivierungstemperatur wurde 8 Stunden nach dem Start der Kultivierung von 33ºC, 34ºC und 35ºC gewechselt. Eine Kontrolle zum Vergleich wurde zu Verfügung gestellt, indem die Kultivierungstemperatur nicht gewechselt wurde, um eine Kultivierung genau bei 31,5ºC fortzusetzen. In jedem Experiment wurde die Kultivierung beendet, nachdem 40 bis 50 Stunden vergangen waren. Die Mengen an L-Lysin und L-Glutaminsäure, die hergestellt wurden und in der Kulturflüssigkeit akkumuliert waren, wurden gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 21 gezeigt. Tabelle 21
Aus den Ergebnissen wird verständlich, daß es eine Neigung dazu gibt, daß die Rate an L-Glutaminsäure ansteigt, wenn die Temperatur nach dem Wechsel hoch wird, und daß die Rate an L-Lysin abnimmt, wenn sie niedrig wird, wenn der AJ12993- Stamm kultiviert wird und die Kultivierungstemperatur gewechselt wird.

Industrielle Anwendbarkeit

Erfindungsgemäß wird einem coryneformen L-Glutaminsäureproduzierendem Bakterium eine Temperatursensitivität gegenüber einem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel gegeben. So kann L-Glutamat billig und stabil durch Fermentierung hergestellt werden, selbst wenn Material, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, als Kohlenstoff- Quelle verwendet wird.
Außerdem wird eine L-Lysin-Produktionsfähigkeit gegeben. D. h., daß L-Lysin und L-Glutamat gleichzeitig billig und stabil durch Fermentierung hergestellt werden können selbst wenn ein Material, das eine überschüssige Menge an Biotin enthält, als Kohlenstoff-Quelle verwendet wird.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: AJINOMOTO CO., INC.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUR HER¬ STELLUNG VON L-LYSIN UND L-GLUTAMINSÄURE
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 12
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSE:
(B) STRASSE:
(C) STADT:
(D) BUNDESLAND:
(E) LAND:
(F) POSTLEITZAHL (ZIP):
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version #1.30 (EPO)
(vi) DATEN DER ANMELDUNG
(A) ANMELDE-NR.:
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vi) DATEN DER VORANMELDUNG
(A) ANMELDE-NR.: JP6/195465
(B) ANMELDEDATUM: 19. August 1994
(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
(A) NAME:
(B) REGISTRATIONS-NR.:
(C) REFERENCE/DOCKET-NR.
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEPHON:
(B) TELEFAX:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2733 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Nein
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Brevibacterium lactofermentum
(B) Stamm: ATCC13869
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 359 ... 1987 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 543 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Ja (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Ja (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Ja (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Ja (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 51 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere Nukleinsäure
(A) BESCHREIBUNG:/desc = "Synthetische DNA"
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Nein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 59 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-ART: Andere ... synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTI-SENS: Ja (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

Claims

1. Coryneformer bakterieller Mutantenstamm mit einer Fähigkeit zur Erzeugung von L-Glutaminsäure in Abwesenheit von jedem die Biotinwirkung supprimierenden Mittel in einem Medium, das nicht weniger als 10 ug/l Biotin enthält, dadurch gekennzeichnet, dass er eine temperaturempfindiche Mutation zu einem die Biotinwirkung supprimierenden Mittel aufweist und erhältlich ist durch ein Verfahren, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Mutationsbehandlung von coryneformen L-Glutaminsäure-erzeugenden Bakterien;

(b) Selektion von Kolonien des coryneformen bakteriellen Mutantenstamms, erhalten aus der Mutationsbehandlung (a), die bei einer Kultivierungstemperatur von 33 bis 37ºC in einem Medium, das nicht weniger als 10 ug/l Biotin enthält, ein reduziertes oder kein beobachtbares Wachstum in Gegenwart einer Grenzwertkonzentration des die Biotinwirkung supprimierenden Mittels im Vergleich mit dem Wachstum in Abwesenheit des Mittels unter ansonsten identischen Bedingungen aufweisen,

wobei die Grenzwertkonzentration durch Züchten der coryneformen L-Glutaminsäure-erzeugenden Bakterien bei der Biotinkonzentration und Temperatur des Schrittes (b) in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des die Biotinwirkung supprimierenden Mittels bestimmt wird, und Bestimmung der Grenzwertkonzentration des Mittels, bei der noch ein Wachstum festgestellt wird.

2. Coryneformer bakterieller Mutantenstamm mit einer Fähigkeit zur Erzeugung von sowohl L-Lysin als auch L-Glutaminsäure in Abwesenheit von jedem die Biotinwirkung unterdrückenden Mittel in einem Medium, enthaltend nicht weniger als 10 ug/l Biotin, dadurch gekennzeichnet, dass er eine temperaturempfindliche Mutation zu einem die Biotinwirkung supprimierenden Mittel aufweist und dass er durch ein Verfahren erhältlich ist, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Mutationsbehandlung von coryneformen L-Glutaminsäure- und L-Lysin-erzeugenden Bakterien;

wobei die Grenzwertkonzentration durch Züchten der coryneformen L-Glutaminsäure- und L-Lysin-erzeugenden Bakterien bei der Biotinkonzentration und Temperatur des Schrittes (b) in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des die Biotinwirkung supprimierenden Mittels bestimmt wird, und Bestimmung der Grenzwertkonzentration des Mittels, bei der noch ein Wachstum festgestellt wird.

3. Coryneformer bakterieller Mutantenstamm gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei das die Biotinwirkung supprimierende Mittel Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat ist.

4. Verfahren zur Erzeugung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Kultivierung eines coryneformen bakteriellen Mutantenstamms gemäss Anspruch 1 oder 3 in einem flüssigen Medium zur Erzeugung und Anhäufung von L-Glutaminsäure im Medium; und

(b) Sammeln derselben aus dem Medium.

5. Verfahren zur Erzeugung von L-Glutaminsäure gemäss Anspruch 4, wobei bei dem coryneformen bakteriellen Mutantenstamm die Expression von ein oder mehreren Genen, ausgewählt aus dem Glutamatdehydrogenase-Gen, dem Citratsynthase-Gen, dem Phosphoenolpyruvatcarboxylase- Gen und dem Isocitratdehydrogenase-Gen verstärkt ist.

6. Verfahren zur Erzeugung von L-Lysin und L-Glutaminsäure durch Fermentation, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Kultivierung eines coryneformen bakteriellen Mutantenstamms gemäss Anspruch 2 oder 3 in einem flüssigen Medium zur Erzeugung und Anhäufung von L-Lysin und L-Glutaminsäure in dem Medium; und

(b) Sammeln derselben aus dem Medium.

7. Verfahren zur Bereitstellung eines coryneformen bakteriellen Mutantenstamms mit einer Fähigkeit zur Erzeugung von L-Glutaminsäure in Abwesenheit von jedem die Biotinwirkung supprimierenden Mittel in einem Medium, das nicht weniger als 10 ug/l Biotin enthält, mit einer temperaturempfindlichen Mutation zu einem die Biotinwirkung supprimierenden Mittel, umfassend die folgenden Schritte:

8. Verfahren zur Bereitstellung eines coryneformen bakteriellen Mutantenstamms mit einer Fähigkeit zur Erzeugung von sowohl L-Lysin als auch L-Glutaminsäure in Abwesenheit von jedem die Biotinwirkung supprimierenden Mittel in einem Medium, das nicht weniger als 10 ug/l Biotin enthält, mit einer temperaturempfindlichen Mutation zu einem die Biotinwirkung supprimierenden Mittel, umfassend die folgenden Schritte:

9. Verfahren gemäss Anspruch 7 oder 8, wobei die Mutationsbehandlung (a) durch Bestrahlung mit UV-Licht, durch Röntgenbestrahlung, durch Strahlenbestrahlung oder durch Behandlung mit einem Mutationsmittel durchgeführt wird.

10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das die Biotinwirkung supprimierende Mittel Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat ist.