JPH0549489A - 発酵法によるl−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents
発酵法によるl−フエニルアラニンの製造法Info
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- JPH0549489A JPH0549489A JP21105291A JP21105291A JPH0549489A JP H0549489 A JPH0549489 A JP H0549489A JP 21105291 A JP21105291 A JP 21105291A JP 21105291 A JP21105291 A JP 21105291A JP H0549489 A JPH0549489 A JP H0549489A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ブレビバクテリウム属またはコリネバクテ
リウム属に属し、チロシン要求性とL−フェニルアラニ
ル−L−チロシン耐性を有し、かつL−フェニルアラニ
ン生産能を有する変異株を用いた発酵法によるL−フェ
ニルアラニンの製造法。 【効果】 本発明で使用する菌株はL−フェニルアラ
ニンの生産能に優れており、本発明の方法により従来法
より安価かつ効率的にL−フェニルアラニンを発酵生産
することができる。
リウム属に属し、チロシン要求性とL−フェニルアラニ
ル−L−チロシン耐性を有し、かつL−フェニルアラニ
ン生産能を有する変異株を用いた発酵法によるL−フェ
ニルアラニンの製造法。 【効果】 本発明で使用する菌株はL−フェニルアラ
ニンの生産能に優れており、本発明の方法により従来法
より安価かつ効率的にL−フェニルアラニンを発酵生産
することができる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、発酵法によるL−フェ
ニルアラニンの製造法に関する。L−フェニルアラニン
は、必須アミノ酸として、また、医薬品あるいはジペプ
チド甘味料であるL−アスパルチル−L−フェニルアラ
ニンメチルエステルの原料等として重要である。
ニルアラニンの製造法に関する。L−フェニルアラニン
は、必須アミノ酸として、また、医薬品あるいはジペプ
チド甘味料であるL−アスパルチル−L−フェニルアラ
ニンメチルエステルの原料等として重要である。
【0002】
【従来の技術】従来、発酵法によるL−フェニルアラニ
ンの製造法としては、ミクロコッカス属、バチルス属ま
たはブレビバクテリウム属細菌のチロシン要求性変異株
を使用する方法(特公昭37−6345号)、ブレビバ
クテリウム属に属し、チロシンを生育のために要求しか
つ5−メチルトリプトファンに耐性を有する変異株を使
用する方法(特公昭51−21079号)、アルスロバ
クター属またはコリネバクテリウム属に属し、L−フェ
ニルアラニン代謝アナログに耐性を有する変異株を使用
する方法(特公昭51−28712号)、更にはブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、デ
コイニンに感受性を有する変異株を使用する方法(特公
昭58−14199号)等が知られている。
ンの製造法としては、ミクロコッカス属、バチルス属ま
たはブレビバクテリウム属細菌のチロシン要求性変異株
を使用する方法(特公昭37−6345号)、ブレビバ
クテリウム属に属し、チロシンを生育のために要求しか
つ5−メチルトリプトファンに耐性を有する変異株を使
用する方法(特公昭51−21079号)、アルスロバ
クター属またはコリネバクテリウム属に属し、L−フェ
ニルアラニン代謝アナログに耐性を有する変異株を使用
する方法(特公昭51−28712号)、更にはブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、デ
コイニンに感受性を有する変異株を使用する方法(特公
昭58−14199号)等が知られている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、L−
フェニルアラニン生成能が更に向上した変異株を取得す
ることにより、従来法より安価かつ効率的な発酵法によ
るL−フェニルアラニンの製造法を提供することであ
る。
フェニルアラニン生成能が更に向上した変異株を取得す
ることにより、従来法より安価かつ効率的な発酵法によ
るL−フェニルアラニンの製造法を提供することであ
る。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、L−フェ
ニルアラニンを効率よく発酵生産する方法を開発するた
めに鋭意研究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属また
はコリネバクテリウム属に属し、チロシン要求性とL−
フェニルアラニル−L−チロシン耐性を有し、かつL−
フェニルアラニン生産能を有する変異株の使用がその目
的に適合しうることを見い出し、この知見に基づいて本
発明を完成させるに至った。
ニルアラニンを効率よく発酵生産する方法を開発するた
めに鋭意研究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属また
はコリネバクテリウム属に属し、チロシン要求性とL−
フェニルアラニル−L−チロシン耐性を有し、かつL−
フェニルアラニン生産能を有する変異株の使用がその目
的に適合しうることを見い出し、この知見に基づいて本
発明を完成させるに至った。
【0005】すなわち、本発明は、ブレビバクテリウム
属またはコリネバクテリウム属に属し、チロシン要求性
とL−フェニルアラニル−L−チロシン耐性を有し、か
つL−フェニルアラニン生産能を有する変異株を培養
し、培養液中にL−フェニルアラニンを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする発酵法によるL−
フェニルアラニンの製造法を提供するものである。
属またはコリネバクテリウム属に属し、チロシン要求性
とL−フェニルアラニル−L−チロシン耐性を有し、か
つL−フェニルアラニン生産能を有する変異株を培養
し、培養液中にL−フェニルアラニンを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする発酵法によるL−
フェニルアラニンの製造法を提供するものである。
【0006】本発明において使用する変異株は、ブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、チ
ロシンを生育のために要求し、親株の生育を阻害する濃
度のL−フェニルアラニル−L−チロシンの存在下で生
育可能で、かつL−フェニルアラニン生産能を有するも
のである。また、これらの性質に加えて、5−メチルト
リプトファン耐性やフェニルアラニンアナログ耐性等、
L−フエニルアラニンの生産能を高めることが従来知ら
れている他の性質を付与することにより、更に生産能の
高い変異株を得ることもできる。
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属し、チ
ロシンを生育のために要求し、親株の生育を阻害する濃
度のL−フェニルアラニル−L−チロシンの存在下で生
育可能で、かつL−フェニルアラニン生産能を有するも
のである。また、これらの性質に加えて、5−メチルト
リプトファン耐性やフェニルアラニンアナログ耐性等、
L−フエニルアラニンの生産能を高めることが従来知ら
れている他の性質を付与することにより、更に生産能の
高い変異株を得ることもできる。
【0007】本発明で使用する変異株を具体的に例示す
れば以下のものがある。
れば以下のものがある。
【0008】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム AJ12637(FERM P−12383)(チ
ロシン要求性、L−フェニルアラニル−L−チロシン耐
性、5−メチルトリプトファン耐性、p−フルオロフェ
ニルアラニン耐性、メチオニン要求性、デコイニン感受
性) コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12
638(FERM P−12382)(チロシン要求
性、L−フェニルアラニル−L−チロシン耐性)
ム AJ12637(FERM P−12383)(チ
ロシン要求性、L−フェニルアラニル−L−チロシン耐
性、5−メチルトリプトファン耐性、p−フルオロフェ
ニルアラニン耐性、メチオニン要求性、デコイニン感受
性) コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12
638(FERM P−12382)(チロシン要求
性、L−フェニルアラニル−L−チロシン耐性)
【0009】この様な変異株を得る際に使用される親株
としては、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリ
ウム属に属する公知のL−フェニルアラニン生産菌を使
用することができる。具体的に例示すると次のようなL
−フェニルアラニン生産菌が用いられる。
としては、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリ
ウム属に属する公知のL−フェニルアラニン生産菌を使
用することができる。具体的に例示すると次のようなL
−フェニルアラニン生産菌が用いられる。
【0010】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム AJ11475(FERM P−5248)(チロ
シン要求性、5−メチルトリプトファン耐性、p−フル
オロフェニルアラニン耐性、メチオニン要求性、デコイ
ニン感受性;特公昭58−14199号公報参照)
ム AJ11475(FERM P−5248)(チロ
シン要求性、5−メチルトリプトファン耐性、p−フル
オロフェニルアラニン耐性、メチオニン要求性、デコイ
ニン感受性;特公昭58−14199号公報参照)
【0011】さらに以下に示すような野生株も親株とし
て使用できる。
て使用できる。
【0012】 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ATCC13869 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC14067 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032
【0013】これらの親株に、先にチロシン要求性を付
与した後L−フェニルアラニル−L−チロシン耐性を付
与してもよいし、先にL−フェニルアラニル−L−チロ
シン耐性を付与した後チロシン要求性を付与してもよ
い。
与した後L−フェニルアラニル−L−チロシン耐性を付
与してもよいし、先にL−フェニルアラニル−L−チロ
シン耐性を付与した後チロシン要求性を付与してもよ
い。
【0014】これらの親株を変異処理する方法は、例え
ばX線や紫外線の照射あるいはN−メチル−N’−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン(以下、NGと記す)等の
変異誘導剤に接触せしめる等の通常の方法が適用でき
る。
ばX線や紫外線の照射あるいはN−メチル−N’−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン(以下、NGと記す)等の
変異誘導剤に接触せしめる等の通常の方法が適用でき
る。
【0015】本発明の変異株の取得のより具体的な実験
例を以下に示す。
例を以下に示す。
【0016】ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ム ATCC13869より誘導したチロシン要求性、
5−メチルトリプトファン耐性、p−フルオロフェニル
アラニン耐性、メチオニン要求性、デコイニン感受性の
L−フェニルアラニン生産菌AJ11475(FERM
P−5248)を完全寒天斜面培地で培養し、生育し
た菌体を集めて0.02Mリン酸緩衝液(pH7.0)
に1.1×109個/mlになるように懸濁し、これに
200μg/mlの濃度になるようにNGを加え、室温
で30分間保持した後、同緩衝液で洗浄した。得られた
菌体を同緩衝液で希釈し、表1に示す組成に1g/lの
L−フェニルアラニル−L−チロシンを加えた最少寒天
平板培地に塗布し、31.5℃で4〜10日間培養し
た。
ム ATCC13869より誘導したチロシン要求性、
5−メチルトリプトファン耐性、p−フルオロフェニル
アラニン耐性、メチオニン要求性、デコイニン感受性の
L−フェニルアラニン生産菌AJ11475(FERM
P−5248)を完全寒天斜面培地で培養し、生育し
た菌体を集めて0.02Mリン酸緩衝液(pH7.0)
に1.1×109個/mlになるように懸濁し、これに
200μg/mlの濃度になるようにNGを加え、室温
で30分間保持した後、同緩衝液で洗浄した。得られた
菌体を同緩衝液で希釈し、表1に示す組成に1g/lの
L−フェニルアラニル−L−チロシンを加えた最少寒天
平板培地に塗布し、31.5℃で4〜10日間培養し
た。
【0017】
【表1】
【0018】寒天平板培地上に生育したコロニ−を耐性
株として採取した。次いで表2に示す組成の培地を試験
管に3mlずつ分注し115℃で10分間加熱殺菌した
後、予め乾熱滅菌した炭酸カルシウムを150mgずつ
加え、この培地に採取した耐性株をそれぞれ一白金耳ず
つ接種し、31.5℃で72時間振盪培養し、各耐性株
のL−フェニルアラニン生産能を測定した。その結果、
親株に比べてL−フェニルアラニン生産能が向上した変
異株が高頻度で見いだされた。かくしてチロシン要求性
とL−フェニルアラニル−L−チロシン耐性を有し、か
つ高いL−フェニルアラニン生産能を有する変異株とし
て、ブラビバクテリウム・ラクトフェルメンタム AJ
12637(FERM P−12383)を取得した。
株として採取した。次いで表2に示す組成の培地を試験
管に3mlずつ分注し115℃で10分間加熱殺菌した
後、予め乾熱滅菌した炭酸カルシウムを150mgずつ
加え、この培地に採取した耐性株をそれぞれ一白金耳ず
つ接種し、31.5℃で72時間振盪培養し、各耐性株
のL−フェニルアラニン生産能を測定した。その結果、
親株に比べてL−フェニルアラニン生産能が向上した変
異株が高頻度で見いだされた。かくしてチロシン要求性
とL−フェニルアラニル−L−チロシン耐性を有し、か
つ高いL−フェニルアラニン生産能を有する変異株とし
て、ブラビバクテリウム・ラクトフェルメンタム AJ
12637(FERM P−12383)を取得した。
【0019】
【表2】
【0020】同様な操作により、コリネバクテリウム・
アセトアシドフィラム ATCC13870を親株とし
て、チロシン要求性変異株コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラム PH−1を取得後L−フェニルアラニ
ル−L−チロシン耐性を賦与することにより、高いL−
フェニルアラニン生産能を有する変異株としてコリネバ
クテリウム・アセトアシドフィラム AJ12638
(FERM P−12382)を得た。
アセトアシドフィラム ATCC13870を親株とし
て、チロシン要求性変異株コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラム PH−1を取得後L−フェニルアラニ
ル−L−チロシン耐性を賦与することにより、高いL−
フェニルアラニン生産能を有する変異株としてコリネバ
クテリウム・アセトアシドフィラム AJ12638
(FERM P−12382)を得た。
【0021】次にこのようにして得た変異株並びにその
親株のL−フェニルアラニル−L−チロシンに対する耐
性度を調べた結果を表3に示す。測定方法は、完全寒天
斜面培地で培養して得た各菌株の菌体を、小型試験管に
3ml宛入れた表3に示す濃度のL−フェニルアラニル
−L−チロシンを含む最小培地に接種し、31.5℃で
24時間振とう培養を行い、培養液の560nmにおけ
る吸光度を測定し生育度を求めることによった。表3に
はL−フェニルアラニル−L−チロシンを含まない最小
培地での生育度を100とした時の相対値を示した。
親株のL−フェニルアラニル−L−チロシンに対する耐
性度を調べた結果を表3に示す。測定方法は、完全寒天
斜面培地で培養して得た各菌株の菌体を、小型試験管に
3ml宛入れた表3に示す濃度のL−フェニルアラニル
−L−チロシンを含む最小培地に接種し、31.5℃で
24時間振とう培養を行い、培養液の560nmにおけ
る吸光度を測定し生育度を求めることによった。表3に
はL−フェニルアラニル−L−チロシンを含まない最小
培地での生育度を100とした時の相対値を示した。
【0022】
【表3】
【0023】これらの変異株を用いてL−フェニルアラ
ニンを生産せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、
その他必要に応じて有機微量栄養素及び使用する微生物
が要求する栄養物質を含有する通常の液体栄養培地が使
用される。炭素源としては、使用する変異株が利用可能
なものであればよく、例えばグルコース、シュクロー
ス、糖蜜、デンプン加水分解液等が使用される。また窒
素源としては、硫安、尿素、アンモニア等が利用でき
る。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪
酸、核酸、さらにこれらのものを含有する酵母エキス、
ペプトン、カザミノ酸、大豆蛋白加水分解物等が使用さ
れる。
ニンを生産せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類、
その他必要に応じて有機微量栄養素及び使用する微生物
が要求する栄養物質を含有する通常の液体栄養培地が使
用される。炭素源としては、使用する変異株が利用可能
なものであればよく、例えばグルコース、シュクロー
ス、糖蜜、デンプン加水分解液等が使用される。また窒
素源としては、硫安、尿素、アンモニア等が利用でき
る。有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪
酸、核酸、さらにこれらのものを含有する酵母エキス、
ペプトン、カザミノ酸、大豆蛋白加水分解物等が使用さ
れる。
【0024】培養方法は、発酵温度25〜40℃、好ま
しくは30〜34℃に制御しつつ通気培養を行なう。培
養開始時及び培養中のpHは5.0〜9.0、好ましく
は6.0〜7.5に保つのが良く、pHの調整には無機
あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更には尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用すること
ができる。かくして1ないし4日間培養を行うことによ
り培養液中に著量のL−フェニルアラニンが生成蓄積さ
れる。
しくは30〜34℃に制御しつつ通気培養を行なう。培
養開始時及び培養中のpHは5.0〜9.0、好ましく
は6.0〜7.5に保つのが良く、pHの調整には無機
あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更には尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアガス等を使用すること
ができる。かくして1ないし4日間培養を行うことによ
り培養液中に著量のL−フェニルアラニンが生成蓄積さ
れる。
【0025】培養終了後の発酵液からのL−フェニルア
ラニンの採取する方法は公知の方法に従って行えばよ
い。例えば培養液より菌体を除いた後適度に濃縮し、L
−フェニルアラニンの等電点にpHを調整し晶析する方
法やイオン交換樹脂を用いる方法等により採取される。
ラニンの採取する方法は公知の方法に従って行えばよ
い。例えば培養液より菌体を除いた後適度に濃縮し、L
−フェニルアラニンの等電点にpHを調整し晶析する方
法やイオン交換樹脂を用いる方法等により採取される。
【0026】
【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに詳細に
説明する。
説明する。
【0027】
【実施例1】表4に示す組成の培地を500ml容振と
うフラスコに20mlずつ分注し、115℃で10分間
加熱殺菌後、予め180℃で2時間乾熱滅菌した炭酸カ
ルシウム1gを加えた。この培地に表5に示す本発明で
使用する変異株またはその親株をそれぞれ一白金耳接種
し、31.5℃で72時間振とう培養した。培養液中に
生成蓄積したL−フェニルアラニンを高速液体クロマト
グラフィー(カラム:三菱化成工業製CPK−08、φ
2.6×500mm、溶媒:0.2Mリン酸バッファ
ー、検出:UV210nm)により定量した。
うフラスコに20mlずつ分注し、115℃で10分間
加熱殺菌後、予め180℃で2時間乾熱滅菌した炭酸カ
ルシウム1gを加えた。この培地に表5に示す本発明で
使用する変異株またはその親株をそれぞれ一白金耳接種
し、31.5℃で72時間振とう培養した。培養液中に
生成蓄積したL−フェニルアラニンを高速液体クロマト
グラフィー(カラム:三菱化成工業製CPK−08、φ
2.6×500mm、溶媒:0.2Mリン酸バッファ
ー、検出:UV210nm)により定量した。
【0028】
【表4】
【0029】
【表5】
【0030】表5に示した結果から明らかなように、本
発明で使用する変異株は親株に比べてL−フェニルアラ
ニンの生産能が著しく向上していた。
発明で使用する変異株は親株に比べてL−フェニルアラ
ニンの生産能が著しく向上していた。
【0031】
【実施例2】実施例1の方法により得たブラビバクテリ
ウム・ラクトフェルメンタム AJ12637の培養液
135mlを除菌し濃縮晶析によってL−フェニルアラ
ニンを採取した。得られたL−フェニルアラニンは、
2.8gであった。
ウム・ラクトフェルメンタム AJ12637の培養液
135mlを除菌し濃縮晶析によってL−フェニルアラ
ニンを採取した。得られたL−フェニルアラニンは、
2.8gであった。
【0032】
【発明の効果】本発明で使用する変異株は、親株に比べ
てL−フエニルアラニンの生産能が向上しており、著量
のL−フェニルアラニンを培養液中に生成蓄積させるこ
とができるため、本発明の方法は、安価かつ効率的な発
酵法によるL−フェニルアラニンの製造法として好適で
ある。
てL−フエニルアラニンの生産能が向上しており、著量
のL−フェニルアラニンを培養液中に生成蓄積させるこ
とができるため、本発明の方法は、安価かつ効率的な発
酵法によるL−フェニルアラニンの製造法として好適で
ある。
Claims (1)
- 【請求項1】 ブレビバクテリウム属またはコリネバ
クテリウム属に属し、チロシン要求性とL−フェニルア
ラニル−L−チロシン耐性を有し、かつL−フェニルア
ラニン生産能を有する変異株を培養し、培養液中にL−
フェニルアラニンを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるL−フエニルアラニンの製
造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21105291A JPH0549489A (ja) | 1991-08-22 | 1991-08-22 | 発酵法によるl−フエニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21105291A JPH0549489A (ja) | 1991-08-22 | 1991-08-22 | 発酵法によるl−フエニルアラニンの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0549489A true JPH0549489A (ja) | 1993-03-02 |
Family
ID=16599593
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21105291A Pending JPH0549489A (ja) | 1991-08-22 | 1991-08-22 | 発酵法によるl−フエニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0549489A (ja) |
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5153126A (en) * | 1987-05-29 | 1992-10-06 | Lion Corporation | Method for continuous preparation of highly pure monoglyceride |
US5677701A (en) * | 1994-04-27 | 1997-10-14 | Nippondenso Co., Ltd. | Head-up displaying device for a vehicle |
WO2008044409A1 (en) | 2006-10-10 | 2008-04-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for production of l-amino acid |
WO2008075483A1 (ja) | 2006-12-19 | 2008-06-26 | Ajinomoto Co., Inc. | L-アミノ酸の製造法 |
WO2008102572A1 (ja) | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Ajinomoto Co., Inc. | L-アミノ酸または核酸の製造方法 |
WO2009088049A1 (ja) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
WO2009093703A1 (ja) | 2008-01-23 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co., Inc. | L-アミノ酸の製造法 |
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