JPS6135840B2

JPS6135840B2 -

Info

Publication number: JPS6135840B2
Application number: JP15350681A
Authority: JP
Inventors: Osamu Tosaka; Eiji Ono; Masaru Ishihara; Hayao Hirakawa; Koichi Takinami
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1981-09-28
Filing date: 1981-09-28
Publication date: 1986-08-15
Also published as: JPS5794297A

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は発酵法によるＬ―リジンの製造法に
関する。本発明者らは新しい視点に立つてより効率の高
いＬ―リジン生産菌を見い出すべく研究した結
果、従来知られているブレビバクテリウム属に属
するＬ―リジン生産菌に、Ｎ―２―テノイル―メ
チオニン（以下TMと記す）耐性を付与した変異
株が、より高いＬ―リジン生産能を有することを
見い出した。本発明の製造法において用いられる微生物は、
上記のようにブレビバクテリウム属に属し、リジ
ン生産性を有するために必要なホモセリン要求
性、Ｓ―（２−アミノエチル）―Ｌ―システイン
（以下AECと記す）耐性、その他の性質のほか
に、TMに耐性を有する変異株である。 TMはロイシンアナログであるが、既に知られ
ているロイシンアナログ（特公昭53−1833）とは
異なり、従来知られているロイシンアナログ、例
えば２―チアゾールアラニン、スレオ―β―ヒド
ロキシ―DL―ロイシン、アザロイシン等はＬ―
ロイシン以外にもＬ―バリン、Ｌ―イソロイシン
等によつてもその生育阻害が解除されるが、TM
においては、Ｌ―ロイシンによつては生育阻害は
解除されるが、Ｌ―バリン、Ｌ―イソロイシン等
によつて全く生育阻害が解除されないような特殊
な薬剤である。 TM以外にもこれらの薬剤と同じような性質を
有するものとして以下のものがある。従つて、
TMに耐性を有してさえいれば、以下の薬剤に耐
性を有するものも本発明の範囲内に入ることは明
白である。 DL―ターシヤリ――ロイシン、NN′―ジメチ
ルロイシン、α―メチルロイシン、Ｄ―ロイシ
ン、Ｎ―アセチル―Ｓ―メルカプトシステイン、
Ｏ―メチルホモセリン、２―アミノ―５―ニトロ
チアゾール、CBZ―スレオニン、DL―α―アミ
ノ酷酸、NN′―ジメチル―Ｌ―イソロイシン、Ｌ
―２，４―ジアミノ―ｎ―酷酸、トリクロロアラ
ニン、Ｓ―メチルシステインスルホキサイド。 TMに耐性を有する変異株とは、該当する変異
株の親株が生育できないような量のTMを含有す
る培地中に生育できるような変異株をいう。この様な変異株は、紫外線照射、Ｎ―メチル―
Ｎ―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジン等の変異誘
起剤による処理等通常の変異処理法によりうるこ
とができる。本発明の変異株の親株は、いわゆるコリネフオ
ームのＬ―グルタミン酸生産菌として知られてい
るものであつて、具体的には、ブレビバクテリウ
ム・デイバリカタムATCC14020、ブレビバクテ
リウム・フラバムATCC14067、ブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムATCC13869、ブレ
ビバクテリウム・ロゼウムATCC13825等があ
る。これらの親株は、いずれもその変異株がＬ―リ
ジンを生産するという共通の性質を有していて、
かついずれもTMに感受性を有するものである。以下に本発明の変異株について、その具体的誘
導方法の１例および、上記薬剤に対する耐性の度
合いを示す実験例をあげる。なおCCLは、α―
クロロカプロラクタムを示す。実施例１ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11082（FERM―Ｐ 3840）（AEC〓，
CCL〓，AIa^-）を250μｇ／mlのＮ―メチル―
N′―ニトロ―Ｎ―ニトロソグアニジンにて30℃
で30分処理した後、以下に示す最少培地に、TM
を５mg／ml添加した培地に接種し、31.5℃で、振
とうし、耐性株の集積培養を行なつた。２〜７日
後、菌の生育が認められた培養液を、下記培地組
成の分離用培地に塗沫し、２〜４日間31℃にて培
養し、生じたコロニーを採取した。最少培地組成グルコース 2.0 ｇ／dl 尿素 0.25ｇ／dl 硫酸アンモニウム 1.0 ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1 ｇ／dl MgSO₄・7HB₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0 mg／dl ビオチン 50 μｇ／サイアミン塩酸塩 100 μｇ／ NaC1 5.0 mg／dl Ｌ―アラニン 50 ft／dl ニコチン酸アミド 0.5 ft／dl PH 7.2 この様にして得られた変異株の内、Ｌ―リジン
生産能のすぐれた変異株としてAJ11282（FERM
―P4556）（AEC^r，CCL^r，AIa^-，TM^r）を採取
した。実験例２第１表に示す菌株について、TMに対する耐性
の度合いを調べた。結果を第１表に示す。実験方法：各菌株の菌体を下記組成の液体培地
で先浄後、同じ液体培地の６mlにそれぞれけん濁
した（このけん濁液の562mμにおける吸光度
は、その26培希釈液として、0.300、0.300、
0.330、0.320であつた。）これを、下記の液体培地に、第１表に記載した
濃度のTMを添加した培地を、３mlずつ入れた試
験管に、0.1mlずつ接種して30℃にて24時間培養
した。

【表】これらの微生物をもちいてＬ―リジンを生産せ
しめるには、とくに困難はなく、炭素源、窒素
源、無機塩類、および使用する微生物が要求する
栄養物質を含有する通常の栄養培地をもちいて常
法によりおこなう。炭素源としては、グルコー
ス、シユークロース、及びこれらを含有する糖
蜜、デンプン加水分解液などの糖類、酢酸、プロ
ピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノー
ルなどのアルコール類などが使用できる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニウ
ム塩、尿素、アンモニア水その他が使用できる。
又、栄養要求性を示す変異株に対しては、その要
求物質もしくはそれらを含有する、例えば、大豆
タンパク質加水分解物、コーン・ステイープ・リ
カー、酵母エキス、あるいはペプトンなどを培地
に添加する。培養方法については、好気的条件が好ましく、
培養温度は、24〜37℃、培養中のPHは5.0〜9.0が
好ましい。 PHの調整には、無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更には尿素、炭酸カルシウ
ム、アンモニアガスなどを使用することができ
る。かくして２〜７日間も培養すれば培養液中に
著量のＬ―リジンが蓄積される、培養液からのＬ
―リジンの採取は、通常イオン交換樹脂法等によ
りおこなわれ、培地の種類によつては直接晶析法
により行なうことも可能である。実施例１下記の組成の培地を20ml宛、500ml容振とうフ
ラスコに入れ、110℃にて５分間殺菌した。培地組成グルコース 10 ｇ／dl 硫酸アンモニウム 4.5 ｇ／dl KH₂PO₄ 0.1 ｇ／dl MgSO₄・7H₂O 0.04ｇ／dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg／dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg／dl ビオチン 50 μ／ザイアミン塩酸塩 200 μｇ／大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物
1.5 ml／dl （総窒素７％）炭酸カルシウム（別殺菌添加）５ｇ／dl PH 7.0 上記の如く調製したフラスコ中の培地に、あら
かじめグルコース・ブイヨンスラント上で生育せ
しめた第２表に示す菌株を各々を一白金耳接種
し、それらを31℃にて72時間振とう培養した。 72時間培養後の培地中のＬ―リジン生成量を、
酸性―銅ニンヒドリン反応を用いる比色法によつ
て行なつた。結果を第２表にす。

【表】 AJ11282株の培養終了液を集め遠心分離によつ
て、菌体及びカルシウム塩を除いた上清液１
を、強酸性イオン交換樹脂（「アンバーライト」
IR―120CH）に通過させ、Ｌ―リジンを吸着さ
せた。ついで、３％アンモニア水で、Ｌ―リジン
を容出し、溶出液を減圧濃縮した。濃縮液に塩酸
を添加したのち、冷却し、Ｌ―リジンを、Ｌ―リ
ジン塩酸塩第２水加物として、析出させ、結晶
36.7ｇを得た。

Claims

【特許請求の範囲】

１ブレビバクテリウム属に属しＮ―２―テノイ
ルーメチオニンに耐性を有するＬ―リジン生産性
変異株を培養し、培地中に生成蓄積したＬ―リジ
ンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ―
リジンの製造法。