JPH0456598B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は発酵法によるＬ−フエニルアラニン
（以下単にフエニルアラニンという。）の製造法に
関する。従来、発酵法によるフエニルアラニンの
製造法としてはブレビバクテリウム属又はミクロ
コツカス属細菌のチロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にチロシンを要求しかつ
５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変異株
を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニルア
ラニンアナログに耐性を有する変異株を使用する
方法（特公昭51−28712）、更にはデコイニン感受
性変異株を使用する方法（特公昭56−64793）等
が知られている。 本発明者等は更に効率良くフエニルアラニンを
発酵生産する方法を開発することを目的として研
究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属又はコリ
ネバクテリウム属等のコリネ型細菌のフエニルア
ラニン生産菌に変異処理を施し、唯一の炭素源と
してプロトカテク酸では生育できるがキナ酸では
生育できない変異株の中から多量のフエニルアラ
ニンを生成、蓄積する菌株が存在することを見い
出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明で使用する微生物の親株となる微生物は
ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属
等のコリネ型細菌に属し、フエニルアラニン生産
に必要な性質、例えばＬ−チロシン要求性又はフ
エニルアラニンアナログ耐性、もしくはＬ−チロ
シン要求性でかつトリプトフアンアナログ又はフ
エニルアラニンアナログ耐性を有する微生物であ
る。 本発明において使用される変異株はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属等のコリネ
型細菌に属し、上記フエニルアラニン生産能を示
す性質を持ち、かつ唯一の炭素源としてプロトカ
テク酸では生育できるが、キナ酸では生育できな
いデヒドロシキミ酸デヒドラターゼ欠損の性質を
有する微生物である。このような性質を有する微
生物はフエニルアラニン生産能の他に、Ｌ−トリ
プトフアン生産能およびＬ−チロシン生産能を有
する。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12102FERM Ｐ−7329（Tyr-、DSDTse） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12103FERM Ｐ−7330（Tyr-、５−MTr、
DSDTse） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ12104FERM Ｐ−7331（pFPr、DSDTse） Tyr-＝Ｌ−チロシン要求性 ５−MTr＝５−メチルトリプトフアン耐性 pFPr＝ｐ−フルオロフエニルアラニン耐性 DSDTse＝デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ欠
損 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属のフエニルアラニン
生産菌を親株として、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NGと
略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処
理した菌体を唯一の炭素源としてプロトカテク酸
では生育できるが、キナ酸では生育できないよう
なコロニーを分離することによつて得られる。 親株となるブレビバクテリウム属又はコリネバ
クテリウム属等のコリネ型細菌のフエニルアラニ
ン生産菌は公知のものを使用すれば良いが、具体
例としては次のような変異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3435FERM Ｐ−1912（Tyr-） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3432FERM Ｐ−1844（Tyr-、５−MTr） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3244ATCC21421（ｐ−Ｆ−pher 親株としてはこの他、ブレビバクテリウム属又
はコリネバクテリウム属のコリネ型細菌特にグル
タミン酸生産性細菌として知られている微生物を
使用し、これに唯一の炭素源としてプロトカテク
酸では生育できるがキナ酸では生育できないデヒ
ドロシキミ酸デヒドラターゼ欠損性質、及びフエ
ニルアラニン生産性を付与することによつて誘導
することができる。このような親株の例として
は、ブレビバクテリウム・デバリカタム
ATCC14020、ブレビバクテリウム・ラクトフエ
ルメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・
ロゼウムATCC14066、コリネバクテリウム・ア
セトアシドフイラムATCC13870、コリネバクテ
リウム・アセトグルタミクムATCC15806、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032等が
使用される。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及び
薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導したTyrかつ５−MTrのフ
エニルアラニン生産菌AJ3432FERM Ｐ−1844を
イーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育し
た菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に
懸濁し（108〜109個／mlの菌体を含む）、これに
NGを加え（NG濃度は200μｇ／ml）、室温で30分
間保持した。このようにしてNG処理した菌体を
同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、菌液を適当に
希釈して、完全培地を含む寒天平板上でコロニー
数が200コ位になるように塗布する。そして次に
唯一の炭素源としてプロトカテク酸及びキナ酸を
各々含む第１表に示す最少寒天平板培地上にレプ
リカし、キナ酸では生育できないが、プロトカテ
ク酸では生育できるデヒドロシキミ酸デヒドラタ
ーゼ欠損変異株のコロニーを分離する。このよう
にして得られたコロニーの内には親株よりフエニ
ルアラニン生産能の優れたものが多く見い出され
た。 第 １ 表 最少培地の組成（PH7.0）成 分 含 量 グルコース 10ｇ／ （又はプロトカテク酸、キナ酸 0.4％） 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿素 ２ 〃 KH2PO4 １ 〃 MgSO4・7H2O １ 〃 Fe、Mnイオン 2ppm ビオチン 50μｇ／ サイアミン塩酸塩 200 〃 DL−メチオニン 200mg／Ｌ−チロシン 100 〃 この内生産能の最も高い菌株AJ12103を選ん
だ。同様の変異操作により、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンタムAJ3435を親株として
同様の方法によりAJ12102を選んだ。 全く同様の方法でコリネバクテリウム・アセト
アシドフイラムAJ3244を親株としてAJ12104を
誘導した。 次にこのようにして得た変異株のグルコース及
びキナ酸、プロトカテク酸を各々唯一の炭素源と
した場合の生育の結果を第２表に示す。
（以下単にフエニルアラニンという。）の製造法に
関する。従来、発酵法によるフエニルアラニンの
製造法としてはブレビバクテリウム属又はミクロ
コツカス属細菌のチロシン要求菌を使用する方法
（特公昭37−6345）、生育にチロシンを要求しかつ
５−メチルトリプトフアンに耐性を有する変異株
を使用する方法（特公昭51−21079）、フエニルア
ラニンアナログに耐性を有する変異株を使用する
方法（特公昭51−28712）、更にはデコイニン感受
性変異株を使用する方法（特公昭56−64793）等
が知られている。 本発明者等は更に効率良くフエニルアラニンを
発酵生産する方法を開発することを目的として研
究を重ねた結果、ブレビバクテリウム属又はコリ
ネバクテリウム属等のコリネ型細菌のフエニルア
ラニン生産菌に変異処理を施し、唯一の炭素源と
してプロトカテク酸では生育できるがキナ酸では
生育できない変異株の中から多量のフエニルアラ
ニンを生成、蓄積する菌株が存在することを見い
出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。 本発明で使用する微生物の親株となる微生物は
ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属
等のコリネ型細菌に属し、フエニルアラニン生産
に必要な性質、例えばＬ−チロシン要求性又はフ
エニルアラニンアナログ耐性、もしくはＬ−チロ
シン要求性でかつトリプトフアンアナログ又はフ
エニルアラニンアナログ耐性を有する微生物であ
る。 本発明において使用される変異株はブレビバク
テリウム属又はコリネバクテリウム属等のコリネ
型細菌に属し、上記フエニルアラニン生産能を示
す性質を持ち、かつ唯一の炭素源としてプロトカ
テク酸では生育できるが、キナ酸では生育できな
いデヒドロシキミ酸デヒドラターゼ欠損の性質を
有する微生物である。このような性質を有する微
生物はフエニルアラニン生産能の他に、Ｌ−トリ
プトフアン生産能およびＬ−チロシン生産能を有
する。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12102FERM Ｐ−7329（Tyr-、DSDTse） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12103FERM Ｐ−7330（Tyr-、５−MTr、
DSDTse） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ12104FERM Ｐ−7331（pFPr、DSDTse） Tyr-＝Ｌ−チロシン要求性 ５−MTr＝５−メチルトリプトフアン耐性 pFPr＝ｐ−フルオロフエニルアラニン耐性 DSDTse＝デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ欠
損 これら本発明の変異株は、ブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属のフエニルアラニン
生産菌を親株として、これに通常の変異誘導操
作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NGと
略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、変異処
理した菌体を唯一の炭素源としてプロトカテク酸
では生育できるが、キナ酸では生育できないよう
なコロニーを分離することによつて得られる。 親株となるブレビバクテリウム属又はコリネバ
クテリウム属等のコリネ型細菌のフエニルアラニ
ン生産菌は公知のものを使用すれば良いが、具体
例としては次のような変異株が使用される。 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3435FERM Ｐ−1912（Tyr-） ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ3432FERM Ｐ−1844（Tyr-、５−MTr） コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3244ATCC21421（ｐ−Ｆ−pher 親株としてはこの他、ブレビバクテリウム属又
はコリネバクテリウム属のコリネ型細菌特にグル
タミン酸生産性細菌として知られている微生物を
使用し、これに唯一の炭素源としてプロトカテク
酸では生育できるがキナ酸では生育できないデヒ
ドロシキミ酸デヒドラターゼ欠損性質、及びフエ
ニルアラニン生産性を付与することによつて誘導
することができる。このような親株の例として
は、ブレビバクテリウム・デバリカタム
ATCC14020、ブレビバクテリウム・ラクトフエ
ルメンタムATCC13869、ブレビバクテリウム・
ロゼウムATCC14066、コリネバクテリウム・ア
セトアシドフイラムATCC13870、コリネバクテ
リウム・アセトグルタミクムATCC15806、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC13032等が
使用される。 次に本発明で使用する変異株の変異誘導法及び
薬剤に対する耐性度を以下の実験例にて示す。 実験例 １ ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC13869より誘導したTyrかつ５−MTrのフ
エニルアラニン生産菌AJ3432FERM Ｐ−1844を
イーストブイヨン寒天斜面培地で培養し、生育し
た菌体を集めて1/50Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）に
懸濁し（108〜109個／mlの菌体を含む）、これに
NGを加え（NG濃度は200μｇ／ml）、室温で30分
間保持した。このようにしてNG処理した菌体を
同リン酸緩衝液で充分洗浄した後、菌液を適当に
希釈して、完全培地を含む寒天平板上でコロニー
数が200コ位になるように塗布する。そして次に
唯一の炭素源としてプロトカテク酸及びキナ酸を
各々含む第１表に示す最少寒天平板培地上にレプ
リカし、キナ酸では生育できないが、プロトカテ
ク酸では生育できるデヒドロシキミ酸デヒドラタ
ーゼ欠損変異株のコロニーを分離する。このよう
にして得られたコロニーの内には親株よりフエニ
ルアラニン生産能の優れたものが多く見い出され
た。 第 １ 表 最少培地の組成（PH7.0）成 分 含 量 グルコース 10ｇ／ （又はプロトカテク酸、キナ酸 0.4％） 硫酸アンモニウム ５ 〃 尿素 ２ 〃 KH2PO4 １ 〃 MgSO4・7H2O １ 〃 Fe、Mnイオン 2ppm ビオチン 50μｇ／ サイアミン塩酸塩 200 〃 DL−メチオニン 200mg／Ｌ−チロシン 100 〃 この内生産能の最も高い菌株AJ12103を選ん
だ。同様の変異操作により、ブレビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンタムAJ3435を親株として
同様の方法によりAJ12102を選んだ。 全く同様の方法でコリネバクテリウム・アセト
アシドフイラムAJ3244を親株としてAJ12104を
誘導した。 次にこのようにして得た変異株のグルコース及
びキナ酸、プロトカテク酸を各々唯一の炭素源と
した場合の生育の結果を第２表に示す。
【表】
実験方法は、各変異株の菌体を第１表の最少培
地で良く洗浄した後、小型試験管に入れた第２表
に示す所定量の炭素源を含む最少培地（４ml）に
一定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、
培養液の560nｍに於る吸光度を測定して生育度
を求めた。第２表にはその相対生育値を示した。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
の利用可能なものであれば良く、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてはノルマルパラフイン等も単独あるいは他の
炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりフエニルアラニンが
多量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えば良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
地で良く洗浄した後、小型試験管に入れた第２表
に示す所定量の炭素源を含む最少培地（４ml）に
一定量接種し、31.5℃で24時間振盪培養を行い、
培養液の560nｍに於る吸光度を測定して生育度
を求めた。第２表にはその相対生育値を示した。 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン、
核酸等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培
地が使用される。炭素源としては使用する変異株
の利用可能なものであれば良く、例えばグルコー
ス、フラクトース、シユークロース、マルトー
ス、澱粉分解物糖蜜等の糖類が使用され、その
他、エタノール、プロパノール等のアルコール
類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、更に菌株によ
つてはノルマルパラフイン等も単独あるいは他の
炭素源と併用して使用される。 窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機
あるいは有機の窒素源が使用される。有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザ
ミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物等が使用され、
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を
使用する場合には要求される栄養素を補添するこ
とが必要である。 培養は好気的条件で行うことが望ましく、培養
期間中培地のPHを５ないし９、温度を20℃ないし
40℃に制御しつつ１日ないし４日間振盪培養又は
通気撹拌培養することによりフエニルアラニンが
多量培養液中に蓄積される。培養液からフエニル
アラニンを採取する方法は公知の方法に従つて行
えば良く、培養液から菌体を分離除去した後、濃
縮晶析する方法あるいはイオン交換樹脂を用いる
方法等により採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示すフエニルアラニン生産用培地
を調製し、500ml容振盪フラスコに20ml宛分注し、
120℃で10分間加熱滅菌した。これに別途加熱殺
菌した炭酸カルシウム粉末1.0ｇを補添した。
【表】
この培地に第４表に示すフエニルアラニン生産
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。
菌を１白金耳接種し、30℃で72時間振盪培養し
た。培養液中のフエニルアラニン生成量を測定
し、その結果を第４表に示した。
【表】
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
ム属に属し、唯一の炭素源としてプロトカテク酸
では生育できるがキナ酸では生育できないデヒド
ロシキミ酸デヒドラターゼ欠損の性質、かつＬ−
フエニルアラニン生産能を有する微生物を培養し
て、Ｌ−フエニルアラニンを培地中に生成、蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法
によるＬ−フエニルアラニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20726583A JPS6098991A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 発酵法によるｌ―フェニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20726583A JPS6098991A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 発酵法によるｌ―フェニルアラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6098991A JPS6098991A (ja) | 1985-06-01 |
| JPH0456598B2 true JPH0456598B2 (ja) | 1992-09-08 |
Family
ID=16536925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20726583A Granted JPS6098991A (ja) | 1983-11-04 | 1983-11-04 | 発酵法によるｌ―フェニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6098991A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2570548A1 (en) | 2011-09-19 | 2013-03-20 | Electrolux Home Products Corporation N.V. | A washer-dryer with at least one condenser |
-
1983
- 1983-11-04 JP JP20726583A patent/JPS6098991A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6098991A (ja) | 1985-06-01 |
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