JPS61128897A - 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法Info
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- JPS61128897A JPS61128897A JP25004184A JP25004184A JPS61128897A JP S61128897 A JPS61128897 A JP S61128897A JP 25004184 A JP25004184 A JP 25004184A JP 25004184 A JP25004184 A JP 25004184A JP S61128897 A JPS61128897 A JP S61128897A
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- kinase activity
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
〈産業上の利用分野〉
本発明は発酵法によるし一７エニルアラニン（以下、フ
ェニルアラニンと記す。）の製造法に関する。フェニル
アラニンはペプチド系甘味料であるアス）４ルテームの
原料として重要である〇〈従来の技術〉 従来発酵法によるフェニルアラニンの製造法としてはブ
レビバクテリウム属又はミクロコツカス属細菌のＬ−チ
ロシン要求菌を使用する方法（特公昭３７．−６３４５
．） 、フェニルアジニンアナログに耐性を有する変異
株を使用する方法（特公昭５ｌ−２８７１２）などが知
られている。
ェニルアラニンと記す。）の製造法に関する。フェニル
アラニンはペプチド系甘味料であるアス）４ルテームの
原料として重要である〇〈従来の技術〉 従来発酵法によるフェニルアラニンの製造法としてはブ
レビバクテリウム属又はミクロコツカス属細菌のＬ−チ
ロシン要求菌を使用する方法（特公昭３７．−６３４５
．） 、フェニルアジニンアナログに耐性を有する変異
株を使用する方法（特公昭５ｌ−２８７１２）などが知
られている。
〈本発明が解決しようとする問題点〉
本発明が解決しようとする問題点は更に安価にフェニル
アラニンを製造することにある。
アラニンを製造することにある。
〈問題点を解決するための手段〉
本発明者等は発酵法によシ更に安価にフェニルアラニン
を製造する方法を開発すべく研究を行なっ°た結果、ブ
レビバクテリウム属細菌に７エニルアラニン生産能とと
もにピルビン酸キナーゼ活性の低下という性質を併せ持
たせたところ、従来のピルビン酸キナーゼ活性の低下７
持たないフェニルアラニン生産菌よシ更に大量に７エニ
ルアラニンを生産することを見い出した。この発明はこ
の知見に基づいて更に研究の結果完成されたものである
。
を製造する方法を開発すべく研究を行なっ°た結果、ブ
レビバクテリウム属細菌に７エニルアラニン生産能とと
もにピルビン酸キナーゼ活性の低下という性質を併せ持
たせたところ、従来のピルビン酸キナーゼ活性の低下７
持たないフェニルアラニン生産菌よシ更に大量に７エニ
ルアラニンを生産することを見い出した。この発明はこ
の知見に基づいて更に研究の結果完成されたものである
。
本発明の７エニルアラニン製造法において用いられる微
生物は、ブレビバクテリウム属に属しピルビン酸キナー
ゼ活性が低下していてかつフェニルアラニン生産能に必
要な性質、例えばｍ−フロロフェニルアラニン耐性を有
する変異株である。
生物は、ブレビバクテリウム属に属しピルビン酸キナー
ゼ活性が低下していてかつフェニルアラニン生産能に必
要な性質、例えばｍ−フロロフェニルアラニン耐性を有
する変異株である。
これらの性質の他に更にＬ−チロシン要求性、他の７エ
ニルアラニンアナログ耐性、チロシンアナログ耐性、５
−メチルトリプトファン耐性、デコイニン感受性などを
付与すると生産能を更に向上させることができる。
ニルアラニンアナログ耐性、チロシンアナログ耐性、５
−メチルトリプトファン耐性、デコイニン感受性などを
付与すると生産能を更に向上させることができる。
本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルタミン酸生
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
であシ、例えば次のような菌株をあげることができる。
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
であシ、例えば次のような菌株をあげることができる。
ブレビバクテリウム フラバムＡＴＣＣ１４０６７プレ
ビパクテリウム ディノ守りカタムＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ブレビバクテリウム ロゼラムＡＴＣＣ１３８
２５本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株と
して変異操作を施して、ピルビン酸キナーゼ活性の低下
及びンエニルアラニン生産能を付与することによって得
られる。なお変異操作は通常の方法、例えば紫外線照射
或いはＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニ
ジン（以下、ＮＧと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理に
よって行なうことができる。
ビパクテリウム ディノ守りカタムＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９ブレビバクテリウム ロゼラムＡＴＣＣ１３８
２５本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株と
して変異操作を施して、ピルビン酸キナーゼ活性の低下
及びンエニルアラニン生産能を付与することによって得
られる。なお変異操作は通常の方法、例えば紫外線照射
或いはＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニ
ジン（以下、ＮＧと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理に
よって行なうことができる。
なおピルビン酸キナーゼ活性の低下した変異株は親株を
変異処理し変異処理した菌体のピルビン酸キナーゼ活性
を測定し、選択することによって得ることができる（％
開昭５８−１７０４８７）。
変異処理し変異処理した菌体のピルビン酸キナーゼ活性
を測定し、選択することによって得ることができる（％
開昭５８−１７０４８７）。
以下に本発明の使用菌株の一例プレビパクテリウムフラ
バムＡＪ−１２１７９（Ｆ酵■−Ｐグｑ／３）の具体的
誘導方法Ｚ示す。即ち特願昭５８−１７０４８７記載の
ピルビン酸キナーゼ活性低下株プレビパクテリウムフラ
パムＡＪ−１１９５５（ＦＥＲＭ−Ｐ６６６５）を親株
として、これよりフェニルアラニンアナログ耐性株を誘
導した。プレヒハクテリウムフラパムＡＪ−１１９５５
ヲ１５０μｇ／ｍｌのＮＧで３０℃１５分間処理した（
生残率２．０％）。ついで第−表に示す合成培地に親株
が生育できない濃度の８００４／ｙｙｒｌになるように
フェニルアラニンのアナログの一つであるＤＬ −ｍ−
７０ロフエニルアラニンを添加して平板培地を作製し、
これに変異処理したＡＪ−１１９５５株を塗布し、３０
℃１０日間放置後、コロニーとして生育する菌株即ちｍ
−７０口フェニルアラニン耐性変異株を採取し、このう
ちフェニルアラニン生産能のすぐれた変異株ＡＪ−１２
１７９（ＦＥＲＭ−Ｐ’７’？／３）（ピルビン酸キナ
ーゼ低下、ｍ−フロロフェニルアラニン耐性、５−（２
−アミノエチル）−Ｌ−システィン耐性）を採取した。
バムＡＪ−１２１７９（Ｆ酵■−Ｐグｑ／３）の具体的
誘導方法Ｚ示す。即ち特願昭５８−１７０４８７記載の
ピルビン酸キナーゼ活性低下株プレビパクテリウムフラ
パムＡＪ−１１９５５（ＦＥＲＭ−Ｐ６６６５）を親株
として、これよりフェニルアラニンアナログ耐性株を誘
導した。プレヒハクテリウムフラパムＡＪ−１１９５５
ヲ１５０μｇ／ｍｌのＮＧで３０℃１５分間処理した（
生残率２．０％）。ついで第−表に示す合成培地に親株
が生育できない濃度の８００４／ｙｙｒｌになるように
フェニルアラニンのアナログの一つであるＤＬ −ｍ−
７０ロフエニルアラニンを添加して平板培地を作製し、
これに変異処理したＡＪ−１１９５５株を塗布し、３０
℃１０日間放置後、コロニーとして生育する菌株即ちｍ
−７０口フェニルアラニン耐性変異株を採取し、このう
ちフェニルアラニン生産能のすぐれた変異株ＡＪ−１２
１７９（ＦＥＲＭ−Ｐ’７’？／３）（ピルビン酸キナ
ーゼ低下、ｍ−フロロフェニルアラニン耐性、５−（２
−アミノエチル）−Ｌ−システィン耐性）を採取した。
この変異株は実施例に示すようにピルビン酸キナーゼ活
性を有するｍ−フロロフェニルアラニン耐性フェニルア
ラニン生産変異株ＡＪ−１２１８０（ＦＥＲＭ−Ｐ ７
９／４ ）よりフェニルアラニンヲ１．８倍も多く生
成した。
性を有するｍ−フロロフェニルアラニン耐性フェニルア
ラニン生産変異株ＡＪ−１２１８０（ＦＥＲＭ−Ｐ ７
９／４ ）よりフェニルアラニンヲ１．８倍も多く生
成した。
次にこの操作によって得られた変異株ＡＪ−１２１７９
のピルビン酸キナ７ゼ活性及びｍ−フロロフェニルアラ
ニンに対する耐性の度合を親株ＡＪ−１１９５５、野生
株ＡＴＣＣ−１４０６７、ピルビン酸キナーゼ活性？有
するフェニルアラニン生産株ＡＪ−１２１８０と比較し
た結果をそれぞれ第ｆ Ｉ： Ａ 二表、第三表に示した。
のピルビン酸キナ７ゼ活性及びｍ−フロロフェニルアラ
ニンに対する耐性の度合を親株ＡＪ−１１９５５、野生
株ＡＴＣＣ−１４０６７、ピルビン酸キナーゼ活性？有
するフェニルアラニン生産株ＡＪ−１２１８０と比較し
た結果をそれぞれ第ｆ Ｉ： Ａ 二表、第三表に示した。
なお、ピルビン酸キナーゼ活性の測定はＡｇｒ ｉ ｃ
。
。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、４８ 、 （５） １１８９〜
１１９７（１９８４）に従って行なった。またｍ−フロ
ロフェニルアラニンに対する耐性の度合は次のように調
べた。第−表に示す合成培地にＤＬ −ｍ−７０ロフエ
ニルアラニンを第三表に示した濃度になるように溶解し
て、平板培地（直径８．５ ｃｔｎ）を作り、各々の培
地に第四表に示した培地に生育した菌をおよそ１０コ接
種した後３０℃で４日間培養を行ない生成したコロニー
数乞調べた。
１１９７（１９８４）に従って行なった。またｍ−フロ
ロフェニルアラニンに対する耐性の度合は次のように調
べた。第−表に示す合成培地にＤＬ −ｍ−７０ロフエ
ニルアラニンを第三表に示した濃度になるように溶解し
て、平板培地（直径８．５ ｃｔｎ）を作り、各々の培
地に第四表に示した培地に生育した菌をおよそ１０コ接
種した後３０℃で４日間培養を行ない生成したコロニー
数乞調べた。
第三表及び第三表に示すようにＡＪ−１２１７９株はピ
ルビン酸キナーゼの低下及びｍ−７０ロフエニルアラニ
ンに対して耐性の両性質を有していることが判明した。
ルビン酸キナーゼの低下及びｍ−７０ロフエニルアラニ
ンに対して耐性の両性質を有していることが判明した。
なお本発明で言うｍ−フロロフェニルアラニン耐性とは
上記培養条件下でＤＬ−ｍ−７０ローエニルアラニンを
３０００μ９Ａｎｌ含す上記培地に微生物をおよそ１０
７コ接種し３０℃で４日間培養後１０００コ以上のコロ
ニーを生成する場合を言う。
上記培養条件下でＤＬ−ｍ−７０ローエニルアラニンを
３０００μ９Ａｎｌ含す上記培地に微生物をおよそ１０
７コ接種し３０℃で４日間培養後１０００コ以上のコロ
ニーを生成する場合を言う。
フェニルアラニン生産用の培養培地は特に制限するとこ
ろはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機
微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源として
は炭水化物（グルコース、フラクトース或いはデンプン
、セルロース等の加水分解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸
、クエン酸等）、アルコール（グリセリン、エタノール
等）、或いは炭化水素（ノルマル・ぐラフイン等）が使
用できる。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、アンモニアガス、その他を、無機塩トしてはリン酸
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩
、その他微量金属塩等を必要に応じて使用する。有機微
量栄養素としては、栄養要求性のある場合には該当する
アミノ酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量
添加し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ酸
、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分解物）、酵母
エキス、ベゾトン、カザミノ酸等が使用できる。
ろはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機
微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源として
は炭水化物（グルコース、フラクトース或いはデンプン
、セルロース等の加水分解物、糖蜜等）、有機酸（酢酸
、クエン酸等）、アルコール（グリセリン、エタノール
等）、或いは炭化水素（ノルマル・ぐラフイン等）が使
用できる。窒素源としては硫酸アンモニウム、尿素、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、アンモニアガス、その他を、無機塩トしてはリン酸
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩
、その他微量金属塩等を必要に応じて使用する。有機微
量栄養素としては、栄養要求性のある場合には該当する
アミノ酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量
添加し、必要に応じて更に生育促進物質としてアミノ酸
、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分解物）、酵母
エキス、ベゾトン、カザミノ酸等が使用できる。
培養条件は通常の方法でＰＨ５ないし９、温度は２０な
いし４０℃で好気的条件下に：２４ないし７２時間培養
すれば良い。培養中にＰＨが下がる場合には□炭酸カル
シウム乞別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモ
ニアガス等のアルカリで中和する。又有機酸を炭素源と
する場合はｐＨの上昇な鉱酸又は有機酸で中和する。
□ フェニルアラニンの単離採取は常法によって行いうる。
いし４０℃で好気的条件下に：２４ないし７２時間培養
すれば良い。培養中にＰＨが下がる場合には□炭酸カル
シウム乞別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモ
ニアガス等のアルカリで中和する。又有機酸を炭素源と
する場合はｐＨの上昇な鉱酸又は有機酸で中和する。
□ フェニルアラニンの単離採取は常法によって行いうる。
得られたものけイー／’ｅ−クロマトグラム上のＲｆ値
及び微生物定量法による生物活性値により、フェニルア
ラニン標品のそれらと一致することを確めフェニルアラ
ニンと同定した。
及び微生物定量法による生物活性値により、フェニルア
ラニン標品のそれらと一致することを確めフェニルアラ
ニンと同定した。
フェニルアラニンの定量はロイコノストックメセンテロ
イデス（ＡＴＣＣ８０４２）を用いる微生物定量法に従
って行なった。
イデス（ＡＴＣＣ８０４２）を用いる微生物定量法に従
って行なった。
以下、実施例にて説明する。
実施例１
下記第五衣に示した組成の７エニルアジニン生産用培地
２Ｑ ｒａｌを５００ｍ１のフラスコに分注し、これに
第六表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ３０℃
で７２時間振盪培養した。それぞれの培養液中のフェニ
ルアラニン生成量は第六表の如くであった。
２Ｑ ｒａｌを５００ｍ１のフラスコに分注し、これに
第六表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ３０℃
で７２時間振盪培養した。それぞれの培養液中のフェニ
ルアラニン生成量は第六表の如くであった。
第−表 合成培地組成
グルコース ２０ｇ／を
硫酸アンモニウム ５ 〃尿 素
２ ＬＪリン酸１カリウム
ＩＩ硫酸マグネシウム １
リ硫酸第１鉄 １０■／を 硫酸マンガン ８ 〃 ｄ−ビオチン ５０１４／ｌビタミンＢ ・
塩酸塩 ２０００μｇ／１寒 天
２０９／ｌＰＨ６，６ 第二衣 菌株のピルビン酸キナーゼ活性ＡＪ−１１９５
５０，２ ＡＪ−１２１８０９８ ／ａ ） 第三衣 菌株のｍ−フロロフェニルアラニン耐性度ＤＬ
−ｍ−７ｏｏフゴマレアラニン 生成コロニー数
／平板培地濃度（μＥ／／ＴＬｌ）ＡＪ−１１９５５Ａ
Ｊ−１２１８０ＡＪ−１２１７９０＋＋十 ３０００ − ＋
＋（＋）はコロニー数１０００以上を表わし、（−
）はコロニー数がＯの場合を示す。
２ ＬＪリン酸１カリウム
ＩＩ硫酸マグネシウム １
リ硫酸第１鉄 １０■／を 硫酸マンガン ８ 〃 ｄ−ビオチン ５０１４／ｌビタミンＢ ・
塩酸塩 ２０００μｇ／１寒 天
２０９／ｌＰＨ６，６ 第二衣 菌株のピルビン酸キナーゼ活性ＡＪ−１１９５
５０，２ ＡＪ−１２１８０９８ ／ａ ） 第三衣 菌株のｍ−フロロフェニルアラニン耐性度ＤＬ
−ｍ−７ｏｏフゴマレアラニン 生成コロニー数
／平板培地濃度（μＥ／／ＴＬｌ）ＡＪ−１１９５５Ａ
Ｊ−１２１８０ＡＪ−１２１７９０＋＋十 ３０００ − ＋
＋（＋）はコロニー数１０００以上を表わし、（−
）はコロニー数がＯの場合を示す。
第四衣 シード培養培地
グルコース ２ＣＪｇ／を
硫酸アンモニウム １ｏｇ７を尿 素
３ ９／ｌリン酸１カリ
ウム Ｉ Ｖｔ硫酸マグネシウム
０．４９／を硫酸第１鉄 １０ｍ９／
を 硫酸マンガン ８ ｍｌ／ｌｄ−ビオチン
３００μｇ／ｌビタミンＢ、・塩酸塩
１００ μｇ／ｌｐＨ７，３ 第五衣 フェニルアラニン生産用培地 グルコース １３０ｇ／を 硫酸ア、モユウム ２５９／ｌフマル酸
１２ｇ／を
３ ９／ｌリン酸１カリ
ウム Ｉ Ｖｔ硫酸マグネシウム
０．４９／を硫酸第１鉄 １０ｍ９／
を 硫酸マンガン ８ ｍｌ／ｌｄ−ビオチン
３００μｇ／ｌビタミンＢ、・塩酸塩
１００ μｇ／ｌｐＨ７，３ 第五衣 フェニルアラニン生産用培地 グルコース １３０ｇ／を 硫酸ア、モユウム ２５９／ｌフマル酸
１２ｇ／を
Claims (1)
- ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キナーゼ活性
が低下し、かつＬ−フェニルアラニン生産能を有する微
生物を液体培地中に好気的に培養し、培養液中にＬ−フ
ェニルアラニンを生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とするＬ−フェニルアラニンの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25004184A JPS61128897A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25004184A JPS61128897A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61128897A true JPS61128897A (ja) | 1986-06-16 |
| JPH0429354B2 JPH0429354B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=17201942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25004184A Granted JPS61128897A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61128897A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1134283A1 (en) * | 2000-03-03 | 2001-09-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-Phenylalanine |
| CN103319349A (zh) * | 2013-07-02 | 2013-09-25 | 南京大学 | 一种间硝基苯胺生产工艺 |
-
1984
- 1984-11-27 JP JP25004184A patent/JPS61128897A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1134283A1 (en) * | 2000-03-03 | 2001-09-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-Phenylalanine |
| US6350596B2 (en) | 2000-03-03 | 2002-02-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-phenylalanine |
| CN103319349A (zh) * | 2013-07-02 | 2013-09-25 | 南京大学 | 一种间硝基苯胺生产工艺 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0429354B2 (ja) | 1992-05-18 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |