JPH0211236B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるＬ−フエニルアラニン
（以下、単にフエニルアラニンという。）の製造法
に関する。 従来、発酵法によるフエニルアラニンの製造法
としては、ブレビバクテリウム属、又はミクロコ
ツカス属細菌のチロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にチロシンを要求しかつ
５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変異株
を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニルア
ラニンアナログに耐性を有する変異株を使用する
方法（特公昭51−28712）、更にはデコイニン感受
性変異株を使用する方法（特公昭56−64793）等
が知られている。 本発明者等は更に効率良くフエニルアラニンを
発酵生産する方法を開発することを目的として研
究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属又はコリ
ネバクテリウム属のフエニルアラニン生産菌に桂
皮酸又はスチリル酢酸に耐性を付与した変異株の
中により多量のフエニルアラニンを生成、蓄積す
る菌株が存在することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明において使用される変異株はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属に属し桂皮
酸耐性を有するか、又はスチリル酢酸に耐性を有
し、更に従来知られているフエニルアラニン生産
の為に必要な性質、例えばＬ−チロシン要求性、
フエニルアラニンアナログ耐性、Ｌ−チロシン要
求性でかつトリプトフアンもしくはフエニルアラ
ニンアナログ耐性、即ちフエニルアラニン生産能
を有するものである。 本発明の方法において用いられる微生物は、具
体的には例えば ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11825 FERM−P6446（Tyr^-、CIN^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11826 FERM−P6447（Tyr^-、Sty^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11827 FERM−P6448（Tyr^-、CIN^r、Sty^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11828 FERM−P6449（Tyr^-、ｐ−Ｆ−phe^r、
５−MT^r、CIN^r、Sty^r） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ11829 FERM−P6450（ｐ−Ｆ−phe^r、CIN^r） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ11830 FERM−P6451（ｐ−Ｆ−phe^r、CIN^r、
Sty^r） Tyr^-：Ｌ−チロシン要求性 ５−MT〓：５−メチルトリプトフアン耐
性 ｐ−Ｆ−phe^r：Ｐ−フルオロフエニルアラニン耐
性 CIN^r：桂皮酸耐性 Sty^r：スチリル酢酸耐性 これらの本発明の変異株は、ブレビバクテリウ
ム属又はコリネバクテリウム属のフエニルアラニ
ン生産菌を親株とし、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NGと
略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処
理した菌体を親株が生育できないような量の桂皮
酸又はスチリル酢酸を含有する寒天平板培地で培
養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離す
ることによつて得られる。 上記ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
ウム属のフエニルアラニン生産菌は公知のものを
使用すれば良いが、具体例としては次のような変
異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3435 FERM−P1912（Tyr^-） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3432 FERM−P1844（Tyr^-、５−MT^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3437 FERM−P1914（Tyr^-、５−MT^r、ｐ−
Ｆ−phe^r） コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
AJ3244 ATCC21421（ｐ−Ｆ−phe^r） 親株としてはこの他、ブレビバクテリウム属又
はコリネバクテリウム属の微生物特にグルタミン
酸生産性細菌として知られている微生物を使用
し、桂皮酸耐性又はスチリル酢酸耐性及びフエニ
ルアラニン生産性を付与することによつて誘導す
ることができる。このような親株の例としては、
ブレビバクテリウム・デバリカタムATCC14020、
ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869、ブレビバクテリウム・ロゼウム
ATCC14066、コリネバクテリウム・アセトアシ
ドフイラムATCC13870、コリネバクテリウム・
アセトグルタミクムATCC15806、コリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC13032等が使用され
る。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及び
薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導したチロシン要求性のフエ
ニルアラニン生産菌AJ3435 FERM−P1912をイ
ーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した
菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に懸
濁し（10⁸〜10⁹個／mlの菌体を含む）、これにNG
を加え（NG濃度は250μｇ／ml）、室温で430分間
保持した。このようにしてNG処理した菌体を同
リン酸緩衝液で充分洗浄した後、桂皮酸を含む第
１表に示す最少寒天平板培地に塗布し、31.5℃で
４〜10日間培養した。 第１表 最少培地の組成 （PH7.0） 成 分 含 量 グルコース 20ｇ／ 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿 素 ２ 〃 KH₂PO₄ １ 〃 MgSO₄・7H₂O １ 〃 Fe⁺⁺、Mn⁺⁺イオン 2ppm ビオチン 50μｇ／ サイアミン塩酸塩 200 〃 DL−メチオニン 200mg／ Ｌ−チロシン 100 〃 寒天平板上に生育したコロニーのうち大きなも
のを桂皮酸耐性株として採取した。このようにし
て得られた耐性株の内には親株よりフエニルアラ
ニン生産能の優れたものが多く見い出された。こ
の内生産能の最も高い菌株AJ11825を選んだ。同
様の変異操作により、AJ3435を親株としてスチ
リル酢酸耐性株AJ11826を、更にAJ11826を親株
として桂皮酸耐性株AJ11827を選んだ。又同様の
変異操作によりAJ3437を親株として桂皮酸耐性
及びスチリル酢酸耐性を順次付与してAJ11828を
誘導した。 全く同様の方法でコリネバクテリウム・アセト
アシドフイラムAJ3244を親株として、桂皮酸耐
性株AJ11829を、更にAJ11829を親株としてスチ
リル酢酸耐性株AJ11830を夫々誘導した。次にこ
のようにして得た変異株の桂皮酸耐性度、及びス
チリル酢酸耐性度の結果を第２表に示す。

【表】 実験方法は、各変異株の菌体を第１表の最少培
地で良く洗浄した後、小型試験管に入れた第２表
に示す所定量の薬剤を含む最少寒培地（４ml）に
一定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、
培養液の560nｍに於る吸光度を測定して生育度
を求めた。第２表にはその相対生育値を示した。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
の利用可能なものであれば良く、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてはノルマルバラフイン等も単独あるいは他の
炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりフエニルアラニンが
著量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えば良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。

【表】

【表】 この培地に第４表に示すフエニルアラニン生産
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
   ム属に属し、桂皮酸又はスチリル酢酸に耐性を有
   し、Ｌ−フエニルアラニン生産能を有する微生物
   を培地中で培養してＬ−フエニルアラニンを生
   成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
   る発酵法によるＬ−フエニルアラニンの製造法。