JPS58158186A - 細菌のプロトプラスト融合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はブレビバクテリウム−又ｌはコリネバクテリウ
ム＠細菌とバチルス属細菌の効率的な細胞−合方ｌ去に
関する。

紫外線照射や変異誘発剤処理による人工変異法は時間と
多くの労力を要するものの発酵工業で使用される微生物
の実用的な育種方法として従来採用されてきているが、
近年、このような従来の育種法に幻して、遺伝子操作に
よる組み換えＤＮＡ技術、プロトプラスト融合法あるい
は遺伝子増幅云等一連の新しい育種方法が急速に開発さ
れ、インターフェロン、インシュリン、ホルモン−Ｈ１
発酵法では生産できなかった有用刃物質が微生物によっ
て生産されるようになって味ている。これら胃性法の応
用微生物工業に及ばず影響ははかり知れないものである
。この内、組み４０えＤＮＡ法によって微生物を育種す
るためには正確な遺伝子地図、ベクター、あるいは宿主
の開９≧がなされていることが前提条件とな、る。とこ
ろか、アミノ酸、核酸あるいは抗生動員生産菌について
は宿主、ベクターの開発が遅れているため直ちに適用で
きない。

これに対し、プロトプラスト融合法は微生物の持つ自然
の遺伝子組み換え能を利用する方法で遺伝子地図が不明
であシ、ベクター、宿主が開発されていなくても比較的
簡単に通用できるものであり、別々に高生産性の菌株を
人工変異法で肪導し、生産性の高い菌株をプロトプラス
ト融合させて更に生１ｆｆＥの高い菌株を育種すること
が可能となるので、この方法も実用的な育種方法として
大いに期待されている。

今日までに、細菌のプロトプラスト融合法としてはブレ
ビバクテリウム属細菌間の融合方法が報告され、（Ａｇ
ｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｏｍ、、　４３（５）、１００７〜
１０１３．１９７９　）　　又コリネバクテリウム属細
菌間の融合方法（％開昭５６−１０９５８７　）が開発
されている一方、酵母についてはすでに品種改良法が知
られている（特開昭５４−１６３８８３）。

しかしながら、これら従来の方法では同種間、あるいは
同属間の細菌間のプロトプラスト融合にとどまり、異っ
た属の細菌の融合法は開発されていない。

そこで本発明者等は同属間のみならず異った属の細菌の
融合法、特に発酵工業に於て重要な微生物であるブレビ
バクテリウム属あるいはコリネノくクテリウム属の細菌
とバチルス属細菌の融合法を効率的に行う方法を開発す
ることを目的として鋭意研究を重ねた結果、夫々の細菌
のプロトプラストをポリエチレングリコール及びカルシ
ウムイオンを１０　ｍＭ以上含むｐＨ８，０〜１２０の
高張液中で融合せしめれば、異った属の細菌間に於ても
１０１〜１０−６の高頻度で融合が起ることを発見し本
発明を完成するに至った。

以下、本発明の方法について説明する。

本発明は次の４つの工程を含むプロトプラストの融合方
法であシ、第２工程のプロトプラストｍ合金、ポリエチ
レングリコール及びカルシウムイオンを１０ｍＭ以上含
有するｐＨ−Ｂ□−＋１ｑ２弔のアルカリ性高張液を使
用する点が特徴である。

（１）栄養細胞からプロトプラストの形成（２）　　プ
ロトプラストの融合 （３）　　７８合プロトプラストの細胞への復帰再生（
４）　　目的とする組み換え株の選択。

栄誉細胞からプロトプラストの形成方法は公知（Ａｇｒ
、　Ｂｉｏｌ　、　Ｏｈｅｍ　、、　４３（５）　、　
１００７〜１０１３．１９７９）の方法に従って行われ
る。

栄養細胞を得るために使用する培地は菌が増殖できる液
体培地であれはよく、例えば完全栄養培地（ｃ　Ｍ培地
−酵母エキス１０ハポリペプトン１０ｔ１塩化ナトリウ
ム５ｔ１グルコーズ！Ｍ’を純水１ｊに含み、ｐＨ７，
２に調製した培栃などが用いられる。この培地にブレビ
バクテリウム、コリネバクテリウム又はバチルス属の微
生物を接種、培養し、リゾチーム感受性の細胞を得るた
め対数増殖期にペニシリン寺細胞壁合成阻害剤を微生物
の生育を抑制しないか又は半抑制する程度添加する。

例えばベニ、シリシの場合では１〜２０　Ｕｎｉｔ　／
　１０　ａｌ爾加し、更に９０分以上培養を就けて数世
代増殖せしめてリゾチーム感受性の栄養細胞を得る。

培養液から夫々細胞を分離し、これを高張液で洗浄後、
それぞれの高張最少培地に懸濁する。ここで使用される
高張液としては公知のものを使用すれば良く、例えば０
２５Ｍシュークローズ、０２５Ｍコハク酸２ナトリウム
、２０ｍＭリン酸１カリウム、１００ｍＭリン酸２カリ
ウム、５ｍＭＥＤＴＡをきみｐＨ７〜１０５に”調整し
たＨＰ液等が使用され、又、高張最少培地としては０４
１Ｍのンユークロースと００１Ｍの硫酸マグネシウムを
含む最少培地が使用される。この栄養細胞懸濁液にリゾ
チーム（０，１〜１０　”５１７／ｒｔｌ　）を加え、
３Ｏ−３７ｃに放置する。プロトプラストの形成は、反
応時間と共に進行し光学顯微鏡で観察できる。栄養細胞
がプロトプラスト化されるのに要する時間は、用いた菌
株の種類、細胞培養時の添加ペニシリン濃度およびプロ
トプラスト形成に用いるリゾチーム濃度によって変化す
るが、前記条件にて約０．３〜２４時間である。

このようにして調製したプロトプラストは、適当な高張
寒天培地上でコ、ロニーを形成し、栄養細胞に実生する
。この寒天培地は、０３〜０．８　Ｍコハク酸２ナトリ
ウムを含むものならば、完全栄養培地（ＣＭ）および最
少培地でもよい。

ｌ）プロトプラストの細胞融合工程 それぞれの親株のプロトプラストを混合して遠心分離に
付し、これをカルシウムイオンを１００ｍＭ以上含んだ
ｐＨ８，０〜１２０のアルカリ性高張液に再！ｖ濁し、
これに照合促進効果のあるポリエチレングリコール（ｐ
ｇＧ）溶液を加え、１０ｍＭ以上のカルシウムイオン及
びＰＥＧ　１０〜５０％の共存下、ｐＨ８〜１２の条件
下で細胞融合を誘発させる。

カルシウムイオンの供給源としては溶解性の良いカルシ
ウム塩であれば良く、通常塩化カルシウムを使用する。

カルシウムイオンの濃度はＬ　ＯｍＭ以上、望ましくは
１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲が良く、１０ｍＭ以下では
融合頻度が低くて本発明の目的を達成することはできな
い。

２）融合プロトプラストの栄養細胞への再生再生は前記
のプロトプラストの再生同様、コハク酸２ナトＩＪウム
含有高張幕天培地（例えば完全栄養培地または最少培地
）上に融合プロトプラストを接種し、その上に０４〜１
．０％寒天を含んだ同培地を重層し、親株の栄養細胞が
生育できる温［ｔで培養することによって行なわれる。

３）組換え株の選択 組換え株は、再生細胞中から、両親法の特徴的形質が検
査できる標準的方法で遺伝的検査を行い、両親法からの
遺伝子を有するものを選択することによ、て同定される
。

本発明のプロトプラストｅ合法によるＤＮＡの交換また
は組み換えの頻度は１０〜１０　と高く、同種間、同属
間の微生物の遺伝子交換をはじめとしてブレビバクテリ
ウム属とバチルス属、コリネバクテリウム属とバチルス
属間の異った属の微生物の遺伝子交換法として利用でき
るものである。

このように異った馬の微生物の遺伝子交換を可能ならし
める本発明の方法は従来不可能であった新しい形の育種
法として利用される。

例えば、澱粉資化能を有しないブレビバクテリウム又は
コリネノソテリウム属のアミノ酸生産菌と澱粉資化能を
有するバチルス属微生物をプロトプラスト融合せしめ、
澱粉資化能を有するアミノ酸生産菌を育種する方法、あ
るいは、コリネバクテリウム属のイノシン酸生産菌とバ
チルス属のデコイニン耐性、又は／及びサイコ７ラニン
耐性株をプロトプラスト融合させて、デコイニン又は／
及びサイコフラニン耐性を有する高イノシン酸生産菌の
育種等に利用することができる。

以下、実施例にて詳細に説明する。

実施例１ ペプトン１．０ｆム　酵母エキス１．０　ｆ／ｄｌｌ、
　塩化ナトリウ−／、　０．５　ｔ／−アデニン１０　
”Ｅｌ／ａ、キサンチン１０　”５ｊ／ｄ及びシューク
ローズ０．５　ｆ／ｄｌｌを含むｐＨ７，２の完全栄養
培地（０Ｍ培地）を大型試雇管に１ｏｎｅ宛分注し加熱
滅菌した。この培地に同ＣＭ寒天スラント上に生育した
バチルス・ズブチリスＡＪ　１１７９０　ＦＥＲＭ　−
Ｐ　６４１３　’（アデニン安水性、Ｌ−アルギニン要
求性、８アザグアニン耐性、サイコフラニン耐性、デコ
イニン耐性）を接種し、３１．５ｒで振盪培養し、対故
瑠泊期（菌体量１０　個／　ｍｅ　）にペニシリンＧを
３拳位／１゜ｔｎｌ　Ｍｍ加し、更に９０分間培養した
。培養液から菌体を集め、高張希釈液（ＨＰ液）で洗浄
した。これをリゾチームＩ　Ｏ００ｐｉ／ｍｌ　、シュ
ークロース１４Ｐ／＃硫酸マグネシウム０．２４　？／
ｄｌｌを含む第１六の最少培地に懸濁し、３］、５ｒに
保持した。

プロトプラストの形成を光学顕微鏡で観察した。

プロトプラスト化は３０分間で完了した。

ファグアニジン耐性、リファンピシン耐性）を培養し、
菌体を染めだ。この菌体をリゾチーム５０００μｍ１／
ｙｘｌ　、シュークロース１４．０　ｆ／ｄｌｌ、硫酸
マグネシウム０．２４１７ａを含む第１表の高張最少培
地に懸濁し、３１．５ｒに保持してプロトプラスト化を
行った。プロトプラスト化は２０時間で完了した。

第１表　最少培地組成 グルコース　　　　　　　　２．０　　ｆ／ａ　　１．
Ｏｆ７箇硫酸アンモニウム　　　　　　　　　　０．２
〃ＮＨ，Ｃ１Ｏ，５＃肩　　− ＫＨ２ＰＯ，’　　　　　　　　　０．４　　　／／　
　　０．１　　＃／ｄｌ１ＭｇＳＯ，・７Ｈ，００，０
４／／　　　０．０４　　ｔｔビオチン　　　　　　　
　　　　　　　２００　μＶ！パントテン酸カルシウム
　　　　　　　　　　１．０〜／！アデ二７　　　　　
　　１０′塾個　５　　”ｆｉ／ｄｒｌＬ−アルギニン
　　　　　５０〜’Ｊ　　　−／／カザミノ酸　　　　
　　　　　　　　　　０５　ｔ／諦Ｆ’ｅイオン、Ｍｎ
イオン　　　２．０　　ｐｐｍ　　　２．０　　ｐｐｍ
グアニン　　　　　　　　１０　　”ｐ／簡　　−クエ
ン酸ナトリウム　　　　　５０　　　〃　　　−ｐＨ７
，３７，３ プロトプラスト化した後、ＡＪ　１１７８９及びＡＪ１
１７９０　のプロトプラストを混合した後遠心分離し、
これをＯ〜２００　ｍＭの塩化カルシウムを含んだ高張
液（Ｈｒ液）に懸濁し、これに３３％のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）／ｇａ（’ｐＥＧ−６０００、純正
化学製）水溶液を９＠量加え３６Ｃに３０分間保持して
プロトプラストの融合を行った。

次いで、ポリエチレングリコール液を遠心分離してプロ
トプラストを集め、上記高張液に再懸濁し、スルファグ
アニジン１　′ａｙ／ｍｅ、　リファンピシン５μｇ／
ｌｎｌ、　　８アザグアニン１τ／ｍｅ、　　サイコフ
ラニン２　’ｆｌ／ｍｌ、　ｆコイエン１００μ＃／Ｊ
＆び”’・り酸ナトリウムを含む高張最少寒天培地に接
種し、その上聞に吋寒天培地を薄層上に重層した後、３
１５Ｃで１０日間培養して、組み換え株（アデニン要求
性、スルファグアニジン耐性、リファンピシン耐性、８
アザグアニン耐性、サイコフラニン耐性、デコイニン耐
性）の出現頻度を調べだ。プロトプラスト融合反応液の
カル７ウムイオンの濃度（塩化力ルシュウム）及びｐＨ
と出専頻度との関係を第２表及び第３表に示す。

第２表 ６．５　　　　　　　　　＜１０−８ ８．０　　　　　　　　３．８Ｘ１０”５９．０　　　
２．ＯＸＩ　Ｏ”” １０．５　　　１．２Ｘ１０’ １２．０　　　２．ＯＸＩ　Ｏ−７ ※　薬剤含有培地上に生育したコロニー数７０Ｍ培地上
に生育したコロニー数 ０．１Ｍ０ａＯ１，，３６Ｃ，３０分間処理５　　　　
　　　　　　＜　１０　’ １０　　　　　　　　　２．３Ｘ１０’５０　　　　　
　　　　３．８Ｘ１０−４１００　　　　　　　　　３
．２Ｘ１０−３２００　　　　　　　　・　８．２Ｘ１
０−６※　薬剤含有培地上に生育したコロニー数７０Ｍ
培地上に生育したコロニー数 ｐＨ１０，５，３６Ｃ，３０分間処理 このようにして得られた組み換え株のｖ９からＦＥＲＭ
−Ｐ　　６４１４ ＡＪ１１７９１を選びその薬剤耐性を次のようにして調
べた。

Ｌ−アルギニン、グアニンそして所定の量の薬剤を含む
ＡＪ１１７８９の最少培地を試験管に４０７πｅ宛分注
し、これに一定量の試験菌を接種し３１５Ｃで２４時間
振盪培養し、培養漱の５６２ｎｍに於る吸光度を測定し
生育度を調べ、相対生育度を求めた。その結果を第４表
に示す。

この結果より、プレートに出現したコロニーは両親株の
表現型を有するコリネバクテリウム属とバチルス属との
組換え株であシ、これらの組換え株はその表現型に関し
ては全く安定であった。

組み換え株ＡＪ１１７９１を１０′ν／８グアニンを含
むコリネバクテリウム・エキイＡ、７１１７８９の最少
澱粉培地（グルコースの代シに澱粉を炭素源として使用
）を用いて生育を調べた結果を第５表に示す。

第５表　ＡＪｌｌ、７９１の澱粉資化能培養時間　　　
生育度（ＯＤａｔ　５６２ｎｍ）（Ｈｒ）　　　ＡＪ１
１７８９　　ＡＪ１１７９１’ＡＪ１１７９０１５　　
　　０．０４．　　　　０．３０　　　　０．４６３０
　　　　　　０．０２　　　　　０．５３　　　　　　
０．６８この結果から、組み換え株ＡＪ１１７９１は両
親株の表現型の他に、再に澱粉資化能を有するものであ
ることが確認された。

次に、組み換え株Ａ、Ｔ１１７９１の５１−イノシン酸
の生産性を調べた。

第６表に示した組成の培地（ＰＨ６，５）を最終２０ｔ
ｒｔｌになるよう肩付フラスコに入れ、１１５Ｃにて１
０分間加熱殺菌した。

第６表　５゛−イノシン酸生産用培地 グルコース　　　　　　　１ｏｏ　　ｙ７Ｊ硫　　　　
安　　　　　　　　　　　５　　〃に’Ｈ，Ｐ０．　　
１２　／１ 酵母エキス　　　　　　　　１０／／ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，０６ｎ パントテン酸カルシウム　　　　１０　τ／！パ２アミ
ノ安息香酸　　　　　　１０　　〃アデニン　　　　　
　８０〃 ビオチン　　　　　１，０００γ／ｊ 大豆蛋白酸加水分解物　　　　　３０　　ｍｅ／ＺＦｅ
ＳＯ４・７Ｈ，０１００’９／ＩｅＭｎＳＯ，−４Ｈ，
０１０ｔｔ グ２．タミ７酸　　　　　　　　　　２０　　ｇ／Ｚキ
サンチン　　　　　　　　　１００　ゝＦｌ／ｌｋ炭酸
カルシウム（別乾殺菌）　　　２０　　〃これに第７表
に示す菌株を３白金耳接種し、３４ｃで５日間振盪培養
（１１０回／分、７ｃｍ振幅）し培地中に蓄積した５Ｉ
−イノシン酸の蓄積を第７表に示す。

Ａ、Ｊ１１７８９　　　　　　１．５０ＡＪ１１７９０
　　　　　　０ 実施例２ Ｓ−（２−アミノエチル）−シスチン耐性（ＡＥＣ！ｒ
）、α−クロロカプロラクタム耐性（ｃｃＬｒ）、　ア
ラニン要求性（Ａｌａ−）のＬ　　ＩＪレジン産菌ブレ
ビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ　１１０ｌ
１０８２ＦＫＲ３９４０及びアデニン要求性（Ａａ’ｅ
−）のバチルス・ズブチリスＡＪ　１１１ｓ　９　ＦＥ
Ｒ＃ｐ４ｘｚｘを夫々実施例１と同様の方法で培養し、
細胞のプロトプラスト化を行った。尚、　ＡＪ１１０８
２をプロトプラスト化する際には第８表の最少培地を使
用した。

第８表　Ａ、７１１０８２の最少培地（ｐＨ７，４）シ
ュークロース　　　　　　　　　２．Ｏｆ！／ｄｌｌ硫
酸アンモニウム　　　　　　　　１．ＯｎＫＨ，ＰＯ４
０，１ｕ ＭｇＳＯ，−７Ｈ，ＯＯ，０４／／ Ｆｅ、Ｍｎイオ７　　　　　　　　　　２．Ｏｐｐｍビ
オチン　　　　　　　　５ｏ　　　μＶ！サイアミイ塩
酸塩　　　　　　　２００尿　　　素　　　　　　　　
　　　　　０．２５　　ｇ／ｄｌｌＬ−アラニン　　　
　　　　　　　４０　　　”ｐ／ｄニュチン酸アミド　
　　　　　　　５　　　〃アデニン　　　　　　　　１
０　　　ｔｔグルタミン酸ナトリウム　　　　　ｌ　Ｏ
ｎ次いで夫々のプロトプラストを混合した後遠心分離し
、１００ｍＭの塩化カルシウムを含ムｐＨ１０，５のＨ
Ｐ高張液に懸濁し、これに：（３％ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ−６０００）水溶液を９倍量加え、３６Ｃ
に３０分間保持してプロトプラストの融合を行った。

プロトプラストを遠心分離して集め、これをＡ］ｉＣ！
３０００μｆ／ｙｔｔｌ及び０．５Ｍコハク酸ナトリウ
ムを含む澱粉を炭素源とする第８表の最少寒天培地に接
種し、同培地（０８％寒天培地）を重層し、３１５Ｃで
１４日間培養し、プレート上に出現したコロニーを組み
換え株（ＡＥＯ耐性、澱粉資化能）として分離した。

その出現頻度は】Ｏ〜１０　であった。尚、塩化カルシ
ウムを添加しない場合、及びｐＨ６，５でも同様の実験
を行ったが、このような場合には株を選びその澱粉資化
能及びＡＥＣに対する耐性度を調べた。澱粉を炭素源と
する第８表の最少培地Ｋ　Ａ　Ｅ　ＯヲＯ〜７５００　
ｔＪ／ｍｅ添加し、４．　Ｏ＋ｒｔｅ宛試験管に分注し
、試験菌を一定量宛接種し３１．５ｔ：’で２４時間振
盪培養し、２６倍に希釈した後５６２ｎｍに於る吸光度
を測定したその結果を第９表に示す。

第９表　澱粉培地での生育度 ＡＥＯ濃度　　ＡＪ　１１０８２　　ＡＪｌ１１５９　
　Ａ、Ｔ１１７９２（μｆ／ｍ１） ０　　　　　　　　０．０６　　　　　　　０．３４　
　　　　　　０．４２１０００　　　　　　　　０．０
３　　　　　　　０．１１　　　　　　　０．３５５０
００　　　　　　　　０．００　　　　　　　０．０６
　　　　　　　０．３３７５００　　　　　　　　０．
００　　　　　　　０．０７　　　　　　　０．２９次
に、ＡＪ１１７９２　　のＬ　　＋７ジン生産性を調べ
た。

第１０表の組成の培地を２０ａｌ宛、５００ゴ容振盪フ
ラスコに入れ、１１０Ｃで１０分間蒸気殺菌した。これ
にあらかじめ、０Ｍ培地（スラント）で生育さした第１
１表に示す菌株を一白金耳づつ接種し、３１．５Ｃにて
７２時間振盪培養した。７２時間培養後の培地中のＬ　
−１７ジン生成量（Ｌ−’）ジン塩酸として）は、第１
１表のごとくであった。

澱粉　　　　　　１０１７ａ （Ｎ式）ｓ”０４　　　　　　　　　　　　４．５　　
　ｔｔＫＨ，Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．１５　　ｌｌＭｇ５Ｏ、−７Ｈ，ＯＯ，０
４／ｌ ＦｅＳＯ４−７Ｈ，０１”９／ｄｌ１ ＭｎＳＯ，−４Ｈ，０１ｔｔ プサイミン・塩酸塩　　　　　　　　２００　８ｇ７’
ｔ。

ビオチン　　　　　　　　　　１００　　　ｐ大豆蛋白
加水分解液　　　　　　　　　１．０威／ｉアデ二７　
　　　　　　　　　１０　　’ｌ／ｌがＬ−アラニン　
　　　　　　　　　　４０　　〃消泡剤　　　　　　　
２０〃 炭酸カルシウム（別殺菌）　　　　　　　５　　ｆ／ｄ
ｌｌｐＨ７，２（ＫＯＨで中和） 第１１表 融合株　ＡＪ１１７９２　　５．５ バチルス・ズブチリス　　　　　　　ＡＪ１１１５９　
　０第１１表に示すように、融合株の親株はＬ　−ＩＪ
レジン全く生成しないが、融合株は澱粉を炭素源として
Ｌ−リジンを著量蓄積することかで外る。

この性質は少くとも１０代継代培養を続けた場合でも安
定に保持されることが確認された。

特許出願人　味の素株式会社 第１頁の続き ［相］発　明　者　平馬晴雄 横浜市瀬谷区ニッ橋町４６８ ０発　明　者　池田茂穂 横浜市港南区日野町２３００−２１３ ０発　明　者　吉井寛依 横浜市金沢区釜利谷町２１５３−７５

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム檎の細菌
   のプロトプラストとバチルス属細菌のプロトプラストを
   ポリエチレングリコールと１０ｍＭ以子のカルシウムイ
   オンを含むｐＨ８，０〜１２０の画帳液中で細胞融合せ
   しめることを特徴とする細菌のプロトプラストｍ合法。