JPH055476B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明はＬ−グルタミン酸の製造法に関する。 従来の技術 従来、微生物を用いるＬ−グルタミン酸の製造
法としては種々の方法が知られているが、本発明
にかかわるものとしては、ブレビバクテリウム属
に属するＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として
利用できない変異株を用いる方法が公知である
（特開昭57−138395）。 発明が解決しようとする問題点 近年、Ｌ−グルタミン酸の需要は増大してお
り、Ｌ−グルタミン酸の生産性を向上させる方法
の改良は常に望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、コリネバクテリウム属に属す
る、Ｌ−グルタミン酸生産菌のうち、Ｌ−グルタ
ミンまたはＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源とし
て生育する能力の欠失（不完全欠失を含む）した
菌株を用いることにより収率よくＬ−グルタミン
酸を得ることができることを見出し、本発明を完
成した。 以下に本発明について詳細に説明する。 本発明は、コリネバクテリウム属に属し、Ｌ−
グルタミン酸生産能を有し、Ｌ−グルタミンまた
はＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として生育す
る能力が欠失または著しく低下した微生物を培地
に培養し、培養物中にＬ−グルタミン酸を蓄積さ
せ、該培養物から蓄積したＬ−グルタミン酸を採
取することを特徴とする発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法を提供する。 本発明に使用する微生物としては、コリネバク
テリウム属に属し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有
し、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミン酸を唯
一の炭素源として生育する能力が欠失または著し
く低下した微生物であればいずれでも用いること
ができる。 すなわち、本発明の微生物は、グルコースを唯
一の炭素源とする最少培地では生育できるが、Ｌ
−グルタミンまたはＬ−グルタミン酸を唯一の炭
素源とする最少培地では生育しないかもしくは生
育が極めて遅い。 本発明に使用する微生物は、Ｌ−グルタミン酸
生産能を有する微生物に変異処理を施して、Ｌ−
グルタミンまたはＬ−グルタミン酸を唯一の炭素
源として生育する能力が欠失または著しく低下し
た変異株を誘導することによつて得ることができ
る。 変異処理としては、通常の変異処理法、例えば
紫外線照射またはＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（NTG）、亜硝酸などの化
学処理を施す常法が採用される。また、他の遺伝
的手法（例えば遺伝子組換え操作法、形質導入
法、細胞融合法など）によつても変異株を誘導す
ることができる。さらに、本発明の微生物は上記
の性質に加えて他の性質（例えば各種栄養要求
性、薬剤耐性、薬剤感受性、薬剤依存性、各種糖
類あるいは有機酸類の資化性の変化など）をあわ
せ持つていてもよい。 本発明に使用する微生物の具体例としては、Ｌ
−グルタミン酸生産菌であるコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＢ−15（微工研菌寄7982号）か
ら誘導したコリネバクテリウム・グルタミクムＧ
−28およびＧ−37が挙げられる。 次に、このような微生物を得る具体的な操作例
を説明する。 操作例 コリネバクテリウム・グルタミクムＢ−15（以
下、Ｂ−15と称す）の細胞を0.1規定のトリス−
マレイン酸緩衝液（PH6.0）中に10⁸個／mlになる
ように懸濁した。これに、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを最終濃度0.2
mg／mlになるように添加し、室温で30分間放置後
グルコースを唯一の炭素源とする最少寒天培地
（グルコース0.5ｇ／dl，KH₂PO₄0.15ｇ／dl，K₂
HPO₄0.05ｇ／dl，NaCl0.01ｇ／dl，MgSO₄・
7H₂O0.05ｇ／dl，CaCl₂・2H₂O1μｇ／ml，
FeSO₄・7H₂O10μｇ／ml，MnCl₂・4H₂O7μｇ／
ml、チアミン・HCl0.1μｇ／ml、硫安0.15ｇ／dl、
ビオチン30μｇ／dl、寒天1.5ｇ／dl（NaOHでPH
7.2に調整）〕の表面に塗抹し30℃で３日間静置培
養した。 ついで、コロニー状に生育した細胞を、上述の
最少寒天培地と、Ｌ−グルタミンを唯一の炭素源
とする最少寒天培地（上述のグルコース培地から
グルコースを除き、0.5ｇ／dlのＬ−グルタミン
を添加した培地）にレプリカ法で転写して30℃で
３日間静置培養を行つた結果、グルコースを炭素
源とする最少培地では生育するが、Ｌ−グルタミ
ンを炭素源とする最少培地では生育しないかもし
くは親株であるＢ−15と比較して生育の著しく遅
い変異株を多数得た。これらの変異株を、さらに
グルコースを炭素源とする最少培地、Ｌ−グルタ
ミンを炭素源とする最少培地およびＬ−グルタミ
ン酸を炭素源とする最少培地（上述のグルコース
を炭素源とする最少培地からグルコースを除き、
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム0.5ｇ／dlを添加し
た培地）の３種の培地に塗抹して、グルコースを
炭素源とする最少培地ではよく生育するが、Ｌ−
グルタミンを炭素源とする最少培地およびＬ−グ
ルタミン酸を炭素源とする最少培地の両培地では
生育しないかもしくは親株と比較して生育が著し
く遅い変異株を40株分離した。これらの変異株す
べてを、Ｌ−グルタミン酸発酵試験（実施例１と
同じ方法）にかけて、親株よりＬ−グルタミン酸
生産性のすぐれた菌株としてＧ−28およびＧ−37
の両株を選択した。 Ｇ−28は昭和60年５月25日付で工業技術院微生
物工業技術研究所（微工研）に寄託されており、
その寄託番号はFERM Ｐ−8267である。 これらの菌株の各種炭素源を含む最少寒天培地
での生育試験の結果は第１表に示すとおりであ
る。

【表】 本発明において、微生物を培養する培地として
は、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子などを
含有する栄養培地または合成培地が用いられる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
シユークロース、糖蜜、デンプン、デンプン加水
分解物、果汁などの炭水化物、エタノール、メタ
ノール、プロパノールなどのアルコール類が使用
できる。 窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、塩酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、アンモニア、アミン類、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカー、カゼイン加水分解物、各種発酵菌
体およびその消化物が使用できる。 無機塩としては、リン酸一カリウム、リン酸二
カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、炭酸カルシウムなどが使用できる。 栄養要求性を示す変異株を使用する場合には、
それらの要求物質を標品もしくはそれを含有する
天然物として添加する。 培養は、通気攪拌、振盪培養などの好気的条件
下で行う。培養温度は24〜37℃、培養日数は２〜
７日間である。培養液のPH５〜９の範囲に維持す
る。PHの調整には中和剤として尿素、炭酸カルシ
ウム、アンモニアガス、アンモニア水、リン酸マ
グネシウムなどを用いる。 培養終了後、培養液からＬ−グルタミン酸を単
離する方法としては公知の方法、例えば、イオン
交換樹脂法、溶媒抽出法などが用いられる。 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に示す。 実施例 １ 種菌として、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＧ−28およびＧ−37を使用した。 これらの変異株をグルコース40ｇ／、ペプト
ン10ｇ／、肉エキス５ｇ／、酵母エキス５
ｇ／，KH₂PO₄１ｇ／，K₂HPO₄１ｇ／，
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ／，FeSO₄・7H₂O20mg／
，MnSO₄・4H₂O20mg／、尿素５ｇ／，
（NH₄）₂SO₄５ｇ／からなる種培地（PH7.2）20
mlを含む300ml容三角フラスコに接種し30℃で24
時間培養した。この培養液７mlを発酵培地〔グル
コース77ｇ／、尿素7.7ｇ／、（NH₄）₂SO₄３
ｇ／，KH₂PO₄1.5ｇ／，K₂HPO₄1.5ｇ／，
MnSO₄・4H₂O30mg／、ビオチン77μｇ／、
パントテン酸カルシウム770μｇ／、ニコチン
酸アミド770μｇ／、チアミン・HCl300μｇ／
，PH7.2〕13mlを含む300ml容三角フラスコに接
種し、さらにペニシリンＧ溶液（１ml）を最終濃
度5U／mlになるように添加して34℃で振盪培養
した。培養中、培養液のPHを6.5から8.0に保つよ
うに殺菌した10％尿素溶液0.5mlを添加しながら
30時間培養した。対照として、同一条件下で同時
に親株であるＢ−15を培養した。各々の菌株のＬ
−グルタミン酸の蓄積量は第２表に示す通りであ
つた。

【表】 発明の効果 本発明方法によれば、Ｌ−グルタミン酸の発酵
生産を著しく向上させることができるので、Ｌ−
グルタミン酸を大量に安価に供給することができ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム属に属し、Ｌ−グルタミ
   ン酸生産能を有し、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グ
   ルタミン酸を唯一の炭素源として生育する能力が
   欠失または著しく低下した微生物を培地に培養
   し、培養物中にＬ−グルタミン酸を蓄積させ、該
   培養物から蓄積したＬ−グルタミン酸を採取する
   ことを特徴とする発酵法によるＬ−グルタミン酸
   の製造法。 ２ 該微生物が、コリネバクテリウム・グルタミ
   クムに属することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の方法。