SU1682392A1 - Способ получени штаммов возбудител чумы с HFR - свойствами - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологии , в частности к генетике возбудител  чумы , и может быть использовано дл  получени  Hfr-доноров возбудител . Целью изобретени   вл етс  повышение частоты образовани  Hfr-штаммов. Способ заключаетс  в том, что плазмиду F lacj Tn ввод т в бактериальные клетки, содержащие плазмиду кальцийзависимости (pCad). Транс- коныогантывыращиваютна магн иево-аксалатном агаре, приготовленном на основе среды Эндо. Отбор кланов с Н(г свойствами осуществл ют по сочетанию признаков кальцийзависимости и способности сбраживать лактозу и последующей проверкой на перекос хромосомных маркеров в спот-тесте. Эффективность способа 100%, в расчете на выделенные Cad ас+-клоны. 6

Description

Изобретение относитс  к микробиологии , в частности к генетике возбудител  чумы , и может быть использовано дл  получени  Hfr-доноров возбудител .

Целью изобретени   вл етс  повышение частоты образовани  Hfr-штаммов.

Способ заключаетс  в том, что в бактериальные клетки ввод т гетерологичную конъюгативную плазмиду F lac .Tn, транс- коньюганты рассевают до изолированных клонов и отбирают клоны, имеющие Hfr-доноров , однако при этом в качестве реципиентов F lac;:Tn используют штаммы возбудител  чумы, несущие плазмиду кальцийзависимости (pCad), в качестве селективной среды дл  отбора Hfr-доноров магниево-оксалатный агар на основе среды Эндо и отбирают клоны с сочетанием признака кальцийзависимости (Cad и способности сбраживать лактозу (Lac4).

Плазмида pCad J.pestis, играюща  большую функцию в обеспечении свойства вирулентности, детерминирует, нар ду с другими признаками, зависимость роста клеток от ионов Са2+ при 37°С. Клоны, несущие pCad, не способны расти на магниево- оксалатном агаре, дефектном по содержанию ионов, кальци , при указанной температуре, но вырастают при 28°С.

Плазмида pCad возбудител  чумы несовместима с конъюгативными плазмидами

Оч 00

ю

OJ

чэ

N3

группы IncFI, в том числе F lsc;;Tn. При передаче последней штамму pCad+ наблюдаетс  выраженна  элиминаци  как резидентной , так и,. в особенности, введенной плазмиды (при раздельном нахождении в клетках возбудител  оба репликона сохран ютс  достаточно стабильно). О наличии F1 1ас::Тп в клонах суд т по устойчивости к хлорамфенико лу (в случае Тп9) или канами- цу Тп5), а также по способности сбраживать лактозу и, соответственно, по формированию окрашенных колоний на среде Эндо (природные штаммы l.pestls лактозонега- тивны).

Предлагаема  комбинированна  магни- ево-оксалатна  среда на основе агара Эндо позвол ет одновременно тестировать микробную попул цию по признакам, кодируемым обеими плазмидами, При высеве на нее трансконьюгантов pCad F lac:;Tn большинство субклонов (69-91%, в среднем 77%) кальцийзависимы, не способны сбраживать лактозу и несут, по данным последующего скрининг-электрофореза, лишь резидентную плазмиду. Друга  значительна  фототипическа  группа(9-30%, веред- нем 17%) - Cad Lac+ - обнаруживает лишь фракцию плазмидной ДНК, соответствующую по молекул рной массе F ac;Jn.

Кроме того, в каждом опыте вы вл етс  относительно небольшое количество (1- 12% в среднем 5%) субклонов, сохранивших как кальцийзависимость, так и лактозопозитмвность (Cad+ Lac4). Однако электрофоретический анализ показывает наличие у них только одной автономной плазмиды - pCad, что свидетельствует о веро тной интеграции F lacrfFn с бактериальной хромосомой. Изучение донорной активности позвол ет получить генетические доказательства интеграции: практически все тестируемые субклоны обладают свойствами Hfr-доноров. Они осуществл ют градиентный перенос хромосомных генов , в р де случаев - с высокой частотой (до ) и не передают маркеры р |ас:;Гп (Lac+ - признак и устойчивость к соответствующему антибиотику).

Показано, что транспозоны 1 п9 и Тп5 транслоцируютс  из плазмиды F lac в хромосому возбудител  чумы с чрезвычайно высокой частотой - до 100% в расчете на клетку, потер вшую вектор. Таким образом, при передаче F ас::Тп возбудителю происходит спонтанное формирование транспо- зонных областей гомологии (на конъюгативной плазмиде и в хромосоме). Далее имеет место гомологична  рекомбинаци , привод ща  к внедрению Flacrlfn в бактериальную хромосому и образованию

Hfr-доноров. Этот процесс, по видимому также идет с высокой эффективностью, поскольку , по данным изучени  попул цион- ного состава трансконъюгантов pCad F1

lac::Tn, дол  клонов с интегрированной коньюгативной плазмидой составл ет 1- 12%.

При совместном нахождении в клетках возбудител  чумы F ac::Tn обычно сохран 0 етс  менее стойко, чем p.Cad. Интеграци  с хромосомой, веро тно, приводит к повышению стабильности наследовани  F lac::Tn, что внешне про вл етс  в возникновении клонов Cad+L.acT. Использование комбини5 рованной селективной среды позвол ет по сочетанию этих двух фенотипичных признаков целенаправленно, с высокой эффективностью отбирать клоны, несущие вставку конъюгативной плазмиды в хромосому, а

0 следовательно, искомые Hfr-доноры.

Пример. Плазмиду F 1ас::Тп9 (F ас::Тгп передают в межродовых конъюга- ционных скрещивани х от Escherfchla coll AB51-1I гесА штамму возбудител  чумы, не5 сущему плазмиду кальцийзависимости (например , pestis 358/12).

Дл  этого 3-часовую культуру донора, выращенную в бульоне Хоттингера (рН 7,2) на качалке до концентрации около 10

0 м.к./мл, смешивают с ночной бульонной культурой реципиента в соотношении 1:2 и инкубируют при 28°С в течение 3 ч. Конъю- гационную смесь высевают на пластинки агара Хоттингера (рН 7,2) с добавлением

5 полимиксина в концентрации 100 ед/мл (контрселективный агенгвозбудителю чумы свойственна природна  устойчивость к пол- имиксину), а также антибиотика в соответствии с маркером транспозона - 25 мкг/мл

0 хлорам феникола (в случае Тп9) или канами- цмна (при использовании Тп5).

Выросшие через трое суток трансконь- югэнты (отбирают 4-5 клонов) после однократного пассажа на селективной среде

5 пересевают петлей на агар Эндо, изучают с помощью скрининг-электрофореза плазмидной ДНК и одновременно высевают на комбинированную магниево-оксалатную среду на основе агара Эндо.

0 Дл  ее приготовлени  к 150 мл гор чей среды Эндо (t 50-55°С) добавл ют 14 мл 0,25 М Ъксалата натри , смесь взбалтывают и через 2-4 мин внос т 7 мл 0,5 М сульфата или хлорида магни . После перемешивани 

5 среда готова к разливу.

Растворы солей стерилизуют автоклавированием при 110°С (0,5 атм) в течение 30 мин.

Каждый клон высевают на 2-3 чашки

так, чтобы получить 200-300 изолированных

колоний на агарной пластине. Посевы инкубируют двое суток при 37°С, после чего отмечают выросшие колонии кальцийнеза- висимых субклонов и перенос т чашки в термостат при 28°С. Через сутки отмечают доросшие - кальцийзависимые колонии. Из них отбирают лактозопозитивные варианты (около 50 субклонов), отсевают на агар Хот- тингера, провер ют на наличие маркера транспозона, изучают с помощью электрофореза клеточных лизатов и используют в качестве доноров хромосомных генов в спотскрещивани х со стрептомицино- устойчивыми ауксотрофными мутантами возбудител  чумы.

Использование нескольких независимых нитрозогуанидин- или транспозонмн- дуцированныхреципиентов с

повреждением одного - двух маркеров позвол ет идентифицировать Шт-штаммы с различными 0-пунктами переноса,

Ночные бульонные культуры рецмпиен- тных штаммов с помощью металлических рапликаторов нанос т на поверхность подсушенных чашек с селективной средой (ми- нимальный агар с добавлением стрептомицина в концентрации 100 мкг/мл и.факторов роста в соответствии с природой ауксотрофностью реципиента, исключа  питательные вещества, требуемые в результате мутации).

Концентраци  аминокислот (в а -форме) и азотистых оснований в среде составл ет 10 мкг/мл, тиамина и никотиновой кислоты 1 мкг/мл.

После впитывани  в агар на п тна культуры реципиента с помощью таких же репликаторов нанос т ночные бульонные культуры предполагаемых Hfr-доноров. Через 3-6 сут отмечают рост рекомбинантов.

Доноры, дающие наибольшее количество колоний рекомбинантов в слот-тестах, излечивают от плазмиды pCad, наличие которой может неблагопри тно сказыватьс  на стабильности Hfr-штамма. С этой целью

культуры высевают на магниево-оксалат- ный агар, отбирают по три капьцийнезави- симых субклонэ и тестируют их с помощью скрининг-электрофореза. По одному производному , потер вшему pCad, отбирают дл  дальнейшего изучени  в развернутых скре- дивзни х с полиаухсотрофными нитрозогу- анидининдуцировачными мутантами возбудител , чумы.

Преимущество предлагаемого способа заключаетс  прежде всего в чрезвычайно высокой эффективности (100% в расчете на изолированный Cad Lac -клон по сравнению с 10%-ной эффективностью известного

способа. Способ весьма надежен и позвол ет в короткие сроки (примерно а течение трех недель от момента посева J.pestls рСаЬ+дл  скрещивани  с E.coil Ffac::Tn идо учета результатов спот-скрещиваний) целенаправленно получать дес тки Hfr-доноров с различными сайтами интеграции плазмиды F lac::Tn, в то врем  как получение Hfr- доноров с помощью известного способа не всегда воспроизводимо ввиду весьма слабсго роста возбудител  при 40°С. Способ менее трудоемок, так как в нем отсуствует стади  выращивани  возбудител  в бульоне в течение 18ч.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  штаммов возбудител  чумы с Hfr-саойствами, включающий введение в бактериальные клетки плазмиды F ас::Тп, выращивание клеток на средах, содержащих антибиотик, детерминируемый

   транспозоном плазмиды, отбор Hfr-штам- мов, сохран ющих плазмидные маркеры, отличающийс  тем, что, с целью повышени  частоты образовани  Hfr- штаммов, в качестве реципиентов плазмиды F iac::Tn используют штаммы возбудител  чумы, содержащие плазмиду кальцийзависимости, а отбирают Hfr-штам- мы, сочетающие признаки кальцийзависимости и способность сбраживать лактозу.