JPH0211235B2

JPH0211235B2 -

Info

Publication number: JPH0211235B2
Application number: JP21234581A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiko Yoshihara; Hidekazu Nakano; Shigeo Ikeda; Takashi Tanaka; Katsuaki Sato; Hitoshi Ei; Hiroi Yoshii
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1981-12-29
Filing date: 1981-12-29
Publication date: 1990-03-13
Also published as: JPS58116693A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるＬ−フエニルアラニン
（以下、単にフエニルアラニンという。）の製造法
に関する。従来、発酵法によるフエニルアラニンの製造法
としては、ブレビバクテリウム属、又はミクロコ
ツカス属細菌のチロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にチロシンを要求しかつ
５−メチルトリプトフアンに耐性を有するフエニ
ルアラニン生産菌を使用する方法（特公昭51−
21079）、フエニルアラニンアナログ耐性変異株を
使用する方法（特公昭51−28712）、更にはデコイ
ニン感受性変異株を使用する方法（特公昭56−
64793）等が知られている。本発明者等は更に効率よくフエニルアラニンを
発酵生産する方法を開発することを目的として研
究を重ねた結果、ブレビバクテリウム又はコリネ
バクテリウム属のフエニルアラニン生産菌にロイ
シンアナログ耐性、あるいはロイシンアナログ耐
性に更にサルフアグアニジン耐性を付与した変異
株の中により多量のフエニルアラニンを生成する
菌株が存在することを見い出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。本発明において使用される変異株はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属に属しロイ
シンアナログに耐性を有し、更に従来知られてい
るフエニルアラニン生産の為に必要な性質、例え
ば、Ｌ−チロシン要求性、フエニルアラニンアナ
ログ耐性、Ｌ−チロシン要求性でかつトリプトフ
アンもしくはフエニルアラニンアナログ耐性、即
ちフエニルアラニン生産能を有するものである。本発明でいうロイシンアナログとはブレビバク
テリウム及びコリネバクテリウム属の微生物の生
育を阻害し、この生育阻害がＬ−ロイシンの存在
で回復されるようなものをいい、例えばβ−ヒド
ロキシルロイシン、４−アザロイシン、ノルロイ
シン、5′，5′，5′−トリフルオロロイシン、Ｄ−
ロイシン、メタアリルグリシン、β−ハイドロキ
シノルロイシン、シクロペンテアラニン等があ
る。本発明でいうフエニルアラニンアナログとは、
Ｏ−、ｍ−又はｐ−フルオロフエニルアラニン、
Ｏ−、ｍ−又はｐ−アミノフエニルアラニン、β
−フエニルセリン、シクロヘキシルアラニン、α
−アミノ−α−フエニルエタンスルホン酸、Ｏ
−、ｍ−又はｐ−プロモフエニルアラニン、β−
２−チエニルアラニン、β−３−チエニルアラニ
ン、β−２−フリルアラニン、β−２−ピロール
アラニン、１−シクロペンテン−１−アラニン、
１−シクロヘキセン−１−アラニン、２−アミノ
−４−メチル−４−ヘキセン酸、Ｓ−（1.2−ジク
ロロビニル）−システイン、β−４−ピリジルア
ラニン、β−２−ピリジルアラニン、β−４−ピ
ラゾルアラニン、ｐ−ニトロ−フエニルアラニン
等をいう。又、本発明でいうトリプトフアンアナログと
は、５−フルオロトリプトフアン、６−フルオロ
トリプトフアン、７−アザトリプトフアン、メチ
ルトリプトフアン、ナフチルアラニン、インドー
ルアクリル酸、ナフチルアクリル酸、β−（２−
ベンゾチエニル）アラニン、インドール、スチリ
ル−酢酸、トリプタゾン等をいう。本発明の方法において用いられる微生物は、具
体的には、例えばブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 11764 FERM−P6287（Tyγ^-、βHL〓）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 11758 FERM−P6283（Tyγ^-、5MT〓、
βHL〓）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 11759 FERM−P6284（Tyγ^-、5MT〓、ｐ−
Ｆ−phe〓、βHL〓）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 11760 FERM−P6285（Tyγ^-、5MT〓、ｐ−
Ｆ−phe〓、４−AL〓、SG〓）コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ 11761 FERM−P6286（ｐ−Ｆ−phe〓、Dec^s、
βHL〓） (注)Tyγ^-：Ｌ−チロシン要求性 5MT〓：５−メチルトリプトフアン
耐性ｐ−Ｆ−phe〓：Ｐ−フルオロフエニルアラ
ニン耐性 β−HL〓：β−ヒドロキシルロイシン
耐性 8AG〓：８−アザグアニン耐性 SG〓：サルフアグアニジン耐性 Dec^s：デコイニン感受性 4AL〓：４−アザロイシン耐性これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属のフエニルアラニン
生産菌を親株とし、これに通常の変異誘導操作、
例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NGと略
す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処理
した菌体を親株が生育できないような量のβ−ヒ
ドロキシルロイシンを含有する寒天平板培地で培
養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離す
ることによつて得られる。サルフアグアニジン耐性も同様の操作によつて
付与される。上記ブレビバクテリウム又はコリネバクテリウ
ム属のフエニルアラニン生産菌は公知のものを使
用すれば良いが、具体例としては次のような変異
株が使用される。ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 3435 FERM−P1912（Tyγ^-）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 3432 FERM−P1844（Tyγ^-、5MT〓）ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ 3437 FERM−P1914（Tyγ^-、5MT〓、ｐ−Ｆ
−phe〓）コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
AJ 11477 FERM−P5250（ｐ−Ｆ−phe〓、Dec^s）親株としてはこの他、ブレビバクテリウム又は
コリネバクテリウム属の微生物、特にグルタミン
酸生産性細菌として知られている微生物を使用
し、β−ヒドロキシルロイシン耐性及びフエニル
アラニン生産性を付与することによつて誘導する
ことができる。このような親株の例としては、ブ
レビバクテリウム・デバリカタムATCC14020、
ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869、ブレビバクテリウム・ロゼウム
ATCC13825、ブレビバクテリウム・サツカロリ
テイカムATCC14066、コリネバクテリウム・ア
セトアシドフイルムATCC13870、コリネバクテ
リウム・アセトグルタミクムATCC15806、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032等が
使用される。次の本発明で使用する変異株の変異誘導法及び
薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。実験例１ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導したチロシン要求性のフエ
ニルアラニン生産菌AJ 3435 FERM−P1912を
イーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育し
た菌体を集めてＭ／30リン酸緩衝液（PH7.0）に
懸濁し（１ml当り10⁸〜10⁹個の菌体を含む）、こ
れにNGを加え（NG濃度は250μｇ／ml）室温に
30分間保持した。このようにしてNG処理した菌
体を同リン酸緩衝液で充分洗滌した後β−ヒドロ
キルロイシンを含む最少寒天平板培地（第１表）
に塗布し、31.5℃で４〜10日間培養した。第１表最少培地の組成（PH7.0）成分含量グルコース 2.0ｇ／dl 尿素 0.2 硫酸アンモニウム 1.5 KH₂PO₄ 1.0 K₂HPO₄ 0.3 MgSO₄・7H₂O 0.01 ビオチン 50μｇ／サイアミン塩酸塩 100 〃 ※ Ｌ−チロシン 30mg／Ｌ−メチオニン 40 〃 Fe、Mnイオン各2ppm 平板上に上育したコロニーのうち大きなものを
β−ヒドロキシロイシン耐性株として採取した。
このようにして得られた耐性株の内には親株より
フエニルアラニン生産能の優れたものが多く見い
出された。この内生産能の最も高い菌株AJ
11764を選んだ。同様の変異誘導操作により、AJ
11764を親株として５−メチルトリプトフアン耐
性株AJ 11758、５−メチルトリプトフアン及び
ｐ−フルオロフエニルアラニン耐性を付与した
AJ 11759を誘導した。更に同様の方法でAJ
3437を親株として４−アザロイシン及びサルフア
グアニジン耐性のAJ 11760、コリネバクテリウ
ム・アセトアシドフイルムAJ 11477（ｐ−Ｆ−
phe〓、Dec^s）を親株として、β−ヒドロキシル
ロイシン耐性株AJ 11761を夫々誘導した。この
ようにして得られた変異株のβ−ヒドロキシルロ
イシン又はサルフアグアニジンへの耐性度を調べ
た。その結果を第２表に示す。

【表】

【表】実験方法は、各変異株の菌体を第１表の最少培
地で良く洗滌した後、大型試験管に入れた第２表
に示す所定量の薬剤を含む最少寒培地（30ml）に
一定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、
培養液の560nｍに放る吸光度を測定して生育度
を求めた。第２表にはその相対生育値を示した。本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
の利用可能なものであれば良く、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてはノルマルパラフイン等も単独あるいは他の
炭素源と併用して使用される。窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりフエニルアラニンが
著量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えば良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。以下、実施例にて説明する。実施例１下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。

【表】この培地に第４表に示すフエニルアラニン生産
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。第４表フエニルアラニンの蓄積量菌株ｇ／dl AJ 3435（親株） 0.42 AJ 11764 1.70 AJ 11758 2.01 AJ 11759 2.25 AJ 11760 2.46 AJ 11477（親株） 1.70 AJ 11761 1.95

Claims

【特許請求の範囲】

１ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属に属し、ロイシンアナログに耐性を有しＬ−
フエニルアラニン生産能を有する微生物を培地中
で培養してＬ−フエニルアラニンを生成・蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする発酵法に
よるＬ−フエニルアラニンの製造法。