JPH02234686A - 発酵法によるｌ―リジンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は発酵法によるＬ−リジンの製造法に関する。さ
らに詳しくはフェニルアラニンアナログ耐性を有するブ
レビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属のし−リ
ジン生産菌を用いる発酵法によるし−リジンを製造する
方法に関する。

（従来の技術） 従来、発酵法によるし−リジンの製造法としてはＳ−（
２−７ミノエチル）−Ｌ−システイン（以下ＡＢＣと記
す）耐性菌を使用する方法（特公昭４２−５５２１３号
）　、ＡＢＣ耐性でかつＬ一ロイシン、Ｌ−ホモセリン
、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、あるいはＬ−アラニ
ン要求性（以下　八ｒａと記す）変異株を使用する方法
（特開昭４９−３６８８８号、特開昭４９−８０２８９
号、特公昭５１−２１０７８号）、ＡＢＣ耐性でかつβ
−ヒドロキシルロイシン（以下ＨＬと記す）等のロイシ
ンアナログ耐性変異株を用いる方法（特公昭５３−１８
３３）、α−クロロカブ口ラクタム（以下ＣＣＬと記す
）耐性変異株を用いる方法（特公昭５３−４３５９１）
　、ｒ−メチルリジン（以下ＭＬと記す）耐性変異株を
用いる方法（特公昭５６−１９２３５）　、フルオロピ
ルビン酸（以下ＦＰと記す）惑受性変異株を使用する方
法（特開昭５５９７８３号）、ビルビン酸キナーゼ活性
が低下した変異株を使用する方法（特開昭５８−１７０
４８７号）スーパーオキシドジスムターゼ活性を有する
変異株を用いる方法特開昭６１−２８２０９２などが知
られている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明が解決しようとする問題点は、更に安価に発酵法
によりＬ−リジンを製造する方法を確立することにある
。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは上述の問題点を解決するためにＬ一リジン
生産菌の菌株改良によって発酵収率を高めるべく種々検
討した結果、Ｌ−リジン生産菌にフェニルアラニンアナ
ログ耐性を付与することにより、この菌のし−リジン生
産能を大巾に高めうろことを見出し、これに基いて本発
明を完成するに至った。

発酵法によるし−リジンの製造に際し、フェニルアラニ
ンアナログ耐性の性質をもった菌株を用いればＬ−リジ
ンの生産性が飛躍的に改善されることは本発明者らによ
ってはじめて見出された知見である。

本発明に使用する微生物は、ブレビバクテリウム属また
はコリネバクテリウム属に属しＬ−リジン生産能を有す
るものを変異処理し、得られた変異株のうちから、フェ
ニルアラニンアナログに耐性を有する株を選別すること
によって取得できる。

本発明で誘導する変異株の親株としてはブレビバクテリ
ウム属又はコリネバクテリウム属に属する微生物であれ
ば種、菌株を問わずどのような菌株でも良いが、以下に
示すような、いわゆるコリネフォームのし−グルタミン
酸生産菌として知られるものが好適である。

ブレビバクテリウム・フラブム　ＡＴＣ０　１４０６７
ブレビバクテリウム・ロゼウム　ＡＴＣＣ　１３８２５
コリネバクテリウム・リリウム　ＡＴＣＣ　１５９９０
菌株としては、これら野生株の他に、リジン生産に有利
な性質、例えばＡＢＣ耐性、ＣＣＬ耐性、ＭＬ耐性、ホ
モセリン要求性、アラニン要求性、フルオロピルビン酸
感受性、スレオニン感受性、メチオニン感受性などの性
質を有する変異株を使用することもできる。

ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に属し
、リジン生産に有利な性質を有する菌株を用いて、本発
明の変異株を得るには、紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘
起剤処理等の一般に微住物を変異誘導する通常の方法を
用いればよい。変異誘起剤処理の例としては、２５０μ
ｇ／ｎｕのＮニトローＮ′一メチルーＮ−ニトロソグア
ニジンによって３０℃で２０分間処理する方法がある。

本発明においてはこのようにして得られた変異株からフ
エニルアラニンアナログに対する耐性株を選択取得する
。

フエニルアラニンアナログとしては、メタトリフ口口メ
チルーＤＬ−フェニルアラニンＳ−ベンジルーし−ホモ
システィン，ＤＬ−バラクロロフエニルアラニン等の薬
剤が有効であった。

これらの薬剤に対する耐性株の取得は通常の薬剤耐性株
取得方法に準じて行なえばよく、例えば前記薬剤のいず
れかを親株が生育しないような濃度で含有する寒天培地
に変異株を撒いて培養し、生育したコロニーを採取すれ
ばよい。培地中の薬剤の濃度は薬剤の種頻によって異な
り、例えばメタトリフ口口メチルフェニルアラニンの場
合には１．０■／ｍβ程度、Ｓ−ベンジルーし−ホモシ
スティン，ＤＬ−バラクロロフェニルアラニンの場合に
は２．０■／ＩＩ１β程度が適当である。

その他の薬剤を用いる場合には予め培養試験を行なって
適切な濃度を定めればよいことはいうまでもない。

また、ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム
属に属する野生株を変異処理し、得られた変異株の中か
らファニルアラニンアナログに耐性を有する株を選別し
た後にこれらの耐性株にリジン生産に有用な性質、例え
ばＡＢＣ耐性やホモセリン要求性、ＣＣＬ耐性、ＭＬ耐
性、フロロピルビン酸惑受性等を付与してもリジン生産
能を大巾に高めた菌株を取得できる。

本発明に使用しうる微生物の例としてはブレビバクテリ
ウム　ラクトフェルメンタムＡＪ　１２４３７，ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−　　Ｚ乙’ｌクコリネバクテリウム　アセト
アシドフィラムＡＪ　１２４３６．ＦＥＲＭ　ＢＰ−　
ｚｚＱｌｓを挙げることができる。

次に微生物の取得例を示す。

ブレビバクテリウム　ラクトフェルメンタムＡＪ　１２
４３５（ＦＥＲＭ−ＢＰ　２２’？４　　）　，　ＡＪ
　１２４１５（ＦＥＲＭＢＰ　’ｌ’ｌ’ｉタ）を親株
とした。

これらの菌株をブイヨンスラントで２４時間培養し、得
られた各菌株をいずれも２５０μｇ／ｍ　ｊ！のＮ−ニ
トローＮ′−メチルーＮ−ニトロソグアニジンによって
３０℃で２０分間処理して変異株を得た。

グル：］−ス２ｇ／ｄｆ，　（ＮＨ４）２ＳＯ４１ｇ／
ｄｊ！ＫＨｚＰＯ４０．　Ｉｇ／ｄｌ，ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２０　０．　０　４ｇ／ｄＣＦｅＳＯａ　・７Ｈ２０
　０．　Ｏ　Ｏ　Ｉｇ／ｄＡ，　ＭｎＳＯ４・４８２０
０．　０　０　１ｇ／ｄ７！，尿素０．２ｇ／ｄＣ　ビ
オチン５０μｇ／ｌｌ．　　ビタミンＢ１・ｌｌｃｊ！
１００μｇ／１．寒天２ｇ／ｄｚよりなる培地にメタト
リフロロメチルフェニルアラニン１．０ｍｇ／ｍｊ！又
はパラクロロフェニルアラニン２．Ｏｙ＋＋ｇ／ｍｊ！
を添加しｐＨ７．０に調整後１２０゜Ｃ１５分間殺菌し
て寒天培地を調製した。

前記変異株をこの寒天培地に撒いて３１、５℃で４８時
間培養し、生成したコロニーを採取して各薬剤耐性株を
取得し、メタトリフロロメチルアラニン耐性株の中から
ＡＪ　１２４３７，ＦＥＲＭ　ＢＰ−　２　’Ｚ　’Ｉ
クを、バラクロロフェニルアラニン耐性株の中からＡＪ
　１２４３６．ＦＥＲＭ　ＢＰ−　Ｚ　２　Ｑ　ｂを得
た。

第１表に親株ならびに変異株の耐性の度合いを示した。

第　　　１　　　表 メタトリフロυメチル　　　　　　　５　　　　　　　
　　　　　　３５　　　　　　　　　　８５フェニルア
ラニン バラクｌ［７ｚニル７５：ン　　　１０　　　　　　　
　　　　　　４０　　　　　　　　　　７０このような
微生物を用いてＬ−リジンを生成蓄積させるにはＬ−リ
ジン発酵に用いられる常法を用いて行なえばよい。

すなわち、使用する培地としては、通常の炭素源、窒素
源、無機イオンその他の栄養素の含有する通常の培地を
用いる。炭素源としては、例えばサトウキビ、甜菜から
の糖汁あるいは廃糖蜜、澱粉加水分解物等の糖質原料等
または酢酸等の有機酸等を用いればよい。

窒素源も通常のＬ−リジン発酵に用いられるアンモニウ
ム塩、アンモニア水、尿素等を用いればよく、その他リ
ン酸イオン、マグネシウムイオン等の有機イオン及びサ
イアミン等のビタミンを必要に応じて適宜使用する。

栄養要求性株のような特定の物質を生育に必要とする菌
株を用いるときにはこれらの物質そのものを培地に加え
るか、これらを含む蛋白加水分解物、ベプトン、コーン
ステープリカー、肉エキス、酵母エキスなどを加えた培
地を用いればよい。

培養条件についても、温度３０〜４　０　’ｃ、ρＨ６
〜８の範囲内で好気的条件で実施する等常法によって実
施すればよい。また、発酵液からＬ−リジンを取得する
方法も常法に従って行なえばよいことはいうまでもない
。

以下、実施例を示す。

実施例１ ル ク号コース　３６■／ｍβ、塩化アンモニウム２　０　
ｖｇ／ｍｌｌ　，　ＫＨ２ＰＯ４　１　ｔｒｉ／ｍｌｌ
　、ＭｇＳＯａ　・７ａｑＯ．４ｒｒｗ／ｍｌｌ、Ｆｅ
ＳＯ，　Ｈ　７ａｑ　１　０　ｐ　ｇ／ｍ　ｆ，ＭｎＳ
Ｏ４・４ａｑ　８　ｐ　ｇ／ｎ＋１！、大豆蛋白酸加水
分解物（窒素として）１μｇ／ｍｆ、サイアミン塩酸塩
０．　１μｇ　／　ｍ　ｌおよびビオチン０．３μｇ／
ｍｌ！を含有する培地を調製し、その３０　ｍ！！づつ
を５００ｍβ容の振盪フラスコに入れて１１５℃で１０
分間加熱殺菌し、あらかじめ乾熱滅菌した炭酸カルシウ
ムを１ｇを加えた。この培地に第１表に示す菌株を接種
し、往復振盪機により３１．５℃で培養を行った。４８
時間で発酵を終了し発酵液中に蓄積したし−リジンを測
定した。その結果、第２表に示すようにいずれの薬剤耐
性株も良好なし−リジン（塩酸塩換算）を蓄積していた
。

実施例２ 廃蔗糖蜜を糖として８　０　ｍｇ／　ｍ　Ｉｌ，　ＫＨ
ｚＰ｛ｌａ１ｍｇ／ｍ　ｊ！　，　ＭｇＳＯ４・７　ａ
ｑ　１　ｍｇ／ｍ　ｊｆ！、大豆加水分解物を窒素換算
で１■／ｍｐおよび硫酸アンモニウム５ｅ−１３μｇ／
ｍβの組成を有する培地を調製し（ｐＨ７．０）、その
２０　ｍｌづつを５００ｍｌ振盪フラスコに分注して加
熱殺菌し、あらかじめ別殺菌した炭酸カルシウムを１ｇ
加えた。この培地に下記の菌株を接種し、往復振盪機に
より３１．５℃で培養を行った。

７２時間で発酵を終了し、発酵液中に蓄積したし−リジ
ンを測定した。その結果、第３表に示すようにいずれの
薬剤耐性株もし−リジン（塩酸塩換算）を良好に蓄積し
た。

９．４ ６，９ １６．１ １＋５ ２０．６ １７．１ ３３，０ ３１．０ ２６．０ １９．２ ４４．９ ４０．３ ２５．８ ２１．４ ４１．２ ３８．７

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属に属
   し、フェニルアラニンアナログ耐性を有するＬ−リジン
   生産株を栄養培地に培養し、培養物中にＬ−リジンを生
   成蓄積し採取することを特徴とするＬ−リジンの製造方
   法。