BR112016008830B1 - Método para produzir uma substância alvo - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA ALVO. É fornecido um método para produzir uma substância alvo. A substância alvo, que tem mutação(ções) tendo sido introduzidas em uma região codificadora do gene NCg12954 e/ou uma região de controle de expressão no cromossoma e assim apresenta uma capacidade de assimilação de xilose melhorada, é produzida cultivando-se uma bactéria corineforme, a dita bactéria corineforme sendo capaz de produzir a substância alvo, em um meio contendo xilose e depois coletar a substância alvo do meio.

Description

Campo Técnico
[0001] A presente invenção refere-se a um método para produzir uma substância alvo tal como L-aminoácidos usando uma bactéria corineforme. Os L-aminoácidos são industrialmente úteis como aditivos para rações para animal, ingredientes para temperos, comidas e bebidas, soluções para infusão de aminoácido, e assim por diante.
Fundamentos da Técnica
[0002] Os L-aminoácidos são industrialmente produzidos, por exemplo, através da fermentação usando vários microrganismos tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido. Os exemplos de métodos para produzir um L-aminoácido através da fermentação incluem, por exemplo, os métodos para usar um microrganismo do tipo selvagem (cepa do tipo selvagem), os métodos para usar um cepa auxotrófica derivada de uma cepa do tipo selvagem, os métodos para usar um cepa mutante para a regulagem metabólica derivada como uma cepa mutante resistente a qualquer uma das várias drogas de uma cepa do tipo selvagem, e os métodos para usar uma cepa tendo características tanto como uma cepa auxotrófica quanto uma cepa mutante para a regulagem metabólica.
[0003] Além disso, nos últimos anos, microrganismos nos quais uma capacidade de produzir L-aminoácido é melhorada por técnicas de DNA recombinantes são usados para a produção de L-aminoácido. Os exemplos de métodos para melhorar uma capacidade de produzir L-aminoácido de um microrganismo incluem, por exemplo, aumentar a expressão de um gene que codifica uma enzima biossintética de L-aminoácido (Documentos de patente 1 e 2), e aumentar o influxo de uma fonte de carbono em um sistema de biossíntese de aminoácido (Documento de patente 3).
[0004] Na produção industrial convencional das substâncias alvos tais como L-aminoácidos através da fermentação, glicose, frutose, sacarose, melaços não refinados, hidrolisados de amido e assim por diante foram usados como a fonte de carbono. Contudo, estes são relativamente caros, e o uso de matérias primas de biomassa derivadas de plantas também foi desenvolvida nos últimos anos.
[0005] Embora as matérias primas que consistem em porções comestíveis tais como amidos, gorduras e óleos sejam principalmente usadas como tais matérias primas de biomassa no presente, é desejado usar matérias primas de biomassa consistindo em porções não comestíveis tais como celulose, hemicelulose, e lignina no futuro. A celulose e hemicelulose são convertidas em pentoses e hexoses através de um pré-tratamento usando calor ou ácido, e um tratamento de sacarificação usando uma enzima tal como celulose, e estas podem ser usadas como uma matéria prima para a fermentação (Documentos de patente 4 e 5). É conhecido que se os sacarídeos misturados de tais pentoses e hexoses são usados como a matéria prima para a fermentação de aminoácido etc., Escherichia coli preferencialmente assimila a glicose, e como um resultado, um fenômeno de proliferação em duas etapas (diauxy), e um crescimento atrasado foi confirmado (Documentos que não de patente 1 e 2)
[0006] Na Escherichia coli, uma via de assimilação de xilose compreendo xilose isomerase codificada pelo gene xylA e xilulocinase codificada pelo gene xylB é conhecida, e também é conhecido que um L- aminoácido pode ser produzido a partir de xilose usando Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum que foram introduzidas nesta via (Documentos que não de patente 3 e 4, Documentos de patente 6 e 7). Como via de assimilação de xilose, também é conhecida uma outra via em que a xilose é convertida em ácido a-cetoglutárico por intermédio do ácido xilônico, e é conhecido que uma substância alvo tal como ácido L-glutâmico pode ser produzida a partir de xilose usando uma bactéria que foi introduzida nesta via (Documento de patente 8).
[0007] O gene NCgl2954 de Corynebacterium glutamicum é um gene que codifica um fator de transcrição. Contudo, a relevância da assimilabilidade entre o gene NCgl2954 e a xilose não foi relatada.
Referências da Técnica Anterior Documentos de patente
[0008] Documento de patente 1: Patente U.S. No. 5.168.056
[0009] Documento de patente 2: Patente U.S. No. 5.776.736
[00010] Documento de patente 3: Patente U.S. No. 5.906.925
[00011] Documento de patente 4: Patente Japonesa Aberta ao Público (Kohyo) No. 9-507386
[00012] Documento de patente 5: Patente Japonesa Aberta ao Público (Kohyo) No. 11-506934
[00013] Documento de patente 6: Patente Europeia No. 1577396
[00014] Documento de patente 7: WO2013/105802
[00015] Documento de patente 8: WO2013/069634 Documentos que não de patente
[00016] Documento que não de patente 1: Nichols N.N. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Jul, 56(1-2):120-125
[00017] Documento que não de patente 2: Gonzalez, R., Biotechnol. Prog., 2002 Jan-Fev, 18(1):6-20
[00018] Documento que não de patente 3: Tao H., et al., J. Bacteriol., 2001 Maio, 183(10):2979-2988
[00019] Documento que não de patente 4: Gopinath, V. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011 Dez, 92(5):985-96
Sumário da Invenção Objetivo a ser atingido pela invenção
[00020] O objetivo da presente invenção é desenvolver uma nova técnica para melhorar a assimilabilidade de xilose da bactéria corineforme, e deste modo fornecer um método para produzir eficientemente uma substância alvo tal como L-aminoácidos e ácidos nucleicos a partir de uma matéria prima contendo xilose.
Meios de atingir o objetivo
[00021] De modo a atingir os objetivos acima mencionados, os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas. Como um resultado, descobriram que a bactéria corineforme em que a mutação foi introduzida no gene NCgl2954 e a bactéria corineforme deficiente no gene NCgl2954 podem assimilar a xilose de maneira eficiente, e realizaram a presente invenção.
[00022] Cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade para produzir uma substância alvo a presente invenção pode ser deste modo expressada, por exemplo, como segue. [1]
[00023] Um método para produzir uma substância alvo que compreende: cultivar uma bactéria corineforme tendo a capacidade para produzir uma substância alvo em um meio contendo xilose para produzir e acumular a substância alvo no meio; e coletar a substância alvo do meio, em que assimilabilidade de xilose da bactéria foi melhorada através da introdução de uma mutação em uma região de codificação e/ou uma região de controle de expressão do gene NCgl2954 no cromossomo da bactéria. [2]
[00024] O método mencionado acima, em que a assimilabilidade de xilose foi melhorada pelo aperfeiçoamento da capacidade de absorção de xilose. [3]
[00025] O método mencionado acima, em que a assimilabilidade de xilose foi melhorada através da atenuação da expressão do gene NCgl2954, ou rompimento do gene. [4]
[00026] O método mencionado acima, em que o gene NCgl2954 é um DNA que codifica uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo uma propriedade que a exclusão destes na bactéria corineforme fornece uma melhora da assimilabilidade de xilose; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, e tendo uma propriedade de que a exclusão desta na bactéria corineforme fornece uma melhora da assimilabilidade de xilose. [5]
[00027] O método mencionado acima, em que a mutação consiste em uma ou mais das mutações selecionadas das mutações de (1) a (7) mencionadas abaixo: (1) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (2) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de triptofano na posição 274 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não um resíduo de triptofano; (3) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de tirosina na posição 377 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de tirosina; (4) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 365 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (5) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 366 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (6) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 367 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de alanina; (7) uma mutação para excluir os resíduos de aminoácido que correspondem ao resíduo de aminoácido na posição 368 da SEQ ID NO: 14 e aos seguintes resíduos de aminoácido. [6]
[00028] O método mencionado acima, em que as mutações de (1) a (6) mencionadas acima são as mutações de (1a) a (6a) mencionadas abaixo, respectivamente: [7] ) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de prolina; [8] ) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de triptofano na posição 274 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de arginina; [9] ) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de tirosina na posição 377 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de asparagina; [10] uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 365 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de serina; [11] uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 366 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de arginina; [12] uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 367 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de fenilalanina; [7]
[00029] O método mencionado acima, em que a bactéria também foi ativada de modo que as atividades ou atividade da xilose isomerase e/ou xilulocinase são aumentadas. [8]
[00030] O método mencionado acima, em que a xilose isomerase é uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de xilose isomerase; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, e tendo atividade de xilose isomerase. [9]
[00031] O método mencionado acima, em que a xilulocinase é uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de xilulocinase; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e tendo atividade de xilulocinase. [10]
[00032] O método mencionado acima, em que a bactéria também foi ativada de modo que atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas do grupo que consiste em xilose desidrogenase, xilonolactonase, xilonato desidratase, 2-ceto-3-deoxixilonato desidratase, e a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase são aumentadas. [11]
[00033] O método mencionado acima, em que o xilonato desidratase, 2-ceto-3-deoxixilonato desidratase, e a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase são proteínas derivadas de uma bactéria de Escherichia, bactéria de Sphingomonas, e bactéria de Bacillus, respectivamente. [12]
[00034] O método mencionado acima, em que a xilose desidrogenase é uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 ou 42; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 ou 42, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de xilose desidrogenase; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 ou 42, e tendo atividade de xilose desidrogenase. [13]
[00035] O método mencionado acima, em que a xilonolactonase é uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 ou 44; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 ou 44, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de xilonolactonase; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 ou 44, e tendo a atividade de xilonolactonase. [14]
[00036] O método mencionado acima, em que o xilonato desidratase é uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou 46; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou 46, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de xilonato desidratase; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou 46, e tendo atividade de xilonato desidratase. [15]
[00037] O método mencionado acima, em que o 2-ceto-3- deoxixilonato desidratase é uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou 38; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou 38, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de 2-ceto-3- deoxixilonato desidratase; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou 38, e tendo atividade de 2-ceto-3- deoxixilonato desidratase. [16]
[00038] O método mencionado acima, em que o a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase é uma proteína definida em (A), (B), ou (C) mencionados abaixo: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 ou 40; (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 ou 40, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, e tendo atividade de a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase; (C) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando uma identidade de 90% ou maior para a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 ou 40, e tendo atividade de a- cetoglutárico semialdeído desidrogenase. [17]
[00039] O método mencionado acima, em que a substância alvo é uma substância selecionada do grupo que consiste em um aminoácido, ácido nucleico e peptídeo. [18]
[00040] O método mencionado acima, em que a substância alvo é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em ácido L-glutâmico, L- glutamina, L-arginina e L-lisina. [19]
[00041] O método mencionado acima, em que a substância alvo é um nucleosídeo de purina selecionado do grupo que consiste em inosina, xantosina, guanosina e adenosina. [20]
[00042] O método mencionado acima, em que a substância alvo é um nucleotídeo de purina selecionado do grupo que consiste em ácido inosínico, ácido xantílico, e ácido guanílico. [21]
[00043] O método mencionado acima, em que a bactéria é uma bactéria Corynebacterium. [22]
[00044] O método mencionado acima, em que a bactéria é Corynebacterium glutamicum.
Breve Descrição das Figuras
[00045] A Fig. 1 mostra um perfil de proliferação da C. glutamicum ATCC cepa 13869/pVK9Peftu_xylAB obtida no meio de xilose.
[00046] A Fig. 2 mostra um perfil de proliferação da C. glutamicum cepa XM obtida no meio de xilose.
[00047] A Fig. 3 mostra um perfil de proliferação da C. glutamicum cepa ATCC13869ΔNCgl2954/pVK9Peftu_xylAB obtida no meio de xilose.
[00048] A Fig. 4 mostra as taxas de proliferação específicas máximas observadas em 40 horas depois do início da cultura no meio de xilose. “WT” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xylAB, “XM” representa a C. glutamicum cepa XM, e “ΔNCgl2954” representa C. glutamicum cepa ATCC13869ΔNCgl2954/pVK9Peftu_xylAB.
[00049] A Fig. 5 mostra os resultados da fermentação do ácido glutâmico realizada no meio de glicose: (A) turbidez (OD620) do caldo de cultura, (B) concentração de glicose no sobrenadante de cultura, e (C) concentração de ácido glutâmico no sobrenadante de cultura. “WT” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xylAB, e “ΔNCgl2954” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869ΔNCgl2954/pVK9Peftu_xylAB.
[00050] A Fig. 6 mostra os resultados da fermentação do ácido glutâmico realizada no meio de xilose: (A) turbidez (OD620) do caldo de cultura, (B) concentração de xilose no sobrenadante de cultura, e (C) concentração de ácido glutâmico no sobrenadante de cultura. “WT” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xylAB, e “ΔNCgl2954” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869ΔNCgl2954/pVK9Peftu_xylAB.
[00051] A Fig. 7 mostra os resultados da fermentação do ácido glutâmico realizada no meio de glicose/xilose: (A) turbidez (OD620) do caldo de cultura, (B) concentração de glicose no sobrenadante de cultura, (C) concentração de xilose no sobrenadante de cultura, e (D) concentração de ácido glutâmico no sobrenadante de cultura. “WT” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xylAB, e “ΔNCgl2954” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869ΔNCgl2954/pVK9Peftu_xylAB.
[00052] A Fig. 8 mostra os resultados da fermentação do ácido glutâmico realizada no meio de xilose: (A) turbidez (OD620) do caldo de cultura, (B) concentração de xilose no sobrenadante de cultura, e (C) concentração de ácido glutâmico no sobrenadante de cultura. “WT” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869+D/pVK9Peftu_NXA, e “ΔNCgl2954” representa a C. glutamicum cepa ATCC13869ΔNCgl2954+D/pVK9Peftu_NXA.
Modos de Realizar a Invenção
[00053] Em seguida, a presente invenção será explicada em detalhes.
[00054] O método da presente invenção é um método para produzir um L-aminoácido compreendendo cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir a substância alvo em um meio contendo xilose para produzir e acumular a substância alvo no meio ou células da bactéria, e coletar a substância alvo do meio ou células, em que a assimilabilidade de xilose da bactéria foi melhorada através da introdução de uma mutação no gene NCgl2954. A bactéria usada para o método também será indicada como “bactéria da presente invenção”.
<1> Bactéria da presente invenção
[00055] A bactéria da presente invenção é uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir a substância alvo, da qual a assimilabilidade de xilose foi melhorada através da introdução de uma mutação no gene NCgl2954. <1-1> Bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir a substância alvo.
[00056] Na presente invenção, uma “bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância alvo” se refere a uma bactéria tendo uma capacidade de produzir e acumular uma substância alvo em um meio ou células da bactéria em tal grau que a substância alvo pode ser coletada quando a bactéria é cultivada no meio. A bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância alvo pode ser uma bactéria que é capaz de acumular uma substância alvo em um meio em uma quantidade maior do que aquela obtenível com uma cepa não modificada. Os exemplos da cepa não modificada incluem as cepas do tipo selvagem e a cepa da bactéria precursora. A bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância alvo pode ser uma bactéria que é capaz de acumular uma substância alvo em um meio em uma quantidade de preferivelmente 0,5 g/l ou mais, mais preferivelmente 1,0 g/l ou mais.
[00057] A substância alvo não é particularmente limitada, contanto que esta possa ser produzida através da fermentação usando uma bactéria corineforme. Os exemplos da substância alvo incluem, por exemplo, L- aminoácidos, ácidos nucleicos, e proteínas. Os exemplos da substância alvo também incluem, por exemplo, a-cetoglutárico ácido e derivados destes. Na presente invenção, a bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir um tipo da substância alvo, ou pode ter uma capacidade de produzir dois ou mais tipos das substâncias alvo.
[00058] Os exemplos do L-aminoácido incluem aminoácidos básicos tais como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina, e L-citrulina; aminoácidos alifáticos tais como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina, e glicina; aminoácidos que são ácidos hidróxi-monocarboxílicos tais como L- treonina e L-serina; aminoácidos cíclicos tais como L-prolina; aminoácidos aromáticos tais como L-fenilalanina, L-tirosina, e L-triptofano; aminoácidos contendo enxofre tais como L-cisteína, L-cistina, e L-metionina; aminoácidos ácidos tais como ácido L-glutâmico e ácido L-aspártico; e aminoácidos tendo um grupo amida na cadeia lateral tal como L-glutamina e L-asparagina. A bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir um tipo de L-aminoácido, ou pode ter uma capacidade de produzir dois ou mais tipos de L-aminoácidos. Na presente invenção, o termo “aminoácido” pode se referir a L-aminoácido, a menos que de outro modo indicado.
[00059] Os Exemplos de ácido a-cetoglutárico e derivados destes incluem o ácido a-cetoglutárico, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-arginina, L-citrulina, L-ornitina, L-prolina, ácido Y-aminobutírico (GABA), e putrescina.
[00060] Os exemplos de ácidos nucleicos incluem as substâncias de purina. Os exemplos de substâncias de purina incluem nucleosídeos de purina e nucleotídeos de purina. Os exemplos dos nucleosídeos de purina incluem inosina, guanosina, xantosina e adenosina. Os exemplos dos nucleotídeos de purina incluem os ésteres de 5’-fosfato dos nucleosídeos de purina. Os exemplos dos ésteres de 5’-fosfato dos nucleosídeos de purina incluem ácido inosínico (inosina-5’-monofosfato, IMP), ácido guanílico (guanosina-5’- monofosfato, GMP), ácido xantílico (xantosina-5’-monofosfato, XMP), e ácido adenílico (adenosina-5’-monofosfato, AMP). A bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir um tipo da substância de purina, ou pode ter uma capacidade de produzir dois ou mais tipos de substâncias de purina. Por exemplo, a bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade de produzir um ou mais tipos de nucleosídeos de purina. Por exemplo, as bactérias da presente invenção podem ter uma capacidade de produzir um ou mais tipos de nucleotídeos de purina.
[00061] A proteína não é particularmente limitada, contanto que esta possa ser expressada em uma bactéria corineforme como um hospedeiro. A proteína pode ser uma proteína derivada da bactéria da presente invenção ou uma proteína heterogênica. A proteína heteróloga pode ser, por exemplo, uma proteína derivada de um microrganismo, uma proteína derivada de uma planta, uma proteína derivada de um animal, ou uma proteína derivada de um vírus, ou uma proteína da qual a sequência de aminoácidos é artificialmente projetada. As proteínas podem ser uma proteína monomérica ou uma proteína multimérica. As proteínas podem ser uma proteína naturalmente secretória ou uma proteína naturalmente não secretória. O termo “proteína” também inclui aqueles chamados peptídeos, oligopeptídeos ou polipeptídeos.
[00062] A substância alvo a ser produzida pode ser um composto livre, sal deste, ou mistura deste. Isto é, na presente invenção, o termo “substância alvo” pode significar a substância alvo na forma de um composto livre, sal deste, ou mistura deste, a menos que de outro modo indicado. Os exemplos de sais serão mencionados em seguida.
[00063] Os exemplos da bactéria corineforme incluem as bactérias que pertencem ao gênero Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium ou outros.
[00064] Os exemplos específicos da bactéria corineforme incluem as seguintes espécies. Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum
[00065] Os exemplos específicos das bactérias corineformes incluem as seguintes cepas. Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020 Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerinum ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
[00066] As bactérias Corynebacterium incluem as bactérias que foram previamente classificadas no gênero Brevibacterium, mas são, no presente, unidas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)). Além disso, a Corynebacterium stationis inclui tal bactéria que foi previamente classificada em Corynebacterium ammoniagenes, mas foi no presente reclassificada em Corynebacterium stationis com base na análise da sequência de nucleotídeos do rRNA 16S etc. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879 (2010)).
[00067] Estas cepas são disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, os números de registro são concedidos às respectivas cepas, e as cepas podem ser ordenadas usando-se estes números de registro (referência à http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection.
[00068] A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria que inerentemente possui uma capacidade de produzir a substância alvo, ou pode ser uma bactéria modificada de modo que este tenha uma capacidade de produzir a substância alvo. A bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância alvo pode ser obtida, por exemplo, pela comunicação de uma capacidade para produzir a substância alvo a uma tal bactéria como mencionado acima, ou aumentado uma capacidade de produzir a substância alvo de tal bactéria como mencionado acima. <1-1-1> Bactérias que produzem L-aminoácido
[00069] Para comunicar ou realçar uma capacidade de produzir L- aminoácido, os métodos convencionalmente utilizados na geração das cepas que produzem aminoácido da bactéria corineforme, a bactéria Escherichia, e assim por diante, (ver “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a Edição, publicada em 30 de maio de 1986, pp,77-100) pode ser usada. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, adquirir uma cepa auxotrófica mutante, adquirindo uma cepa resistente ao análogo de L- aminoácido, adquirindo uma cepa mutante para a regulagem metabólica, e construindo uma cepa recombinante em que a atividade de uma enzima biossintética de L-aminoácido é aumentada. Na geração de bactérias que produzem L-aminoácido, uma das propriedades descritas acima tais como auxotrofia, resistência análoga, e mutação da regulagem metabólica pode ser comunicada sozinha, ou duas ou três ou mais de tais propriedades podem ser comunicadas em combinação. A atividade de uma das enzimas biossintéticas de L-aminoácidos pode ser aumentada sozinha, ou as atividades de duas ou três ou mais de tais enzimas pode ser aumentada em combinação. Além disso, comunicar a(s) propriedade(s) tais como auxotrofia, resistência análoga, e mutação da regulagem metabólica pode ser combinado com o aumento da(s) atividade(s) da(s) enzima(s) biossintética(s).
[00070] Uma cepa auxotrófica mutante, cepa resistente análoga, ou cepa mutante para a regulagem metabólica tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser obtida submetendo-se uma cepa precursora ou uma cepa do tipo selvagem a um tratamento de mutagênese habitual, e depois selecionando-se uma cepa que apresenta autotrofia, resistência análoga, ou uma mutação da regulagem metabólica, e tendo uma capacidade de produzir L-aminoácido das cepas mutantes obtidas. Os exemplos do tratamento de mutagênese habitual incluem a irradiação de raio X ou ultravioleta e um tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N- nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS).
[00071] Uma capacidade de produzir o L-aminoácido também pode ser comunicada ou intensificada aumentando-se a atividade de uma enzima envolvida na biossíntese de um L-aminoácido objeto. Uma atividade enzimática pode ser intensificada, por exemplo, modificando-se uma bactéria de modo que a expressão de um gene que codifica a enzima é aumentada. Os métodos para aumentar a expressão de gene são descritos na WO00/18935, EP 1010755 A, e assim por diante. Os procedimentos detalhados para aumentar a atividade enzimática serão descritos posteriormente.
[00072] Além disso, uma capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser comunicada ou aumentada reduzindo-se a atividade de uma enzima que catalisa uma reação de ramificação fora da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto outro que não o L- aminoácido objetivo. A “enzima que catalisa uma reação de ramificação fora da via biossintética de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto outro que não o L-aminoácido objetivo” aqui indicada inclui uma enzima envolvida na decomposição do aminoácido objetivo. O método para reduzir uma atividade enzimática será descrito posteriormente.
[00073] Em seguida, as bactérias que produzem L-aminoácido e os métodos para comunicar ou intensificar uma capacidade de produzir o L- aminoácido serão especificamente exemplificados. Todas as propriedades das bactérias que produzem L-aminoácido e as modificações para comunicar ou intensificar uma capacidade de produzir L-aminoácido podem ser usadas independentemente ou em qualquer combinação apropriada. < Bactérias que produzem o ácido L-glutâmico >
[00074] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produção do ácido L-glutâmico incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tem uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas da biossíntese do ácido L-glutâmico. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintase (gltBD), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), metilcitrato sintase (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc), piruvato desidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato cinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato cinase (pgk), gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutocinase (pfkA, pfkB), glicose fosfato isomerase (pgi), 6-fosfogluconato desidratase (edd), 2-ceto-3-desóxi-6- fosfogluconato aldolase (eda), e transidrogenase. São mostrados em parênteses depois dos nomes das enzimas, os exemplos dos nomes dos genes que codificam a enzimas (o mesmo deve se aplicar às mesmas ocasiões que seguem). É preferível intensificar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados de, por exemplo, glutamato desidrogenase, citrato sintase, fosfoenol piruvato carboxilase, e metilcitrato sintase, entre estas enzimas.
[00075] Os exemplos de bactérias corineforme modificadas de um modo cuja expressão do gene de glutamato sintetase (gltBD) é aumentada incluem aqueles descritos na WO99/07853.
[00076] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produção do ácido L-glutâmico também incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação de ramificação fora da via de biossíntese da ácido L-glutâmico para gerar um composto outro que não ácido L-glutâmico. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, isocitrato liase (aceA), α-cetoglutarato desidrogenase (sucA, odhA), fosfotransacetilase (pta), acetato cinase (ack), ácido acetoidróxi sintase (ilvG), acetolactato sintase (ilvI), formiato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (ldh), álcool desidrogenase (adh), glutamato descarboxilase (gadAB), succinato desidrogenase (sdhABCD), e 1- pirolino-5-carboxilato desidrogenase (putA). É preferível reduzir ou excluir, por exemplo, a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase, entre estas enzimas.
[00077] As bactérias corineformes nas quais a atividade de α- cetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada, e os métodos para obter estas são descritos na WO2008/075483. Os exemplos específicos de bactérias corineformes em que a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase é reduzida ou eliminada incluem, por exemplo, as seguintes cepas. Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) cepa L30-2 (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2006-340603) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) cepa ΔS (WO95/34672) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12821 (FERM BP-4172, Patente Francesa No. 9401748) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12822 (FERM BP-4173, Patente Francesa No. 9401748) Corynebacterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, Patente Francesa No. 9401748) Corynebacterium glutamicum cepa L30-2 (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2006-340603)
[00078] Os exemplos de bactérias que produzem o ácido L-glutâmico e as cepas precursoras para derivá-las também incluem as cepas em que tanto a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase (sucA) quanto a atividade de succinato desidrogenase (sdh) são reduzidas ou eliminadas (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2010-041920). Os exemplos específicos de tais cepas incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum cepa 8L3GΔSDH, que é a cepa duplamente deficiente em odhAsdhA de Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2010-041920).
[00079] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produção do ácido L-glutâmico também incluem um método para modificar uma bactéria de modo que a atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e/ou a atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase são/é aumentada(s) (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kohyo) No. 2008-509661). Uma das atividades de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e de frutose-6-fosfato fosfocetolase pode ser intensificada, ou ambas podem ser intensificadas. Neste relatório descritivo, D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase e frutose-6-fosfato fosfocetolase podem ser coletivamente indicados como fosfocetolase.
[00080] A atividade de D-xilulose-5-fosfato fosfocetolase significa uma atividade para converter xilulose-5-fosfato em glicelaldeído-3-fosfato e fosfato de acetila com o consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser medida pelo método descrito por Goldberg, M. et al. (Methods Enzymol., 9, 515-520, 1996) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).
[00081] A atividade de frutose-6-fosfato fosfocetolase significa uma atividade para converter frutose-6-fosfato em eritrose-4-fosfato e fosfato de acetila com consumo de ácido fosfórico para liberar uma molécula de H2O. Esta atividade pode ser medida através do método descrito por Racker, E. (Methods Enzymol., 5, 276-280, 1962) ou o método descrito por L. Meile (J. Bacteriol., 183:2929-2936, 2001).
[00082] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico também incluem, por exemplo, um método de aumentar a expressão do gene de yhfK (WO2005/085419) ou do gene ybjL (WO2008/133161), que é um gene da secreção do ácido L- glutâmico.
[00083] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produção do ácido L-glutâmico a ou em uma bactéria corineforme também incluem os métodos de comunicar resistência a um análogo do ácido orgânico, inibidor respiratório, ou outros, e métodos de comunicar sensibilidade a um inibidor da síntese da parede celular. Os exemplos específicos de tais métodos incluem, por exemplo, o método para comunicar resistência ao ácido monofluoroacético (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 50-113209), o método para comunicar resistência à adenina ou resistência à timina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-065198), o método para atenuar a urease (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 52-038088), o método para comunicar resistência ao ácido malônico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 52-038088), o método para comunicar resistência às benzopironas ou naftoquinonas (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-1889), o método para comunicar resistência a HOQNO (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-140895), o método para comunicar resistência ao ácido α- cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-2689), o método para comunicar resistência à guanidina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-35981), o método para comunicar sensibilidade à penicilina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 4-88994), e assim por diante.
[00084] Os exemplos específicos de tais bactérias resistentes ou sensíveis incluem as seguintes cepas Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ3949 (FERM BP-2632, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 50-113209) Corynebacterium glutamicum AJ11628 (FERM P-5736, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-065198) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11355 (FERM P-5007, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-1889) Corynebacterium glutamicum AJ11368 (FERM P-5020, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-1889) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11217 (FERM P-4318, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-2869) Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-2869) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11564 (FERM BP-5472, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-140895) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11439 (FERM BP-5136, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-35981) Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 04-88994) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11426 (FERM P-5123, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-048890) Corynebacterium glutamicum AJ11440 (FERM P-5137, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-048890) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ11796 (FERM P-6402, referente à Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 58-158192)
[00085] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produção do ácido L-glutâmico a ou na bactéria corineforme também incluem um método para intensificar a expressão do gene yggB e um método para introduzir um gene yggB mutante tendo uma mutação na região de codificação (WO2006/070944). O gene yggB é um gene que codifica um canal mecanossensível. O gene yggB da Corynebacterium glutamicum cepa ATCC 13032 corresponde à sequência complementar à sequência dos números de nucleotídeos 1.336.091 a 1.337.692 na sequência genômica registrada como Acesso no Genbank No. NC_003450 no banco de dados NCBI, e também é chamado de NCgl1221. A proteína YggB é registrada como Acesso no Genbank No. NP_600492. A sequência de nucleotídeos do gene yggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) e a sequência de aminoácidos da proteína YggB codificada pelo gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 25 e 26, respectivamente.
[00086] Os exemplos do gene yggB mutante úteis nos métodos acima mencionados incluem os genes yggB tendo a(s) seguinte(s) mutação(ões). A proteína YggB codificada por um gene yggB mutante também é indicada como uma proteína YggB mutante. Um gene yggB que não possui tal(is) mutação(ões) e a proteína YggB codificada pelo gene também são indicados como gene de yggB do tipo selvagem e proteína de YggB do tipo selvagem, respectivamente. Os exemplos da proteína YggB do tipo selvagem incluem, por exemplo, uma proteína tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26. (1) Mutação no lado C-terminal
[00087] A mutação no lado C-terminal é uma mutação introduzida em uma parte da sequência de nucleotídeos da região que codifica a sequência dos números de aminoácido de 419 a 533 na SEQ ID NO: 26. Embora a mutação no lado C-terminal não seja particularmente limitada contanto que uma mutação seja introduzida em pelo menos uma parte da sequência de nucleotídeos da região acima mencionada, a mutação no lado C-terminal é preferivelmente uma mutação para inserir uma sequência de inserção (daqui em diante, também indicada como “IS”) ou transpóson de inserção. A mutação no lado C-terminal pode ser qualquer uma de uma mutação para introduzir a substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), uma mutação para introduzir a mutação de mudança de armação induzida pela inserção da IS acima mencionada ou outras, e uma mutação para introduzir a mutação de sentido errado.
[00088] Os exemplos da mutação do lado C-terminal incluem, por exemplo, uma mutação para inserir uma sequência de nucleotídeos no sítio que codifica o resíduo de valina na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem (mutação do tipo2A-1). A mutação do tipo 2A-1 pode ser, por exemplo, uma mutação que causa uma exclusão ou substituição de uma parte ou todos os resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem. Os exemplos específicos de um gene yggB mutante tendo a mutação do tipo 2A-1 incluem, por exemplo, um gene yggB tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 25, mas que inclui a inserção de IS na posição próxima à “G” da posição 1255, e que codifica uma proteína YggB mutante tendo um tamanho natural de 423 resíduos de aminoácido, que é mais curta do que a proteína YggB do tipo selvagem original (SEQ ID NO: 26) (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2007-222163).
[00089] Os exemplos da mutação no lado C-terminal também incluem, por exemplo, uma mutação para substituir um resíduo de prolina existente em qualquer uma das posições de 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de prolina. Os exemplos de tal resíduo de prolina incluem os resíduos de prolina nas posições 424, 437, 453, 457, 462, 469, 484, 489, 497, 515, 529, e 533 da proteína YggB do tipo selvagem. (2) Mutação na região de transmembrana
[00090] É estimado que a proteína YggB codificada pelo gene yggB tem cinco regiões de transmembrana. Na sequência de aminoácidos da proteína YggB do tipo selvagem da SEQ ID NO: 26, as regiões de transmembrana correspondem às regiões dos números de aminoácido de 1 a 23 (primeira região de transmembrana), de 25 a 47 (segunda região de transmembrana), de 62 a 84 (terceira região de transmembrana), de 86 a 108 (quarta região de transmembrana), e de 110 a 132 (quinta região de transmembrana). O gene yggB pode ter uma mutação em uma região que codifica qualquer uma destas regiões de transmembrana. A mutação na região de transmembrana é desejavelmente uma mutação incluindo a substituição, exclusão, adição, inserção, ou inversão de um ou vários resíduos de aminoácido enquanto não acompanhado pela mutação de mudança de armação ou mutação sem sentido. Os exemplos da mutação na região de transmembrana incluem uma mutação para inserir um ou vários resíduos de aminoácido (por exemplo, Cys-Ser-Leu) entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15, uma mutação para substituir o resíduo de alanina na posição 100 com outro resíduo de aminoácido (por exemplo, um resíduo de aminoácido tendo grupo hidroxila na cadeia lateral (Thr, Ser, ou Tyr), preferivelmente Thr), e uma mutação para substituir o resíduo de alanina na posição 111 com outro resíduo de aminoácido (por exemplo, um resíduo de aminoácido tendo um grupo hidroxila na cadeia lateral (Thr, Ser, ou Tyr), preferivelmente Thr), na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26, e assim por diante. Os exemplos específicos de um gene yggB mutante tendo tal mutação em uma região de transmembrana incluem, por exemplo, um gene yggB tendo a sequência da SEQ ID NO: 25, mas que inclui a inserção de TTCATTGTG na posição próxima ao “G” da posição 44 (mutação do tipo A1), um gene yggB tendo a sequência da SEQ ID NO: 25, mas que inclui a substituição de “A” por “G” da posição 298 (mutação do tipo19), e um gene yggB tendo a sequência da SEQ ID NO: 25, mas que inclui a substituição de “T” por “C” da posição 332 (mutação do tipo L30).
[00091] Quando a proteína YggB do tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos outra que não a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26, o gene yggB mutante pode ter uma mutação em uma região que codifica o resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de aminoácido na posição acima mencionada na SEQ ID NO: 26. Em uma proteína YggB arbitrária do tipo selvagem, o resíduo de aminoácido é “o resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de aminoácido na posição acima mencionada na SEQ ID NO: 26” pode ser determinado com base em um alinhamento entre a sequência de aminoácidos da proteína YggB do tipo selvagem e da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. O “número de aminoácido X na SEQ ID NO: 26” pode ser lido como a “posição X na SEQ ID NO: 26”. < Bactérias que produzem L-Glutamina >
[00092] Os exemplos do método para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-glutamina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas da biossíntese de L-glutamina são intensificados. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, glutamato desidrogenase (gdhA) e glutamina sintetase (glnA). A atividade de glutamina sintetase também pode ser intensificada pelo rompimento do gene glutamina adenililtransferase (glnE) ou rompimento do gene da proteína de controle PII (glnB) (EP 1229121).
[00093] Os exemplos do método para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-glutamina também incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas que catalisam uma reação de ramificação fora da via de biossíntese de L-glutamina para gerar um composto outro que não L- glutamina são reduzidas. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitadas a glutaminase.
[00094] Os exemplos específicos de bactérias que produzem L- glutamina e cepas precursoras para derivá-las incluem, por exemplo, bactéria corineforme em que a atividade ou atividades de glutamato desidrogenase (gdhA) e/ou glutamina sintetase (glnA) (EP 1229121, EP 1424398) são intensificadas, e a bactéria corineforme em que a atividade de glutaminase (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2004-187684) é reduzida.
[00095] Os exemplos dos métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-glutamina a ou na bactéria corineforme também incluem o método para comunicar a resistência a 6-diazo-5-oxo-norleucina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 3-232497), o método para comunicar resistência à purina análoga e resistência ao sulfóxido de metionina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 61-202694), e o método para comunicar resistência ao ácido a-cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-151495). Os exemplos específicos de bactéria corineforme tendo capacidade de produzir L-glutamina incluem, por exemplo, as seguintes cepas. Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11573 (FERM P-5492, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-151495) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11576 (FERM BP-10381, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 56-151495) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12212 (FERM P-8123, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 61-202694) < Bactérias que produzem L-Prolina >
[00096] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-prolina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tem uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas da biossíntese de L-prolina. Os exemplos de tais enzimas incluem glutamato-5-cinase (proB), Y-glutamilfosfato redutase, e pirolino-5- carboxilato redutase (putA). Para aumentar a atividade de tal enzima, por exemplo, o gene proB que codifica uma glutamato cinase dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-prolina (Patente Alemã No. 3127361) pode ser preferivelmente usada.
[00097] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-prolina também incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade reduzida de uma enzima envolvida na decomposição de L-prolina. Os exemplos de tais enzimas incluem prolina desidrogenase e ornitina aminotransferase. <Bactérias que produzem L-Treonina >
[00098] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-treonina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas da biossíntese de L-treonina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, aspartocinase III (lysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartocinase I (thrA), homosserina cinase (thrB), treonina sintase (thrC), e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC). Entre estas enzimas, é preferível intensificar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas de aspartocinase III, aspartato semialdeído desidrogenase, aspartocinase I, homosserina cinase, aspartato aminotransferase, e treonina sintase. Qualquer um dos genes que codificam as enzimas da biossíntese de L-treonina pode ser introduzido em uma bactéria tendo uma capacidade reduzida de decompor a treonina.
[00099] As atividades das enzimas da biossíntese de L-treonina são inibidas pelo produto final, L-treonina. Portanto, para formar as cepas que produzem L-treonina, é preferido que os genes das enzimas da biossíntese de L-treonina sejam modificados de modo que as enzimas sejam dessensibilizadas para a inibição da retroalimentação pela L-treonina. Os genes thrA, thrB, e thrC acima mencionados constituem o operon de treonina, que forma uma estrutura atenuadora. A expressão do operon de treonina é inibida por isoleucina e treonina no meio de cultura e também inibida através da atenuação. Portanto, a expressão do operon de treonina pode ser intensificada removendo-se a sequência guia ou o atenuador na região de atenuação (referente à Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.L, e Gardner, J.F., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808; e WO2003/097839).
[000100] O promotor nativo do operon de treonina está presente a montante do operon de treonina, e pode ser substituído com um promotor não nativo (referente à WO98/04715). Além disso, o operon de treonina pode ser formado de modo que os genes de biossíntese de treonina são expressados sob controle do repressor e promotor do fago X (Patente Europeia No. 0593792). Além disso, uma bactéria modificada de modo que seja dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-treonina também pode ser obtida selecionando-se uma cepa resistente ao ácido α-amino-β-hidroxiisova^rico (AHV), que é um análogo da L-treonina.
[000101] É preferido que a quantidade de expressão do operon de treonina que é modificado de modo a ser dessensibilizado para a inibição da retroalimentação pela L-treonina como descrito acima seja aumentada em um hospedeiro aumentando-se o número de cópias deste ou ligando este a um promotor potente. O número de cópias pode ser aumentado introduzindo-se um plasmídeo contendo o operon de treonina em um hospedeiro. O número de cópias também pode ser aumentado transferindo-se o operon de treonina para o genoma de um hospedeiro usando um transpóson, fago Mu, ou outros.
[000102] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-treonina também incluem, por exemplo, um método para comunicar a resistência à L-treonina a um hospedeiro, e um método para comunicar a resistência à L-homosserina a um hospedeiro. Tal resistência pode ser concedida, por exemplo, aumentando-se a expressão de um gene que comunica resistência à L-treonina ou um gene que comunica resistência à L- homosserina. Os exemplos dos genes que comunicam a resistência mencionada incluem o gene rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), gene rhtB (Patente Europeia Aberta ao Público No. 0994190), gene rhtC (Patente Europeia Aberta ao Público No. 1013765), gene yfiK e gene yeaS (Patente Europeia Aberta ao Público No. 1016710). Considerando os métodos para comunicar resistência à L-treonina a um hospedeiro, aqueles na Patente Europeia Aberta ao Público No. 0994190 e na WO90/04636 podem ser indicados.
[000103] O gene thrA que codifica aspartocinase homosserina desidrogenase I de E. coli foi ilustrado (números de nucleotídeos de 337 a 2799, acesso no Genbank NC_000913,2, gi: 49175990). O gene thrA se localiza entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrB que codifica a homosserina cinase de Escherichia coli foi ilustrado (números de nucleotídeos de 2801 a 3733, acesso no Genbank NC 000913,2, gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrC que codifica a treonina sintase de E. coli foi ilustrado (números de nucleotídeos de 3734 a 5020, acesso no Genbank NC 000913,2, gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre a estrutura de leitura do gene thrB e do gene yaaX no cromossomo de E. coli K- 12. O operon thrA*BC contendo um gene thrA mutante que codifica aspartocinase homosserina desidrogenase I resistente à inibição da retroalimentação pela treonina e genes thrBC do tipo selvagem pode ser obtida através do plasmídeo pVIC40 bem conhecido, que está presente na cepa de E. coli que produz treonina VKPM B-3996 (Patente U.S. No. 5.705.371).
[000104] O gene rhtA de E. coli está presente a 18 min no cromossomo de E. coli próximo ao operon glnHPQ, que codifica os componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao ORFl (gene ybiF, números de nucleotídeos de 764 a 1651, número de Acesso no Genbank AAA218541, gi:440181), e está localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa a proteína codificada por ORPl é indicada como o gene (rht: resistente a homosserina e treonina). Também foi revelado que a mutação de rhtA23, que comunica resistência contra uma alta concentração de treonina ou homosserina, é uma substituição de A-para-G na posição 1 com relação ao códon de partida ATG (ABSTRATOS do 17o International Congress of Biochemistry and Molecular Biology em conjugação com o Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, São Francisco, Califórnia 24 a 29 de agosto de 1997, Abstrato No. 457, EP 1013765 A).
[000105] O gene asd de E. coli já foi ilustrado (números de nucleotídeos de 3572511 a 3571408, acesso no GenBank NC_000913,1, gi:16131307), e pode ser obtido pela PCR (referente à White, T.J. et al., Trends Genet, 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd dos outros microrganismos também podem ser obtidos de uma maneira similar.
[000106] O gene aspC de E. coli também já foi ilustrado (números de nucleotídeos de 983742 a 984932, acesso no Genbank NC 000913,1, gi:16128895), e pode ser obtido através da PCR utilizando iniciadores preparados com base nas sequências de nucleotídeo do gene. Os genes aspC de outros microrganismos também podem ser obtidos de uma maneira similar.
[000107] Além disso, os exemplos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produzir L-treonina incluem, por exemplo, Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172, referente à Patente U.S. No. 5.188.949). <Bactérias que produzem L-lisina >
[000108] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-lisina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas da biossíntese de L-lisina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, di-hidrodipicolinato sintase (dapA), aspartocinase III (lysC), di-hidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato descarboxilase (lysA), diaminopimelato desidrogenase (ddh) (Patente U.S. No. 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC), diaminopimelato epimerase (dapF), tetra- hidrodipicolinato succinilase (dapD), succinil diaminopimelato desacilase (dapE), e aspartase (aspA) (EP 1253195 A). É preferível intensificar a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas de, por exemplo, di-hidrodipicolinato redutase, diaminopimelato descarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeído desidrogenase, tetra-hidrodipicolinato succinilase, e succinil diaminopimelato desacilase, entre estas enzimas. Além disso, as bactérias que produzem L- lisina e as cepas precursoras para reduzir estas podem expressar um nível aumentado do gene envolvido na eficiência energética (cyo) (EP 1170376 A), do gene que codifica a nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente U.S. No. 5.830.716), o gene ybjE (WO2005/073390), ou combinações destes. Visto que a aspartocinase III (lysC) é submetida à inibição de retroalimentação pela L-lisina, um gene lysC mutante que codifica uma aspartocinase III dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-lisina (Patente U.S. No. 5.932.453) pode ser usado para aumentar a atividade desta enzima. Além disso, visto que o di-hidrodipicolinato sintase (dapA) é submetido à inibição da retroalimentação pela L-lisina, um gene dapA mutante que codifica um di-hidrodipicolinato sintase dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-lisina pode ser usado para aumentar a atividade desta enzima.
[000109] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir a L-lisina também incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação de ramificação fora da via biossintética de L-lisina para gerar um composto outro que não L-lisina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, homosserina desidrogenase, lisina descarboxilase (Patente U.S. No. 5.827.698), e enzima málica (WO2005/010175).
[000110] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-lisina para ou na bactéria corineforme incluem, por exemplo, o método para modificar as bactérias de modo que a atividade do sistema secretório de lisina (lysE) é aumentada (WO97/23597). O gene lysE da Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 corresponde à sequência complementar da sequência das posições de 1329712 a 1330413 na sequência de genoma registrada no banco de dados da NCBI como Acesso no Genbank NC_006958 (VERSION NC_006958,1 GI:62388892). A proteína LysE de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é registrada como Acesso no Genbank YP_225551 (YP_225551,1 GI:62390149).
[000111] Os exemplos das bactérias que produzem L-lisina e as cepas precursoras para reduzir estas também incluem as cepas mutantes tendo resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-Lisina inibem o crescimento de bactérias tais como as bactérias da família Enterobacteriaceae e bactéria corineforme, mas esta inibição é total ou parcialmente diminuída quando a L-lisina está presente no meio. Os exemplos destes análogos de L- lisina incluem, mas não são particularmente limitados a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), Y—metilisina, e α- clorocaprolactama. As cepas mutantes tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidas submetendo-se uma bactéria a um tratamento de mutagênese artificial convencional.
[000112] Os exemplos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produzir L-lisina incluem, por exemplo, as cepas mutantes resistentes a AEC (Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum AJ11082) cepa (NRRL B-11470) etc., referente às Publicações de Patente Japonesa (Kokoku) Nos. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 e 7-112438); as cepas mutantes que requerem um aminoácido tal como L-homosserina para seu crescimento (referente às Publicações de Patente Japonesa Nos. 48-28078 e 56-6499); as cepas mutantes que apresentam resistência a AEC e que também requerem um aminoácido tal como L-leucina, L-homosserina, L- prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina, e L-valina (referente às Patentes U.S. Nos. 3.708.395 e 3.825.472); as cepas mutantes que apresentam resistência a DL-α-amino-ε-caprolactama, α-amino-laurilactama, análogo do ácido aspártico, droga de sulfa, quinoide, e N-lauroil-leucina; cepas mutantes que apresentam resistência a um inibidor de oxaloacetato descarboxilase ou um inibidor enzimático da cadeia respiratória (Patentes Japonesas Abertas ao Público (Kokai) Nos. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, Publicações de Patentes Japonesas Nos. 53-43591 e 53-1833); as cepas mutantes que requerem inositol ou ácido acético (Patentes Japonesas Abertas ao Público (Kokai) Nos. 55-9784 e 56-8692); cepas mutantes que são suscetíveis ao ácido fluoropirúvico ou uma temperatura de 34°C ou maior (Patentes Japonesas Abertas ao Público (Kokai) Nos. 55-9783 e 53-86090); e cepas mutantes que apresentam resistência ao etileno glicol (Patente U.S. No. 4.411.997). <Bactérias que produzem L-arginina >
[000113] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-arginina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-arginina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, N-acetilglutamato sintase (argA), N- acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetil transferase (argJ), N- acetilglutamato cinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina desacetilase (argE), ornitina carbamoil transferase (argF), argininossuccinato sintetase (argG), argininossuccinato liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB). Como o gene de N-acetilglutamato sintase (argA), por exemplo, um gene que codifica um N-acetilglutamato sintase mutante dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L- arginina através da substituição pelos resíduos de aminoácido que correspondem às posições de 15 a 19 da enzima do tipo selvagem (Patente Europeia Aberta ao Público No. 1170361) pode ser preferivelmente usado.
[000114] Os exemplos de Bactérias que produzem L-arginina e cepas precursoras para reduzir estas, incluem tais bactérias corineformes como uma cepa deficiente em ArgR, que é um repressor de arginina (Pedido de Patente Publicado U.S No. 20020045223), e um cepa em que a atividade de glutamina sintetase é aumentada (Pedido de Patente Publicado U.S No. 20050014236).
[000115] Os exemplos de bactérias que produzem L-arginina e as cepas precursoras para reduzir estas também incluem as cepas mutantes de bactérias corineformes, as cepas mutantes tendo resistência a um análogo de aminoácido ou outros. Os exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, cepas tendo resistência a 2-tiazolealanina e também apresentando auxotrofia para L- histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina, ou L-triptofano (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 54-44096); as cepas resistente ao ácido cetomalônico, ácido fluoromalônico, ou ácido monofluoroacético (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-18989); as cepas resistente ao argininol (Publicação de Patente Japonesa No. 62-24075); as cepas resistente a X-guanidina (X representa uma cadeia alifática ou um derivado desta, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-186995); e as cepas resistentes a hidroxamato de arginina e 6-azauracila (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-150381). Os exemplos específicos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produzir L- arginina incluem as seguintes cepas. Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11169 (FERM BP-6892) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12092 (FERM BP-6906) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11336 (FERM BP-6893) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ11345 (FERM BP-6894) Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12430 (FERM BP-2228) < Bactérias que produzem L-citrulina e bactérias que produzem L-ornitina>
[000116] As vias biossintéticas de L-citrulina e L-ornitina são comuns àqueles da L-arginina. Portanto, uma capacidade de produzir L-citrulina e/ou L-ornitina pode ser concedida ou intensificada aumentando-se a atividade ou atividades de N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), ornitina acetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato cinase (argB), acetilornitina transaminase (argD), e/ou acetilornitina desacetilase (argE) (WO2006/35831). <Bactérias que produzem L-Histidina >
[000117] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir a L-histidina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas biossíntese de L-histidina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil AMP cicloidrolase (hisI), fosforibosil-ATP pirofosfoidrolase (hisI), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), e histidinol desidrogenase (hisD).
[000118] Entre estas enzimas, as enzimas biossíntese de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são conhecidas ser inibidas por L-histidina. Portanto, a capacidade de produzir L-histidina pode ser concedida ou intensificada, por exemplo, introduzindo-se uma mutação para conferir resistência à inibição pela retroalimentação no gene que codifica ATP fosforibosiltransferase (hisG) (Patentes Russas Nos. 2003677 e 2119536). <Bactérias que produzem L-cisteína >
[000119] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-cisteína incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das Enzimas de biossíntese de L-cisteína. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, serina acetiltransferase (cysE) e 3- fosfoglicerato desidrogenase (serA). A atividade de serina acetiltransferase pode ser aumentada, por exemplo, introduzindo-se um gene cysE mutante que codifica uma serina acetiltransferase mutante resistente à inibição da retroalimentação pela cisteína em uma bactéria. Tal serina acetiltransferase mutante é descrita, por exemplo, na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 11-155571 e Pedido Publicado de Patente U.S No. 20050112731. Além disso, a atividade de 3-fosfoglicerato desidrogenase pode ser intensificada, por exemplo, introduzindo-se um gene serA mutante que codifica um 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante resistente à inibição da retroalimentação pela serina em uma bactéria. Tal 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante é descrita, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.180.373.
[000120] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-cisteína também incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação de ramificação fora da via de biossíntese de L-cisteína para gerar um composto outro que não L- cisteína. Os exemplos de tais enzimas incluem, por exemplo, as enzimas envolvidas na decomposição de L-cisteína. Os exemplos das enzimas envolvidas na decomposição da L-cisteína incluem, mas não são particularmente limitados a, cisteína dessulfidrase (aecD) (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2002-233384).
[000121] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir a L-cisteína também incluem, por exemplo, um método para intensificar o sistema excretório de L-cisteína, e um método para intensificar o sistema de transporte de sulfato/tiossulfato. Os exemplos de proteínas do sistema excretório de L-cisteína incluem as proteínas codificadas pelo gene ydeD (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2002-233384), as proteínas codificadas pelo gene yfiK (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2004-49237), as proteínas codificadas pelos genes emrAB, emrKY, yojIH, acrEF, bcr, e cusA (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2005-287333), e as proteínas codificadas pelo gene yeaS (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2010-187552). Os exemplos das proteínas do sistema de transporte de sulfato/tiossulfato incluem as proteínas codificadas pelo grupo do gene cysPTWAM.
[000122] Além disso, os exemplos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produzir L-cisteína incluem a bactéria corineforme tendo serina acetiltransferase dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L- cisteína para deste modo apresentar uma atividade de serina acetiltransferase intracelular aumentada (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2002-233384). <Bactérias que produzem L-Serina >
[000123] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-serina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas de enzimas da biossíntese da L-serina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 11-253187). Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, 3-fosfoglicerato desidrogenase (serA), fosfosserina transaminase (serC), e fosfosserina fosfatase (serB) (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 11-253187). A atividade de 3- fosfoglicerato desidrogenase pode ser intensificada, por exemplo, introduzindo-se um gene serA mutante que codifica um 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante resistente à inibição pela retroalimentação pela serina em uma bactéria. A 3-fosfoglicerato desidrogenase mutante é descrita, por exemplo, na Patente U.S. No. 6.180.373.
[000124] Os exemplos de bactérias que produzem L-serina e as cepas precursoras para reduzir estas, incluem, por exemplo, a bactéria corineforme resistente à azasserina ou β-(2-tienil)-DL-alanina, e deficiente na capacidade de decomposição de L-serina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 10-248588). Os exemplos específicos de tais bactérias corineforme incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ13324 (FERM P-16128), que é resistente à azasserina e deficiente na capacidade de decomposição de serina, e Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ13325 (FERM P-16129), que é resistente a β-(2- tienil)-DL-alanina e deficiente na capacidade de decomposição de serina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 10-248588). <Bactérias que produzem L-metionina>
[000125] Os exemplos de bactérias que produzem L-metionina e as cepas precursoras para reduzir estas, incluem as cepas auxotróficas de L- treonina e as cepas mutantes resistentes a norleucina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2000-139471). Os exemplos de bactérias que produzem L-metionina e as cepas precursoras para reduzir estas também incluem uma cepa contendo uma homosserina transuccinilase mutante resistente à inibição da retroalimentação pela L-metionina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2000-139471, Pedido Publicado de Patente U.S No. 20090029424). Visto que a L-metionina é biossintetizada por intermédio de L-cisteína como um intermediário, a capacidade de produzir L- metionina também pode ser melhorada melhorando-se a capacidade de produzir L-cisteína (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2000-139471, Pedido Publicado de Patente U.S No. 20080311632). <Bactérias que produzem L-Leucina>
[000126] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a Capacidade de produzir L-leucina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-leucina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados às enzimas codificadas pelos genes do operon de leuABCD. Além disso, para aumentar a atividade de tal enzima, por exemplo, o gene leuA mutante que codifica um isopropil maleato sintase dessensibilizada para a inibição da retroalimentação pela L-leucina (Patente U.S. No. 6.403.342) pode ser preferivelmente usado.
[000127] Os exemplos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produzir a L-leucina incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ3718 (FERM P-2516), que é resistente à 2-tiazol alanina e β-hidroxileucina e auxotrófica para isoleucina e metionina. <Bactérias que produzem L-isoleucina>
[000128] Os Exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produção de L-isoleucina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas biossintéticas de L-isoleucina são aumentadas. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, treonina desaminase e ácido acetoidróxi sintase (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-458, FR 0356739, Patente U.S. No. 5.998.178).
[000129] Os exemplos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produção de L-isoleucina incluem a bactéria corineforme em que o gene brnE que codifica uma proteína de excreção de aminoácido de cadeia ramificada é amplificado (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2001-169788), a bactéria corineforme a qual a capacidade de produção de L-isoleucina é concedida através da fusão do protoplasto com uma bactéria que produz L- lisina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 62-74293), a bactéria corineforme em que a homosserina desidrogenase é intensificada (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 62-91193), a cepa resistente a hidroxamato de treonina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No 62195293), a cepa resistente ao a-ácido cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 61-15695), a cepa resistente à metilisina (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 61-15696), e Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) AJ12149 (FERM BP-759, Patente U.S. No. 4.656.135). <Bactérias que produzem L-Valina>
[000130] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-valina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha uma atividade ou atividades aumentadas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas de biossíntese de L-valina. Os Exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados às enzimas codificadas pelos genes do operon de ilvGMEDA e as enzimas codificadas pelo operon de ilvBNC. O gene ilvBN codifica ácido acetoidróxi sintase, e o gene ilvC codifica isomerorredutase (WO00/50624). As expressões do operon de ilvGMEDA e o operon de ilvBNC são inibidas (atenuadas) por L-valina, L-isoleucina e/ou L- leucina. Portanto, para aumentar a atividade de tal enzima, é preferido que a inibição da expressão por L-valina seja diminuída pela remoção ou modificação de uma região necessária para a atenuação. Além disso, a treonina desaminase codificada pelo gene ilvA é uma enzima que catalisa a reação de desaminação da L-treonina resultando em ácido 2-cetobutírico, que é a etapa limitante de taxa do sistema de biossíntese de L-isoleucina. Portanto, para a produção de L-valina, é preferido que o gene ilvA seja, por exemplo, rompido, e, deste modo, a atividade de treonina desaminase atividade é diminuída.
[000131] Os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-valina também incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a bactéria tenha atividade ou atividades reduzidas de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas que catalisam uma reação de ramificação fora da via de biossíntese de L-valina para gerar um composto outro que não L-valina. Os exemplos de tais enzimas incluem, mas não são particularmente limitados a, treonina desidratase envolvida na síntese de L-leucina, e as enzimas envolvidas na síntese do ácido D-pantotênico (WO00/50624).
[000132] Os exemplos de bactérias que produzem L-Valina e as cepas precursoras para reduzir estas também incluem as cepas resistente a um análogo de aminoácido ou outros. Os exemplos de tais cepas incluem, por exemplo, as cepas de bactéria corineforme que são auxotróficas para L- isoleucina e L-metionina, e resistentes a D-ribose, purina ribonucleosídeo, ou pirimidino ribonucleosídeo, e possuem uma capacidade de produzir L-valina (FERM P-1841, FERM P-29) (Publicação de Patente Japonesa No. 53-025034), as cepas de bactéria corineforme resistentes às policetidas (FERM P-1763, FERM P-1764) (Publicação de Patente Japonesa No. 06-065314), e cepas de bactéria corineforme resistentes à L-valina em um meio contendo ácido acético como a fonte única de carbono e sensível aos análogos do ácido pirúvico (ácido fluoropirúvico etc.) em um meio contendo glicose como a fonte única de carbono (FERM BP-3006, BP-3007) (Patente Japonesa No. 3006929). <Bactérias que produzem L-Alanina>
[000133] Os exemplos de bactérias que produzem L-alanina e as cepas precursoras para reduzir estas, incluem a bactéria corineforme deficiente em H+-ATPase (Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001 Nov., 57(4):534-40) e a bactéria corineforme em que a atividade de aspartato β-descarboxilase é intensificada (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 07-163383). <Bactérias que produzem L-Triptofano, bactérias que produzem L- fenilalanina, e bactérias que produzem L-tirosina >
[000134] Os exemplos do método para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir L-triptofano, capacidade de produzir L-fenilalanina, e/ou capacidade de produzir L-tirosina incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas das enzimas biossintéticas de L- triptofano, L-fenilalanina, e/ou L-tirosina são intensificadas.
[000135] Os exemplos de enzimas comuns aos sistemas de biossíntese destes aminoácidos aromáticos incluem, mas não são particularmente limitados a, 3-desóxi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintase (aroG), 3- deidroquinato sintase (aroB), xiquimato desidrogenase (aroE), xiquimato cinase (aroL), 5-enolpiruvilxiquimato-3-fosfato sintase (aroA), e corismato sintase (aroC) (EP 763127 B). A expressão dos genes que codificam estas enzimas é controlada pelo repressor de tirosina (tyrR), e as atividades destas enzimas podem ser intensificadas pela exclusão do gene tyrR (EP 763127 B).
[000136] Os exemplos das enzimas biossintéticas de L-triptofano incluem, mas não são particularmente limitadas a, antranilato sintase (trpE), triptofano sintase (trpAB), e fosfoglicerato desidrogenase (serA). Por exemplo, introduzindo-se um DNA contendo o operon de triptofano, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser concedida ou intensificada. O triptofano sintase consiste em subunidades α e β codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Visto que a antranilato sintase é submetida à inibição pela retroalimentação pelo L-triptofano, um gene que codifica esta enzima introduzida com uma mutação para a dessensibilização da inibição pela retroalimentação pode ser usado para aumentar a atividade daquela enzima. Visto que o fosfoglicerato desidrogenase é submetido à inibição pela retroalimentação pela L-serina, um gene que codifica esta enzima introduzido com uma mutação para a dessensibilização para a inibição da retroalimentação pode ser usado para aumentar a atividade daquela enzima. Além disso, intensificando-se a expressão do operon (operon ace) consistindo do gene de maleato sintase (aceB), gene de isocitrato liase (aceA), e gene de isocitrato desidrogenase cinase/fosfatase (aceK), a capacidade de produzir L- triptofano pode ser concedida ou intensificada (WO2005/103275).
[000137] Os exemplos das enzimas biossintéticas de L-fenilalanina incluem, mas não são particularmente limitados a, corismato mutase e prefenato desidratase. A corismato mutase e a prefenato desidratase são codificadas para o gene pheA como uma enzima bifuncional. Visto que a corismato mutase e a prefenato desidratase são submetidas à inibição de retroalimentação pela L-fenilalanina, um gene que codifica estas enzimas introduzidas com uma mutação para a dessensibilização da inibição da retroalimentação pode ser usado para aumentar as atividades destas enzimas.
[000138] Os exemplos das enzimas biossintéticas de L-tirosina incluem, mas não são particularmente limitadas a, corismato mutase e prefenato desidrogenase. A corismato mutase e a prefenato desidrogenase são codificadas pelo gene tyrA como uma enzima bifuncional. Visto que a corismato mutase e a prefenato desidrogenase são submetidas à inibição da retroalimentação pela L-tirosina, um gene que codifica estas enzimas introduzidas com uma mutação para a dessensibilização para a inibição da retroalimentação pode ser usado para aumentar as atividades destas enzimas.
[000139] As bactérias que produzem L-triptofano, L-fenilalanina, e/ou L-tirosina podem ser modificadas de modo que a biossíntese de um aminoácido aromático outro que não o aminoácido aromático objeto seja reduzida. Além disso, as bactérias que produzem L-triptofano, L-fenilalanina, e/ou L-tirosina podem ser modificadas de modo que um sistema de absorção de subproduto seja intensificado. Os exemplos do subproduto incluem os aminoácidos aromáticos outros que não o aminoácido aromático objetivo. Os exemplos do gene que codifica tal sistema de absorção de subproduto incluem tnaB e mtr, que são genes que codificam o sistema de absorção de L- triptofano, pheP, que é um gene que codifica o sistema de absorção de L- fenilalanina, e tyrP, que é um gene que codifica o sistema de absorção de L- tirosina (EP 1484410).
[000140] Os exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-triptofano incluem Corynebacterium glutamicum AJ12118 (FERM PARES DE BASE-478) (Patente Japonesa No. 01681002), que é resistente à sulfaguanidina, a cepa introduzida com o operon de triptofano (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 63-240794), e a cepa introduzida com um gene que codifica xiquimato cinase derivada de uma bactéria corineforme (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 01-994749).
[000141] Os exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-fenilalanina incluem, por exemplo, as cepas de Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM PARES DE BASE-1777), K77 (FERM PARES DE BASE-2062), e K78 (FERM PARES DE BASE-2063) (EP 331145 A, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 02-303495), das quais a atividade de fosfoenolpiruvato ou piruvato carboxilase cinase é reduzida, e a cepa de tirosina auxotrófica (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 05-049489).
[000142] Os exemplos de bactérias corineformes tendo a capacidade de produzir L-tirosina incluem, por exemplo, Corynebacterium glutamicum AJ11655 (FERM P-5836, Publicação de Patente Japonesa No. 2-6517), e Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12081 (FERM P-7249, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 60-70093).
[000143] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar uma capacidade de produzir L-aminoácido incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a atividade para secretar um L-aminoácido da célula bacteriana é intensificada. A atividade para secretar um L-aminoácido pode ser aumentada, por exemplo, aumentando-se a expressão de um gene que codifica uma proteína responsável pela secreção do L-aminoácido. Os exemplos de genes que codificam as proteínas responsáveis pela secreção de vários aminoácidos incluem, por exemplo, o gene b2682 (ygaZ), gene b2683 (ygaH), gene b1242 (ychE), e o gene b3434 (yhgN) (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2002-300874).
[000144] Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar uma capacidade de produzir L-aminoácido também incluem, por exemplo, um método para modificar uma bactéria de modo que a atividade ou atividades de uma ou mais das proteínas envolvidas no glicometabolismo e das proteínas envolvidas no metabolismo energético são aumentadas.
[000145] Os exemplos das proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem as proteínas envolvidas na absorção de sacarídeos e das enzimas do sistema de glicólise. Os exemplos de genes que codificam as proteínas envolvidas no glicometabolismo incluem o gene de glicose-6-fosfato isomerase (pgi, WO01/02542), gene de fosfoenolpiruvato sintase (pps, EP 877090 A), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc, WO95/06114), gene de piruvato carboxilase (pyc, WO99/18228, EP 1092776 A), gene de fosfoglicomutase (pgm, WO03/04598), gene de frutose bisfosfato aldolase (pfkB, fbp, WO03/04664), gene de piruvato cinase (pykF, WO03/008609), gene de transaldolase (talB, WO03/008611), gene de fumarase (fum, WO01/02545), gene de absorção de sacarose que não PTS (csc, EP 149911 A), e gene de utilização da sacarose (operon de scrAB, WO90/04636).
[000146] Os exemplos de genes que codificam as proteínas envolvidas no metabolismo energético incluem o gene transidrogenase (pntAB, Patente U.S. No. 5.830.716) e o gene da citocromo tipo bo oxidase (cyoB, EP 1070376 A). <1-1-2> Bactérias que produzem ácido nucleico
[000147] Uma capacidade de produzir uma substância de purina pode ser concedida ou intensificada através dos métodos convencionalmente utilizados no cultivo das bactérias que produzem a substância de purina tais como aquelas das bactérias Bacillus e bactérias Escherichia.
[000148] Uma capacidade de produzir a substância de purina pode ser concedida ou intensificada, por exemplo, concedendo-se uma auxotrofia tal como auxotrofia de adenina, ou também pela comunicação da resistência aos análogos de purina e uma droga tal como sulfaguanidina (referente à Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160, 57-41915 e 59-42895, Pedido de Patente U.S Publicado No. 20040166575). Uma cepa mutante tendo uma capacidade de produzir a substância de purina, tal como uma cepa auxotrófica e uma cepa resistente à droga, pode ser obtida submetendo-se uma cepa precursora ou cepa do tipo selvagem a um tratamento de mutagênese e selecionando-se uma cepa mutante que apresenta um fenótipo desejado usando um meio de seleção apropriado. Os exemplos do tratamento de mutagênese incluem, por exemplo, irradiação de raio X, irradiação de ultravioleta, e tratamento com um agente de mutagênese tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS).
[000149] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser concedida ou intensificada aumentando-se a atividade intracelular de uma enzima envolvido na biossíntese de uma substância de purina. A atividade de um tipo da enzima pode ser intensificada, ou as atividades de dois ou mais tipos de enzimas podem ser intensificadas. Os métodos para aumentar uma atividade enzimática serão explicados posteriormente. Uma atividade enzimática pode ser intensificada, por exemplo, modificando-se uma bactéria de modo que a expressão de um gene que codifica a enzima é intensificada. Os métodos para aumentar a expressão genética são descritos na WO18935, EP 1010755 A, e assim por diante.
[000150] Os nucleotídeos de purina são biossintetizados por intermédio de fosforibosilpirofosfato (PRPP) como um intermediário. Os nucleosídeos de purina são biossintetizados pela desfosforilação dos nucleotídeos de purina. Os exemplos de enzimas envolvidas na biossíntese destas substâncias de purina incluem, por exemplo, PRPP sintetase (prs) e as proteínas codificadas pelo operon de purina.
[000151] Os exemplos do operon de purina incluem, por exemplo, o operon de purEKBCSQLFMNHD da Bacillus subtilis (Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor chefe: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002) e o regulon de pur da Escherichia coli (Escherichia and Salmonella, Segunda Edição, Editor chefe: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Por exemplo, a expressão do operon total de purina pode ser intensificada, ou a expressão de um ou mais genes selecionados dos genes contidos no operon de purina pode ser intensificada.
[000152] Entre estas, por exemplo, a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas de PRPP sintetase (prs) e PRPP amidotransferase (purF) são preferivelmente intensificadas.
[000153] Quando uma enzima envolvida na biossíntese de uma substância de purina é negativamente regulada pela inibição da retroalimentação, pela inibição da expressão, ou outros, a atividade enzimática pode ser intensificada, por exemplo, pela redução ou eliminação de tal regulagem, e a capacidade de produzir a substância de purina pode ser deste modo melhorada (WO99/003988).
[000154] A expressão do operon de purina é inibida pelo repressor de purina codificado pelo gene. Portanto, a expressão do operon de purina pode ser intensificada, por exemplo, através da redução da atividade do repressor de purina (Patente U.S. No. 6.284.495). A atividade do repressor de purina pode ser reduzida, por exemplo, rompendo o gene purR que codifica o repressor de purina (Patente U.S. No. 6.284.495). Além disso, a expressão do operon de purina é regulada pela sequência terminadora-antiterminadora (também é chamada de sequência atenuadora) localizada a jusante do promotor (Ebbole, D.J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287; Ebbole, D.J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894-10902; Ebbole, D.J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141). Portanto, a expressão do operon de purina pode ser intensificada, por exemplo, pela exclusão do atenuador de sequência. A exclusão do atenuador de sequência pode ser obtida pelo mesmo método como aquele usada para o rompimento de um gene explicado posteriormente.
[000155] A PRPP sintetase é submetida à inibição da retroalimentação pela ADP. Portanto, por exemplo, fazendo-se com que a bactéria abrigue um gene PRPP sintetase mutante que codifica uma PRPP sintetase do tipo dessensibilizada para que a inibição da retroalimentação pela ADP seja reduzida ou eliminada, a atividade de PRPP sintetase pode ser intensificada, e a capacidade de produzir a substância de purina pode ser deste modo melhorada (WO99/003988). Os exemplos da PRPP sintetase do tipo dessensibilizada incluem a PRPP sintetase tendo uma mutação que substitui Ala (A) por Asp (D) da posição 128 da PRPP sintetase tipo selvagem (S.G. Bower et al., J. Biol. Chem., 264, 10287 (1989)).
[000156] A PRPP amidotransferase é submetida à inibição da retroalimentação pela AMP e GMP. Portanto, por exemplo, fazendo-se com que uma bactéria abrigue um gene PRPP amidotransferase mutante que codifica uma PRPP amidotransferase tipo dessensibilizada para a qual a inibição da retroalimentação pela AMP e/ou GMP é reduzida ou eliminada, a atividade de PRPP amidotransferase pode ser intensificada, e a capacidade de produzir a substância de purina pode ser deste modo melhorada (WO99/003988). Os exemplos da PRPP amidotransferase tipo dessensibilizada incluem PRPP amidotransferase em que Gln (Q) substitui Lys (K) da posição 326 da PRPP amidotransferase do tipo selvagem, e a PRPP amidotransferase e que Gln (Q) substitui Lys (K) da posição 326, e Trp (W) substitui Pro (P) da posição 410 da PRPP amidotransferase do tipo selvagem (G. Zhou et al., J. Biol. Chem., 269, 6784 (1994)).
[000157] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser concedida ou intensificada reduzindo-se a atividade de uma enzima que catalisa uma reação de ramificação fora da via biossintética de uma substância de purina para gerar outro composto (WO99/003988). A atividade de um tipo da enzima pode ser reduzida, ou s atividades de dois ou mais tipos de enzimas podem ser reduzidas. A “enzima que catalisa uma reação de ramificação fora da via biossintética de uma substância de purina para gerar outro composto” aqui indicada também inclui uma enzima envolvida na decomposição de uma substância de purina. Os métodos para reduzir a atividade enzimática serão explicados posteriormente.
[000158] Os exemplos da enzima que catalisa uma reação de ramificação fora da via biossintética de uma substância de purina para gerar outro composto incluem, por exemplo, nucleosídeo de purina fosforilase (deoD, pupG), succinil-AMP sintase (purA), adenosina desaminase (add), inosina-guanosina cinase (gsk), GMP redutase (guaC), 6-fosfogliconato desidrase (edd), fosfoglicose isomerase (pgi), adenina desaminase (yicP), xantosina fosforilase (xapA), e IMP desidrogenase (guaB). A enzima da qual a atividade deve ser reduzida pode ser escolhida de acordo com o tipo de substância alvo de purina, e assim por diante.
[000159] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser concedida ou intensificada reduzindo-se a atividade de frutose bisfosfatase (frutose 1,6-bisfosfatase) (fbp) (WO2007/125782).
[000160] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser concedida ou intensificada reduzindo-se a atividade de uma proteína envolvida na absorção de uma substância de purina (WO99/003988). Os exemplos de tal proteína envolvida na absorção de uma substância de purina incluem, por exemplo, nucleosídeo permease (nupG) (WO99/003988).
[000161] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser concedida ou intensificada intensificando-se a atividade de uma proteína envolvida na excreção de uma substância de purina. Os exemplos de tal proteína envolvida na excreção de uma substância de purina incluem, por exemplo, proteínas codificadas pelo gene rhtA (ybiF) (Patente Russa No. 2239656), gene yijE (Patente Russa No. 2244003), gene ydeD (Patente Russa No. 2244004), gene yicM (Patente Russa No. 2271391), gene ydhL (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kohyo) No. 2007-530011), e gene nepI (FEMS Microbiology Letters, Volume 250, Edição 1, Páginas de 39 a 47, Setembro de 2005).
[000162] Além disso, a capacidade de produzir ácido inosínico pode ser concedida ou intensificada concedendo-se resistência a um análogo de L- glutamina e resistência a um análogo de prolina a uma bactéria (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2004-516833). Os exemplos do análogo de L-glutamina incluem azasserina e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON). Os exemplos do análogo de prolina incluem 3,4-deidroprolina, ácido L-azetidina-2-carboxílico, ácido L-tiazolidina-4-carboxílico, ácido (S)-2,2- dimetil-4-oxazolida-carboxílico, ácido (S)-5,5-dimetil-4-tiazolida-carboxílico, (4S,2RS)-2-etil-4-tiazolidina-carboxílico, ácido (2S,4S)-4-hidróxi-2-pirrolino- carboxílico, ácido 2-piperidina-carboxílico, e 2,5-pirrolidinodiona. Os exemplos de bactérias que produzem ácido inosínico incluem, por exemplo, Corynebacterium ammoniagenes CJIP009 (KCCM-10226, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2004-516833).
[000163] Além disso, a capacidade de produzir ácido xantílico pode ser concedida ou intensificada através dos métodos usados para a reprodução das bactérias que produzem ácido xantílico da bactéria corineforme, da que o exemplo típico é a Corynebacterium ammoniagenes. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, intensificar a atividade de PRPP amidotransferase (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 8-168383), concedendo resistência a um aminoácido alifático (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 4-262790), e concedendo resistência à desidroprolina (Patente Sul Coreana Aberta ao Público No. 2003-56490).
[000164] Tais métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir a substância de purina como mencionados acima podem ser usados de maneira independente, ou usados como uma combinação arbitrária destes. <1-1-3> Bactérias que produzem proteína
[000165] A produção secretória de proteínas pode ser permitida com a bactéria corineforme usando um peptídeo de sinal que funciona na bactéria corineforme. Especificamente, a produção secretória de uma proteína alvo pode ser permitida fazendo-se com que uma bactéria abrigue uma formação genética compreendendo uma sequência promotora que funciona na bactéria corineforme, uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de sinal que funciona na bactéria corineforme e ligada a jusante da sequência promotora, e uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína alvo e ligada a jusante da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de sinal, e permite a expressão da proteína alvo. É suficiente que a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína alvo seja ligada a jusante da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo de sinal de modo que uma proteína heterogênea seja expressada como uma proteína fundida com este peptídeo de sinal. Os exemplos de bactérias corineformes usadas para a produção secretória das proteínas incluem, por exemplo, as cepas das quais a atividade da proteína da superfície celular é reduzida. Os exemplos de tais cepas incluem a cepa de C. glutamicum YDK010 (WO2004/029254), que é uma proteína da superfície celular da cepa deficiente em PS2 da C. glutamicum cepa AJ12036 (FERM PARES DE BASE-734). Além disso, os exemplos de métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produção secretória da proteína incluem, por exemplo, modificar uma bactéria corineforme de modo que a atividade de proteína que liga à penicilina é reduzida (WO2013/065869), modificar uma bactéria corineforme de modo que a expressão do gene que codifica uma metalopeptidase é aumentada (WO2013/065772), modificar uma bactéria corineforme de modo que a bactéria corineforme abrigue um gene S1 da proteína ribossômica mutante (WO2013/118544), e expressar uma proteína alvo com a inserção de uma sequência de aminoácidos contendo Gln-Glu-Thr entre um peptídeo de sinal e a proteína alvo (WO2013/062029). Tais métodos para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir proteína como mencionados acima podem ser usados de maneira independente, ou podem ser usados em uma combinação arbitrária. <1-2> Assimilabilidade de xilose
[000166] A bactéria da presente invenção tem assimilabilidade de xilose. A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria que possui inerentemente assimilabilidade de xilose, ou pode ser uma bactéria modificada de modo que esta tenha assimilabilidade de xilose. Uma bactéria tendo assimilabilidade de xilose pode ser obtida, por exemplo, concedendo-se a assimilabilidade de xilose a tais bactérias como mencionado acima, ou intensificando-se a assimilabilidade de xilose de tais bactérias como mencionado acima.
[000167] A assimilabilidade de xilose pode ser concedida ou intensificada modificando-se uma bactéria de modo que atividade ou atividades de um ou mais tipos de proteínas selecionadas das proteínas que constituem uma via de assimilação de xilose sejam aumentadas. A proteína da qual a atividade deve ser aumentada pode ser apropriadamente escolhida de acordo com o tipo de bactéria corineforme a ser usada, e assim por diante.
[000168] Os seguintes dois tipos de vias podem ser mencionados como a via de assimilação de xilose. A bactéria da presente invenção pode ter ambas as vias, ou somente uma das vias.
Figure img0001
[000169] A via 1 é constituída por xilose isomerase e xilulocinase.
[000170] “Xilose isomerase” se refere a uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação de isomerizar a D-xilose em D- xilulose (EC 5,3,1,5). Esta atividade também é indicada como “atividade de xilose isomerase”.
Figure img0002
[000171] “Xilulocinase” se refere a uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação de fosforilar a D-xilulose (EC 2,7,1,17). Esta atividade também é indicada como “atividade de xilulocinase”.
Figure img0003
[000172] Os exemplos de um gene que codifica a xilose isomerase incluem o gene xylA. Os exemplos de um gene que codifica xilulocinase incluem o gene xylB. Os exemplos do gene xylA e gene xylB incluem o gene xylA e gene xylB de Escherichia coli. A sequência de nucleotídeos do operon de xylAB da Escherichia coli cepa K-12 MG1655 é mostrada como SEQ ID NO: 10. Na sequência de nucleotídeos mostrada como SEQ ID NO: 10, o gene xylA e o gene xylB correspondem à sequência das posições de 1 a 1323 e a sequência das posições de 1395 a 2849, respectivamente. As sequências de aminoácido da proteína XylA e proteína XylB da Escherichia coli cepa K-12 MG1655 são mostradas como SEQ ID NOS: 11 e 12, respectivamente. Os exemplos do gene xylB também incluem o gene xylB de Corynebacterium glutamicum. A sequência de nucleotídeos do gene xylB e a sequência de aminoácidos da proteína XylB de C. glutamicum ATCC 13869 são mostradas como SEQ ID NOS: 35 e 36, respectivamente.
[000173] A via 2 é constituído por xilose desidrogenase, xilonolactonase, xilonato desidratase, 2-ceto-3-deoxixilonato desidratase, e α- cetoglutárico semialdeído desidrogenase. A segunda metade da via 2, isto é, a via de xilonato para α-cetoglutarato constituído por xilonato desidratase, 2- ceto-3-deoxixilonato desidratase, e a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase também é chamado de “via de Weimberg” (J. Biol. Chem., 236:629-636). A via 2 total ou via de Weimberg também é chamada de via “NXA (Nova Assimilação Xilose)”.
[000174] “Xilose desidrogenase” se refere a uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação de oxidar a D-xilose em D- xilonolactona (EC 1,1,1,175 ou 1,1,1,179). Esta atividade também é indicada como “atividade de xilose desidrogenase”.
Figure img0004
[000175] A “Xilonolactonase” se refere a uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação de clivagem de anel da D- xilonolactona (EC 3,1,1,68). Esta atividade também é indicada como “atividade de xilonolactonase”.
Figure img0005
[000176] “Xilonato desidratase” se refere a uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação de desidratar o D-xilonato (EC 4,2,1,82). Esta atividade também é indicada como “atividade de xilonato desidratase”.
Figure img0006
[000177] “2-ceto-3-desoxixilonato desidratase” se refere a uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação de desidratar 2-ceto-3- desoxixilonato (EC 4,2,1.-). Esta atividade também é indicada como “atividade de 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase”.
Figure img0007
[000178] “a-Cetoglutárico semialdeído desidrogenase” se refere a uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação de oxidar α- cetoglutárico semialdeído (EC 1,2,1,26). Esta atividade também é indicada como “atividade de a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase”.
Figure img0008
[000179] Os exemplos de genes que codificam as enzimas que constituem a via 2 incluem os genes do operon de xylXABCD. O gene xylB gene codifica a xilose desidrogenase. O gene xylC codifica xilonolactonase. O xylD gene codifica xilonato desidratase. O gene xylX codifica 2-ceto-3- desoxixilonato desidratase. O gene xylA codifica a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase.
[000180] Embora os mesmos nomes de genes sejam usados, os genes xylA e xylB que codificam xilose isomerase e xilulocinase da via 1 são genes diferentes do gene xylA e gene xylB que codificam a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase e xilose desidrogenase da via 2, respectivamente.
[000181] Os exemplos do operon de xylXABCD incluem o operon de xylXABCD da Caulobacter crescentus. Os exemplos de Caulobacter crescentus incluem a cepa CB15, cepa NA1000, e cepa K31. A sequência de genomas da Caulobacter crescentus cepa CB15, cepa NA1000, e cepa K31 são registrados no banco de dados NCBI como Acesso no Genbank Nos. AE005673, CP001340, e CP000927, respectivamente. Os genes xylXABCD da Caulobacter crescentus cepa CB15 são registrados com os símbolos de CC_0822, CC_0821, CC_0820, CC_0819, e CC_0823, respectivamente. Os genes de xylXABCD da Caulobacter crescentus cepa NA1000 são registrados com os símbolos de gene de CCNA_00865, CCNA_00864, CCNA_00863, CCNA_00862, e CCNA_00866, respectivamente. Os genes xylABCD (xylX não é identificado ainda) da Caulobacter crescentus cepa CB15 são registrados com os símbolos de gene de Caul_4001, Caul_4002, Caul_4003, e Caul_4000, respectivamente. As sequências de nucleotídeos dos genes xylXABCD da Caulobacter crescentus cepa CB15 são mostradas como SEQ ID NOS: 37, 39, 41, 43, e 45, respectivamente. As sequências de aminoácidos das proteínas XylXABCD da Caulobacter crescentus cepa CB15 são mostradas como SEQ ID NOS: 38, 40, 42, 44, e 46, respectivamente.
[000182] Os exemplos do gene de xilose desidrogenase também incluem o gene xylB das bactérias de Sphingomonas ou Pseudomonas tais como Sphingomonas elodea (antigamente, Pseudomonas elodea). A sequência de nucleotídeos do gene xylB e a sequência de aminoácidos da proteína XylB de Sphingomonas elodea são mostradas como SEQ ID NOS: 15 e 16, respectivamente.
[000183] Os exemplos do gene xilonolactonase também incluem o gene xylC das bactérias Sphingomonas ou Pseudomonas tais como Sphingomonas elodea (Pseudomonas elodea). A sequência de nucleotídeos do gene xylC e a sequência de aminoácidos da proteína XylC da Sphingomonas elodea são mostradas como SEQ ID NOS: 17 e 18, respectivamente.
[000184] Os exemplos do gene de xilonato desidratase também incluem o gene yjhG e o gene yagF da bactéria Escherichia tal como Escherichia coli, bem como os homólogos do gene xylD da bactéria Agrobacterium tal como microrganismos de Agrobacterium tumefaciens, bactéria de Herbaspirillum tal como Herbaspirillum seropedicae, bactéria de Actinoplanes tal como Actinoplanes missouriensis, e Aspergillus tais como Aspergillus oryzae. A sequência de nucleotídeos do gene yagF e a sequência de aminoácidos da proteína YagF da Escherichia coli cepa K-12 MG1655 são mostradas como SEQ ID NOS: 19 e 20, respectivamente.
[000185] Os exemplos do gene de 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase incluem os homólogos do gene xylX da bactéria Agrobacterium tal como Agrobacterium tumefaciens, bactérias de Sphingomonas ou Pseudomonas tais como Sphingomonas elodea (Pseudomonas elodea), bactéria de Zobellia tal como Zobellia galactanivorans, bactéria de Thermobacillus tal como Thermobacillus composti, e bactéria de Arthrobacter tal como Arthrobacter globiformis. A sequência de nucleotídeos do gene xylX e a sequência de aminoácidos da proteína XylX de Sphingomonas elodea são mostradas como SEQ ID NOS: 21 e 22, respectivamente.
[000186] Os exemplos do gene a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase incluem os homólogos do gene xylA de bactéria Azospirillum tais como Azospirillum brasilense, e bactéria Halomonas tal como Halomonas boliviensis, bem como o gene ycbD da bactéria Bacillus tal como Bacillus subtilis. A sequência de nucleotídeos do gene ycbD e a sequência de aminoácidos da proteína YcbD de Bacillus subtilis são mostradas como SEQ ID NOS: 23 e 24, respectivamente.
[000187] A atividade de cada uma das proteínas que constituem as vias de assimilação de xilose pode ser medida de acordo com as descrições das referências publicadas (Documento que não de patente 3 e Documento de patente 8).
[000188] Além disso, algumas das glicose desidrogenases (EC 1,1,1,47, EC 1,1,1,118, EC 1,1,1,119, EC 1,1,5,2 etc.) catalisam a reação de oxidar D- xilose em D-xilonolactona. Portanto, de modo a comunicar ou intensificar a assimilabilidade de xilose, a atividade de tal glicose desidrogenase pode ser intensificada além da, ou ao invés da atividade de xilose desidrogenase mencionados acima. Os exemplos de tais glicose desidrogenase incluem a glicose desidrogenase da Pseudomonas putida S12 (Jean-Paul Meijnen et al., Appl. Environ. Microbiol., Maio de 2009, 75(9):2784-2791). A glicose desidrogenase da Pseudomonas putida S12 catalisa a reação de oxidar a D- xilose em D-xilonolactona usando pirroloquinolino quinona como um receptor de elétrons.
[000189] Os genes usados para as modificações de bactérias acima mencionadas, tal como o fornecimento ou intensificação de uma capacidade de produzir a substância alvo, e fornecimento ou intensificação da assimilabilidade de xilose, não são limitados aos genes exemplificados acima ou aos genes tendo uma sequência de nucleotídeos conhecida, mas podem ser uma variante deste, contanto que uma proteína que mantenha a função original seja codificada. Por exemplo, os genes usados para as modificações de bactérias podem ser um gene que codifica uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos da proteína conhecida, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições. A tais variantes de genes ou proteínas, as descrições com relação às variantes do gene NCgl2954 e as proteínas deste modo codificadas mencionadas posteriormente podem ser aplicadas, mutatis mutandis.
<1-3> Melhora da assimilabilidade de xilose através da introdução de mutação no gene NCgl2954
[000190] Na bactéria da presente invenção, a assimilabilidade de xilose foi melhorada através da introdução de uma mutação no gene NCgl2954. A bactéria da presente invenção pode ser obtida introduzindo-se uma mutação no gene NCgl2954 de uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir a substância alvo para melhorar a assimilabilidade de xilose da bactéria. A bactéria da presente invenção também pode ser obtida introduzindo-se uma mutação no gene NCgl2954 de uma bactéria corineforme para melhorar a assimilabilidade de xilose da bactéria, e depois comunicar uma capacidade de produzir a substância alvo à bactéria. A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria que adquiriu uma capacidade de produzir a substância alvo como um resultado de uma melhora da assimilabilidade de xilose fornecida através da introdução de uma mutação no gene NCgl2954. Na presente invenção, as modificações para formar a bactéria da presente invenção podem ser realizadas em uma ordem arbitrária.
[000191] Especificamente, a assimilabilidade de xilose pode ser melhorada através da melhora da capacidade de absorção de xilose. Isto é, a bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria em que capacidade de absorção de xilose foi melhorada através da introdução de uma mutação no gene NCgl2954.
[000192] Uma melhora da assimilabilidade de xilose (por exemplo, melhora da capacidade de absorção de xilose) pode ser confirmada, por exemplo, confirmando a melhora do crescimento ou a melhora do consumo de xilose na cultura de uma bactéria corineforme realizada em um meio contendo xilose como uma fonte única de carbono.
<1-3-1> Gene NCgl2954 e proteína NCgl2954
[000193] O gene NCgl2954 é um gene que codifica um fator de transcrição. As proteínas codificadas pelo gene NCgl2954 também são indicadas como proteína NCgl2954. O gene NCgl2954 de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 corresponde à sequência das posições 3261130 a 3261993 na sequência de genoma registrada no banco de dados NCBI como Acesso no Genbank NC_003450 (VERSÃO NC_003450,3 GI: 58036263). O gene NCgl2954 de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é sinônimo com Cgl3059. A proteína NCgl2954 de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é registrada como Acesso no Genbank NP_602251 (versão NP_602251,2 GI:23309012). Além disso, a sequência de nucleotídeos do gene NCgl2954 e a sequência de aminoácidos da proteína NCgl2954 de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 são mostradas como SEQ ID NOS: 13 e 14, respectivamente.
[000194] O gene NCgl2954 pode ser uma variante dos genes exemplificados acima, contanto que a variante mantenha a função original. Similarmente, a proteína NCgl2954 pode ser uma variante das proteínas exemplificadas acima, contanto que a variante mantenha a função original. Tal variante que mantém a função original pode ser indicada como “variante conservadora”. Na presente invenção, o termo “gene NCgl2954” não inclui somente os genes NCgl2954 exemplificados acima, mas também as variantes conservadoras destes. Similarmente, o termo “proteína NCgl2954” não inclui somente as proteínas NCgl2954 exemplificadas acima, mas também as variantes conservadoras destas. Os exemplos das variantes conservadoras incluem, por exemplo, homólogos e genes artificialmente modificados e proteínas dos genes NCgl2954 e NCgl2954 exemplificadas acima.
[000195] A expressão “variante mantém a função original” significa que a variante tem uma função (tal como atividade e propriedade) que corresponde à função (tal como atividade e propriedade) do gene ou proteína originais. Isto é, a expressão “variante mantém a função original” significa que, no caso do gene NCgl2954, uma variante do gene tem uma propriedade cuja exclusão deste em uma bactéria corineforme melhora a assimilabilidade de xilose da bactéria. Além disso, a expressão “variante mantém a função original” também pode significar que, no caso do gene NCgl2954, uma variante do gene codifica uma proteína que mantém a função original. Similarmente, a expressão “variante mantém a função original” significa que, no caso da proteína NCgl2954, uma variante da proteína tem uma propriedade de que a exclusão desta em uma bactéria corineforme melhora a assimilabilidade de xilose da bactéria. Especificamente, a assimilabilidade de xilose pode ser melhorada através da melhora da capacidade de absorção de xilose. Isto é, “para melhorar a assimilabilidade de xilose” pode significar melhorar a capacidade de absorção de xilose.
[000196] Se uma variante do gene ou proteína tem a propriedade cuja exclusão em uma bactéria corineforme melhora a assimilabilidade de xilose da bactéria, isto pode ser confirmado pela exclusão do gene ou um gene que codifica a proteína em uma bactéria corineforme tendo assimilabilidade de xilose, e confirmando se a assimilabilidade de xilose é melhorada ou não.
[000197] Os homólogos dos genes NCgl2954 acima mencionados podem ser facilmente obtidos a partir de banco de dados públicos, por exemplo, BLAST por pesquisa ou pesquisa FASTA usando uma sequência de nucleotídeos do gene NCgl2954 mencionado acima como uma sequência de consulta. Além disso, os homólogos dos genes NCgl2954 acima mencionados também podem ser obtidos, por exemplo, por PCR usando um cromossomo de uma bactéria corineforme como o modelo, e oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência genética conhecida como os iniciadores.
[000198] O gene NCgl2954 pode codificar uma proteína tendo qualquer uma das sequências de aminoácidos acima mencionadas, mas que inclui a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos em uma ou várias posições, de modo que a proteína mantenha a função original. Embora o número de “um ou vários” mencionados acima pode diferir dependendo das dos resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, este é, por exemplo, de 1 a 50, de 1 a 40, ou de 1 a 30, preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5, de maneira particularmente preferível de 1 a 3.
[000199] A substituição, exclusão, inserção, ou adição acima mencionadas de um ou vários resíduos de aminoácido é uma mutação conservativa que mantém a função normal da proteína. Os exemplos típicos da mutação conservativa são substituições conservativas. A substituição conservativa é uma mutação em que a substituição ocorre mutualmente entre Phe, Trp, e Tyr, se o sítio de substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile, e Val, se este é um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se este é um aminoácido polar; entre Lys, Arg, e His, se este é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se este é um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se este é um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Os exemplos de substituições considerados como substituições conservativas incluem, especificamente, a substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His, ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His, ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu, ou Gln for Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg por Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys, ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg, ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val, ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Val, ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His, ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val, ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe, ou Trp for Tyr, e substituição de Met, Ile, ou Leu por Val. Além disso, tal substituição, exclusão, inserção, adição, inversão, ou outros de resíduos de aminoácido como mencionados acima incluem um mutação de ocorrência natural devido a uma diferença individual, ou uma diferença de espécies do organismo a partir da qual o gene é derivado (mutante ou variante).
[000200] O gene NCgl2954 pode ser um gene que codifica uma proteína que apresenta uma homologia de, por exemplo, 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, ainda mais preferivelmente 97% ou mais, de maneira particularmente preferível 99% ou mais, para a sequência total de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos mencionadas acima, contanto que a proteína mantenha a função original. Nesta descrição, “homologia” significa “identidade”.
[000201] O gene NCgl2954 também pode ser um DNA que é capaz de hibridizar sob condições restritas com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida, tal como uma sequência complementar a uma sequência parcial ou inteira de qualquer uma das sequências de nucleotídeos acima mencionadas. As “condições restritas” referentes às condições sob as quais um então chamado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos das condições restritas incluem aquelas sob as quais os DNAs altamente homólogos hibridizam uns com os outros, por exemplo, DNAs não menos do que 80% homólogos, preferivelmente não menos do que 90% homólogos, mais preferivelmente não menos do que 95% homólogos, ainda mais preferivelmente não menos do que 97% homólogos, de maneira particularmente preferível não menos do que 99% homólogos, hibridizando um com os outros, e os DNAs menos homólogos do que os acima não hibridizando um com os outros, ou condições de lavagem da hibridização de Southern típica, isto é, condições de lavar uma, preferivelmente 2 ou 3 vezes, em uma concentração salina e temperatura que corresponde a 1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 68°C.
[000202] A sonda usada para a hibridização acima mencionada pode ser uma parte de uma sequência que é complementar ao gene como descrito acima. Tal sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência genética conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA contendo qualquer uma das sequências de nucleotídeos acima mencionadas como um modelo. Como a sonda, por exemplo, um fragmento de DNA tendo uma extensão de cerca de 300 pares de base pode ser usado. Quando um fragmento DNA tendo uma extensão de cerca de 300 pares de base é usado como a sonda, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo, 50°C, 2 x SSC e 0,1% de SDS.
[000203] Além disso, visto que a degeneração dos códons difere dependendo do hospedeiro, os códons arbitrários no gene NCgl2954 podem ser substituídos com códons equivalentes, contanto que a função original seja mantida.
[000204] As descrições acima mencionadas relacionadas às variantes conservadoras dos genes e proteínas podem ser aplicadas mutatis mutandis às variantes das proteínas arbitrárias tais como enzimas do sistema de biossíntese de aminoácido e os genes que as codificam.
<1-3-2> Mutação a ser introduzida no gene NCgl2954
[000205] A expressão “uma mutação é introduzida no gene NCgl2954” especificamente significa que uma mutação é introduzida em uma região de codificação e/ou uma região de controle de expressão do gene NCgl2954 em um cromossomo. A “região de controle de expressão” é um termo genérico para se referir a um sítio que afeta a expressão do gene. Os exemplos de região de controle de expressão incluem promotor, sequência de Shine- Dalgarno (SD) (também indicada como sítio de ligação de ribossomos (RBS)), e região espaçadora entre o RBS e o códon de partida. As regiões de controle de expressão podem ser determinadas, por exemplo, através do uso de um vetor de busca de promotor, ou suporte lógico para análise dos genes tal como GENETYX.
[000206] A mutação a ser introduzida no gene NCgl2954 não é particularmente limitada, contanto que introdução da mutação melhore a assimilabilidade de xilose de uma bactéria corineforme. Os exemplos da mutação que melhoram a assimilabilidade de xilose de uma bactéria corineforme incluem uma mutação que atenua a expressão do gene NCgl2954 e uma mutação que rompe o gene NCgl2954. Isto é, a bactéria da presente invenção pode ser, por exemplo, uma bactéria da qual a assimilabilidade de xilose foi melhorada através da atenuação da expressão do gene NCgl2954 ou rompimento do gene.
[000207] Um estado em que a “expressão de um gene é atenuada” também é indicado como “expressão de um gene é reduzida”. Um estado em que a “expressão de um gene é reduzida” significa que a quantidade de expressão do gene por célula é reduzida se comparado com aquela observada em uma cepa não modificada tais como as cepas do tipo selvagem e a cepa da bactéria precursora. Um estado em que a “expressão de um gene é reduzida” inclui um estado em que o gene não é expressado. A expressão de um gene pode ser reduzida, por exemplo, a 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0% daquela observada em uma cepa não modificada.
[000208] Uma redução in a expressão de um gene pode ser fornecida, por exemplo, através de uma redução na eficiência de transcrição, uma redução na eficiência de tradução, ou uma combinação destes. Uma redução na expressão de um gene pode ser obtida, por exemplo, modificando-se uma região de controle de expressão do gene tal como promotor, sequência SD (RBS), e região espaçadora entre RBS e o códon de partida do gene. Quando uma região de controle de expressão é modificada, preferivelmente um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, de maneira particularmente preferível três ou mais nucleotídeos, da região de controle de expressão são modificados. Além disso, uma parte ou o todo da região de controle de expressão pode ser excluído. Uma redução na expressão de um gene também pode ser obtida, por exemplo, introduzindo-se uma mutação que reduz a expressão do gene na região de codificação do gene. Por exemplo, a expressão de um gene pode ser reduzida substituindo-se um códon em uma região de codificação de um gene com um códon sinônimo menos frequentemente usado em um hospedeiro. Além disso, por exemplo, a expressão do gene por si pode ser reduzida através do rompimento de um gene como descrito posteriormente.
[000209] A expressão de que “um gene é rompido” significa que o gene é modificado de modo que este não produza uma proteína que funcione normalmente. O estado de que “uma proteína que não funcione normalmente é produzida” inclui um estado em que a proteína não é produzida a partir do gene, e um estado em que a proteína da qual a função (tal como a atividade e propriedade) por molécula é reduzida ou eliminada é produzida a partir do gene.
[000210] O rompimento de um gene pode ser obtido, por exemplo, excluindo-se uma parte ou a parte total da região de codificação do gene em um cromossomo. Além disso, a parte total de um gene, incluindo as sequências a montante e a jusante do gene em um cromossomo pode ser excluída. As sequências a montante e a jusante do gene podem conter, por exemplo, uma região de controle de expressão do gene. A região a ser excluída pode ser qualquer região tal como uma região N-terminal, uma região interna, ou uma região C-terminal. A exclusão de uma região mais longa pode, geralmente, inativar mais seguramente o gene. Além disso, é preferido que as estruturas de leitura das sequências a montante e a jusante da região a ser excluída são sejam as mesmas.
[000211] O rompimento de um gene também pode ser obtido, por exemplo, introduzindo-se uma mutação para uma substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), um códon de parada (mutação sem sentido), uma mutação de troca de estrutura que adiciona ou exclui um ou dois resíduos de nucleotídeo, ou outros na região de codificação do gene em um cromossomo (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, EUA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)).
[000212] O rompimento de um gene também pode ser obtido, por exemplo, inserindo-se outra sequência em uma região de codificação do gene em um cromossomo. O sítio de inserção pode estar em qualquer região do gene. Geralmente, a inserção de uma região mais longa pode, geralmente, inativar o gene de maneira mais segura. É preferido que as estruturas de leitura das sequências a montante e a jusante do local de inserção sejam as mesmas. A outra sequência não é particularmente limitada contanto que inserção da sequência fornece o rompimento de um gene, e os exemplos destes incluem, por exemplo, um gene marcador tal como genes de resistência a antibióticos, e um gene útil para a produção de uma substância alvo.
[000213] Tal modificação de um gene em um cromossomo como descrito acima pode ser obtida, por exemplo, preparando um gene tipo deficiente em que uma sequência do gene parcial é excluída de modo que este não pode produzir uma proteína que pode funcionar normalmente, e transformando um hospedeiro com um DNA recombinante incluindo o gene tipo deficiente para causar a recombinação homóloga entre o gene tipo deficiente e o gene tipo selvagem em um cromossomo e deste modo substituir o gene tipo deficiente pelo gene tipo selvagem no cromossomo. Neste procedimento, se um gene marcador selecionado de acordo com as características do hospedeiro tais como auxotrofia é incluído no DNA recombinante, a operação se torna mais fácil. As proteínas codificadas pelo gene tipo deficiente tem uma configuração diferente daquela da proteína do tipo selvagem, mesmo se esta é produzida, e deste a função desta é reduzida ou eliminada. Tal rompimento de gene com base na substituição de gene utilizando a recombinação homóloga já foi estabelecido, e existem métodos para usar um DNA linear tal como um método chamando de “Integração Conduzida por Vermelho” (Datsenko, K.A, e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 97:6640-6645 (2000)), e um método que utiliza a integração conduzida por vermelho em combinação com um sistema de excisão derivado do fago X (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (referente à WO2005/010175), um método para usar um plasmídeo, incluindo um origem de replicação sensível à temperatura, um método para usar um plasmídeo capaz da transferência conjugativa, um método de utilizar um vetor suicida não incluindo uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro (Patente U.S. No. 6.303.383, Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 05-007491), e assim por diante.
[000214] Uma mutação também pode ser introduzida, por exemplo, através de um tratamento de mutagênese. Os exemplos dos tratamentos de mutagênese incluem tratamentos de mutação habituais tais como irradiação de raio X, irradiação ultravioleta, e tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS).
[000215] Uma redução na expressão de um gene pode ser confirmada confirmando-se uma redução na quantidade de transcrição do gene ou uma redução na quantidade da proteína expressada a partir do gene.
[000216] Uma redução na quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmada comparando-se a quantidade de mRNA transcrito do gene com aquela observada em uma cepa não modificada. Os exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização de Northern, RT-PCR, e assim por diante (Molecular Cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA), 2001). A quantidade de mRNA é preferivelmente diminuída a, por exemplo, 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0%, daquela observada em uma cepa não modificada.
[000217] Uma redução na quantidade de uma proteína pode ser confirmada por Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA) 2001). A quantidade da proteína é preferivelmente diminuída, por exemplo, a 50% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos, 5% ou menos, ou 0%, daquela observada em uma cepa não modificada.
[000218] O rompimento de um gene pode ser confirmado determinando- se a sequência de nucleotídeos de uma parte ou da parte total do gene, o mapa de restrição de enzima, a extensão do mapa, ou outros do gene dependendo dos meios usados para rompimento.
[000219] Além disso, os exemplos específicos da mutação a ser introduzida no gene NCgl2954 incluem, por exemplo, as mutações de (1) a (7) mencionadas abaixo. Através da introdução de qualquer uma das mutações de (1) a (7) mencionadas abaixo, por exemplo, a expressão do gene NCgl2954 pode ser atenuada, ou o gene NCgl2954 pode ser rompido. O gene NCgl2954 no tendo qualquer uma das mutações de (1) a (7) mencionadas abaixo também pode ser indicado como “gene NCgl2954 do tipo selvagem”, e o gene NCgl2954 tendo qualquer uma das mutações de (1) a (7) mencionadas abaixo também podem ser indicados como “gene NCgl2954 mutante”. Além disso, uma proteína codificada por um gene NCgl2954 do tipo selvagem também pode ser indicada como uma “proteína NCgl2954 do tipo selvagem”, e uma proteína codificada por um gene NCgl2954 mutante também pode ser indicada como “proteína NCgl2954 mutante”. Os exemplos do gene NCgl2954 do tipo selvagem incluem o gene NCgl2954s exemplificado acima, e as variantes conservadoras destes. (1) Uma mutação para substituir o resíduo de prolina na posição 483 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem com outro resíduo de aminoácido. (2) Uma mutação para substituir o resíduo de cisteína na posição 334 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem com outro resíduo de aminoácido. (3) Uma mutação para substituir o resíduo de tirosina na posição 377 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem com outro resíduo de aminoácido. (4) Uma mutação para substituir o resíduo de leucina na posição 365 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem com outro resíduo de aminoácido. (5) Uma mutação para substituir o resíduo de leucina na posição 366 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem com outro resíduo de aminoácido. (6) Uma mutação para substituir o resíduo de alanina na posição 367 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem com outro resíduo de aminoácido. (7) Uma mutação para excluir o resíduo de aminoácido na posição 368 e os seguintes resíduos de aminoácido de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem.
[000220] O “outro resíduo de aminoácido” (isto é, o resíduo de aminoácido que existe depois da substituição) não é particularmente limitado, contanto que este seja um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de aminoácido existente antes da substituição. Os exemplos específicos do “outro resíduo de aminoácido” incluem lisina, ornitina, arginina, histidina, isoleucina, alanina, valina, leucina, glicina, treonina, serina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, cisteína, metionina, ácido glutâmico, ácido aspártico, glutamina, e resíduo de asparaginas, contanto que estes devem ser outros que não os resíduos de aminoácido existentes antes da substituição. O resíduo de leucina na posição 438 pode ser substituído com, por exemplo, um resíduo de prolina. O resíduo de triptofano na posição 274 pode ser substituído com, por exemplo, um resíduo de arginina. O resíduo de leucina na posição 365 pode ser substituído com, por exemplo, um resíduo de serina. O resíduo de leucina na posição 366 pode ser substituído com, por exemplo, um resíduo de arginina. O resíduo de alanina na posição 367 pode ser substituído com, por exemplo, um resíduo de fenilalanina. O resíduo de tirosina na posição 377 pode ser substituído com, por exemplo, um resíduo de asparagina.
[000221] Um gene NCgl2954 mutante pode ter uma ou mais mutações selecionadas dessas mutações. Por exemplo, um gene NCgl2954 mutante pode ter as mutações de (4) a (7) mencionadas acima em combinação. Especificamente, por exemplo, um gene NCgl2954 mutante produzido a partir do gene NCgl2954 do tipo selvagem mostrado como SEQ ID NO: 13 pela exclusão de GC nas posições 1092 e 1093 codifica uma proteína NCgl2954 mutante que corresponde à proteína NCgl2954 do tipo selvagem mostrada como SEQ ID NO: 14 em que os resíduos de leucina-leucina-alanina nas posições 365 a 367 são substituídos com os resíduos de serina-arginina- fenilalaninas, e os resíduos de aminoácido na posição 368 e as seguintes posições são excluídas.
[000222] Um “resíduo de aminoácido na posição X de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem” indicada na presente invenção significa um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de aminoácido na posição X da SEQ ID NO: 14, a menos que de outro modo indicado. Isto é, as mutações de (1) a (7) mencionadas acima podem ser descritas, em outras palavras, como segue. (1) Uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (2) Uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de triptofano na posição 274 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não um resíduo de triptofano; (3) Uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de tirosina na posição 377 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de tirosina; (4) Uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 365 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (5) Uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 366 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (6) Uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 367 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de alanina; (7) Uma mutação para excluir os resíduos de aminoácido que correspondem ao resíduo de aminoácido na posição 368 da SEQ ID NO: 14 e aos seguintes resíduos de aminoácido
[000223] A “posição X” em uma sequência de aminoácidos é a Xa posição contada a partir do terminal N da sequência de aminoácidos, e o resíduo de aminoácido do terminal N é o resíduo de aminoácido na posição 1. Isto é, a posição do resíduo de aminoácido é uma posição relativa, e a posição absoluta deste pode mudar devido à exclusão, inserção, adição, ou outros de um resíduo ou resíduos de aminoácido. Por exemplo, “o resíduo de leucina na posição 438 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem” significa um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14. Quando um resíduo de aminoácido é excluído no lado do terminal N com relação à posição 438, o 437o resíduo de aminoácido do terminal N deve ser o “resíduo de leucina na posição 438 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem”. Além disso, quando um resíduo de aminoácido é inserido no lado do terminal N com relação à posição 438, o 439o resíduo de aminoácido contado a partir do terminal N deve ser o “resíduo de leucina na posição 438 de uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem”.
[000224] Tal resíduo de aminoácido é o “resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de aminoácido na posição X da SEQ ID NO: 14” em uma sequência de aminoácidos arbitrária pode ser determinado alinhando-se a sequência de aminoácidos arbitrária e a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14. O alinhamento pode ser realizado, por exemplo, usando um suporte lógico conhecido para a análise dos genes. Os exemplos específicos de tais suportes lógicos incluem DNASIS produzido pela Hitachi Solutions, GENETYX produzido pela Genetyx, e assim por diante (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1) 72-96, 1991; Barton G.J. et al., Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327-37, 1987).
[000225] Quando uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos outra que não a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 14, os resíduos de aminoácido nos quais as mutações de (1) a (7) mencionadas acima são introduzidos podem ser, ou podem não ser conservados em tal sequência de aminoácidos. Isto é, por exemplo, em uma proteína NCgl2954 do tipo selvagem, o “resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14” não precisa ser o resíduo de leucina. Portanto, por exemplo, a “mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de leucina” não é limitada a uma mutação para substituir, no caso em que o resíduo de aminoácido naquela posição da proteína NCgl2954 do tipo selvagem é um resíduo de leucina, o resíduo de leucina com um resíduo de prolina, mas também pode incluir uma mutação para substituir, no caso em que o resíduo de aminoácido naquela posição não seja o resíduo de leucina, o resíduo de aminoácido (não sendo o resíduo de leucina) com um resíduo de prolina.
[000226] Um gene NCgl2954 mutante pode ser obtido modificando-se um gene tipo selvagem NCgl2954 de modo que o gene modificado deve ter qualquer uma das mutações mencionadas acima. A modificação do DNA pode ser realizada através de um método conhecido. Especificamente, a modificação do DNA pode ser realizada, por exemplo, pelo método de mutagênese de sítio específico para introduzir uma mutação objetiva em um sítio alvo do DNA. Os exemplos do método de mutagênese de sítio específico incluem, por exemplo, um método para usar PCR (Higuchi, R., 61, in PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press, 1989; Carter P., Meth., in Enzymol., 154, 382, 1987), e um método para usar um fago (Kramer, W. And Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367, 1987). Além disso, um gene NCgl2954 mutante também pode ser obtido através da síntese química.
<1-4> Método para reduzir a atividade de proteína
[000227] Em seguida, os métodos para reduzir a atividade de uma proteína serão explicados.
[000228] A expressão “atividade de uma proteína é reduzida” significa que a atividade da proteína por célula é reduzida se comparado com aquela de uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem e uma cepa precursora. O estado em que “a atividade de uma proteína é reduzida” também inclui um estado em que a atividade da proteína desapareceu completamente. Especificamente, a expressão “atividade de uma proteína é reduzida” significa que o número de moléculas da proteína por célula é reduzido, e/ou que a função de cada molécula da proteína é reduzida se comparado com aquela de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” não é limitado à atividade catalítica da proteína, mas também pode significar a quantidade de transcrição de um gene (isto é, a quantidade de mRNA) que codifica a proteína ou a quantidade de tradução da proteína (isto é a quantidade da proteína). O estado em que “o número de moléculas da proteína por célula é reduzida” também inclui um estado em que a proteína não existe. O estado em que “a função de cada molécula da proteína é reduzida” também inclui um estado em que a função de cada molécula de proteína desapareceu completamente. O grau da redução na atividade de uma proteína não é particularmente limitado, contanto que a atividade seja reduzida se comparado com aquela de uma cepa não modificada. A atividade de uma proteína pode ser reduzida, por exemplo, a 50% ou menos, a 20% ou menos, a 10% ou menos, a 5% ou menos, ou a 0% daquela de uma cepa não modificada.
[000229] A modificação para reduzir a atividade de uma proteína pode ser obtida, por exemplo, pela redução da expressão de um gene que codifica a proteína. Além disso, a modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, através do rompimento do gene que codifica a proteína. Além disso, a modificação para reduzir a atividade de uma proteína também pode ser realizada, por exemplo, através e um tratamento de mutagênese. Os métodos para reduzir a expressão de um gene, os métodos para romper um gene, e o tratamento de mutagênese são como descritos acima.
[000230] Quando uma proteína funciona como um complexo consistindo em uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda a pluralidade de subunidades pode ser modificada, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda uma pluralidade de genes que codifica as respectivas subunidades pode ser rompida ou outros. Além disso, quando existe uma pluralidade de isozimas de uma proteína, uma parte ou todas as atividades da pluralidade das isozimas podem ser reduzidas, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente reduzida. Isto é, por exemplo, uma parte ou toda uma pluralidade de genes que codifica as respectivas isozimas pode ser rompida ou outros.
[000231] Uma redução na atividade de uma proteína pode ser confirmada pela medição da atividade da proteína. Uma redução na atividade de uma proteína também pode ser confirmada através da confirmação de uma redução na expressão de um gene que codifica a proteína, ou confirmando-se o rompimento de tal gene.
[000232] Os métodos acima mencionados para reduzir a atividade de uma proteína como mencionados acima podem ser aplicados à redução nas atividades de proteínas arbitrárias tal como uma enzima que catalisa uma reação de ramificação fora da via de biossíntese de um L-aminoácido objetivo para gerar um composto outro que não o L-aminoácido objetivo, e a redução na expressão dos genes arbitrários tais como os genes que codificam estas proteínas arbitrárias.
<1-5> Métodos para intensificar a atividade de proteína
[000233] Em seguida, os métodos para intensificar a atividade de uma proteína serão explicados.
[000234] A expressão “a atividade de uma proteína é intensificada” significa que a atividade da proteína por célula é intensificada se comparada com aquela de uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem e cepa precursora. O estado em que “a atividade de uma proteína é intensificada” também pode ser expresso como “a atividade de uma proteína é intensificada”. Especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é intensificada” significa que o número de moléculas da proteína por célula é aumentada, e/ou a função de cada molécula da proteína é intensificada se comparado com aquela de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “atividade de uma proteína é intensificada” não é limitada à atividade catalítica da proteína, mas também pode significar a quantidade de transcrição de um gene (isto é, a quantidade de mRNA) que codifica a proteína, ou a quantidade de tradução da proteína (isto é, a quantidade da proteína). Além disso, o estado em que “a atividade de uma proteína é intensificada” inclui não somente um estado em que a atividade de uma proteína objetivo é intensificada em uma cepa que possui inerentemente a atividade da proteína objetivo, mas também um estado em que a atividade de uma proteína objetivo é concedida a uma cepa que não possui inerentemente a atividade da proteína objetivo. Além disso, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente aumentada, a atividade de uma proteína objetivo inerentemente contida em um hospedeiro pode ser atenuada e/ou eliminada, e depois um tipo apropriado da proteína objetivo pode ser concedido ao hospedeiro.
[000235] O grau do aumento na atividade de uma proteína não é particularmente limitado, contanto que a atividade da proteína seja intensificada se comparado com uma cepa não modificada. A atividade da proteína pode ser aumentada 1,5 vez ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, se comparado com aquela de uma cepa não modificada. Além disso, quando a cepa não modificada não possui a atividade da proteína objetivo, é suficiente que a proteína seja produzida como um resultado da introdução do gene que codifica a proteína, e por exemplo, a proteína pode ser produzida até tal grau em que a atividade enzimática pode ser medida.
[000236] A modificação para intensificar a atividade de uma proteína é obtida, por exemplo, aumentando-se a expressão de um gene que codifica a proteína. O estado em que “a expressão de um gene é aumentada” também pode ser indicada como “a expressão de um gene é intensificada”. A expressão de um gene pode ser aumentada 1,5 vez ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, se comparado com aquela de uma cepa não modificada. Além disso, o estado em que “a expressão de um gene é aumentada” inclui não somente um estado em que a quantidade de expressão de um gene objetivo é aumentada em uma cepa que inerentemente expressa o gene objetivo, mas também um estado em que o gene é introduzido em uma cepa que não expressa inerentemente o gene objetivo, e aqui expressado. Isto é, a frase “a expressão de um gene é aumentada” também pode significar, por exemplo, que um gene objetivo é introduzido em uma cepa que não possui o gene, e é nesta expressado.
[000237] A expressão de um gene pode ser aumentada, por exemplo, aumentando-se o número de cópias do gene.
[000238] O número de cópias de um gene pode ser aumentado introduzindo-se o gene no cromossomo de um hospedeiro. Um gene pode ser introduzido em um cromossomo, por exemplo, usando-se recombinação homóloga (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Somente uma cópia, ou duas ou mais cópias de um gene podem ser introduzidas. Por exemplo, realizando-se a recombinação homóloga usando uma sequência que está presente em múltiplas cópias em um cromossomo como um alvo, as múltiplas cópias de um gene podem ser introduzidas no cromossomo. Os exemplos de tal sequência que está presente nas múltiplas cópias em um cromossomo incluem DNAs repetitivos, e repetições invertidas localizadas em ambas extremidades de um transposon. Alternativamente, a recombinação homóloga pode ser realizada usando uma sequência apropriada em um cromossomo tal como um gene desnecessário para a produção da substância alvo como um alvo. A recombinação homóloga pode ser realizada, por exemplo, através de um método para usar um DNA linear tal como uma integração conduzida pro vermelho (Datsenko, K.A., and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 97: 6640-6645 (2000)), um método para usar um plasmídeo incluindo uma origem de replicação sensível à temperatura, um método para usar um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método para usar um vetor suicida que não inclui uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro, ou um método de tradução usando um fago. Além disso, um gene também pode ser aleatoriamente introduzido em um cromossomo usando um transposon ou Mini-Mu (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-109985, Patente U.S. No. 5.882.888, EP 805867 B1).
[000239] A introdução de um gene alvo em um cromossomo pode ser confirmada pela hibridização Southern usando uma sonda tendo uma sequência complementar ao gene integral ou uma parte deste, PCR usando iniciadores preparados com base na sequência do gene, ou outros.
[000240] Além disso, o número de cópias de um gene também pode ser aumentado introduzindo-se um vetor contendo o gene em um hospedeiro. Por exemplo, o número de cópias de um gene alvo pode ser aumentado ligando-se um fragmento de DNA contendo o gene alvo com um vetor que funciona em um hospedeiro para formar um vetor de expressão do gene, e transformando o hospedeiro com o vetor de expressão. O fragmento de DNA contendo o gene alvo pode ser obtido, por exemplo, por PCR usando o DNA genômico de um microrganismo tendo o gene alvo como o modelo. Como o vetor, um vetor autonomamente replicável na célula do hospedeiro pode ser usado. O vetor é preferivelmente um vetor de múltiplas cópias. Além disso, o vetor preferivelmente tem um marcador tal como um gene de resistência a antibióticos para a seleção do transformador. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor derivado de um plasmídeo bacteriano, um vetor derivado de um plasmídeo de levedura, um vetor derivado de um bacteriófago, cosmídeo, fagomídeo, ou outros. Os exemplos específicos de vetores autonomamente replicáveis na bactéria corineforme incluem pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); plasmídeos obtidos intensificando-se estes e tendo uma gene de resistência a drogas; o plasmídeo pCRY30 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 3-210184; plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, e pCRY3KX descritos na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-72876 e Patente U.S. No. 5.185.262; plasmídeos pCRY2 e pCRY3 descritos na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 1-191686; pAJ655, pAJ611, e pAJ1844 descritos na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 58-192900; pCG1 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-134500; pCG2 descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 58-35197; e pCG4 e pCG11 descritos na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 57-183799.
[000241] Quando um gene é introduzido, é suficiente que o gene seja expressivamente alojado pela bactéria da presente invenção. Especificamente, é suficiente que o gene seja introduzido de modo que este seja expressado sob controle por uma sequência promotora que funciona na bactéria da presente invenção. O promotor pode ser um promotor derivado do hospedeiro, ou um promotor heterógeno. O promotor pode ser o promotor nativo do gene a ser introduzido, ou um promotor de outro gene. Como o promotor, por exemplo, tal promotor mais potente como mencionado posteriormente também pode ser usado.
[000242] Um terminador para a terminação da transcrição genética pode estar localizado a jusante do gene. o terminador não é particularmente limitado contanto que este funcione na bactéria da presente invenção. O terminador pode ser um terminador derivado do hospedeiro, ou um terminador heterogêneo. O terminador pode ser o terminador nativo do gene a ser introduzido, ou um terminador de outro gene. Os exemplos específicos do terminador incluem, por exemplo, um terminador trpA.
[000243] Os vetores, promotores, e terminadores disponíveis em vários microrganismos são descritos em detalhes em “Fundamental Microbiology Vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987”, e estes podem ser usados.
[000244] Além disso, quando dois ou mais dos genes são introduzidos, é suficiente que os genes sejam cada um expressivamente alojados pela bactéria da presente invenção. Por exemplo, todos os genes podem ser carregados por um vetor de expressão único ou um cromossomo. Além disso, os genes podem ser separadamente carregados por dois ou mais vetores de expressão, ou separadamente carregados por um único ou dois ou mais vetores de expressão e um cromossomo. Um operon constituído por dois ou mais genes também pode ser introduzido. O caso de “introduzir dois ou mais genes” inclui, por exemplo, casos de introduzir os respectivos genes que codificam dois ou mais tipos de enzimas, introduzindo-se os respectivos genes que codificam dois ou mais subunidades que constituem um complexo de enzima único, e uma combinação dos cases antecedentes.
[000245] O gene a ser introduzido não é particularmente limitado, contanto que este codifique uma proteína que funciona no hospedeiro. O gene a ser introduzido pode ser um gene derivada do hospedeiro, ou pode ser um gene heterogêneo. O gene a ser introduzido pode ser obtido, por exemplo, por PCR usando os iniciadores indicados com base na sequência de nucleotídeos do gene, e usando o DNA genômico de um organismo tendo o gene, um plasmídeo que carrega o gene, ou outros como um modelo. O gene a ser introduzido também pode ser totalmente sintetizado, por exemplo, com base na sequência de nucleotídeos do gene (Gene, 60(1), 115-127 (1987)).
[000246] Além disso, quando uma proteína funciona como um complexo consistindo em uma pluralidade de subunidades, uma parte ou toda a pluralidade de subunidades pode ser modificada, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente aumentada. Isto é, por exemplo, quando a atividade de uma proteína é intensificada aumentando-se a expressão de um gene, a expressão de uma parte ou de toda a pluralidade dos genes que codificam as subunidades pode ser intensificada. É geralmente preferível intensificar a expressão de toda a pluralidade de genes que codificam as subunidades. Além disso, as subunidades que constituem o complexo podem ser derivadas de um tipo único de organismo ou dois ou mais tipos de organismos, contanto que o complexo tenha uma função da proteína objetivo. Isto é, por exemplo, os genes do mesmo organismo que codificam uma pluralidade de subunidades podem ser introduzidos em um hospedeiro, ou os genes de diferentes organismos que codificam uma pluralidade de subunidades podem ser introduzidos em um hospedeiro.
[000247] Além disso, a expressão de um gene pode ser aumentada melhorando-se a eficiência de transcrição do gene. A eficiência de transcrição de um gene pode ser melhorada, por exemplo, substituindo-se o promotor de gene em um cromossomo com um promotor mais potente. O “promotor mais potente” significa um promotor que fornece uma transcrição melhorada de um gene comparado com um promotor de gene do tipo selvagem inerentemente existente. Os exemplos de promotores mais potentes úteis na bactéria corineforme incluem o promotor de P54-6 artificialmente modificado (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)), promotores de pta, aceA, aceB, adh, e amyE indutíveis na bactéria corineforme com ácido acético, etanol, ácido pirúvico, ou outros, promotores de cspB, SOD, e tuf (EF-Tu) promotores, que são promotores potentes capazes de fornecer uma grande quantidade de expressão na bactéria corineforme (Journal of Biotechnology, 104 (2003) 311-323; Appl. Environ. Microbiol., 2005 Dez; 71 (12): 8587-96), bem como o promotor de lac, promotor de tac, e promotor de trc. Além disso, como o promotor mais potente, um tipo altamente ativo de um promotor existente também pode ser obtido usando-se vários genes repórter. Por exemplo, tornando-se as regiões -35 e -10 em uma região promotora próxima à sequência de consenso, a atividade do promotor pode ser intensificada (WO00/18935). Os exemplos de promotor do tipo altamente ativo incluem vários promotores semelhantes a tac (Katashkina JI et al., Pedido de Patente da Federação Russa No. 2006134574) e promotor de pnlp8 (WO2010/027045). Os métodos para avaliar a potência dos promotores e exemplos de promotores potentes são descritos nos documentos da Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)), e assim por diante.
[000248] Adicionalmente, a expressão de um gene pode ser aumentada pelo melhoramento da eficiência de tradução do gene. A eficiência de tradução de um gene pode ser melhorada, por exemplo, substituindo-se a sequência de Shine-Dalgarno (SD) (também indicada como sítio de ligação de ribossomos (RBS)) para o gene em um cromossomo com uma sequência SD mais potente. A “sequência de SD mais potente” significa uma sequência de SD que fornece uma tradução melhorada do mRNA comparado com a sequência de SD do gene tipo selvagem inerentemente existente. Os exemplos de sequências de SD mais potentes incluem, por exemplo, RBS do gene 10 derivado de fago T7 (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). Além disso, é conhecido que a substituição, inserção, ou exclusão de vários nucleotídeos em uma região espaçadora entre o RBS e o códon de partida, especialmente em uma sequência imediatamente a montante do códon de partida (5’-UTR), afeta significantemente a estabilidade e a eficiência de tradução do mRNA, e consequentemente, a eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada modificando-a.
[000249] Estas sequências de controle de expressão podem ser modificadas, por exemplo, através de um método para usar um vetor sensível à temperatura, ou o método de integração conduzido por vermelho (WO2005/010175).
[000250] A eficiência de tradução de um gene também pode ser melhorada, por exemplo, modificando-se os códons. Na Escherichia coli etc., uma clara tendência de códon existe entre os códons do aminoácido 61 encontrados dentro da população de moléculas de mRNA, e o nível de tRNA cognato parece diretamente proporcional à frequência do uso do códon (Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6 (5), 494-500 (1995)). Isto é, se existe uma grande quantidade de mRNA contendo uma quantidade em excesso de códons raros, um problema de tradução pode surgir. De acordo com as pesquisas recentes, é sugerido que os clusters dos códons AGG/AGA, CUA, AUA, CGA, ou CCC podem especialmente reduzir tanto a quantidade quanto a qualidade de uma proteína sintetizada. Tal problema ocorre especialmente na hora da expressão de um gene heterólogo. Portanto, no caso da expressão heterogênea de um gene ou outros, a eficiência de tradução do gene pode ser melhorada substituindo-se um códon raro presente no gene com um códon sinônimo mais frequentemente usado. Os códons podem ser substituídos, por exemplo, através do método de mutação de sítio específico para introduzir uma mutação objetiva em um sítio objetivo do DNA. Os exemplos do método de mutação de sítio específico incluem o método utilizando PCR (Higuchi, R., 61, in PCR Technology, Erlich, H.A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)), e o método utilizando fago (Kramer, W. and Frits, H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T.A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Alternativamente, um fragmento genético em que os códons objetivos são substituídos pode ser totalmente sintetizado. As frequências de códons em vários organismos são descritos no “Codon Usage Database” (http: //www.kazusa.ou.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)).
[000251] Além disso, a expressão de um gene também pode ser aumentada amplificando-se um regulador que intensifica a expressão do gene, ou excluindo ou atenuando um regulador que reduz a expressão do gene.
[000252] Tais métodos para intensificar a expressão do gene como acima mencionados podem ser usados independentemente ou em uma combinação arbitrária.
[000253] Além disso, a modificação que intensifica a atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, intensificando-se a atividade específica da enzima. A intensificação da atividade específica também inclui a dessensibilização à inibição pela retroalimentação. Isto é, quando uma proteína é submetida à inibição da retroalimentação pela um metabólito, a atividade da proteína pode ser aumentada fazendo com que a bactéria abrigue um gene que codifica uma proteína mutante a qual foi dessensibilizada para a inibição pela retroalimentação. Na presente invenção, “dessensibilização à inibição pela retroalimentação” inclui a atenuação e eliminação da inibição pela retroalimentação. Uma proteína que apresenta uma atividade específica intensificada pode ser obtida, por exemplo, procurando-se vários organismos. Além disso, um tipo altamente ativo de uma proteína existente também pode ser obtida introduzindo-se uma mutação na proteína existente. A mutação a ser introduzida pode ser, por exemplo, a substituição, exclusão, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições da proteína. A mutação pode ser introduzida, por exemplo, através de tal método de mutação de sítio específico como mencionado acima. A mutação também pode ser introduzida, por exemplo, através de um tratamento de mutagênese. Os exemplos de tratamentos de mutagênese incluem irradiação de raio X, irradiação de ultravioleta, e um tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS), e metanossulfonato de metila (MMS). Além disso, uma mutação aleatória pode ser introduzida tratando-se diretamente o DNA in vitro com hidroxilamina. A intensificação da atividade específica pode ser independentemente usada, ou pode ser usada em uma combinação arbitrária com tais métodos para aumentar a expressão do gene como mencionado acima.
[000254] O método para a transformação não é particularmente limitado, e os métodos convencionalmente conhecidos podem ser usados. Pode ser usado, por exemplo, um método de tratar as células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade destas para o DNA, que foi indicado para Escherichia coli cepa K-12 (Mandel, M. And Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159-162), e um método de preparar células competentes a partir das células que estão na fase de crescimento, seguido pela transformação com DNA, que foi indicado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1977, 1: 153-167). Alternativamente, também pode ser usado um método de tornar as células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver o DNA recombinante, seguido pela introdução de um DNA recombinante nas células receptoras de DNA, que é conhecido ser aplicável ao Bacillus subtilis, actinomicetes, e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168: 111-115; Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A., 1978, Nature, 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 75: 1929-1933). Além disso, o método de pulso elétrico indicado para a bactéria corineforme (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-207791) também pode ser usado.
[000255] Um aumento na atividade de uma proteína pode ser confirmado pela medição da atividade da proteína.
[000256] Um aumento na atividade de uma proteína também pode ser confirmado através da confirmação de um aumento na expressão de um gene que codifica a proteína. Um aumento na expressão de um gene pode ser confirmado através da confirmação de um aumento na quantidade de transcrição do gene, ou confirmando-se um aumento na quantidade de uma proteína expressada a partir do gene.
[000257] Um aumento da quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmado comparando-se a quantidade de mRNA transcrito do gene com aquele de uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem ou cepa precursora. Os exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização Northern, RT-PCR, e assim por diante (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA), 2001). A quantidade de mRNA pode aumentar, por exemplo, 1,5 vez ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, se comparado com aquela de uma cepa não modificada.
[000258] Um aumento na quantidade de uma proteína pode ser confirmado por Western blotting usando anticorpos (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (EUA), 2001). A quantidade da proteína pode aumentar, por exemplo, 1,5 vez ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, se comparado com aquela de uma cepa não modificada.
[000259] Os métodos acima mencionados para intensificar a atividade de uma proteína podem ser usados for a intensificação das atividades de proteínas arbitrárias tais como enzimas de biossíntese de L-aminoácido, e intensificação da expressão dos genes arbitrários tais como os genes que codificam aquelas proteínas arbitrárias.
<2> Método para produzir substância alvo <2-1> Método para produzir a substância alvo
[000260] O método da presente invenção é um método para produzir uma substância alvo compreendendo cultivar a bactéria da presente invenção em um meio contendo xilose para produzir e acumular a substância alvo no meio ou células da bactéria, e coletar a substância alvo do meio ou células. Na presente invenção, um tipo da substância alvo pode ser produzido, ou dois ou mais tipos de substâncias alvo podem ser produzidos.
[000261] O meio a ser usado não é particularmente limitado, contando, naquele contendo xilose, a bactéria da presente invenção pode se proliferar neste, e uma substância alvo pode ser produzida. Como o meio, por exemplo, um meio habitual usado para a cultura de bactérias e assim por diante pode ser usado. O meio pode conter, além de xilose, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de fostato, e fonte de enxofre, bem como os componentes selecionados de outros vários componentes orgânicos e componentes inorgânicos como necessário. Os tipos e concentrações dos componentes do meio podem ser apropriadamente determinados de acordo com várias condições tais como o tipo de bactéria a ser usada e o tipo da substância alvo a ser produzida.
[000262] Como xilose, xilose pura tal como xilose purificada pode ser usada, ou uma mistura contendo xilose e outros componentes pode ser usada. Os exemplos de tal mistura incluem os hidrolisados de biomassa vegetal. Tal biomassa vegetal não é particularmente limitada contanto que esta contenha xilose como um açúcar constituinte. Os exemplos de biomassa vegetal incluem biomassa de madeira e biomassa de ervas. Os exemplos específicos de biomassa vegetal incluem, por exemplo, palha de arroz, palhiço, e bagaço de cana de açúcar. Submetendo-se a biomassa vegetal a um tratamento como o tratamento de decomposição hidrotérmica, hidrólise de ácido concentrado, hidrólise de ácido diluído, hidrólise com uma enzima tal como celulose, e tratamento alcalino, um produto processado contendo xilose pode ser obtido. Tal produto processado pode ser usado como a fonte de carbono, como esta é, ou depois de ser submetida à purificação etc., apropriadamente.
[000263] Como o método para tratar a biomassa vegetal, o tratamento de decomposição hidrotérmica é preferido. A biomassa vegetal pode ser submetida a um tratamento tal como tratamento de decomposição hidrotérmica, como esta é, ou depois de ser submetida a um pré-tratamento tal como vaporização e jateamento, apropriadamente. Por exemplo, a biomassa vegetal pode ser triturada em um tamanho de 5 mm ou menor, e depois ser submetida a um tratamento tal como tratamento de decomposição hidrotérmica. A decomposição hidrotérmica pode ser realizada usando-se, por exemplo, água quente pressurizada de preferivelmente 175 a 240°C, mais preferivelmente de 200 a 230°C. Visto que os componentes de hemicelulose, celulose, e componentes de lignina dissolvem em temperaturas em torno de 140°C ou maiores, em torno de 230°C ou maiores, e em torno de 140°C ou maiores, respectivamente, uma temperatura dentro das faixas acima mencionadas é preferida para dissolver suficientemente os componentes de hemicelulose.
[000264] O tratamento de decomposição hidrotérmica acima mencionado pode ser realizado comunicando-se contracorrentemente a biomassa vegetal com água quente pressurizada. Tal tratamento pode ser realizado usando-se os instrumentos descritos nas Patentes Japonesas Nos. 4436429, 4524351, e 4427583. Através do tratamento de decomposição hidrotérmica da biomassa vegetal, os componentes de lignina e componentes de hemicelulose são transferidos em água quente a partir da biomassa vegetal, e os componentes de celulose permanecem como conteúdo sólido.
[000265] A pressão de reação do tratamento de decomposição hidrotérmica é preferivelmente maior do que a pressão do vapor de saturação da água na temperatura selecionada por 0,1 a 0,5 MPa, de modo que a água no interior do instrumento se torne água quente pressurizada. O tempo de reação é geralmente de 20 minutos ou mais curto, preferivelmente de 3 a 15 minutos.
[000266] Depois, a água quente é separada do conteúdo sólido, e a hemicelulose contida na água quente é submetida a um tratamento de sacarificação. A sacarificação da hemicelulose pode ser realizada através da decomposição enzimática usando uma enzima de sacarificação, ou através da decomposição do ácido sulfúrico usando ácido sulfúrico. Na presente invenção, a decomposição enzimática é preferida.
[000267] A enzima de sacarificação não é particularmente limitada contanto que uma enzima de sacarificação que pode decompor a hemicelulose para gerar xilose é escolhida. Os exemplos específicos da enzima de sacarificação incluem hemicelulose. A hemicelulose é um termo genérico para se referir às enzimas que catalisam a hidrólise das ligações glicosídicas contidas na hemicelulose. A hemicelulose significa os polissacarídeos que constituem paredes celulares de células de plantas terrestres exceto para a celulose e pectina, e o componente principal da hemicelulose é xylAn. XylAn é um heteropolissacarídeo consistindo em uma estrutura compreendendo xilose como um açúcar constituinte, e cadeias laterais compreendendo arabinose etc. e que se ligam à estrutura. Os componentes principais da hemicelulose são endo-1,4-β-xylAnase (EC 3,2,1,8), β-1,4-xilosidase (EC 3,2,1,37), e assim por diante, mas a hemicelulose também contém outras enzimas de hidrólise de ligação glicosídica. Os exemplos de hemiceluloses comercialmente disponíveis incluem Cellic Htec (Novozymes), e assim por diante. Spezyme CP (Genencor, derivada de Trichoderma reesei), que é uma celulose, Novozyme 188 (Novozyme, derivada de Aspergillus niger), que é uma β- glicosidase, e assim por diante também podem ser usadas como hemicelulose. Se estas enzimas são feitas para agir na hemicelulose, a xilose, arabinose e assim por diante são geradas. Além disso, não somente a hemicelulose, mas também a celulose pode ser transferida à ou contaminar a água quente, e portanto, a glicose pode ser gerada pelo tratamento de sacarificação. Na presente invenção, tais subprodutos como a glicose obtida pelo tratamento de sacarificação também podem ser usados como uma fonte de carbono, além da xilose.
[000268] A reação enzimática pode ser realizada de em um solvente aquoso apropriado tal como água e tampões. O solvente usado para a reação enzimática pode ser a água usada para o tratamento hidrotérmico em si. As condições de reação, tais como temperatura de reação e pH, podem ser como descritas na descrições anexas às enzimas comercialmente disponíveis, ou apropriadamente determinada realizando-se experiências preliminares etc. Por exemplo, quando Spezyme CP ou Novozyme 188 mencionados acima são usados, os exemplos das condições de reação são condições de 45 a 60°C e pH de 4,5 a 6,5. A quantidade da enzima pode ser geralmente de 20 a 120 FPU (unidade de papel de filtro) com base na quantidade sólida de substrato, e o tempo de reação pode ser geralmente de, por exemplo, 24 a 144 horas. A reação enzimática pode ser estaticamente realizada, ou pode ser realizada com agitação. Além disso, antes da reação enzimática, um pré-tratamento tal como delignificação e decomposição parcial de hemicelulose pode ser realizado.
[000269] Quando a sacarificação é realizada através da decomposição do ácido sulfúrico, a concentração do ácido sulfúrico pode ser geralmente de 0,1 a 5% em peso, preferivelmente de 1 a 4% em peso. A temperatura de decomposição pode ser geralmente de 100 a 140°C, preferivelmente em torno de 120°C. O tempo de decomposição pode ser geralmente de 30 minutos a 3 horas, preferivelmente em torno de 1 hora. Depois da decomposição, ácido sulfúrico pode ser removido por um tratamento de resina de troca de íons, ou outros.
[000270] A solução de açúcar contendo xilose obtida através do tratamento de sacarificação pode ser usada como a fonte de carbono, como esta é, ou depois de ser submetida a tal tratamento como concentração, diluição, secagem, fracionamento, e purificação, apropriadamente. Por exemplo, um componente tal como xilose pode ser purificado a partir da solução de açúcar a um grau desejado, e depois usada como a fonte de carbono.
[000271] A solução de açúcar obtida através do tratamento de sacarificação pode conter substâncias que inibem o crescimento e metabolismo de microrganismos. Tais substâncias inibidoras são principalmente substâncias não sacarídeas não voláteis tendo um peso molecular de 3000 ou menor. Portanto, é preferido que a solução de açúcar fosse submetida a um tratamento para remover tais substâncias inibidoras, e depois usada como a fonte de carbono. Os exemplos do tratamento para remover tais substâncias inibidoras incluem tratamento adsorvente, filtração por gel, tratamento em membrana, e assim por diante. A solução de açúcar pode ser submetida a um tratamento para remover substâncias inibidoras, como esta é, ou depois de ser submetida à concentração ou diluição, apropriadamente.
[000272] Os exemplos de adsorventes que podem ser usados para o tratamento adsorvente incluem, por exemplo, carbono ativado, resinas de troca de íons, resinas adsorvíeis sintéticas, zeólito, e gel de sílica. O adsorvente é preferivelmente um adsorvente que adsorve seletivamente tais substâncias inibidoras como mencionado acima. Embora o tratamento adsorvente possa ser realizado como um tratamento de batelada ou usando-se uma coluna, é preferível usar uma coluna. No caso do tratamento de batelada, o adsorvente é colocado em um recipiente contendo a solução de açúcar, e depois o adsorvente e a solução de açúcar são separados. Quando uma coluna é usada, a solução de açúcar é escoada através de uma coluna enchida com o adsorvente, uma solução de lavagem é escoada através da coluna se necessário, o fluxo da solução (fração não adsorvida) é coletado. O tratamento adsorvente pode ser realizado somente uma vez, ou pode ser repetido duas vezes ou mais. Além disso, um tipo da adsorvente pode ser usado, ou dois ou mais tipos de adsorventes podem ser usados em combinação para o tratamento adsorvente.
[000273] A solução de açúcar a partir da qual as substâncias inibidoras são removidas pode ser usada como a fonte de carbono, como é, ou depois de ser submetida à concentração, diluição, secagem, fracionamento, purificação, etc., apropriadamente.
[000274] Vários componentes gerados pelo tratamento de sacarificação também podem ser submetidos à isomerização, decomposição, ou outros através de uma reação química ou reação enzimática dependendo do tipo de uso.
[000275] O conteúdo sólido que restou depois que a água quente foi separada de uma matéria prima biomassa submetida ao tratamento hidrotérmico também pode ser usado. Isto é, se a celulose em tal conteúdo sólido é enzimaticamente tratada com celulose ou outros, uma solução de açúcar contendo hexoses tal como glicose pode ser obtida. Além da xilose, tal solução de açúcar ou um produto processado desta pode ser usada como a fonte de carbono.
[000276] No método da presente invenção, a xilose pode ser ou pode não ser usada como uma fonte única de carbono. Isto é, no método da presente invenção, além da xilose, outra fonte de carbono pode ser usada juntamente. A outra fonte de carbono não é particularmente limitada, contanto que a bactéria da presente invenção possa ser utilizada, e uma substância alvo possa ser produzida. Os exemplos específicos da outra fonte de carbono incluem, por exemplo, sacarídeos tais como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, arabinose, melaços negros, hidrolisado de amido, e hidrolisado de biomassa, ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido succínico, e ácido málico, álcoois tais como glicerol, glicerol bruto, etanol, e ácidos alifáticos. Quando outra fonte de carbono é usada, a razão de xilose na fonte de carbono total pode ser, por exemplo, de 5% em peso ou mais, de 10% em peso ou mais, ou de 20% em peso ou mais, preferivelmente de 30% em peso ou mais, mais preferivelmente de 50% em peso ou mais. Como a outra fonte de carbono, um tipo da fonte de carbono pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de carbono podem ser usados em combinação.
[000277] A concentração da fonte de carbono no meio não é particularmente limitada, de modo que a bactéria da presente invenção possa proliferar no meio, e uma substância alvo possa ser produzida. A concentração da fonte de carbono no meio é preferivelmente tornada tão alta quanto possível em tal faixa que a produção da substância alvo não seja inibida. A concentração inicial da fonte de carbono no meio pode ser , por exemplo, geralmente de 1 a 30% (P/V), preferivelmente de 3 a 10% (P/V). Junto com o consumo da fonte de carbono acompanhando o progresso da fermentação, a fonte de carbono pode ser suplementarmente adicionada.
[000278] Os exemplos específicos da fonte de nitrogênio incluem, por exemplo, sais de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio, fontes orgânicas de nitrogênio tal como peptona, extrato de levedura, extrato de carnes, e produtos de decomposição de proteína de soja, amônia e ureia. O gás de amônia ou a amônia aquosa usada para ajustar o pH também pode ser usado como a fonte de nitrogênio. Como a fonte de nitrogênio, um tipo simples de fonte de nitrogênio pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de nitrogênio podem ser usados em combinação.
[000279] Os exemplos específicos da fonte de fostato incluem, por exemplo, sais de ácido fosfórico tais como di-hidrogeno fosfato de potássio e hidrogeno fosfato de dipotássio, e polímeros do ácido fosfórico tal como ácido pirofosfórico. Como a fonte de fostato, um tipo único de fonte de fostato pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de fostato podem ser usados em combinação.
[000280] Os exemplos específicos da fonte de enxofre incluem, por exemplo, compostos inorgânicos de enxofre, tais como sulfatos, tiossulfatos, e sulfitos, e aminoácidos contendo enxofre tais como cisteína, cistina e glutationa. Como a fonte de enxofre, um tipo único de fonte de enxofre pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de enxofre podem ser usadas em combinação.
[000281] Os exemplos específicos de outros vários componentes orgânicos e componentes inorgânicos incluem, por exemplo, sais inorgânicos tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio; metais traço tais como ferro, manganês, magnésio, e cálcio; vitaminas tais como vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, e vitamina B12; aminoácidos; ácidos nucleicos; e componentes orgânicos contendo aqueles tais como peptona, ácido casamínico, extrato de levedura, e produto de decomposição da proteína de soja. Como outros vários componentes orgânicos e componentes inorgânicos, um tipo único de componente pode ser usado, ou dois ou mais tipos de componentes podem ser usados em combinação.
[000282] Além disso, quando uma auxotrófica mutante que requer um aminoácido ou outros parta o crescimento desta é usada, é preferível suplementar um nutriente necessário ao meio. Por exemplo, em muitas das bactérias que produzem L-lisina, a via biossintética de L-lisina é intensificado e a capacidade de degradação da L-lisina é atenuada. Portanto, quando tal bactéria que produz L-lisina é cultivada, por exemplo, um ou mais tipos de aminoácidos selecionados de L-treonina, L-homosserina, L-isoleucina, e L- metionina são preferivelmente adicionados ao meio.
[000283] Além disso, quando o ácido L-glutâmico é produzido através do uso de uma bactéria corineforme, é preferível, por exemplo, restringir a quantidade de biotina no meio, ou adicionar um tensoativo ou penicilina ao meio. Também é preferível adicionar uma quantidade apropriada de um agente antiespuma comercialmente disponível ao meio de modo a inibir a espumação na hora da cultura.
[000284] As condições de cultivo não são particularmente limitadas, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar, e uma substância alvo possa ser produzida. A cultura pode ser realizada com, por exemplo, condições habituais usadas para a cultura de bactérias corineformes. As condições de cultivo podem ser apropriadamente determinadas dependendo de várias condições, tal como o tipo de bactéria a ser usada e o tipo de substância alvo a ser produzida.
[000285] A cultura pode ser realizada usando um meio líquido. Na hora da cultura, a bactéria da presente invenção cultivada em um meio sólido tal como meio de ágar pode ser diretamente inoculada em um meio líquido, ou a bactéria da presente invenção cultivada em um meio líquido como cultura de semente pode ser inoculada em um meio líquido para a cultura principal. Isto é, a cultura pode ser realizada como cultura de semente em separado e cultura principal. Em tal caso, as condições de cultivo da cultura de semente e da cultura principal podem ser as mesmas ou não. A quantidade da bactéria da presente invenção contida no meio na hora do início da cultura não é particularmente limitada. Por exemplo, um caldo de cultura de semente que apresenta uma OD660 de 4 a 8 pode ser adicionada a um meio para a cultura principal em uma razão de 0,1 a 30% em massa, preferivelmente de 1 a 10% em massa, na hora do início da cultura.
[000286] A cultura pode ser realizada como cultura por lote, cultura por lote alimentado, cultura contínua, ou uma combinação destes. O meio usado na hora do início da cultura também é indicado como “meio de partida”. O meio fornecido a um sistema de cultura (tanque de fermentação) na cultura por lote alimentado ou cultura contínua também é indicado como “meio de alimentação”. Além disso, fornecer um meio de alimentação a um sistema de cultura na cultura por lote alimentado ou cultura contínua também é indicado como “alimentação”. Além disso, quando a cultura é realizada como cultura de semente em separado e cultura principal, por exemplo, tanto a cultura de semente quanto a cultura principal podem ser realizadas como cultura por lote. Alternativamente, por exemplo, a cultura de semente pode ser realizada como cultura por lote, e a cultura principal pode ser realizada como cultura por lote alimentado ou cultura contínua.
[000287] Na presente invenção, os componentes do meio, podem cada um estar contidos no meio de partida, meio de alimentação, ou ambos. Os tipos de componentes contidos no meio de partida podem ser ou podem não ser os mesmos que os tipos dos componentes contidos no meio de alimentação. A concentração de cada componente contida no meio de partida pode ser ou pode não ser a mesma que a concentração do componente contido no meio de alimentação. Além disso, dois ou mais tipos de meios de alimentação contendo diferentes tipos e/ou diferentes concentrações de componentes podem ser usados. Por exemplo, quando o meio é intermitentemente alimentado uma pluralidade de vezes, os tipos e/ou concentrações dos componentes contidos no meio de alimentação podem ser ou podem não ser os mesmos.
[000288] A concentração da xilose no meio não é particularmente limitada, contanto que a bactéria da presente invenção possa usar xilose como a fonte de carbono. A xilose pode ser contida no meio em uma concentração de por exemplo, 10% p/v ou menor, preferivelmente 5% p/v ou menor, mais preferivelmente 2% p/v ou menor. Além disso, a xilose pode estar contida no meio em uma concentração de, por exemplo, 0,2% p/v ou maior, preferivelmente 0,5% p/v ou maior, mais preferivelmente 1,0% p/v ou maior. A xilose pode estar contida no meio de partida, meio de alimentação, ou ambos, em uma concentração dentro da faixa exemplificada acima.
[000289] Quando a xilose está contida no meio de alimentação, a xilose pode estar contida no meio de alimentação em tal concentração que, por exemplo, a concentração de xilose no meio depois da alimentação é de 5% p/v ou menor, preferivelmente de 2% p/v ou menor, mais preferivelmente de 1% p/v ou menor. Quando a xilose está contida no meio de alimentação, a xilose pode estar contida no meio de alimentação em tal concentração que, por exemplo, a concentração de xilose no meio depois da alimentação de 0,01% p/v ou maior, preferivelmente de 0,02% p/v ou maior, mais preferivelmente de 0,05% p/v ou maior.
[000290] Quando a xilose é usada como uma fonte única de carbono, a xilose pode estar contida em uma concentração dentro da faixa exemplificada acima. Quando outra fonte de carbono é juntamente usada, a xilose também pode estar contida em uma concentração dentro da faixa exemplificada acima. Quando outra fonte de carbono é juntamente usada, a xilose também pode estar contida em uma concentração dentro de uma faixa definida modificando-se apropriadamente a faixa exemplificada acima com base, por exemplo, na razão de xilose na fonte de carbono total, ou outros.
[000291] A xilose pode estar ou pode não estar contida dentro de uma certa faixa durante o período total de cultura. Por exemplo, a xilose pode estar em estado de falta durante um período parcial da cultura. O termo “estar em estado de falta” significa que a quantidade de xilose é menor do que a quantidade necessária, e pode significar, por exemplo, que a concentração no meio se torna zero. O termo “período parcial da cultura” pode se referir a, por exemplo, 1% ou menos, 5% ou menos, 10% ou menos, 20% ou menos, 30% ou menos, ou 50% ou menos do período total da cultura. Quando a cultura é realizada como cultura de semente e cultura principal separadas, o termo “período total da cultura” pode significar o período total da cultura principal. É preferido que, durante um período em que a xilose está em estado de falta, outra fonte de carbono exista em uma quantidade suficiente. Mesmo se a xilose está em estado de falta durante um período parcial da cultura como descrito acima, a cultura realizada sob tal condição é incluída no escopo da expressão “cultura de bactéria em um meio contendo xilose”, contanto que exista um período de cultura onde a cultura é realizada em um meio contendo xilose.
[000292] A concentração de vários componentes tais como xilose pode ser medida através da cromatografia gasosa (Hashimoto, K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996, 70: 22-30) ou HPLC (Lin, J.T. et al., J. Chromatogr. A., 1998, 808: 43-49).
[000293] A cultura pode ser, por exemplo, aerobiamente realizada. Por exemplo, a cultura pode ser realizada como cultura de aeração ou cultura de agitação. A concentração de oxigênio pode ser controlada para ser, por exemplo, de 5 a 50%, preferivelmente de cerca de 10%, da concentração de oxigênio saturada. O pH do meio pode ser, por exemplo, de 3 a 10, preferivelmente de 4,0 a 9,5. Durante a cultura, o pH do meio pode ser ajustado como necessário. O pH do meio pode ser ajustado usando-se várias substâncias alcalinas e ácidas, tais como gás de amônia, amônia aquosa, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio e hidróxido de magnésio. A temperatura de cultura pode ser, por exemplo, de 20 a 45°C, preferivelmente de 25 a 37°C. O período de cultura pode ser, por exemplo, de 10 a 120 horas. A cultura pode ser continuada, por exemplo, até a fonte de carbono contida no meio ser consumida, ou até a bactéria da presente invenção perder a atividade. Através do cultivo da bactéria da presente invenção sob tais condições como descritas acima, uma substância alvo é acumulada nas células da bactéria e/ou no meio.
[000294] Na cultura de lote alimentado ou cultura contínua, a alimentação do meio de alimentação pode ser continuada durante o período total da cultura ou somente durante um período parcial da cultura. Na cultura de lote alimentado ou cultura contínua, a alimentação pode ser intermitentemente realizada uma pluralidade de vezes.
[000295] Quando a alimentação é intermitentemente realizada uma pluralidade de vezes, a alimentação pode ser repetidamente iniciada e interrompida de modo que o período para o tempo de alimentação seja, por exemplo, de 30% ou mais curto, preferivelmente de 20% ou mais curto, mais preferivelmente de 10% ou mais curto, do período total da alimentação da pluralidade de vezes.
[000296] Além disso, quando a alimentação é intermitentemente realizada uma pluralidade de vezes, a concentração da fonte de carbono no meio de fermentação também pode ser automaticamente mantida em um baixo nível controlando-se a alimentação de modo que a segunda alimentação e as alimentações seguintes sejam iniciadas quando a fonte de carbono no meio de fermentação é esgotada nos períodos de não alimentação imediatamente antes das respectivas alimentações (Patente U.S. No. 5.912.113). O esgotamento da fonte de carbono pode ser detectado com base, por exemplo, na elevação do pH, ou elevação da concentração de oxigênio dissolvido.
[000297] Na cultura contínua, a extração do meio de cultura pode ser continuada durante o período total da cultura ou somente durante um período parcial da cultura. Além disso, na cultura contínua, a extração do meio de cultura pode ser intermitentemente realizada uma pluralidade de vezes. A extração e alimentação do meio de cultura podem ser ou não podem ser simultaneamente realizadas. Por exemplo, depois de extrair o meio de cultura, a alimentação pode ser realizada, ou depois de realizar a alimentação, o meio de cultura pode ser extraído. É preferido que o volume do meio de cultura a ser extraído seja igual ao volume do meio a ser alimentado. A expressão “o volume do meio de cultura a ser extraído é igual ao volume do meio a ser alimentado em um volume igual” mencionada acima pode significar que o volume do meio de cultura a ser extraído seja, por exemplo, de 93 a 107% do volume do meio a ser alimentado.
[000298] Quando o meio de cultura é continuamente extraído, a extração é preferivelmente iniciada no mesmo tempo que ou depois do início da alimentação. Por exemplo, dentro de 5 horas, preferivelmente 3 horas, mais preferivelmente 1 hora, depois do início da alimentação, a extração pode ser iniciada.
[000299] Quando o meio de cultura é intermitentemente extraído, é preferido que, quando a concentração de substância alvo atinge um nível pré- determinado, uma parte do meio de cultura é extraído para coletar a substância alvo, e depois um meio fresco é alimentado para continuar a cultura.
[000300] Além disso, depois da substância alvo ser coletada do meio de cultura extraído, as células podem ser reutilizadas reciclando-se o resíduo de filtração contendo as células no tanque de fermentação (Patente Francesa No. 2669935).
[000301] Além disso, quando o ácido L-glutâmico é produzido, a cultura pode ser realizada usando-se um meio líquido ajustado para satisfazer uma condição sob a qual que o ácido L-glutâmico é precipitado, enquanto precipitando o ácido L-glutâmico no meio. Os exemplos das condições sob as quais o ácido L-glutâmico é precipitado incluem, por exemplo, pH de 5,0 a 3,0, preferivelmente pH de 4,9 a 3,5, mais preferivelmente pH de 4,9 a 4,0, de maneira particularmente preferível um pH em torno de 4,7 (EP 1078989 A). A cultura pode ser realizada em um valor de pH dentro das faixas acima mencionadas durante o período total da cultura, ou somente durante um período parcial da cultura. O termo “período parcial da cultura” pode se referir a, por exemplo, 50% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, ou 99% ou mais, do período total da cultura.
[000302] Quando um aminoácido básico tal como L-lisina é produzido, este pode ser utilizado em um método em que o aminoácido básico é produzido através da fermentação usando íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato como contra-íons principais para o aminoácido básico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2002-65287, Pedido Publicado de Patente U.S No. 20020025564, EP 1813677 A). Através de tal método, um aminoácido básico pode ser produzido enquanto reduzindo a(s) quantidade(s) de íons de sulfato e/ou íons de cloreto a ser usados, os quais foram convencionalmente usados como contra-íons para um aminoácido básico.
[000303] A produção da substância alvo pode ser confirmada através de método conhecidos usados para a exclusão ou identificação dos compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, HPLC, LC/MS, GC/MS e RMN. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada.
[000304] A substância alvo produzida pode ser coletada através de métodos conhecidos usados para a separação e purificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, método de resina de troca de íons, tratamento em membrana, precipitação e cristalização. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada. Quando a substância alvo é acumulada nas células bacterianas, as células bacterianas podem ser rompidas com, por exemplo, ondas ultrassônicas ou outros, e então a substância alvo pode ser coletada através do método de resina de troca de íons ou outros do sobrenadante obtido removendo-se as células da suspensão de célula rompida através da centrifugação. A substância alvo a ser coletada pode ser um composto livre, um sal deste, ou uma mistura deste. Os exemplos de sais incluem, por exemplo, sulfato, cloridreto, carbonato, sal de amônio, sal de sódio, e sal de potássio. Por exemplo, a L-lisina pode ser L-lisina livre, sulfato de L-lisina, cloridreto de L-lisina, carbonato de L-lisina, ou uma mistura destes. Além disso, por exemplo, o ácido L-glutâmico pode ser o ácido L-glutâmico livre, L-glutamato de sódio (L-glutamato monossódico, MSG), L-glutamato de amônio (L-glutamato de monoamônio), ou uma mistura destes. Por exemplo, no caso do ácido L-glutâmico, L-glutamato monossódico (MSG) pode ser obtido adicionando-se um ácido ao caldo de fermentação para cristalizar o L-glutamato de amônio neste contido, e depois adicionando um equimolar de hidróxido de sódio aos cristais. Além disso, a descoloração pode ser realizada usando-se carbono ativado antes e/ou depois da cristalização (ver, Tetsuya KAWAKITA, “Industrial Crystalization for Monosodium L-Glutamate”, Bulletin of the Society of Sea Water Science, Japão, Vol,56: 5). Além disso, por exemplo, os exemplos específicos de sal do ácido inosínico incluem inosinato de sódio (sal de dissódio 5’-IMP). Além disso, por exemplo, os exemplos específicos de sal do ácido guanílico incluem guanilato de sódio (sal de dissódio 5’-GMP).
[000305] Quando a substância alvo é precipitada no meio, esta pode ser coletada por centrifugação, filtração ou outros. A substância alvo precipitada no meio também pode ser isolada junto com a substância alvo dissolvendo no meio, depois a substância alvo dissolvendo no meio é cristalizada.
[000306] A substância alvo coletada pode conter tais componentes como células bacterianas, componentes de meio, umidade, e subprodutos metabólitos da bactéria além da substância alvo. A pureza da substância alvo coletada pode ser, por exemplo, 30% (p/p) ou maior, 50% (p/p) ou maior, 70% (p/p) ou maior, 80% (p/p) ou maior, 90% (p/p) ou maior, ou 95% (p/p) ou maior.
[000307] Quando o L-aminoácido é o ácido L-glutâmico, por exemplo, o cristal do L-glutamato monossódico pode ser usado como um tempero de umami. O cristal de L-glutamato monossódico pode ser usado como um tempero em combinação com um ácido nucleico tal como sal de dissódio de 5’-GMP e sal de dissódio de 5’-IMP, que também têm gosto de umami.
<2-2> Método para produzir nucleotídeo de purina
[000308] Quando um nucleosídeo de purina é produzido pela bactéria da presente invenção, um nucleotídeo de purina pode ser produzido pelo uso do nucleosídeo de purina. A presente invenção fornece assim um método para produzir um nucleotídeo de purina compreendendo cultivar a bactéria da presente invenção tendo uma capacidade de produzir nucleosídeo de purina em um meio para produzir e acumular o nucleosídeo de purina no meio, fosforilar o nucleosídeo de purina para gerar um nucleotídeo de purina, e coletar o nucleotídeo de purina.
[000309] Neste método, um nucleotídeo de purina que corresponde ao nucleosídeo de purina a ser usado é produzido. Isto é, por exemplo, ácido inosínico pode ser produzido a partir de inosina, ácido guanílico pode ser produzido a parti de guanosina, ácido xantílico pode ser produzido a partir de xantosina, e ácido adenílico pode ser produzido a partir de adenosina. Na presente invenção, um tipo de nucleotídeo de purina pode ser produzido, ou dois ou mais tipos de nucleotídeos de purina podem ser produzidos.
[000310] O nucleosídeo de purina pode ser fosforilado em um estado em que o mesmo esteja contido no meio, ou fosforilado depois que o mesmo é coletado do meio. O nucleosídeo de purina também pode ser fosforilado depois de ser submetido a um pré-tratamento, apropriadamente. Os exemplos do pré-tratamento incluem, por exemplo, purificação, diluição, concentração, cristalização, secagem, moagem, dissolução, e assim por diante. Estes pré- tratamentos podem ser realizados em uma combinação apropriada. Por exemplo, um caldo de cultura contendo um nucleosídeo de purina pode ser usado como tal para a fosforilação, ou um nucleosídeo de purina purificado a um grau desejado a partir de um tal caldo de cultura pode ser usado para a fosforilação.
[000311] O método para fosforilar o nucleosídeo de purina não é particularmente limitado. A fosforilação pode ser realizada, por exemplo, por métodos conhecidos.
[000312] A fosforilação pode ser realizada, por exemplo, quimicamente. Tal fosforilação química pode ser realizada usando-se um agente de fosforilação tal como cloreto de fosforila (POCl3) (Yoshikawa et al., Studies of phosphorylation, III, Selective phosphorylation of unprotected nucleosides, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1969, 42: 3505-3508).
[000313] A fosforilação também pode ser realizada usando-se, por exemplo, um microrganismo ou enzima. Isto é, permitindo-se que um microrganismo tendo uma capacidade de produzir nucleosídeo-5’-fosfato atue sobre um nucleosídeo de purina e um doador de fosfato, um nucleotídeo de purina pode ser produzido (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 07-231793). Além disso, permitindo-se que uma enzima de fosforilação atue sobre um nucleosídeo de purina e um doador de fosfato, um nucleotídeo de purina pode ser produzido.
[000314] Os exemplos específicos de microrganismos tendo uma capacidade de produzir nucleosídeo-5’-fosfato incluem, por exemplo, cepas tais como as mencionadas abaixo (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 07-231793). Escherichia blattae JCM 1650 Serratia ficaria ATCC 33105 Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC 33531) Klebsiella pneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724) Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC 33257) Morganella morganii IFO 3168 Enterobacter aerogenes IFO 12010 Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048) Chromobacterium fluviatile IAM 13652 Chromobacterium violaceum IFO 12614 Cedecea lapagei JCM 1684 Cedecea davisiae JCM 1685 Cedecea neteri JCM 5909
[000315] Os exemplos da enzima de fosforilação incluem, por exemplo, fosfatase, nucleosídeo cinase, e nucleosídeo fosfotransferase. A enzima de fosforilação pode ser uma enzima purificada ou não. Por exemplo, uma fração contendo uma enzima de fosforilação, tal como cultura de um microrganismo que produza a enzima de fosforilação, sobrenadante de cultura separado da cultura, células separadas da cultura, produto processado das células do microrganismo, e produtos destes parcialmente purificado, podem ser usados como a enzima de fosforilação.
[000316] Os exemplos da nucleosídeo cinase incluem, por exemplo, inosina-guanosina cinase. Os exemplos específicos de um método usando inosina-guanosina cinase incluem, por exemplo, o método para produzir um nucleotídeo de purina usando uma bactéria Escherichia introduzida com um gene que codifica a inosina-guanosina cinase de Escherichia coli (WO91/08286), e o método para produzir um nucleotídeo de purina usando Corynebacterium ammoniagenes introduzida com um gene que codifica inosina-guanosina cinase de Exiguobacterium acetilicum (WO96/30501).
[000317] Os Exemplos da fosfatase incluem, por exemplo, fosfatase ácida. Os exemplos de fosfatase ácida incluem, por exemplo, a fosfatase ácida descrita na Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2002-000289. Os exemplos preferidos de fosfatase ácida incluem, por exemplo, a fosfatase ácida mutante que apresenta afinidade aumentada aos nucleosídeos (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 10-201481), a fosfatase ácida mutante que apresenta atividade de nucleotidase reduzida (WO96/37603), e a fosfatase ácida mutante que apresenta atividade reduzida da hidrólise do éster do ácido fosfórico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2001-245676).
[000318] Os exemplos do doador de fosfato incluem, por exemplo, ácido polifosfórico, fosfato de fenila, fosfato de acetila, fosfato de carbamila, ATP, e dATP (desóxi-ATP). Os exemplos de ácido polifosfórico incluem, por exemplo, ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, e ácido hexametafosfórico. Os doadores de fosfato cada um pode ser um composto livre, um sal deste, ou uma mistura deles. Os exemplos do sal incluem, por exemplo, sal de sódio e sal de potássio. O doador de fosfato pode ser apropriadamente escolhido dependendo do tipo do microrganismo a ser usado e do tipo da enzima de fosforilação a ser usada, etc. Além disso, quando ATP ou dATP são usados como o doador de fosfato, um sistema de reciclagem para tal também pode ser usado em combinação (WO91/08286, WO96/30501).
[000319] A produção de um nucleotídeo de purina pode ser confirmada por métodos conhecidos usados para a detecção ou identificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, HPLC, LC/MS, GC/MS e RMN. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada.
[000320] O nucleotídeo de purina produzido pode ser coletado pelos métodos conhecidos usados para a separação e purificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, o método da resina de troca iônica, tratamento em membrana, precipitação e cristalização. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada. O nucleotídeo de purina coletado pode ser um composto livre, um sal deste, ou uma mistura deles. O nucleotídeo de purina coletado pode conter componentes tais como enzima de fosforilação, doador de fosfato, células bacterianas, componentes de meio, umidade, e subprodutos metabólitos de bactéria, além do nucleotídeo de purina. O nucleotídeo de purina pode ser purificado em um grau desejado. A pureza do nucleotídeo de purina pode ser, por exemplo, de 30% (p/p) ou maior, 50% (p/p) ou maior, 70% (p/p) ou maior, 80% (p/p) ou maior, 90% (p/p) ou maior, ou 95% (p/p) ou maior.
Exemplos
[000321] Em seguida, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos exemplos. (1) Meio usado
[000322] As composições e métodos de preparação do meio usado neste exemplo são mostrados abaixo. [meio LB]
[000323] O meio LB conteve 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, e 5 g/l de NaCl. O meio foi ajustado ao pH 7,0 com NaOH. O meio de LB ágar além disso conteve 15 g/l de ágar. [meio CM-Dex]
[000324] O meio CM-Dex conteve 10 g/l de polipeptona, 10 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de glicose, 1 g/l de KH2PO4, 3 g/l de ureia, 0,4 g/l de MgS( )-7l I2(), 0,01 g/l de l;eS(')-7l l.-('), 0,01 g/l de MnSCFol H), e 1,2 g/l (T-N) de filtrado de feijão (hidrolisado de feijão de soja). O meio foi ajustado ao pH 7,5 com K)H. ) meio de CM-Dex ágar além disso conteve 15 g/l de ágar. [meio de S10 ágar]
[000325] ) meio S10 conteve 100 g/l de sacarose, 10 g/l de polipeptona, 10 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de KH2P)4, 3 g/l de ureia, 0,4 g/l de MgS(')-7l l.-('), 0,01 g/l de FeSC )-7l H), 0,01 g/l de MnS( Fol F(), 1,2 g/l (TN) de filtrado de feijão, e 10 μg/l de biotina. ) meio foi ajustado ao pH 7,5 com K)H. ) meio de S10 ágar além disso conteve 15 g/l de ágar. [Meio mínimo de xilose]
[000326] ) meio mínimo de xilose conteve 2,5 g/l, 5,0 g/l, ou 10 g/l de xilose, 2,5 g/l de (NH^S)^ 0,5 g/l de KHzPθ^ 0,25 g/l de MgS()^7l F(), 2 g/l de ureia, 10 mg/l de MnSC)r4H2C), 50 μg/l de biotina, 100 μg/l de vitamina B1-HCl, 15 mg/l de ácido protocatecuico, 0,02 mg/l de CuS)4, 10 mg/l de CaCl2, e 40 g/l de M)PS. ) meio foi ajustado ao pH 7,0 com K)H. [Meio de semente]
[000327] ) meio de semente conteve 60 g/l de glicose, 1,45 g/l de K3P)4, 1,45 g/l de K)H, 0,9 g/l de MgS()^7l F(), 0,01 g/l de FeS)4^7H2), 2 g/l de succinato de s()di(v6H2C), 8,55 mg/l de ácido para-aminobenzoico, 8,55 mg/l de ácido ascórbico, 200 μg/l de vitamina B1-HCl, 60 μg/l de biotina, 1,54 g/l (T-N) de filtrado de feijão, 0,28 g/l de DL-metionina, 5 ml/L de Fermol, e 25 mg/l de canamicina. ) meio foi ajustado ao pH 7,2 com gás de amônia. [Meio principal de glicose]
[000328] ) meio principal de glicose conteve 90 g/l de glicose, 3,46 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgS(')-7l l.-('), 0,01 g/l de l;eS(')-7l l.-('), 0,01 g/l de MnSO:θlH), 23 mg/l de vitamina B1-HC1, 0,35 g/l (T-N) de filtrado de feijão, 15 ml/L de Fermol, e 25 mg/l de canamicina. ) meio foi ajustado ao pH 7,2 com gás de amônia. [Meio principal de xilose]
[000329] ) meio principal de xilose correspondeu ao meio principal de glicose em que 90 g/l de glicose foram substituídos com 100 g/l de xilose. [Meio principal de glicose/xilose]
[000330] ) meio principal de glicose/xilose correspondeu ao meio principal de glicose em que 90 g/l de glicose foram substituídos com 45 g/l de glicose e 45 g/l de xilose. (2) Construção de C. Glutamicum comunicou assimilabilidade de xilose
[000331] Transformando-se a cepa ATCC 13869 de C. glutamicum com um plasmídeo pVK9Peftu_xilAB que carrega os genes xilAB que codificam a xilose isomerase e xilulocinase de E. coli, uma cepa comunicada com a assimilabilidade de xilose, a cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xilAB da C. glutamicum, foi construída. )s procedimentos são mostrados abaixo. (2-1) Construção de pVK9Peftu_xilAB
[000332] Um plasmídeo de expressão pVK9Peftu_xilAB para os genes xilAB da E. coli foi construído como segue. pVK9Peftu_xilAB contém uma sequência consistindo em uma sequência promotora do gene tuf do fator de alongamento Tu (EF-Tu) de C. glutamicum (W02008/114721, de agora em diante indicada como “Peftu”), e os genes xilAB da E. coli ligados a jusante da sequência promotora.
[000333] Pela PCR usando o DNA cromossômico da cepa MG1655 da E. coli como o padrão, assim como os iniciadores xilA_SP(2)_4691-80-12 (SEQ ID N): 1) e xilAB_ASP_4691-80-13 (SEQ ID N): 2), um fragmento de DNA contendo os genes xilAB (fragmento xilAB) foram obtidos. Além disso, pela PCR usando o DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum como o padrão, assim como os iniciadores EFTU_SP_4691-80-1 (SEQ ID NO: 3) e EFTU_ASP_4691-80-2 (SEQ ID NO: 4), um fragmento de DNA contendo Peftu (fragmento Peftu) foi obtido. PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio) foi usado para a PCR, e as reações foram realizadas de acordo com o protocolo anexo à enzima.
[000334] O fragmento xilAB e o fragmento Peftu obtido como descrito acima foram misturados com pVK9 (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2007-97573, Pedido de Patente U.S Publicado No. 20050196846) tratados com XbaI, e usados para a reação em fusão com o Kit Clontech In-Fusion HD Cloning (Takara Bio) de acordo com o protocolo anexo ao kit, e JM109 da E. coli foi transformada com a mistura de reação. Os transformantes foram submetidos à seleção cultivando-os durante a noite a 37°C no meio de LB ágar (contendo 40 mg/l de canamicina). O plasmídeo objeto pVK9Peftu_xilAB foi obtido a partir de um transformante obtido. As sequências de nucleotídeos do promotor de EF-Tu clonado (Peftu) e genes xilAB são mostrados como SEQ ID NOS: 9 e 10, respectivamente. (2-2) Transformação de C. glutamicum
[000335] Pelo método do pulso elétrico (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2-207791), a cepa ATCC 13869 de C. glutamicum foi transformada com pVK9Peftu_xilAB. Os transformantes foram submetidos à seleção cultivando-os durante a noite a 31,5°C no meio de CM-Dex ágar (contendo 25 mg/l de canamicina) para se obter uma cepa comunicada com a assimilabilidade de xilose, cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xilAB da C. glutamicum. (3) Crescimento de C. glutamicum comunicada com a assimilabilidade de xilose em meio mínimo de xilose
[000336] A cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xilAB da C. glutamicum, à qual a assimilabilidade de xilose foi comunicada como descrito acima, foi cultivada no meio mínimo contendo xilose como uma única fonte de carbono (meio mínimo de xilose).
[000337] As células da cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xilAB de C. glutamicum foram espalhadas sobre o meio de CM-Dex ágar (contendo 25 mg/l de canamicina), e cultivadas durante a noite a 31,5°C. Depois da cultura, as células em cerca de 1 cm quadrado do meio de ágar foram raspadas juntas, colocadas em suspensão em 1 ml do meio mínimo de xilose a 0,25% (p/v), e inoculada em 5 ml de cada um dos meios mínimos de xilose a 0,25% (p/v), 0,5% (p/v), e 1,0% (p/v) (todas contendo 25 mg/l de canamicina) contidos em um tubo de cultura de modo a se obter uma absorbância de 0,01 em um comprimento de onda de 660 nm (OD660). A cultura foi realizada em uma temperatura de cultura de 31,5°C com agitação em uma velocidade de 70 rpm usando-se um aparelho de cultura sob agitação pequeno, TVS062CA (Advantec Toyo), e a OD660 foi medida com o tempo.
[000338] Os padrões de cultivo nos respectivos meios são mostrados na Fig. 1. Até cerca de 40 horas depois do início da cultura, foi observada uma tendência que as células apresentaram taxa de proliferação mais baixa em um meio de concentração de xilose mais baixa. Contudo, no meio mínimo de xilose a 0,25% (p/v) da concentração de xilose mais baixa, embora a proliferação das células fosse dificilmente observada até cerca de 40 horas depois do início da cultura, as células rapidamente proliferaram depois disso. (4) Aquisição de cepa mutante que apresentam taxa de proliferação melhorada em meio mínimo de xilose
[000339] O caldo de cultura pela cultura por 60 horas no meio mínimo de xilose a 0,25% (p/v) obtido em (3) mencionado acima (Fig. 1) foi espalhada no meio de CM-Dex ágar (contendo 25 mg/l de canamicina), e a cultura foi realizada durante a noite a 31,5°C para permitir a formação de colônia. As colônias obtidas foram raspadas, e separadamente subcultivadas no meio de CM-Dex ágar (contendo 25 mg/l de canamicina) para se obter clones únicos.
[000340] Como um resultado de cultivar alguns clones obtidos como descrito acima no meio mínimo de xilose da mesma maneira como aquela de (3) mencionado acima, foi obtida uma cepa mutante (cepa XM) da qual a taxa de proliferação não reduziu significantemente mesmo em um meio de concentração de xilose baixa (Fig. 2). Esta cepa XM também apresentou uma taxa de proliferação acentuadamente melhorada no meio mínimo de xilose a 1,0% (p/v) comparada com a cepa precursora (cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xilAB de C. glutamicum) (Fig. 4 (a ser explicada ais tarde)). (5) Análise de ponto de mutação de cepa mutante melhorada na assimilabilidade de xilose
[000341] Seis cepas mutantes, incluindo a cepa XM, que apresenta taxa de proliferação melhorada no meio mínimo de xilose foram obtidas pelo mesmo teste como aquele de (4) mencionado acima. As sequências de nucleotídeos dos DNAs cromossômicos das 6 cepas mutantes obtidas foram comparadas com aquela da cepa precursora usando-se MiSeq 2000 (Illumina). Como um resultado, uma mutação causando mutação de aminoácido traduzido foi detectada no gene NCgl2954 no cromossomo para todas as cepas mutantes (Tabela 1). [Tabela 1] Tabela 1: Mutações nos genes NCgl2954 de cepas mutantes que apresentam taxa de proliferação melhorada em meio mínimo de xilose
Figure img0009
* A mutação das cepas mutantes 1, 2, e 5 foi uma mutação para substituir o resíduo de leucina na posição 365 com um resíduo de serina, o resíduo de leucina na posição 366 com um resíduo de arginina, e o resíduo de alanina na posição 367 com um resíduo de fenilalanina, e deletar os resíduos de aminoácido da posição 368 e posições a seguir. (6) Construção da cepa deficiente no gene NCgl2954 de C. glutamicum (6-1) Construção do plasmídeo pBS4SΔNCgl2954 para a exclusão do gene NCgl2954
[000342] Um plasmídeo pBS4SΔNCgl2954 para a exclusão do gene NCgl2954 foi preparado como segue.
[000343] Primeiro, a PCR foi realizada usando-se o DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 C. glutamicum como o padrão, assim como os iniciadores delta_2954_F1 (SEQ ID NO: 5) e delta_2954_MR (SEQ ID NO: 6) para amplificar um fragmento de DNA contendo uma região a montante do gene NCgl2954. Além disso, a PCR foi realizada usando-se similarmente o DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum como o padrão, assim como os iniciadores delta_2954_MF (SEQ ID NO: 7) e delta_2954_R1 (SEQ ID NO: 8) para amplificar um fragmento de DNA contendo uma região a jusante do gene NCgl2954. PrimeSTAR HS DNA Polymerase foi usada para a PCR, e as reações foram realizadas de acordo com o protocolo ligado à enzima.
[000344] Os dois fragmentos de DNA obtidos acima foram misturados com o plasmídeo pBS4S (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2007-97573, Pedido de Patente Publicado U.S No. 20050196846) tratados com XbaI, e usados para a reação em fusão com o kit Clontech In-Fusion HD Cloning (Takara Bio) de acordo com o protocolo anexo ao kit, e JM109 da E. coli foi transformado com a mistura de reação. Os transformantes foram submetidos à seleção cultivando-os durante a noite a 37°C no meio de LB ágar (contendo 40 mg/l de canamicina). Um plasmídeo pBS4SΔNCgl2954 que corresponde ao pBS4S em que as sequências a montante e a jusante do gene NCgl2954 foram inseridas foi obtido a partir de um transformante obtido. (6-2) Aquisição da cepa deficiente no gene NCgl2954
[000345] A cepa ATCC 13869 de C. glutamicum foi transformada com pBS4SΔNCgl2954 pelo método do pulso elétrico, e cultivada a 31,5°C durante duas noites no meio de CM-Dex ágar (contendo 25 mg/l de canamicina) para se obter um recombinante de ocorrência única em que pBS4SΔNCgl2954 foi incorporado no cromossomo. O recombinante de ocorrência única obtido foi subcultivado no meio de S10 ágar para se obter uma cepa ATCC13869ΔNCgl2954 de C. glutamicum recombinante de ocorrência dupla deficiente na região do gene NCgl2954. (7) Crescimento da cepa deficiente no gene NCgl2954 em meio mínimo de xilose
[000346] Da mesma maneira como aquela de (2-2) mencionada acima, a cepa ATCC13869ΔNCgl2954 de C. glutamicum foi transformada com pVK9Peftu_xilAB para se obter uma cepa comunicada com a assimilabilidade de xilose e deficiente no gene NCgl2954 (cepa ATCC13869ΔNCgl2954/ pVK9Peftu_xilAB de C. glutamicum). O crescimento desta cepa no meio mínimo de xilose a 0,25% (p/v), 0,5% (p/v), e 1,0% (p/v) foi verificado da mesma maneira como aquela de (3) mencionado acima.
[000347] A cepa deficiente no gene NCgl2954 não apresentou tal redução acentuada de taxa de proliferação como aquela mostrada pela cepa do tipo selvagem (cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xilAB de C. glutamicum) mesmo em uma concentração baixa de meio mínimo de xilose, e apresentou uma taxa de proliferação específica comparável com aquela da cepa XM (Figs. 3 e 4). Com base nos resultados acima, foi fortemente sugerido que o fator para a melhora na taxa de proliferação da cepa XM no meio mínimo de xilose é a inativação ou atenuação do gene NCgl2954. Por esta verificação, foi revelado que a exclusão do gene NCgl2954 fornece melhora na assimilabilidade de xilose. (8) Influência da deficiência de gene NCgl2954 sobre a produção de ácido glutâmico usando xilose como fonte de carbono
[000348] Um teste de fermentação do ácido glutâmico foi realizado com a cepa deficiente no gene NCgl2954 (cepa ATCC13869ΔNCgl2954/ pVK9Peftu_xilAB de C. glutamicum) e a cepa do tipo selvagem (cepa ATCC13869/pVK9Peftu_xilAB de C. glutamicum) sob limitação de biotina em um meio contendo xilose para verificar a influência da deficiência do gene NCgl2954 sobre a produção de ácido glutâmico usando xilose como a fonte de carbono. (8-1) Condições de cultivo e condições de análise
[000349] O teste de fermentação do ácido glutâmico foi realizado usando-se um fermentador de jarra. Cada cepa foi cultivada durante a noite a 31,5°C no meio de ágar CM-Dex (contendo 25 mg/l de canamicina). Depois da cultura, as células em 1 cm quadrado no meio de ágar foram raspadas juntas, e inoculadas a 250 ml do meio de semente contidos no fermentador de jarra. A cultura foi realizada em uma temperatura de cultura de 31,5°C, pH 7,2 (ajustado pela adição de gás de amônia), taxa de aeração de 250 ml/min, e número de agitação de 700 rpm, e continuada até que a glicose no meio fosse completamente consumida. Cada caldo de cultura de semente obtido como descrito acima foi inoculado [10% (v/v)] para cada um dos meios principais (glicose, xilose, e glicose/xilose) de modo a se obter um volume final de 250 ml, e a cultura foi realizada em uma temperatura de cultura de 31,5°C, pH 7,2 (ajustado pela adição de gás de amônia), taxa de aeração de 250 ml/minuto, e número de agitação de 700 rpm.
[000350] O caldo de cultura foi amostrado com o tempo, e a OD620 do caldo de cultura, concentração de glicose, concentração de xilose, e concentração de ácido glutâmico do sobrenadante de cultura foram medidas. A OD620 do caldo de cultura foi medida usando-se U-2900 (Hitachi High- Technologies). A concentração de ácido glutâmico e concentração de glicose no sobrenadante de cultura foram medidas usando-se Biotech Analyzer AS- 310 (Sakura SI). A concentração de xilose no sobrenadante de cultura foi medida usando-se um sistema de HPLC (Bomba L-7100, Autoamostrador L- 7200 (ambos da Hitachi High-Technologies), e Estufa de Coluna CO 705 (GL Sciences)). As condições da análise de HPLC foram como segue: coluna, SHODEX (SUGAR-G e SUGAR SH1011 (Showa Denko)); temperatura de coluna, 50 °C; eluente, H2O; taxa de fluxo, 1,0 ml/minuto; e detecção, Detector RI (Hitachi High-Technologies). (8-2) Resultados da produção de ácido glutâmico em meio de glicose
[000351] No meio de glicose, tanto a cepa do tipo selvagem quanto a cepa deficiente no gene NCgl2954 consumiram completamente a glicose contida no meio depois da cultura de 11 horas, e a diferença na taxa de consumo de glicose ou produtividade de ácido glutâmico não foi observada entre ambas as cepas (Fig. 5). (8-3) Resultados da produção de ácido glutâmico em meio de xilose
[000352] No meio de xilose, a cepa do tipo selvagem deixou 40 g/l de xilose no meio mesmo depois da cultura de 11 horas, e a quantidade do ácido glutâmico acumulado neste tempo foi de 6,4 g/l (Fig. 6). Isto é, foi confirmado que a taxa de assimilação de xilose da cepa do tipo selvagem foi acentuadamente mais baixa do que a sua taxa de assimilação de glicose. Ao contrário, a cepa deficiente no gene NCgl2954 de modo substancial consumiu completamente a xilose contida no meio depois da cultura de 11 horas, e acumulou 23,6 g/l de ácido glutâmico (Fig. 6). Foi deste modo revelado que, pela exclusão do gene NCgl2954, a taxa de assimilação de xilose foi melhorada, e a produtividade do ácido glutâmico também foi melhorada. (8-4) Resultados da produção de ácido glutâmico em meio de glicose/xilose
[000353] No meio de glicose/xilose, a cepa do tipo selvagem deixou 11 g/l de xilose no meio mesmo depois da cultura de 11 horas, e a quantidade de acúmulo de ácido glutâmico neste tempo foi de 16,5 g/l (Fig. 7). Ao contrário, a cepa deficiente no gene NCgl2954 completamente consumiu a glicose e xilose depois da cultura de 11 horas, e acumulou 24,1 g/l de ácido glutâmico (Fig. 7). Como descrito acima, a cepa deficiente no gene NCgl2954 apresentou melhora na taxa de consumo de xilose, especialmente, mesmo sob a presença de glicose, comparada com a cepa do tipo selvagem, e, portanto, foi demonstrado que a exclusão do NCgl2954 também é eficaz para a assimilação simultânea de glicose e xilose. (9) Construção de C. glutamicum introduzida com a via NXA
[000354] A C. glutamicum na qual os genes da via de NXA foram introduzidos pode ser obtida pela transformação com o plasmídeo pVK9Peftu_ccrNXA (WO2013/069634A1). pVK9Peftu_ccrNXA contém uma sequência consistindo do promotor EF-Tu (Peftu) da C. glutamicum, e os genes xilXABCD que codificam a via NXA de C. crescentus CB15 (ATCC 19089) e ligados a jusante do promotor. O gene yagF que codifica a xilonato desidratase da E. coli foi introduzido nos cromossomos de C. glutamicum ATCC 13869 e ATCC13869ΔNCgl2954, e as cepas resultantes foram além disso transformadas com pVK9Peftu_ccrNXA para construir cepas que podem produzir ácido L-glutâmico a partir de xilose através da via de NXA. Os procedimentos são apresentados abaixo. (9-1) Construção de pBS4SΔxilB_yagF
[000355] De modo a introduzir o gene yagF que codifica a xilonato desidratase da E. coli na região do gene xilB que codifica a xilulocinase no cromossomo da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum, o plasmídeo pBS4SΔxilB_yagF foi construído como segue.
[000356] Primeiro, a PCR foi realizada usando-se o DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum como o padrão, assim como os iniciadores xilB_F1 (SEQ ID NO: 27) e xilB_MR (SEQ ID NO: 28) para amplificar um fragmento de DNA contendo uma região a montante do gene xilB. A PCR foi realizada usando-se similarmente o DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum como o padrão, assim como os iniciadores xilB_MF (SEQ ID NO: 29) e xilB_R1 (SEQ ID NO: 30) para amplificar um fragmento de DNA contendo uma região a jusante do gene xilB. PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio) foi usada para a PCR, e as reações foram realizadas de acordo com o protocolo anexo à enzima.
[000357] Os dois fragmentos de DNA obtidos acima foram misturados com o plasmídeo pBS4S (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2007-97573, Pedido de Patente Publicado U.S No. 20050196846) tratados com XbaI, e usados para a reação em fusão com o kit Clontech In-Fusion HD Cloning de acordo com o protocolo anexo ao kit, e a cepa DH5α da E. coli foi transformada com a mistura de reação. Os transformantes foram submetidos à seleção cultivando-os durante a noite a 37°C no meio de LB ágar (contendo 40 mg/l de canamicina). Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos, e um plasmídeo pBS4SΔxilB que corresponde ao pBS4S em que as sequências a montante e a jusante do gene xilB foram inseridas foi obtido. Em pBS4SΔxilB, a sequência de reconhecimento XbaI foi inserida entre as sequências a montante e a jusante do gene xilB.
[000358] Depois, a PCR foi realizada usando-se o DNA cromossômico da cepa MG1655 da E. coli como o padrão, assim como os iniciadores PcspB_yagF_fw (SEQ ID NO: 31) e yagF_xilB_rv (SEQ ID NO: 32) para amplificar um fragmento de DNA contendo o gene yagF. A PCR também foi realizada usando-se o DNA cromossômico da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum como o padrão, assim como os iniciadores xilB_PcspB_fw (SEQ ID NO: 33) e PcspB_rv (SEQ ID NO: 34) para amplificar um fragmento de DNA contendo a região promotora do gene cspB (de agora em diante indicada como “PcspB”). PrimeSTAR HS DNA Polymerase (Takara Bio) foi usada para a PCR, e as reações foram realizadas de acordo com o protocolo anexo à enzima.
[000359] Os dois fragmentos de DNA obtidos acima foram misturados com o plasmídeo pBS4SΔxilB tratado com XbaI, e usados para a reação em fusão com o Kit Clontech In-Fusion HD Cloning (Takara Bio) de acordo com o protocolo ligado ao kit, e a cepa DH5α da E. coli foi transformada com a mistura de reação. Os transformantes foram submetidos à seleção cultivando- os durante a noite a 37°C no meio de LB ágar (contendo 40 mg/l de canamicina). Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos, e um plasmídeo pBS4SΔxilB_yagF em que uma sequência consistindo em PcspB e o gene yagF ligado a jusante de PcspB foi inserida entre as sequências a montante e a jusante do gene xilB foi obtida. As sequências de nucleotídeos do promotor cspB clonado (PcspB) e o gene yagF são mostrados como SEQ ID NOS: 47 e 19, respectivamente. (2-2) Transformação de C. glutamicum
[000360] A cepa ATCC 13869 de C. glutamicum foi transformada com pBS4SΔxilB_yagF pelo método do pulso elétrico, e cultivada a 31,5°C durante duas noites no meio de CM-Dex ágar (contendo 25 mg/l de canamicina) para se obter um recombinante de ocorrência única em que pBS4SΔxilB_yagF foi incorporada no cromossomo. O recombinante de ocorrência única obtido foi subcultivado no meio de S10 ágar, e uma cepa na qual o gene yagF foi introduzido como pretendido foi selecionada pela PCR a partir das cepas que cresceram no meio de S10 ágar e apresentaram sensibilidade à canamicina. A cepa obtida como descrito acima foi designada como cepa ATCC13869+D. Nesta cepa, a região do gene xilB no cromossomo é substituída com o gene yagF.
[000361] Depois, a cepa ATCC13869+D foi transformada com pVK9Peftu_ccrNXA, e pela seleção dos transformantes no meio de CM-Dex ágar (contendo 25 mg/l de canamicina), uma cepa introduzida na via de NXA, cepa ATCC13869+D/pVK9Peftu_ccrNXA, foi obtida.
[000362] Os mesmos procedimentos como descritos acima foram usados para a cepa ATCC13869ΔNCgl2954 para se obter a cepa ATCC13869ΔNCgl2954+D em que o gene yagF foi introduzido no cromossomo, e esta cepa foi transformada com pVK9Peftu_ccrNXA para se obter uma cepa introduzida com a via de NXA, a cepa ATCC13869ΔNCgl2954+D/pVK9Peftu_ccrNXA. (10) Influência da deficiência do gene NCgl2954 sobre a produção de ácido glutâmico por intermédio da via de NXA
[000363] De modo a confirmar o efeito da deficiência do gene NCgl2954 sobre a produção do ácido glutâmico a partir de xilose por intermédio da via de NXA, um teste de fermentação do ácido glutâmico sob limitação de biotina foi realizado. As condições de cultivo e condições de análise são como mostradas em (8-1).
[000364] Como um resultado da cultura no meio de xilose, a cepa deficiente no gene NCgl2954 apresentou uma taxa de consumo de xilose melhorada e uma taxa de produção de ácido glutâmico melhorada, como comparado com a cepa tendo o gene NCgl2954 (Fig. 8). Com base nestes resultados, foi demonstrado que a exclusão do gene NCgl2954 melhora a produtividade do ácido glutâmico a partir de xilose não somente por intermédio da via compreendendo a xilose isomerase e xilulocinase, mas também por intermédio da via de NXA. Aplicabilidade Industrial
[000365] De acordo com a presente invenção, a assimilabilidade de xilose da bactéria corineforme pode ser melhorada, e uma substância alvo tal como L-aminoácidos e ácidos nucleicos pode ser eficientemente produzida a partir de uma matéria prima contendo xilose. Explicação da Listagem de Sequência SEQ ID NO: 1, Iniciador xilA_SP(2)_4691-80-12 SEQ ID NO: 2, Iniciador xilAB_ASP_4691-80-13 SEQ ID NO: 3, Iniciador EFTU_SP_4691-80-1 SEQ ID NO: 4, Iniciador EFTU_ASP_4691-80-2 SEQ ID NO: 5, Iniciador delta_2954_F1 SEQ ID NO: 6, Iniciador delta_2954_MR SEQ ID NO: 7, Iniciador delta_2954_MF SEQ ID NO: 8, Iniciador delta_2954_R1 SEQ ID NO: 9, Sequência de nucleotídeo do promotor de EF-Tu (Peftu) SEQ ID NO: 10, Sequência de nucleotídeo do operon de xilose (xilAB operon) da cepa K-12 MG1655 da E. coli SEQ ID NO: 11, Sequência de aminoácido da proteína XilA da cepa K-12 MG1655 da E. coli SEQ ID NO: 12, Sequência de aminoácido da proteína XilB da cepa K-12 MG1655 da E. coli SEQ ID NO: 13, Sequência de nucleotídeo do gene NCgl2954 da cepa ATCC 13869 da C. glutamicum SEQ ID NO: 14, Sequência de aminoácido da proteína codificada pelo gene NCgl2954 da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum SEQ ID NO: 15, Sequência de nucleotídeo do gene xilB de Sphingomonas elodea SEQ ID NO: 16, Sequência de aminoácido da proteína XilB de Sphingomonas elodea SEQ ID NO: 17, Sequência de nucleotídeo do gene xilC de Sphingomonas elodea SEQ ID NO: 18, Sequência de aminoácido da proteína XilC de Sphingomonas elodea SEQ ID NO: 19, Sequência de nucleotídeo do gene yagF da cepa K-12 MG1655 de Escherichia coli SEQ ID NO: 20, Sequência de aminoácido da proteína YagF da cepa K-12 MG1655 de Escherichia coli SEQ ID NO: 21, Sequência de nucleotídeo do gene xilX de Sphingomonas elodea SEQ ID NO: 22, Sequência de aminoácido da proteína XilX de Sphingomonas elodea SEQ ID NO: 23, Sequência de nucleotídeo do gene ycbD de Bacillus subtilis SEQ ID NO: 24, Sequência de aminoácido da proteína YcbD de Bacillus subtilis SEQ ID NO: 25, Sequência de nucleotídeo do gene yggB da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum SEQ ID NO: 26, Sequência de aminoácido da proteína YggB de cepa ATCC 13869 de C. glutamicum SEQ ID NOS: 27 a 34, Iniciadores SEQ ID NO: 35, Sequência de nucleotídeo do gene xilB da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum SEQ ID NO: 36, Sequência de aminoácido da proteína XilB da cepa ATCC 13869 de C. glutamicum SEQ ID NO: 37, Sequência de nucleotídeo do gene xilX da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 38, Sequência de aminoácido da proteína XilX da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 39, Sequência de nucleotídeo do gene xilA da cepa CB15de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 40, Sequência de aminoácido da proteína XilA da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 41, Sequência de nucleotídeo do gene xilB da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 42, Sequência de aminoácido da proteína XilB da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 43, Sequência de nucleotídeo do gene xilC da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 44, Sequência de aminoácido da proteína XilC da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 45, Sequência de nucleotídeo do gene xilD da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 46, Sequência de aminoácido da proteína XilD da cepa CB15 de Caulobacter crescentus SEQ ID NO: 47, Sequência de nucleotídeo do promotor de cspB (PcspB)

Claims (20)

1. Método para produzir uma substância alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar uma bactéria corineforme tendo uma capacidade de produzir uma substância alvo em um meio contendo xilose para produzir e acumular a substância alvo no meio; e coletar a substância alvo do meio, em que a assimilabilidade de xilose da bactéria foi melhorada através da introdução de uma mutação em uma região de codificação e/ou uma região de controle de expressão do gene NCgl2954 no cromossomo da bactéria, e em que a mutação consiste em uma ou mais mutações selecionadas de uma mutação de expressão atenuante do gene NCgl2954, uma mutação de ruptura do gene NCgl2954 e as mutações de (1) a (7) mencionadas abaixo: (1) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (2) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de triptofano na posição 274 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não um resíduo de triptofano; (3) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de tirosina na posição 377 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de tirosina; (4) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 365 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (5) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 366 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de leucina; (6) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 367 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de aminoácido outro que não o resíduo de alanina; (7) uma mutação para excluir os resíduos de aminoácido que corresponde ao resíduo de aminoácido na posição 368 da SEQ ID NO: 14 e aos seguintes resíduos de aminoácido.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a assimilabilidade de xilose foi melhorada através da melhora da capacidade de absorção de xilose.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene NCgl2954 é um DNA tendo a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 13 ou sua sequência degenerada que gera a proteína apresentada na SEQ ID NO: 14
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as mutações de (1) a (6) mencionadas acima são mutações de (1a) a (6a) mencionadas abaixo, respectivamente: (1a) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 438 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de prolina; (2a) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de triptofano na posição 274 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de arginina; (3a) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de tirosina na posição 377 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de asparagina; (4a) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 365 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de serina; (5a) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de leucina na posição 366 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de arginina; (6a) uma mutação para substituir um resíduo de aminoácido que corresponde ao resíduo de alanina na posição 367 da SEQ ID NO: 14 com um resíduo de fenilalanina;
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria também foi ativada de modo que as atividades ou atividade de xilose isomerase e/ou xilulocinase é aumentada, em que a xilose isomerase é uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação:
Figure img0010
, e em que a xiluloquinase é uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação:
Figure img0011
.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a xilose isomerase uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.
7. Método de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a xilulocinase é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a bactéria também foi ativada de modo que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas do grupo que consiste em xilose desidrogenase, xilonolactonase, xilonato desidratase, 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase, e a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase são aumentados, em que a xilose desidrogenase é uma proteína com atividade de catalisar a seguinte reação:
Figure img0012
; em que a xilonolactonase é uma proteína com atividade de catalisar a seguinte reação:
Figure img0013
; em que a xilonato desidratase é uma proteína com atividade de catalisar a seguinte reação:
Figure img0014
; em que a 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase é uma proteína com atividade de catalisar a seguinte reação:
Figure img0015
; e em que a semialdeído a-cetoglutárico desidrogenase é uma proteína tendo uma atividade de catalisar a seguinte reação: semialdeído α- cetoglutárico
Figure img0016
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a xilonato desidratase, 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase, e a- cetoglutárico semialdeído desidrogenase são proteínas derivadas de uma bactéria Escherichia, bactéria Sphingomonas, e bactéria Bacillus, respectivamente.
10. Método de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a xilose desidrogenase é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 ou 42.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a xilonolactonase é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 ou 44.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a xilonato desidratase é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou 46.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, caracterizado pelo fato de que a 2-ceto-3-desoxixilonato desidratase é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou 38.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 13, caracterizado pelo fato de que a a-cetoglutárico semialdeído desidrogenase é uma proteína tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 ou 40.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é uma substância selecionada do grupo que consiste em um aminoácido, ácido nucleico, e peptídeo.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um aminoácido selecionado do grupo que consiste em ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-arginina e L-lisina.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um nucleosídeo de purina selecionado do grupo que consiste em inosina, xantosina, guanosina e adenosina.
18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um nucleotídeo de purina selecionado do grupo que consiste em ácido inosínico, ácido xantílico, e ácido guanílico.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a bactéria é uma bactéria de Corynebacterium.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Corynebacterium glutamicum.
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