JPH0211238B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるＬ−フエニルアラニン
（以下、単にフエニルアラニンという。）の製造法
に関する。 従来、発酵法によるフエニルアラニンの製造法
としては、ブレビバクテリウム属、又はミクロコ
ツカス属細菌のチロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にチロシンを要求しかつ
５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変異株
を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニルア
ラニンアナログに耐性を有する変異株を使用する
方法（特公昭51−28712）、更にはデコイニン感受
性変異株を使用する方法（特公昭56−64793）等
が知られている。 本発明者等は更に効率良くフエニルアラニンを
発酵生産する方法を開発することを目的として研
究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属又はコリ
ネバクテリウム属のフエニルアラニン生産菌に
Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グリシン又は
Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンに耐性を付与し
た変異株の中により多量のフエニルアラニンを生
成、蓄積する菌株が存在することを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明において使用される変異株はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属に属しＮ，
Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グリシン又はＮ−
（ホスホノメチル）グリシンに耐性を有し、更に
従来知られているフエニルアラニン生産の為に必
要な性質、例えばＬ−チロシン要求性、フエニル
アラニンアナログ耐性、Ｌ−チロシン要求性でか
つトリプトフアンもしくはフエニルアラニンアナ
ログ耐性、即ちフエニルアラニン生産能を有する
ものである。 本発明の方法において用いられる微生物は、具
体的には例えば、 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11990 FERM−P6851（Tyr^-、BPMG^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11991 FERM−P6852（Tyr^-、PMG^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11992 FERM−P6853（Tyr^-、５−MT^r、
ｐ−Ｆ−phe^r、BPMG^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11993 FERM−P6854（Tyr^-、５−MT^r、
ｐ−Ｆ−phe^r、PMG^r） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ11994 FERM−P6855（ｐ−Ｆ−phe^r、
BPMG^r） Tyr^-：Ｌ−チロシン要求性 ５−MT^r：５−メチルトリプトフアン耐
性 ｐ−Ｆ−phe^r：ｐ−フルオロフエニルアラニ
ン耐性 BPMG^r：Ｎ，Ｎ−ビス−（ホスホノメ
チル）グリシン耐性 PMG^r：Ｎ−（ホスホノメチル）グリ
シン耐性 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属のフエニルアラニン
生産菌を親株として、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NGと
略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処
理した菌体を親株が生育できないような量のＮ，
Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グリシン又はＮ−
（ホスホノメチル）グリシンを含有する寒天平板
培地で培養し、該平板培地上に生育するコロニー
を分離することによつて得られる。 上記ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリ
ウム属のフエニルアラニン生産菌は公知のものを
使用すれば良いが、具体例としては次のような変
異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3435 FERM−P1912（Tyr^-） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3432 FERM−P1844（Tyr^-、５−MT^r） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3437 FERM−P1914（Tyr^-、５−MT^r、ｐ
−Ｆ−phe^r） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3244 ATCC21421（ｐ−Ｆ−phe^r） 親株としてはこの他、ブレビバクテリウム属又
はコリネバクテリウム属の微生物特にグルタミン
酸生産性細菌として知られている微生物を使用
し、Ｎ，Ｎ−ビスー（ホスホノメチル）グリシン
耐性又はＮ−（ホスホノメチル）グリシン耐性及
びフエニルアラニン生産性を付与することによつ
て誘導することができる。このような親株の例と
しては、ブレビバクテリウム・デバリカタム
ATCC14020、ブレビバクテリウム・ラクトフエ
ルメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・
ロゼウムATCC14066、コリネバクテリウム・ア
セトアシドフイラムATCC13870、コリネバクテ
リウム・アセトグルタミクムATCC15806、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032等が
使用される。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及び
薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導したチロシン要求性のフエ
ニルアラニン生産菌AJ3435 FERM−P1912をイ
ーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育した
菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に懸
濁し（10⁸〜10⁹個／mlの菌体を含む）、これにNG
を加え（NG濃度は200μｇ／ml）、室温で30分間
保持した。このようにしてNG処理した菌体を同
リン酸緩衝液で充分洗浄した後、Ｎ，Ｎ−ビス−
（ホスホノメチル）グリシンを含む第１表に示す
最小寒天平板培地に塗布し、31.5℃で４〜10日間
培養した。 第１表 最小培地の組成（PH7.0） 成 分 含 量 グルコース 20ｇ／ 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿 素 ２ 〃 KH₂PO₄ １ 〃 MgSO₄・7H₂O １ 〃 Fe⁺⁺、Mn⁺⁺イオン 2ppm ビオチン 50μｇ／ サイアミン塩酸塩 200 〃 DL−メチオニン 200mg／Ｌ−チロシン 100 〃 寒天平板上に生育したコロニーのうち大きなも
のをＮ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グリシン
耐性株として採取した。このようにして得られた
耐性株の内には親株よりフエニルアラニン生産能
の優れたものが多く見い出された。この内生産能
の最も高い菌株AJ11990を選んだ。同様の変異操
作により、AJ3435を親株としてＮ−（ホスホノメ
チル）グリシン耐性株AJ11991を選んだ。又同様
の変異操作によりAJ3437を親株としてＮ，Ｎ−
ビス−（ホスホノメチル）グリシン耐性を付与し
てAJ11992を、そしてＮ−ホスホノメチルグリシ
ン耐性を付与してAJ11993を誘導した。 全く同様の方法でコリネバクテリウム・アセト
アシドフイラムAJ3244を親株としてＮ，Ｎ−ビ
ス−（ホスホノメチル）グリシン耐性株AJ11994
を誘導した。 次にこのようにして得た変異株のＮ，Ｎ−ビス
−（ホスホノメチル）グリシン耐性度、及びＮ−
（ホスホノメチル）グリシン耐性度の結果を第２
表に示す。

【表】 実験方法は、各変異株の菌体を第１表の最小培
地で良く洗浄した後、小型試験管に入れた第２表
に示す所定量の薬剤を含む最小培地（４ml）に一
定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、培
養液の560nｍに於る吸光度を測定して生育度を
求めた。第２表にはその相対生育値を示した。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
の利用可能なものであれば良く、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてはノルマルパラフイン等も単独あるいは他の
炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりフエニルアラニンが
蓄量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えば良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。

【表】 この培地に第４表に示すフエニルアラニン生産
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
   ム属に属しＮ，Ｎ−ビス−（ホスホノメチル）グ
   リシン又はＮ−（ホスホノメチル）グリシンに耐
   性を有しかつＬ−フエニルアラニン生産能を有す
   る微生物を培地中で培養してＬ−フエニルアラニ
   ンを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特
   徴とする発酵法によるＬ−フエニルアラニンの製
   造法。