JPH0555113B2

JPH0555113B2 -

Info

Publication number: JPH0555113B2
Application number: JP3800686A
Authority: JP
Inventors: Rei Furukawa; Akio Ozaki; Toshihide Nakanishi; Masahiro Sugimoto
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-02-22
Filing date: 1986-02-22
Publication date: 1993-08-16
Also published as: JPS62195293A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はスレオニンハイドロキサメートに耐性
を示し、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネ
型グルタミン酸生産菌に属する微生物を用いるＬ
−イソロイシンの製造法に関する。

Ｌ−イソロイシンは、アミノ酸製剤として医薬
品産業などの分野に利用される。

従来の技術従来、発酵法によるＬ−イソロイシンの製造法
としては、ミクロコツカス・グルタミクスに属
し、スレオニン、メチオニン、ホモセリンまたは
ロイシン要求性を有する微生物を用いる方法（特
公昭38−7091号公報）、ブレビバクテリウム・フ
ラバムに属し、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草
酸耐性およびアデニンまたはリジン要求性を有す
る微生物を用いる方法（特公昭51−6237号公報）、
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸およびＯ−メ
チルスレオニン耐性を有する微生物を用いる方法
（特公昭51−21077号公報）、ブレビバクテリウム
属またはコリネバクテリウム属に属し、α−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性で、かつエチオニ
ン、２−チアゾールアラニンおよびＳ−（２−ア
ミノエチル）−Ｌ−システインのうち少なくとも
１つに耐性を有する微生物を用いる方法（特開昭
50−101582号公報）、コリネバクテリウム属に属
し、イソロイシンアナログ耐性で、かつメチオニ
ンまたはリジン要求性を有する微生物を用いる方
法（特公昭54−32070号公報）、コリネバクテリウ
ム属に属し、ビタミン−Ｐ耐性を有する微生物を
用いる方法（特開昭57−2687号公報）、コリネバ
クテリウム属に属し、アルギニン要求性を有する
微生物を用いる方法（特開昭59−106295号公報）、
コリネバクテリウム属に属し、フルオロピルビン
酸感受性を有する微生物を用いる方法（特開昭59
−106294号公報）などが知られている。

発明が解決しようとする問題点アミノ酸製剤として有用なＬ−イソロイシン
を、より収率よく安価に製造する方法が求めれて
いる。

問題点を解決するための手段本発明者は、Ｌ−イソロイシンを収率よく安価
に製造するためにより優れたＬ−イソロイシン生
産者の研究を行つた。その結果、スレオニンハイ
ドロサキメートに耐性を示し、Ｌ−イソロイシン
生産能を有するコリネ型グルタミン酸生産菌に属
する微生物を用いると、収率よくＬ−イソロイシ
ンを得ることができることを見出し、本発明を完
成した。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属
し、スレオニンハイドロサキメートに耐性を示
し、かつＬ−イソロイシン生産能を有する微生物
を培地に培養し、培養物中にＬ−イソロイシンを
生成蓄積させ、該培養物よりＬ−イソロイシンを
採取することを特徴とする発酵法によるＬ−イソ
ロイシンの製造法を提供する。

本発明に使用する微生物の例としては、コリネ
型グルタミン酸生産菌に属し、スレオニンハイド
ロキサメートに耐性を示し、かつＬ−イソロイシ
ン生産能を有する微生物であればいずれも用いる
ことができる。スレオニンハイドロキサメートに
耐性の菌株は、コリネ型グルタミン酸生産菌を通
常の変異手段により変異させ、スレオニンハイド
ロキサメートを１ｇ／以上含有する寒天培地上
で生育してくる菌として得ることができる。好適
な例としては、コリネバクテリウム・グルタミク
ムＨ−4260をあげることがきる。

本明細書において、コリネ型グルタミン酸生産
菌とは、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属、ミクロバクテリウム属またはアースロバ
クター属に属する一群のグルタミン酸生産菌をい
う〔「発酵と工業」第40巻、102、1982年参照〕。

以下に、上記のスレオニンハイドロサキメート
耐性株の取得方法の具体例を示す。

コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−3501
〔アルギニン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）−
Ｌ−システイン耐性、リフアンピシン耐性、フル
オロピルビン酸感受性、本菌株は昭和60年７月16
日付で工業技術院微生物工業技術研究所（以下微
工研という）にFERM BP−848として寄託され
ている。〕をＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（NTG）による変異処理
（200μg／ml、30℃、30分間）した後、以下に示
す最少寒天培地に２ｇ／のスレオニンハイドロ
キサメートを添加した培地で生育しうるような菌
株を採取することにより行うことができる。得ら
れたスレオニンハイドロキサメート耐性株50株を
Ｌ−イソロイシンの生産試験（実施例の方法）に
かけ、親株よりＬ−イソロイシン生産性が著しく
すぐれた菌株を選んだ。そのうちの１株がコリネ
バクテリウム・グルタミクムＨ−4260〔アルギニ
ン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システ
イン耐性、リフアンピシン耐性、フルオロピルビ
ン酸感受性、スレオニンハイドロキサメート耐
性〕である。

本菌株は昭和61年２月13日付で微工研に
FERM BP−986として寄託されている。培地組
成：グルコース0.5％、（NH₄）₂SO₄0.15％、
KH₂PO₄0.15％、K₂HPO₄0.05％、NaCl0.01％、
MgSO₄・7H₂O0.05％、CaCl₂・2H₂O1μg／ml、
MnCl₂・4H₂O7μg／ml、FeSO₄・7H₂O10μg／
ml、チアミン塩酸塩0.1μg／ml、ビオチン
0.03μg／ml、アルギニン塩酸塩0.01％、寒天1.5
％、PH7.2 上記微生物を炭素源、窒素源、無機塩類、生育
因子などを含有する合成培地または天然培地を用
いて培養することによりＬ−イソロイシンを培養
物中に蓄積させ、これを採取することによりＬ−
イソロイシンを製造することができる。

炭素源としては、グルコース、シユークロー
ス、糖密、デンプン加水分解物などの糖類、酢
酸、プロピオン酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸
などの有機酸類、メタノール、エタノール、プロ
パノールなどのアルコール類、炭化水素などが使
用できる。

窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、尿素、アンモニアなどが使用できる。また、
栄養要求性を示す変異株の場合には、栄養物質を
純品として、または、それらを含有する天然栄養
物の形で添加することができる。

培養は振盪培養あるいは深部通気撹拌培養など
の好気的条件下で行う。培養温度は通常24〜37
℃、好ましくは28〜32℃の範囲で、培地のPHは５
〜９の範囲、好ましくは中性付近に保持すること
が望ましい。培地のPH調節は、炭酸カルシウム、
無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カ
ルシウム、アンモニアガスなどによつて行う。培
養期間は通常２〜７日間で培養物中にＬ−イソロ
イシンが生成蓄積する。

培養終了後、培養液から菌体などの沈殿物を除
去し、イオン交換処理法、濃縮法、吸着法、塩析
法などを併用することにより、培養液からＬ−イ
ソロイシンを回収することができる。

以下に実施例を示す。

実施例１コリネバクテリウム・グルタミクムＨ−4260
〔アルギニン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）−
Ｌ−システイン耐性、フルオロピルビン酸感受
性、リフアンピシン耐性、スレオニンハイドロキ
サメート耐性〕（FERM BP−986）を20mlの種
培地（グルコース５％、酵母エキス１％、ペプト
ン１％、尿素0.3％、NaCl0.25％、コーン・スチ
ープ・リカー0.5％、ビオチン50μg／ml、PH7.2）
を含む300ml容三角フラスコに接種し、28℃で24
時間、210rpmのロータリーシエーカー上で振と
う培養した。この種培養液２mlを20mlの発酵培地
を含む300ml容三角フラスコに接種して72時間、
種培養と同様の方法で培養した。培養終了後の培
養液中のＬ−イソロイシン蓄積量は、13.4ｇ／
であつた。対照とした親株Ｈ−3501株〔アルギニ
ン要求性、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システ
イン耐性、フルオロピルビン酸感受性、リフアン
ピシン耐性〕を用いて同様に培養した結果、Ｌ−
イソロイシンの蓄積量は、11.6ｇ／であつた。

発酵培地の組成は次のとおり。

廃糖密（グルコース換算）70ｇ／、コーン・ス
チープ・リカー５ｇ／、塩化アンモニウム20
ｇ／、尿素２ｇ／、KH₂PO₄2ｇ／、
MgSO₄・7H₂O0.5ｇ／、FeSO₄・7H₂O0.01
ｇ／、MnCl₂・4H₂O0.01ｇ／、CuSO₄・
5H₂O0.01ｇ／、CaCl₂・2H₂O0.01ｇ／、
ZnSO₄・7H₂O1mg／、NiCl₂1mg／、モリブ
デン酸アンモン・４水塩１mg／、CoCl₂・
6H₂O1mg／、パントテン酸カルシウム10mg／
、ニコチン酸１mg／、ビオチン50μg／ml、
アルギニン塩酸塩0.5ｇ／、PH7.4 Ｈ−4260株を用いて得たＬ−イソロイシン含有
培養液200mlを遠心分離（3000rpm、10分）にか
け、菌体その他の不純物を除いた。得られた上澄
液を強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンSKI
（H⁺型）（三菱化成工業社製）のカラムに通し、
Ｌ−イソロイシンを吸着させ、水洗後、0.5規定
のアンモニア水で溶出してＬ−イソロイシン画分
を集めた。集めた画分を濃縮してPH6.02の等電点
で晶出させることにより、純度99％のＬ−イソロ
イシン1.4ｇを得た。

発明の効果本発明方法によれば、収率よくＬ−イソロイシ
ンを得ることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

１コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、スレオ
ニンハイドロサキメートに耐性を示し、かつＬ−
イソロイシン生産能を有する微生物を培地に培養
し、培養物中にＬ−イソロイシンを生成蓄積さ
せ、該培養物よりＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とする発酵法によるＬ−イソロイシンの
製造法。