DE69833200T2

DE69833200T2 - Verfahren für die produktion von l-glutaminsäure mittels fermentation

Info

Publication number: DE69833200T2
Application number: DE69833200T
Authority: DE
Inventors: Inc. Souhei Ajinomoto Co. KANNO; Inc. Eiichiro Ajinomoto Co. KIMURA; Inc. Kazuhiko Ajinomoto Co. MATSUI; Inc. Tsuyoshi Ajinomoto Co. OSUMI; Inc. Tsuyoshi Ajinomoto Co. NAKAMATSU
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1997-08-12
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2018-08-08
Also published as: MY123972A; WO1999007853A1; EP1004671A4; JP3937726B2; PE105599A1; PL338679A1; AU742609B2; CN1275165A; CN1179045C; DE69833200D1; BR9811151A; EP1004671A1; EP1004671B1; ID23892A; AU8561598A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation. L-Glutaminsäure ist eine wichtige Aminosäure, die für Nahrungsmittel, Arzneimittel und anderes verwendet wird.
Stand der Technik
Herkömmlich wird L-Glutaminsäure hauptsächlich durch fermentative Verfahren unter Verwendung so genannter L-Glutaminsäure produzierender coryneformer Bakterien. der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium oder deren Mutanten produziert (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, 195-215, (1986)). Als fermentative Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure unter Einsatz anderer Bakterienstämme sind solche bekannt, welche Mikroorganismen, einschließlich Bacillus, Streptomyces, und Penicillium (US-Patent 3,220,929), verwenden und solche, welche Mikroorganismen, einschließlich solche der Gattung Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, und Candida (US-Patent 3,563,857) verwenden. Obwohl die Produktion von L-Glutaminsäure durch Einsatz herkömmlicher Verfahren deutlich erhöht worden ist, besteht Bedarf an der Entwicklung eines Verfahrens zur Produktion von L-Glutaminsäure, welches effektiver und kostengünstiger ist, um den zunehmenden Bedarf zu decken.
L-Glutaminsäure wird aus α-Ketoglutarsäure, welche ein Intermediat im Citronensäurezyklus ist, der in Zellen von Mikroorganismen vorhanden ist, biosynthetisiert, und es gibt zwei unterschiedliche Biosynthesewege zur Bindung von L-Glutaminsäure aus α-Ketoglutarsäure durch Assimilation von Ammoniumionen. Einer davon ist der Weg, über den in Anwesenheit von Ammoniumionen in hoher Konzentration L-Glutaminsäure durch Katalyse der Glutamatdehydrogenase (im Folgenden als "GDH" bezeichnet) synthetisiert wird, und der andere ist der Weg (GS/GOGAT-Weg), über den L-Glutaminsäure durch Glutaminsynthetase (im Folgenden als "GS" bezeichnet), welche die Reaktion von L-Glutaminsäure und Ammoniumionen zu Glutamin katalysiert, und durch Glutamin-Oxoglutarsäure-Aminotransferase (auch als "Glutamatsynthase" bezeichnet und im Folgenden als "GOGAT" bezeichnet), welche die L-Glutaminsäuresynthesereaktion katalysiert, worin zwei Moleküle L-Glutaminsäure aus einem Molekül Glutamin, das durch GS synthetisiert wird, und einem Molekül α-Ketoglutarsäure synthetisiert wird, synthetisiert. Bislang wurde die L-Glutaminsäureproduktion über den bakteriellen GDH-Weg, der durch Erhöhen der GDH-Aktivität verstärkt worden ist, berichtet, die L-Glutaminsäureproduktion über den bakteriellen GS/GOGAT-Weg, der verstärkt wird, war bislang jedoch nicht bekannt.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Bakterienstämme mit hoher L-Glutaminsäureproduktion zu züchten und ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure bereitzustellen, welches effektiver und kostengünstiger ist, um den zunehmenden Bedarf an L-Glutaminsäure zu befriedigen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Untersuchungen über die Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure unter Verwendung von Bakterienstämmen, deren GOGAT-Aktivität, welches eines der Enzyme ist, die am GS/GOGAT-Weg beteiligt sind, und die Produktion von L-Glutaminsäure katalysiert, erhöht ist. Die Erfinder haben gefunden, dass ein Bakterienstamm mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure mit erhöhter GOGAT-Aktivität eine höhere L-Glutaminsäureproduktion aufweist und haben auf diese Weise die vorliegende Erfindung gemacht.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt einen Bakterienstamm der Gattung Corynebacterium bereit, der L-Glutaminsäure produzieren kann, wobei die Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität in einer Zelle des Bakterienstammes erhöht ist. Die Erhöhung der Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität kann durch Amplifizieren der Kopienzahl eines Gens, das für Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase kodiert, verursacht werden. Alternativ dazu kann die Erhöhung der Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität auch durch Verändern der Expressionsregulationssequenz eines dieses Enzym kodierenden Gens bewirkt werden. Die Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase kann aus Bakterien der Gattung Escherichia oder Corynebacterium abgeleitet sein.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Gen bereit, das für Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase kodiert und eine Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens den Nukleotidnummern 565 bis 6614 der Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 7 entspricht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation bereit, welches die Stufen umfasst, in denen in einem flüssigen Medium ein Bakterienstamm der Gattung Corynebacterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, worin die Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität in einer Zelle des Bakterienstammes erhöht ist, kultiviert wird, die L-Glutaminsäure in dem Kulturmedium produziert und angehäuft wird und die L-Glutaminsäure aus dem Medium gewonnen wird.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden eingehend beschrieben.

(1) Bakterien der Gattung Corynebacterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure

Bakterien der Gattung Corynebacterium, auf die hier Bezug genommen wird, sind eine Gruppe von Mikroorganismen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, S. 599 (1974) beschrieben sind. Die Bakterien sind aerob, Grampositiv, nicht-säurefeste Bazillen ohne die Fähigkeit zur Sporulation und umfassen Bakterien, die als Bakterien der Gattung Brevibacterium klassifiziert worden sind, jedoch derzeit unter der Gattung Corynebacterium zusammengefasst werden [vergleiche Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)], und sie umfassen auch Bakterien der Gattung Brevibacterium und Microbacterium, die mit der Gattung Corynebacterium eng verwandt sind. Unter den Bakterien der Gattung Corynebacterium sind die nachstehend genannten, die als L-Glutaminsäure produzierende Bakterien bekannt sind, für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung am stärksten bevorzugt.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melassecola
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium saccharolyticum
Brevibacterium immariophilium
Brevibacterium roseum
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium thiogenitalis

Genauer gesagt werden als Beispiele die folgenden Stämme dieser Bakterien genannt:

Corynebacteriuma cetoacidophilum	ATCC 13870
Corynebacteriumacetoglutamicum	ATCC 15806
Corynebacterium callunae	ATCC 15991

Corynebacterium glutamicum	ATCC 13032
Corynebacterium glutamicum	ATCC 13060
Brevibacterium divaricatum	ATCC 14020
Brevibacterium lactofermentum	ATCC 13869
Corynebacterium lilium	ATCC 15990
Corynebacterium melassecola	ATCC 17965
Brevibacterium saccharolyticum	ATCC 14066
Brevibacterium immariophilium	ATCC 14068
Brevibacterium roseum	ATCC 13825
Brevibacteriumflavum	ATCC 13826
Brevibacterium thiogenitalis	ATCC 19240

Diese Stämme können von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen werden. Jeder dieser Bakterienstämme hat eine Registrierungsnummer. Ausgehend von dieser Registrierungsnummer kann jedermann den entsprechenden Bakterienstamm von der ATCC beziehen. Die Registrierungsnummern der Bakterienstämme, die bei ATCC hinterlegt sind, sind im ATCC-Katalog beschrieben.
Um L-Glutaminsäure unter Einsatz der vorstehend beschriebenen Bakterien der Gattung Corynebacterium herzustellen, kann jedes der folgenden Mittel eingesetzt werden.

1. Die Biotinkonzentration in dem Medium suboptimal eingestellt. Siehe S. Okumura, T. Tsugawa, T. Tsunoda and A. Kitai, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 36, 197-203 (1962).
2. Ein oberflächenaktives Mittel wird dem Medium mit der Maßgabe zugegeben, dass eine ausreichende Menge Biotin vorhanden ist. Siehe I. Shiio, H. Otsuka and N. Atsuya, J. Biochem., 53, 333-340 (1963); K. Takinami, H. Okada and T. Tsunoda, Agr. Biol. Chem., 27, 853-863 (1963).
3. Penicillin wird dem Medium mit der Maßgabe zugegeben, dass eine ausreichende Menge Biotin vorhanden ist. Siehe das US- Patent 3,080,297; die Japanische Patentveröffentlichung Nr. 37-1695 (1962); M. Shibui, T. Kurima, S. Okabe and T. Osawa, Amino Acid and Nucleic Acid, 17, 61-65 (1968).

Die L-Glutaminsäure kann auch durch eine Verfahren unter Verwendung von Mutanten hergestellt werden, die von den vorstehend genannten Bakterien der Gattung Corynebacterium abgeleitet sind. Als Beispiele der Mutanten können die folgenden genannt werden:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12745 (FERM-BP 2922); vergleiche US-Patent Nr. 5,272,067.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12746 (FERM-BP 2923); vergleiche US-Patent Nr. 5,272,067.
Brevibacterium flavum AJ 12747 (FERM-BP 2924); vergleiche US-Patent Nr. 5,272,067.
Corynebacterium glutamicum AJ 12478 (FERM-BP 2925); vergleiche US-Patent Nr. 5,272,067.
Corynebacterium glutamicum ATCC 21492.
In der vorliegenden Erfindung ist es am stärksten bevorzugt, die vorstehend genannten L-Glutaminsäure produzierenden Bakterien zu verwenden.
(2) Erhöhung der GOGAT-Aktivität
Die GOGAT-Aktivität in Bakterienzellen kann durch Konstruieren einer rekombinanten DNA durch Ligieren eines Genfragments, das für GOGAT kodiert, mit einem Vektor, der in Bakterien der Gattung Corynebacterium funktioniert, Transformieren eines Wirtsstammes eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium, welcher die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure hat, durch Einführen der rekombinanten DNA in den Stamm erhöht werden. GOGAT ist ein Heterooligomer, das aus einer großen Untereinheit und einer kleinen Untereinheit besteht, die von dem gltB-Gen beziehungsweise dem gltD-Gen kodiert werden. Als Ergebnis der Erhöhung der Kopienzahl des Gens, das für GOGAT kodiert (im Folgenden als "gltBD-Gen" bezeichnet), in den Zellen der Transformanten wird die GOGAT-Aktivität erhöht.
Als gltBD-Gen kann das Gen der Bakterien der Gattung Corynebacterium und auch ein Gen, das von einem anderen Mikroorganismus, einschließlich Escherichia coli, abgeleitet ist, verwendet werden. Die Nukleotidsequenz des gltBD-Gens, das von Bakterien der Gattung Corynebacterium abgeleitet ist, ist bislang nicht bekannt, die Nukleotidsequenzen der gltBD-Gene von Escherichia coli K-12 (Gene, 60, 1-11 (1987)) und Hefe (Saccharomyces cerevisiae, GenBank Hinterlegungsnr. X89221) sind jedoch ermittelt worden. Deshalb ist es möglich, auf der Grundlage der Nukleotidsequenzen dieser gltBD-Gene Primer zu synthetisieren und das gltBD-Gen von Mikroorganismen, wie Escherichia coli K-12 und Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, durch das PCR-Verfahren unter Verwendung chromosomaler DNA, die aus diesen Mikroorganismen präpariert worden ist, als Matrize zu erhalten. Solche Primer sind beispielsweise die Primer der SEQ ID NRn: 3 bis 6. Die Nukleotidsequenz des gltBD-Gens von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, das in einem nachfolgenden Beispiel isoliert wird, ist in SEQ ID NR: 7 gezeigt. Das gltBD-Gen von Brevibacterium lactofermentum ist neu.
Die Plasmide, die für die Genklonierung eingesetzt werden, können beliebige Plasmide sein, die in Zellen eines Mikroorganismus, wie Escherichia, replizierbar sind, wobei pBR322, pTWV228, pMWl19 und pUC19 als konkrete Beispiele genannt werden.
Der Vektor, der in Bakterien der Gattung Corynebacterium funktioniert und auf den hier Bezug genommen wird, ist beispielsweise ein Plasmid, das den Bakterien der Gattung Corynebacterium autonom replizierbar ist. Spezifische Beispiele dieses Vektors sind nachstehend genannt:
pAM 330, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 58-67699 (1983)
pHM 1519, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 58-77895 (1983)
pAJ 655, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 58-192900 (1983)
pAJ 611, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 58-192900 (1983)
pAJ 1844, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 58-192900 (1983)
pCG 1, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 57-134500 (1982)
pCG 2, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 58-35197 (1983)
pCG 4, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 57-183799 (1982)
pCG 11, vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 57-183799 (1982)
Um rekombinante DNA durch Ligieren des gltBD-Gens, das für GO-GAT kodiert, und eines Vektors, der in einer Zelle eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium funktioniert, herzustellen, wird der Vektor durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme verdaut, die den Enden des gltBD-Gens entsprechen. Die Ligation wird im Allgemeinen durch Verwendung einer Ligase, die T4-DNA-Ligase, durchgeführt.
Um die rekombinante DNA, die wie vorstehend beschrieben präpariert wurde, in Bakterien der Gattung Corynebacterium einzuführen, kann jedes bekannte Transformationsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Verfahren, bei dem Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität der DNA zu erhöhen, was für Escherichia coli K-12 berichtet wurde [vergleiche Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], und ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem kompetente Zellen aus Zellen präpariert werden, die in der Wachstumsphase sind, und anschließend wird die DNA in diese Zellen eingeführt, was für Bacillus subtilis berichtet worden ist [vergleiche Duncan, C. H., Wilson, G. A. und Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)]. Zusätzlich zu diesem Verfahren ist ein Verfahren einsetzbar, bei dem DNA-Empfängerzellen in Protoplasten oder Spheroplasten überführt werden, die rekombinante DNA's aufnehmen können, und danach wird die rekombinante DNA in die Zellen eingeführt, was bekanntlich für Bacillus subtilis, Actinomycetes und Hefen durchgeführt werden kann [vergleiche Chang, S. und Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. und Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. und Fink, G. R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)].
Das Verfahren der Transformation, das in den Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, ist das elektrische Pulsverfahren (vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 2-207791).
Die Erhöhung der GOGAT-Aktivität kann auch durch Einführen einer Vielzahl von Kopien des gltBD-Gens in die chromosomale DNA der vorstehend beschriebenen Wirtsstämme durchgeführt werden. Um eine Vielzahl von Kopien des gltBD-Gens in die chromosomale DNA eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium einzuführen, wird die homologe Rekombination unter Einsatz einer Sequenz, die in vielfachen Kopien in der chromosomalen DNA vorliegt, als Ziel durchgeführt. Als Sequenzen, die als vielfache Kopien in der chromosomalen DNA vorliegen, können repetitive DNA und umgekehrte Wiederholungen (inverted repeats), die am Ende eines transponierbaren Elements vorliegen, eingesetzt werden. Wie in der offen gelegten Japanischen Patentanmeldung Nr. 2-109985 offenbart wird, ist es möglich, das gltBD-Gen in ein Transposon einzuverleiben und es zu transferieren, um eine Vielzahl von Kopien des gltBD-Gens in die chromosomale DNA einzuführen. Durch eines dieser Verfahren kann die Anzahl der Kopien des gltBD-Gens innerhalb von Zellen des transformierten Stammes erhöht werden, sodass im Ergebnis die GOGAT-Aktivität erhöht wird.
Anders als durch die vorstehend beschriebene Genamplifikation kann die Erhöhung der GOGAT-Aktivität auch durch Substituieren der Expressionsregulationssequenz, beispielsweise des Promotors, des gltBD-Gens, durch eine stärkere erreicht werden. Beispielsweise sind der lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor, tac-Promotor, und der PR-Promotor und der PL-Promotor des Phagen Lambda als starke Promotoren bekannt. Durch Substituieren des eigentlichen Promotors dessen gltBD-Gens durch diese Promotoren wird die Expression des gltBD-Gens verstärkt, wodurch die GOGAT-Aktivität erhöht wird.
(3) Produktion von L-Glutaminsäure unter Verwendung erfindungsgemäßer Bakterienstämme
Durch Verwendung eines Bakterienstammes der Gattung Corynebacterium mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure, worin die GOGAT-Aktivität in einer Zelle des Bakterienstammes erhöht ist, kann L-Glutaminsäure mittels eines üblichen Verfahrens produziert werden, welches ein allgemeines Nährkulturmedium verwendet, welches eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere organische Nährstoffe in Spuren, wie Aminosäuren und Vitamine, bei Bedarf enthält. Es kann sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches Medium verwendet werden. Jede Kohlenstoffquelle oder Stickstoffquelle, die für das Medium eingesetzt wird, kann verwendet werden, wenn es für die Kultivierung des Bakterienstammes eingesetzt werden kann.
Als Kohlenstoffquelle werden Zucker, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Galactose, Stärkehydrolysat und Melasse eingesetzt, und andere organische Säu ren, wie Essigsäure und Citronensäure, werden allein oder in Kombination mit anderen Kohlenstoffquellen eingesetzt.
Als Stickstoffquellen können Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat oder Nitrat verwendet werden.
Als organische Spurennährstoffe können Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren, Nukleinsäuren und außerdem Pepton, Casaminosäuren, Hefeextrakt und Sojabohnenproteinhydrolysat, welche diese Nährstoffe enthalten, verwendet werden, und in dem Fall, bei dem eine auxotrophe Mutante eingesetzt wird, die Aminosäuren oder andere Substanzen für ihr Wachstum benötigt, sollten die erforderlichen Nährstoffe zugesetzt werden.
Als anorganische Salze werden Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze, Mangansalze und dergleichen eingesetzt.
Das Kultivierungsverfahren wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, während die Fermentationstemperatur bei zwischen 20 und 45°C und der pH-Wert bei zwischen 5 und 9 kontrolliert wird. Wenn sich der pH-Wert während der Kultivierung senkt, kann Calciumcarbonat zugegeben werden, oder das Kulturmedium wird mit einer alkalischen Substanz, wie Ammoniakgas, neutralisiert.
Durch eine solche Kultivierung während etwa 10 Stunden bis vier Tage wird eine signifikante Menge an L-Glutaminsäure in dem Kulturmedium angehäuft.
Hinsichtlich des Verfahrens zum Gewinnen der L-Glutaminsäure aus dem Kulturmedium nach der Kultivierung kann jedes bekannte Gewinnungsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann das Produkt durch das Konzentrationskristallisationsverfahren nach Entfernen der Zellen aus dem Kulturmedium oder durch Ionenaustauscherchromatografie oder dergleichen gewonnen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pBD35-43.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung wird anhand der Beispiele im Folgenden eingehender erklärt.
Beispiel 1
(1) Klonierung des gltBD-Gens von Escherichia coli K-12
Die Nukleotidsequenz des gltBD-Gens von Escherichia coli K-12 ist bereits bekannt (Gene, 60, 1-11 (1987)). Auf der Grundlage der berichteten Nukleotidsequenz wurden die in den SEQ ID NRn: 1 und 2 des Sequenzprotokolls gezeigten Primer synthetisiert, und das gltBD-Gen wurde mit dem PCR-Verfahren unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes JM109 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), der von Escherichia coli K-12 abgeleitet ist, als Matrize amplifiziert.
Bei den synthetischen Primern entspricht SEQ ID NR: 1 einer Sequenz im Bereich der Nukleotide 57 bis 96 in der Figur der Nukleotidsequenz des gltBD-Gens, das in Gene, 60, 6 (1987) beschrieben wird, die Nukleotide 77 und 78 wurden jedoch in den Primer von A nach G verändert, und es wurde eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BamHI eingeführt. Die SEQ ID NR: 2 entspricht einer Sequenz im Bereich der Nukleotide 6261 bis 6290 in der Figur der Nukleotidsequenz des gltBD-Gens, das in Gene, 60, 7 (1987) beschrieben wird, das Nukleotid 6380 wurde jedoch von T in G geändert, das Nukleotid 6282 wurde von A in T geändert, und das Nukleotid 6284 wurde im Primer von A in C geändert, sodass die Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms BamHI eingeführt wurde. Die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 2 ist auch eine Sequenz, die der Gegenstrang der Nukleo tidsequenz im Bereich der Nukleotide 6261 bis 6290, die in der Figur der Nukleotidsequenz in Gene, 60, 7 (1987) beschrieben ist und von dem 5'-Ende ausgeht.
Die Präparation der chromosomalen DNA von Escherichia coli K-12 wurde nach üblichen Verfahren durchgeführt (Seibutsu-kogaku Jikken-sho, herausgegeben von Nihon Seibutsu Kougaku-kai, 97-98, Baifu-kan, (1992)). Die PCR-Reaktion wurde unter Einsatz der Standardreaktionsbedingungen durchgeführt, die in PCR Technology beschrieben sind (herausgegeben von Henry Ehrich, Stockton Press, 1989, S. 8).
Nachdem das erhaltene PCR-Produkt unter Einsatz des üblichen Verfahrens gereinigt wurde, wurde es mit einem Restriktionsenzym BamHI behandelt und mit pMW219 (hergestellt von Nippon Gene Co., Ltd.), welches mit BamHI verdaut worden war, unter Einsatz eines Ligation Kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert, und dann wurde die Transformation unter Einsatz der kompetenten Zellen von Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt. Dann wurden die Zellen auf L-Medium (10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 15 g/l NaCl, 15 g/l Agar, pH 7,2), enthaltend 10 μg/ml IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid), 40 μg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 25 μg/ml Kanamycin, plattiert und über Nacht kultiviert, und dann wurden anschließend gebildete weiße Kolonien entnommen und als einzelne Kolonien isoliert, um Transformanten zu erhalten.
Plasmide wurden aus den Transformanten unter Einsatz des alkalischen Verfahrens (Seibutsu-kogaku Jikken-sho, herausgegeben von Nihon Seibutsu Kogaku-kai, 105, Baifu-kan, (1992)) präpariert, und danach wurde eine Restriktionskarte eines DNA-Fragments, das in die Vektoren eingeführt worden war, präpariert, und dann wurde auf der Grundlage des Vergleichs mit der bekannten Restriktionskarte des gltBD-Gens ein Plasmid, dessen DNA-Fragment die gleiche Restriktionskarte wie die bekannte Karte hatte, als pMWGOGAT35 bezeichnet.
Außerdem wurde, um zu bestätigen, dass das gltBD-Gen exprimiert wurde, pMWGOGAT35 in Escherichia coli PA340, welchem gdh und gltB fehlt und dem L-Glutaminsäure zugesetzt werden musste (E. coli Genetic stock center (Yale University, USA)) unter Verwendung des Elektroporationsverfahrens eingeführt. Im Ergebnis verlor die Transformante, in die pMWGOGAT35 eingeführt worden war, die Eigenschaft, dass L-Glutaminsäure zugesetzt werden musste, wodurch die Expression des gltBD-Gens bestätigt wurde.
(2) Konstruktion eines Plasmids mit dem gltBD-Gen von Escherichia coli K-12 und einem Replikationsursprung eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium
Das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pBD35-43, welches das gltBD-Gen von Escherichia coli K-12 und einen Replikationsursprung eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium aufweist, ist in 1 gezeigt. Genauer gesagt wurde das Plasmid pHK4 (offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 5-7491), welches den Replikationsursprung trägt (offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. Hei 5-7491), der von dem Plasmid pHM1519 abgeleitet ist, das in einem Bakterium der Gattung Corynebacterium autonom replizierbar ist (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI verdaut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, welches den Replikationsursprung einschließt, und das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung eines DNA blunting kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Blunting kit) abgestumpft und dann an der XbaI-Stelle des Plasmids pMWGOGAT35 eingeführt, in das das klonierte gltBD-Gen von Escherichia coli K-12 unter Verwendung des XbaI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) eingeführt worden war. Dieses Plasmid wurde pBD35-43 genannt.
(3) Einführen von pBD35-43 in Wildtypstämme von Bakterien der Gattung Corynebacterium AJ12036 und AJ13029 und Untersuchung der erhaltenen Transformanten durch Kultivierung
Wildtypstämme von Bakterien der Gattung Corynebacterium AJ12036 (Agric. Biol. Chem., 51, 93-100 (1987)) und AJ13029 wurden mit dem Plasmid pBD35-43 unter Einsatz des elektrischen Pulsverfahrens transformiert (vergleiche die offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 2-207791), sodass Transformanten erhalten wurden. Die Transformante AJ12036/pBD35-43, die durch Einführen des Plasmids pBD35-43 in den Wildtypstamm AJ12036 erhalten wurde, wurde kultiviert, um L-Glutaminsäure unter Biotinrestriktionsbedingungen wie folgt herzustellen. Zellen von AJ12036/pBD35-43, die auf CM2B-Mediumplatte, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, wurden in ein Kulturmedium eingeimpft, in das 80 g Glucose, 1 g KH₂PO₄, 0,4 g MgSO₄·7H₂O, 30 g (NH₄) 2S0₄, 0,01 g FeSO₄·7H₂O, 0,01 g MnSO₄·7H₂O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 60 μg Biotin, 25 mg Kanamycin, und 50 g CaCO₃ in einem Liter reinem Wasser (durch KOH auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt) zugegeben wurden, und die Zellen wurden bei 31,5°C unter Schütteln kultiviert, bis der Zucker in dem Medium verbraucht wurde. Die erhaltene Kultur wurde in das Medium derselben Zusammensetzung, außer dass Biotin und Kanamycin nicht zugegeben wurden (im Folgenden als "Biotinrestriktionsmedium" bezeichnet) in einer Menge von 5% eingeimpft, und dann wurde die Kultivierung bei 31,5°C unter Schütteln durchgeführt, bis der in dem Medium enthaltene Zucker verbraucht worden war. Als Kontrolle wurde der Stamm AJ12036 auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben kultiviert. Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung wurde die Menge der angehäuften L-Glutaminsäure in dem Kulturmedium unter Einsatz des Biotech Analyzer AS-210, hergestellt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd., gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Unter Verwendung der Transformante AJ13029/pBD35-43, die durch Einführen des Plasmids pBD35-43 in AJ 13029 erhalten wurde, wurde die Kultivierung zur L-Glutaminsäureproduktion wie folgt durchgeführt. Zellen des Stammes AJ13029/pBD35-43, die auf einer CM2B-Mediumplatte, enthaltend 25 μg/ml Kanamycin, kultiviert worden waren, wurden in ein Kulturmedium, in das 30 g Glucose, 1 g KH₂PO₄, 0,4 g MgSO₄·7H₂O, 30 g (NH₄)2SO₄, 0,01 g FeSO₄·7H₂O, 0,01 g MnSO₄·7H₂O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 60 μg Biotin, 25 mg Kanamycin, und 50 g CaCO₃ in einem Liter reinem Wasser (unter Verwendung von KOH auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt) zugegeben worden waren, eingeimpft, und das Kulturmedium wurde bei 31,5°C unter Schütteln kultiviert, bis der in dem Medium enthaltene Zucker verbraucht worden war. Die erhaltene Kultur wurde in das Medium derselben Zusammensetzung in einer Menge von 5% eingeimpft, und dann bei 37,0°C unter Schütteln kultiviert, bis der in dem Medium enthaltene Zucker verbraucht worden war. Als Kontrolle wurde der Stamm AJ12029 auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben kultiviert. Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung wurde die Menge der angehäuften L-Glutaminsäure in dem Kulturmedium unter Verwendung des Biotech Analyzer AS-210, hergestellt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd., gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Der Stamm AJ12029 ist ein Stamm, der in WO96/06180 beschrieben wird und eine Temperaturempfindlichkeit gegen eine Biotinaktivitätreprimierende Substanz aufweist. Dieser Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postleitzahl: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) gemäß dem Budapester Abkommen hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer des Stammes ist FERM BP-5189.
Tabelle 2
Durch diese Ergebnisse wurde gezeigt, dass das L-Glutaminsäure produzierende Bakterium der Gattung Corynebacterium, das durch Einführen des gltBD-Gens erhöhte GOGAT-Aktivität aufwies, eine erhöhte Ausbeute an L-Glutaminsäure zeigte.
Beispiel 2
(1) Klonieren des gltBD-Gens von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
Es ist wünschenswert, das gltBD-Gen aus einem Bakterium der Gattung Corynebacterium im Fall der fermentativen Produktion von L-Glutaminsäure unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium einzusetzen.
Die Oligonukleotide der SEQ ID NRn: 3 und 4 wurden gemäß der Nukleotidsequenz, die aus der Aminosäuresequenz der ausgewählten Region der gltBD-Genprodukte, die zwischen Escherichia coli und Hefe hoch homolog war, angenommen wurde, synthetisiert. Chromosomale DNA wurde aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 unter Verwendung des Bacterial Genomic DNA Purification Kit präpariert (hergestellt von Advanced Genetic Technologies Corp.). Unter Verwendung der vorstehenden Oligonukleotide als Primer und der chromosomalen DNA als Matrize wurde die PCR unter den Standardreaktionsbedingungen durchgeführt, die in "PCR Technology" beschrieben sind (herausgegeben von Henry Ehrich, Stockton Press, 1989, S. 8). Die Agarosegelelektrophorese des PCR-Produkts zeigte, dass ein DNA-Fragment von etwa 1,4 kbp amplifiziert wurde. Beide Enden der erhaltenen DNA wurden unter Verwendung der Oligonukleotide der SEQ ID NRn: 3 und 4 sequenziert. Die Sequenzierung wurde unter Einsatz des DNA Sequencing Kit (hergestellt von Applied Biosystems Co., Ltd.) nach dem Sanger-Verfahren (J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)) durchgeführt. Die bestimmte Nukleotidsequenz wurde in die Aminosäuren translatiert, und die Sequenz wurde mit den Aminosäuresequenzen, die von den gltBD-Genen von Escherichia coli und Hefe abgeleitet worden war, verglichen. Aufgrund der hohen Homologie wurde deshalb darauf geschlossen, dass das DNA-Fragment, das durch PCR amplifiziert worden war, ein Teil des gltBD-Gens von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 war. Dann wurde die chromosomale DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, hergestellt durch das vorstehend beschriebene Verfahren, mit EcoRI, BamHI, HindIII, PstI und SalI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durch das übliche Verfahren verdaut und durch Southern Hybridisierung unter Einsatz des amplifizierten DNA-Fragments als Sonde und des DIG DNA Labeling and Detection Kit (hergestellt von Boeringer Mannheim) analysiert. Es wurde gefunden, dass ein etwa 14 kb Fragment, das durch HindIII geschnitten wurde, mit der DNA-Sonde hybridisiert. Deshalb wurde das HindIII-Fragment der chromosomalen DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, hergestellt durch das übliche Verfahren, einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, und es wurden DNA-Fragmente mit etwa 10 kb oder größer unter Einsatz eines Glaspulvers gewonnen. Das gewonnene DNA-Fragment wurde mit dem Vektor pMW219 (hergestellt von Nippon Gene Corporation), der mit dem Restriktionsenzym HindIII (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) geschnitten worden war, unter Einsatz des Ligation kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert. Kompetente Zellen von Escherichia coli JM109 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert. Die Transformanten wurden auf L-Medium (10 g/ml Bacto-Tripton, 5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 15 g/l NaCl, 15 g/l Rgar, pH 7,2), enthaltend 10 μg/ml IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid), 40 μg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 25 μg/ml Kanamycin, plattiert und über Nacht inkubiert. Die so gebildeten weißen Kolonien wurden aufgenommen und in einzelne Kolonien isoliert, wobei etwa 1000 Transformanten erhalten wurden. Unter Verwendung der erhaltenen Transformanten wurden Plasmide durch das alkalische Verfahren präpariert (Seibutsu-Kogaku Jikken-sho, herausgegeben von Nihon Seibutsu-kogaku Gakkai, 105, Baifu-kan, (1992)). Die PCR wurde unter Einsatz der synthetischen Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NRn: 5 und 6, die ausgehend von dem sequenzierten Teil der DNA-Sequenz, die als Sonde eingesetzt wurde, synthetisiert wurden, und unter Einsatz des vorstehend genannten Plasmids als Matrize beziehungsweise Primer unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Dann wurden die Transformanten, die ein amplifiziertes Fragment von etwa 1,3 kbp ergaben, wobei deren Größe dieselbe ist wie die des DNA-Fragments, das amplifiziert wurde, wenn die PCR unter Verwendung der vorstehend genannten Primer und unter Einsatz des Chromosoms von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 als Matrize durchgeführt worden war, selektiert.
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz des gltBD-Gens von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Plasmid-DNA, hergestellt aus den in (1) erhaltenen Transformanten durch das alkalische Verfahren, enthielten ein DNA-Fragment von etwa 14 kbp, das von dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 abgeleitet ist. Auf dieselbe Weise wurde mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren die Nukleotidsequenz des gltBD-Gens, das in dem DNA-Fragment von etwa 14 kbp, abgeleitet von dem Chromosom von Brevibacterium 1actofermentum ATCC 13869, enthalten war, bestimmt.
Innerhalb der so bestimmten Nukleotidsequenz ist das AatII-Fragment, welches das gltBD-Gen enthält, in SEQ ID NR: 7 gezeigt. Ausgehend von der Nukleotidsequenz wurde angenommen, dass zwei offene Leserahmen vorhanden sind, und die Aminosäuresequenzen der Translationsprodukte, die von der Nukleotidsequenz abgeleitet wurden, sind in SEQ ID NR: 7 gezeigt. Das heißt, das Gen, das für zwei Proteine mit den Aminosäuresequenzen der SEQ ID NR: 7 kodiert, ist das gltBD-Gen von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. In der Sequenz entsprechen die Nukleotide der Nummern 565 bis 5094 dem gltB-Gen, und die Nukleotide der Nummern 5097 bis 6614 entsprechen dem gltD-Gen. Die Aminosäuresequenzen, die von dem gltB-Gen und dem gltD-Gen kodiert werden, sind in den SEQ ID NRn: 8 beziehungsweise 9 gezeigt. Da der Methioninrest, der am N-Terminus des Proteins liegt, von dem Initiationscodon ATG abgeleitet ist, hat der Rest üblicherweise keinen Bezug zu der Funktion des Proteins an sich, und es ist bekannt, dass er nach der Translation mittels einer Peptidase entfernt wird. Im Fall der vorstehend beschriebenen Proteine besteht dementsprechend die Möglichkeit, dass der Methioninrest entfernt wird.
Die Nukleotidsequenzen und die Aminosäuresequenzen wurden mit bekannten Sequenzen auf Homologie verglichen. Die eingesetzten Datenbanken waren EMBL und SWISS-PROT. Es wurde gefunden, dass die DNA in SEQ ID NR: 7 ein neues Gen in einem Bakterium der Gattung Corynebacterium ist, das mit den bereits bekannten gltBD-Genen von Escherichia coli, Hefe oder dergleichen Homologie zeigt.
(3) Präparation eines Plasmids, welches das gltBD-Gen von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und den Replikationsursprung eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium aufweist
Um die Wirkung der Amplifikation des gltBD-Gens von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 zu untersuchen, wurde ein Plasmid konstruiert, welches das gltBD-Gen von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und einen Replikationsursprung eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium aufweist. Im Speziellen wurde die Plasmid-DNA, die das etwa 14 kbp DNA-Fragment, abgeleitet von dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, enthält, das aus den in (1) erhaltenen Transformanten durch das alkalische Verfahren präpariert worden war, mit dem Restriktionsenzym AatII geschnitten, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, welches das gltBD-Gen von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 enthält, und das erhaltene Fragment wurde mit dem DNA blunting kit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., Blunting kit) abgestumpft, und danach wurde es in die Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI innerhalb des Plasmids pVC7 eingeführt, welches den Replikationsursprung trägt, der von dem Plasmid pAM330 abgeleitet ist, das in einem Bakterium der Gattung Corynebacterium autonom replizieren kann (offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. Sho 58-67699). Das Plasmid wurde pVCGOGAT genannt. Das Plasmid pVC7 wurde durch Ligieren von pHSG399, einem Vektor für E. coli (Cm^r; Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74 (1987)), mit pAM330, einem kryptischen Plasmid von Brevibacterium lactofermentum, konstruiert. Das Plasmid pAM330 wurde aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 präpariert. Das Plasmid pHSG399 wurde mit dem Restriktionsenzym AvaII (hergestellt von Takara Shuzo), welches zu einer Schnittstelle führt, verdaut, mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft und mit pAM330, das mit HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut worden war und mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft worden war, ligiert. Das Plasmid pVC7 ist sowohl in E. coli als auch in Brevibacterium lactofermentum autonom replizierbar und hat eine Vielzahl von Klonierungsstellen, die von pHSG399 und lacZ' abgeleitet sind.
Um zu bestätigen, dass das gltBD-Gen exprimiert wurde, wurde pVCGOGAT außerdem in Escherichia coli PA340, welchem gdh und gltB fehlt und dem L-Glutaminsäure zugesetzt werden muss (E. coli Genetic stock center (Yale University, USA)), durch das Elektroporationsverfahren eingeführt. Der transformierte Stamm, der pVCGOGAT trägt, zeigte im Ergebnis nicht mehr die Eigenschaft, dass er L-Glutaminsäure benötigt, sodass die Expression des gltBD-Gens auf diese Weise bestätigt wurde.
(4) Einführen von pVCGOGAT in einen Wildtypstamm eines Bakteriums der Gattung Corynebacterium AJ 12036 und Untersuchung der Kultivierung
Der Wildtypstamm des Bakteriums AJ 12036 der Gattung Corynebacterium (Agric. Biol. Chem., 51, 93-100 (1987)) wurde mit dem Plasmid pVCGOGAT durch das elektrische Pulsverfahren (offen gelegte Japanische Patentanmeldung Nr. Hei 2-207791) transformiert, wobei eine Transformante erhalten wurde. Die Transformante AJ 12036/pVCGOGAT, die durch Einführen des Plasmids pVCGOGAT in den Wildtypstamm AJ 12036 erhalten wurde, wurde zur L-Glutaminsäureproduktion unter Biotinrestriktionsbedingungen wie folgt kultiviert. Zellen von AJ12036/pVCGOGAT, die durch Kultivieren auf einer CM2B-Mediumplatte, enthaltend 5 mg/ml Chloramphenicol, erhalten wurden, wurden in ein Kulturmedium, in das 80 g Glucose, 1 g KH₂PO₄, 0,4 g MgSO₄·7H₂O, 30 g (NH₄)2S0₄, 0,01 g FeSO₄·7H₂O, 0,01 g MnSO₄·7H₂O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 60 μg Biotin, 10 mg Chloramphenicol, und 50 g CaCO₃ in einem Liter reinem Wasser (mit KOH auf pH 8,0 eingestellt) gegeben worden waren, eingeimpft, und bei 31,5°C unter Schütteln kultiviert, bis der in dem Kulturmedium enthaltene Zucker verbraucht worden war.
Die erhaltene Kultur wurde in einer Menge von 5% in das Medium derselben Zusammensetzung, außer dass Biotin und Chloramphenicol nicht zugegeben wurden (im Folgenden als "Biotinrestriktionsmedium" bezeichnet), eingeimpft und bei 31,5°C unter Schütteln kultiviert, bis der in dem Kulturmedium enthaltene Zucker verbraucht worden war. Als Kontrolle wurde ein Bakterienstamm, der durch Einführen von pVC7 in AJ12036 unter Einsatz des vorstehend beschriebenen Verfahrens präpariert worden war, auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Menge der angehäuften L-Glutaminsäure in dem Medium unter Verwendung von Biotech Analyzer AS-210 (hergestellt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Industrielle Anwendbarkeit
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann die Produktion von L-Glutaminsäure in Bakterien der Gattung Corynebacterium, die erhöhte GOGAT-Aktivität haben und L-Glutaminsäure produzieren können, erhöht werden, wodurch die Herstellung von L-Glutaminsäure kostengünstiger und effektiver wird. Das gltBD-Gen, abgeleitet von einem Bakterium der Gattung Corynebacterium, wurde erhalten und effektiv eingesetzt, um in einem Bakterium der Gattung Corynebacterium Glutamat zu produzieren. SEQUENZLISTE

Claims

Bakterienstamm der Gattung Corynebacterium mit der Fähigkeit zur Produktion und Anhäufung von L-Glutaminsäure in dem Medium, wobei die Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität in einer Zelle des Bakterienstammes erhöht ist.
Stamm nach Anspruch 1, wobei die Erhöhung der Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität durch Erhöhung der Kopienzahl eines Gens bewirkt wird, das für Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase kodiert.
Stamm nach Anspruch 1, wobei die Erhöhung der Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität durch Veränderung der Expressionsregulationssequenz eines Gens bewirkt wird, das für Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase kodiert.
Stamm nach Anspruch 1, wobei die Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase von einem Bakterium der Gattung Escherichia oder Corynebacterium abgeleitet ist.
Stamm nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Gen, das für Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase kodiert, eine Nukleotidsequenz enthält, die mindestens den Nukleotidnummern 565 bis 6614 der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 7 enspricht.
Gen, das für Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase kodiert und eine Nukleotidsequenz enthält, die mindestens den Nukleotidnummern 565 bis 6614 der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 7 enspricht.
Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches die folgenden Stufen umfasst: Kultivieren eines Bakterienstammes der Gattung Corynebacterium, der die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure hat, in einem Medium, wobei die Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferaseaktivität in einer Zelle des. Bakterienstammes erhöht ist, Produktion und Anhäufung von L-Glutaminsäure in dem Kulturmedium und Gewinnen der L-Glutaminsäure aus dem Medium.