DE3139397A1

DE3139397A1 - Verfahren zur herstellung von aminosaeuren auf fermentativem wege

Info

Publication number: DE3139397A1
Application number: DE19813139397
Authority: DE
Inventors: Kan Takasago Hyogo Hirakawa; Masami Kato; Koji Takasago Hyogo Nomura; Ryoji Kakogawa Hyogo Takakuma; Kiyoshi Akashi Hyogo Watanabe
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1980-10-07
Filing date: 1981-10-03
Publication date: 1982-06-24
Also published as: CA1162499A; AU7571781A; NL8104573A; US4411991A; NZ198413A; FR2491495A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren_s bei dem ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus mit der Fähigkeit Milchsäure zu assimilieren aerob kultiviert wird in Anwesenheit von mindestens einem Milchsäure-Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium, das mindestens ein Kohlenhydrat, das durch den Milchsäure-Mikroorganismus assimilierbar, jedoch durch den Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus nicht assimilierbar oder schwach assimilierbar ist, enthält_; und akkumulierte Aminosäure aus der Kulturbrühe gewonnen wird.

Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines industriell vorteilhaften Verfahrens zur Herstellung von Aminosäuren, die wichtig für die menschliche und tierische Ernährung sind, durch Ausnutzung kostengünstiger Kohlenstoffquellen oder organischer Substanzen aus landwirtschaftlichen Abfällen oder Viehbestand-Abfällen, die bisher nicht wirksam verwertet werden konnten.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verringerung der Umweltverschmutzung, die durch landwirtschaftliche Abfälle und Viehbestandsabfälle bewirkt wird.

In der letzten Zeit wurde die Begrenztheit der natürlichen Quellen erkannt und ihre wirksame Verwertung wurde zu einem der gegenwärtigen Hauptziele; jedoch steckt die wirksame Verwertung der Quellen noch in den Kinderschuhen. Beispielsweise wurde in einer ΙΆΟ-Untersuchung ausgeführt, daß von 74- Millionen Donnen Molke, die in der Welt 1973 erzeugt wurden, nur die Hälfte hauptsächlich als Shatter für Viehbestand verwendet wurde und der Rest nicht ausgenützt wurde. Dies bedeutet, daß mehr als 2 Millionen Tonnen Lactose und mehr als 300 000 Tonnen wertvoller Proteine in diesem Jahr verschwendet wurden, da Molken, die von der Eäse oder Caseinherstellung stammen, etwa 5 % Lactose und etwa 1 % Proteine enthalten. Diese Situation führt nicht nur zu einem Verlust natürlicher Quellen, sondern führt auch zu ernstlichen Abfallbeseitigungsproblemen vom Gewichtspunkt der Umweltverschmutzung her. Daher besteht seit langem ein Bedürfnis nach verbesserten Verfahren zur Ausnutzung von Molke. Die beständigen Anstrengungen der Molkereiindustrie im letzten Jahrzehnt konnten jedoch nicht zu einer zufriedenstellenden Lösung des Problems führen. Einer der am umfangreichsten untersuchten Näherungsversuche war die fermentative Verwertung von Molke. Beispielsweise wurde die Umwandlung von Molkenfeststoffen in eine eßbare Hefezellmasse versucht unter Verwendung eines Hefestammes, der geeignet ist zur Assimilierung von Lactose (US-PS 3 818 109). Jedoch war die extensive Verwendung von Molke als Ausgangsmaterial für die Fermentation noch nicht erfolgreich.

Pies ist voraussichtlich der begrenzten Anzahl von Mikroorganismen zuzuschreiben, die geeignet sind Lactose, die in Molke enthalten ist, zu assimilieren.

Die Fähigkeit Kohlenstoffquellen, wie Kohlenhydrate, zu assimilieren, stellt ein wichtiges Charakteristikum zur Taxonomie oder Identifizierung von Mikroorganismen dar. Es ist sehr schwierig oder unmöglich, Mikroorganismen die Assimilationsfähigkeit zu verleihen oder die Assimilationsfähigkeit von Mikroorganismen durch übliche künstliche Mutationstechniken zu erhöhen.

Daher sind bei bekannten fermentativen Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, bei denen ein einziger Mikroorganismen-Stamm verwendet wird (Monokulturmethode) verwendbare Ausgangsmaterialien auf solche beschränkt, die wirksam durch den angenommenen Stamm assimiliert oder metabolisiert werden können und die Produktionsfähigkeit wird durch die fundamentalen genetischen Eigenschaften bestimmt, die der Stamm besitzt und die kaum durch künstliche Mutation verbessert werden können. Andererseits wurden in der letzten Zeit trickreiche genetische Techniken vielversprechend als Technik zur Erzielung von Mutantenstämmen von Mikroorganismen;, jedoch erfordert die Anwendung der Technik in industriellem Maßstab noch die Lösung zahlreicher Probleme, wie die Bestätigung der Stabilität und der Sicherheit von fiekombinationsstämmen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können Aminosäuren fermentativ hergestellt werden durch Anwendung von Kohlenstoffquellen, die durch Aminosäure erzeugende

Mikroorganismen nicht assimilierbar oder schwach assimilierbar sind, durch Kultivieren von Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen in Anwesenheit von Milchsäure-Mikroorganismen, die seit langer Zeit zur Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken verwendet wurden. So wird es durch die Erfindung möglich, Ausgangsmaterialien nach den Assimilationsfähigkeiten der verwendeten Milchsäure-Mikroorganismen weitverbreitet zu verwenden. Mit anderen Worten wurde durch die Erfindung das gleiche Ziel erreicht, das man erreichen könnte durch genetische Eingriffe, wobei es erfindungsgemäß möglich gemacht wurde, die genetischen Eigenschaften von Milchsäure-Mikroorganismen an Aminosäure erzeugende Mikroorganismen durch eine einfache und sichere Technik zu verleihen.

Es gibt verschiedene Berichte über eine Methode zur gemischten Kultivierung: David E. i¹. Harrison betrachtete den Eahmen und die Möglichkeiter¹ der Anwendung der gemischten·Kultivierung für die industrielle Fermentation (Adv. Appl. Microbiol., Vol. 24, Seite 129 (1978J. Bei der Herstellung von Aminosäuren durch gemischte Populationen von Mikroorganismen berichteten M. Suzuki und S. Xamatodani, daß L-Glutaminsäure in großen Mengen erzeugt wurde durch gemischte Kultivierung von Escherichia coli (E) und einem Stamm von Corynebacterium (A); als Mechanismus zeigten sie, daß a-Ketoglutarat durch den Ε-Stamm akkumuliert wird und das oc-Ketoglutarat seinerseits durch den Α-Stamm unter Erzeugung von L-Glutamat aminiert wird. Bei diesem Verfahren muß der Ε-Stamm die Fähigkeit haben, a-Ketoglutarat als einen Vorläufer von Glutaminsäure zu erzeugen, was sich wesentlich von der vorliegenden Erfindung unterscheidet

(M. Suzuki und S. Yamatodani; Annual Meat. Agr. Chem. Soc. Jpn., Abst., Seite 164- (1967))· Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bekannt, bei dem ein Kohlenwasserstoff assimilierender Mikroorganismus, der der Gattung Arthrobacter oder Brevibacterium angehört und ein L-Lysin erzeugender Mikroorganismus, der der Gattung Corynebacterium angehört, gemischt kultiviert werden in einem Nährmedium, das einen Kohlenwasserstoff als Hauptkohlenstoffquelle enthält (US-PS 5 655 510). Es ist auch ein Verfahren bekannt, bei dem einzellige Proteine erhalten werden durch gemischtes Kultivieren einer Hefe, die der Gattung Saccharomyces oder Candida angehört und eines Milchsäure erzeugenden Mikroorganismus, der der Gattung Lactobacillus angehört (US-PS 3 818 109, DE-OS 2 4-0? 306 und DE-OS 2 500 325).

So wurden zwar bisher Versuche gemacht, verschiedene fermentative Produkte durch gemischtes Kultivieren zu erzeugen, jedoch ist eine industriell vorteilhafte Erzeugung von Aminosäuren durch gemischtes Kultivieren von Milchsäure-Mikroorganismus und Aminosäure erzeugendem Mikroorganismus unbekannt.

Andererseits ist es bereits bekannt, daß eine Aminosäure in einem Nährmedium durch aerobes Kultivieren eines Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus in einem JJährmedium akkumuliert wird, das Milchsäure als Hauptkohlenstoff quelle enthält (beispielsweise V. N. Shaposhnikov und V. S. Isaeva, Mikrobiologia Vol. 36, Seite -31 (1967) , K. Seto und T. Harada, T. Ferment. Technol., Vol. 47, Seite 558 (1969)). Milchsäure wurde jedoch kaum als Ausgangsmaterial für die industrielle

Herstellung von Aminosäuren verwendet, da die Extraktion und die Eeinigung von Milchsäure aus einer Kulturbrühe der Fermentation von Milchsäure schwierig sind und die durch Synthese erhaltene Milchsäure kostspielig ist. Die zweistufige Fermentation bei der die Milchsäurefermentation und die Aminosäurefermentation in Serie kombiniert werden, ist denkbar, jedoch erfordert diese Methode eine alkalische Substanz wie Calciumcarbonat oder Ammoniak als "Kfeutralisationsmittel und erfordert eine lange Zeit, da die Geschwindigkeit der Milchsäureproduktion durch die Inhibierung der Fermentation durch das Produkt Milchsäure, das in hohen Konzentrationen akkumuliert wird, verlangsamt wird. Darüber hinaus erfordert die zweite Stufe dieses Verfahrens den Zusatz einer sauren Substanz zur Steuerung der Erhöhung des pH-Werts für den Verbrauch der Milchsäure.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren jedoch kann davon ausgegangen werden, daß Milchsäure, die durch einen Milchsäure-Mikroorganismus erzeugt wird, sofort durch einen Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus verwertet wird, mit dem Ergebnis, daß das Ausgangskohlenhydrat in einem einstufigen Verfahren in Aminosäuren umgewandelt werden kann; somit kann eine wirksame fermentative Erzeugung von Aminosäuren durchgeführt werden und gleichzeitig kann die Menge des Neutralisationsmittels auf ein Minimum herabgesetzt werden und die Extraktion und die Eeinigung der Aminosäuren aus der resultierenden Kulturbrühe können erleichtert werden.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure, das darin besteht, einen Aminosäure

erzeugenden Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, Milchsäure zu assimilieren, aerob zu kultivieren in Anwesenheit von mindestens einem Milchsäure-Mikroorganismus, in einem wäßrigen Nährmedium, das mindestens ein Kohlenhydrat, das durch den Milchsäure-Mikroorganismus assimilierbar, jedoch durch den Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus nicht assimilierbar oder schwach assimilierbar ist, als Hauptkohlenst'offquelle enthält, die Aminosäure in der resultierenden Kulturbrühe zu akkumulieren und die Aminosäure aus der Kulturbrühe zu gewinnen.

Aminosäuren, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden, sind beispielsweise L-Lysin, L-Valin, L-Threonin, L-Glutaminsäure, L-Isoleucin, L- Leucin, DL-Alanin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Arginin, L-Histidin, L-Serin, L-Glycin und L-Asparaginsäure.

Im folgenden wird die Erfindung genauer beschrieben. Zwar ist der Mechanismus der Erfindung noch nicht völlig geklärt, jedoch ist ein Mechanismus denkbar, durch den Metabolite, die Milchsäure als Hauptbestandteil enthalten, aus einem Kohlenhydrat durch einen Milchsäure-Mikroorganismus gebildet und anschließend durch einen Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus assimiliert werden unter Umwandlung in eine Aminosäure. Mit anderen Worten ist ein System denkbar, bei dem der erste Mikroorganismus - ein Milchsäure-Mikroorganismus L - eine Glycolyse eines Kohlenhydrats durchführt und der zweite Mikroorganismus - ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus A - eine Aminosäureerzeugung aus diesen Metaboliten, die Milchsäure als Hauptbestandteil enthalten, die von dem ersten Mikroorganismus gebildet werden,

durchführt. Da man annehmen kann, daß die Oxidation von Milchsäure über einen Hauptweg erfolgt, an dem Lactatdehydrοgenäse (UDH) beteiligt ist, werden die .Aminosäuren voraussichtlich durch dieses Enzym über Brenztraubensäure gebildet, die sich im Zentrum des Metabolismus-Verfahrenswegs der allgemeinen Mikroorganismen, wie nachstehend gezeigt, befindet.

Mikroorganismus (L)

I
I

ICohlenhydrat > Lactat

(LDH)

<■— Mikroorganismus (A)

(Pyruvat) > L-Aminosäure

Ein hypothetischer Mechanismus für die L-Aminosäureerzeugung aus einem Kohlenhydrat gemäß der Erfindung

Ein.unterscheidendes Merkmal der Erfindung liegt darin, daß die einfache Kombination der beiden Mikroorganismensysteme nicht nur zweckmäßig die Charakteristika der beiden Mikroorganismen ausnutzt, sondern ein unbekannter Synergistiseher Effekt angenommen werden kann und daß zahlreiche industrielle Vorteile erzielt werden können, die mit einer Monokultur nicht möglich sind.

Die Vorteile der Erfindung werden nachstehend erläutert. Erstens werden organische Substanzen, die bisher als Ausgangsmaterial für die Fermentation wegen ihrer Nichtassimilierbarkeit oder geringen Assimilierbarkeit durch

Aminosäure erzeugende Mikroorganismen unbrauchbar waren, als Ausgangsmaterial für die Aminosäurefermentation verwendet. Beispielsweise können Käsemolke oder Caseinmolke, Abfälle aus Industriebetrieben, als geeignetes Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwertet werden. Es muß nicht näher ausgeführt werden, daß es industriell sehr vorteilhaft ist, kostengünstige Ausgangsmaterialien Je nach der Verfügbarkeit von Ausgangsmaterialien ausnutzen zu können.

Zweitens trägt die Erfindung zur Verringerung der Umweltverschmutzung bei, da in Molke enthaltene organische Substanzen oder flüssige Abfälle oder Müll von Stärkefabriken in Aminosäuren und Mikrobenzellen für deren Verwertung als Ausgangsmaterial zur fermentation umgewandelt werden, mit dem Ergebnis, daß BSB-Bestandteile, die Gründe für die Umweltverschmutzung darstellen, durch Verfahren zur Gewinnung von Aminosäuren stark verringert werden.

Drittens wird die fermentative Produktionsfähigkeit beträchtlich verbessert im Vergleich mit Monokulturverfahren. Wenn ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus der die Fähigkeit hat Milchsäure zu assimilieren, verwendet wird, hängt die Verbrauchsrate eines Kohlenhydrats als ein Substrat, die häufig proportional zu der Bate der Produktfermentation ist, von der Aktivität eines Milchsäure-Mikroorganismus ab, d. h. von der Eate der Milchsäurefermentation. In einem System einer gemischten Kultur gemäß der Erfindung wird durch Milchsäure-Mikroorganismen erzeugte und akkumulierte Milchsäure rasch unter Verwendung von Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen verwertet, mit

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dem Ergebnis, daß voraussichtlich die gleiche Wirkung erzielt wird, wie die der Dialysefermentation, wodurch die Fermentation durch Entfernen der Produkte durch eine Membran "beschleunigt wird; dementsprechend bleibt die hohe Aktivität des Milchsäure-Mikroorganismus erhalten. Voraussichtlich besteht auch die Möglichkeit, daß die hohe Kate der Milchsäurefermentation durch einen unbekannten Synergistischen Effekt aufrechterhalten wird, wie einen beschleunigenden Effekt, durch Zersetzung von Wasserstoffperoxid, das eine Inhibierung des Metabolismus bewirken kann, durch Katalase, die in Milchsäure-Mikroorganismen fehlt, jedoch durch Aminosäure erzeugende Mikroorganismen bereitgestellt wird. Wenn homofermentative Milchsäure-Mikroorganismen, die nur Milchsäure aus Kohlehydraten erzeugen, verwendet werden, so trägt dies voraussichtlich zu der hohen Produktionsfähigkeit bei, so daß die Umwandlungsrate eines Kohlenhydrats in Milchsäure hohe Werte, wie 90 bis 100 %, annimmt, was zu einem verringerten Verlust der Kohlenstoffquelle führt.

Im Rahmen der Erfindung hat es sich gezeigt, daß die Milchsäurefermentation, obwohl im allgemeinen unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, wirksam im erfindungsgemäßen Verfahren selbst unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden kann, die für die Aminosäurefermentation allgemein erforderlich sind. Hierdurch werden die vorstehenden Vermutungen bestärkt.

Viertens führt ein Vorteil der Erfindung zu einer Beständigkeit gegen Verunreinigung durch fremde Mikroorganismen. Die vorstehend erwähnte Zusammenfassung von David E. i¹. Harrison erwähnt die Beständigkeit gegen

die Verunreinigung durch Fremd-Mikroorganismen als einen Vorteil der gemischten Kultivierung. Beim erfindungsgemäßen Verfahren, "bei dem Milchsäure-Mikroorganismen verwendet werden, werden neben dem durch den Autor erläuterten Mechanismus antimikrobielle Substanzen (beispielsweise Nisin durch Streptococcus lactis und Diplococcin durch Streptococcus cremoris, usw.) voraussichtlich an der Verringerung der Wirkungen der Verunreinigung durch fremde Mikroorganismen beteiligt. Die Verhinderung der Verunreinigung durch fremde Mikroorganismen stellt eines der bedeutendsten Probleme dar, die bei der industriellen Fermentation auftreten.

Aminosäure erzeugende Mikroorganismen, die die Fähigkeit aufweisen, Milchsäure zu assimilieren, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, gehören einer Gattung an, ausgewählt aus der Gruppe von Alkaligenus, Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Microbacterium, Nocardia, Proteus, Serratia, Candida, Saccharomyces, Sporoboromyces und Schizosaccharomyces.

Die Fähigkeit von Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen" Milchsäure zu assimilieren kann durch aerobes Kultivieren eines Testmikroorganismus in einem Minimalmedium, das Milchsäure (L~ oder DL-Lactat) als einzige Kohlenstoffquelle enthält, gefolgt von der Beobachtung des Wachstums des Mikroorganismus, überprüft und verglichen werden. Es ist auch möglich, Stämme mit einer ausgezeichneten Fähigkeit zur Assimilation von Milchsäure aus der Natur durch eine Anreicherungskultur unter Anwendung eines Minimalmediums, das Milchsäure enthält (0,5 bis 2 %) zu isolieren.

!Repräsentative Beispiele für Stämme, die "beim erfindungsgemäßen Verfahren als Aminosäure erzeugende Mikroorganismen verwendet werden, sind im folgenden aufgeführt :

Alkaligenes faecalis Alkaligenes marshallii Acinetobacter sp-38-15 Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter paraffineus Arthrobacter citreus Arthrobacter sp-18 ^:

Bacillus circulans Bacillus megatherium Bacillus subtilis Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium acetylicum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Corynebacterium hydrocarbociaäfcmn Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium glutamicum Flavobacterium lutescens Micrococcus luteus Micrococcus roseus Microbacterium ammoniafilm. Nocardia alkanoglutinosa IFO-3160 ATCC-21030

FERM~P~2187 jIFO-12552 ATCC-15591 ATCC-17775 FEßM-P-14 IFO-3329 IFO-3970 XAM-1071 ATCC-19350 XAM-1790 IFO-12400 ATCC-13826 ATCC-13869 ATCC-15960 ATCC-I3870 ATCC-13032 IFO-3085 lFO-3333 IFO-3764 ATCC-15354 ATCC-31220

Nocardia erythropolis . IAM-12122

Kocardia lyena . · ATCC-21338

Proteus morganii · IFO-3848

Serratia marcescens IFO-3054

Serratia plymuthium " . IFO-3055

Saccharomyces oviformis . . IAM-4325

/Saccharomyces cerevisiae · XFO-0971

Candida h'umicola IFO-1577

Candida lypolitica - . " IFO-0746

Sporoboromyces roseus IFO-1037

Schxzosaccharomyces pombe . ' IFO-6170

Anmerkung:

IAM: Institute of Applied Microbiology, Univ. of Tokio, 1-chome, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokio,

Japan,
Ii¹O: Institute for Fermentation, Osaka, Juso, Uishinomachi, Higashiyodogawa-ku, Osaka,

Japan,
IEEM-P: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of Industrial Trade and Industry,

Chiba-city, Japan

Diese Stämme weisen die Fähigkeit auf, Milchsäure zu assimilieren, jedoch unterscheidet sich, die Intensität der Assimilierbarkeit mit den verschiedenen Stämmen. Es ist auch möglich, Assimilationsfähigkeit durch aerobes Kultivieren eines Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus in einem Medium zu induzieren oder zu erhöhen, das 0,2 bis 4 % Gew./Vol. Milchsäure (Natrium- oder Calciumlactat) enthält. Es ist bekannt, daß von

Lactatdehydrogenaseη, die voraussichtlich den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Lactat-Verwertung beherrschen, L(+)-Lactat-dehydrogenase durch aerobes Kultivieren eines Mikroorganismus in Anwesenheit eines Lactats induziert werden kann (Ellen I. Carvie; Microbiological Keview, Vol. 44 (1), Seiten 106-139 (1980)). Die künstliche Mutation kann ebenfalls die Milchsäure-Assimilierbarkeit erhöhen.

Von den vorstehend als Beispiele aufgeführten Mikroorganismen können Stämme mit einer hohen Aminosäureproduktionsfähigkeit erhalten werden durch übliche Mutationsbehandlung, wie die unter Verwendung chemisch mutierender Mittel, beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder Bestrahlen, beispielsweise Ultraviolettstrahlung und Röntgenstrahlung, gefolgt von dem Isolieren der Mutantenstämme nach bekannten Verfahren (K. Nakayama, et al., J. Gen. Appl. Microbiol., Vol. 7, Seite 41 (1961); Koichi Yamada, Biotechnol. and Bioeng., Vol. 19, Seite 1563 (1977))·

L-Lysin erzeugende Stämme sind beispielsweise im folgenden aufgeführt:

Auxötrophe, die Homoserin erfordern (oder Threonin plus Methionin (US-PS 2 979 439, GB-PS 1 200 587): Auxötrophe, die eine der folgenden Aminosäuren erfordern: Threonin, Isoleucin, Valin, Methionin, Leucin, Alanin, Arginin, Histidin, Phenylalanin, Cystin, Cystein (PS-PS 1 486 235, PE-PS 158 154, US-PS 3 527 672, GB-PS 1 184 530, GB-PS 1 118 719); Mutanten, die sich von einem Homoserin erfordernden Autotroph ableiten (US-PS 3 524 797, GB-PS 1 186 988, BE-PS 753 394); Mutanten, die beständig gegen L-Lysin-Analoge sind wie S-(2-Aminoäthyl)-L-cystein (S-AEC)

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(US-PS 3 707 441; K. Sano und I. Shiio: J. Gen. Appl. Microbiol., Vol. 16, Seite 373 (1970); E. Takenouchi et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 41, 615 (1977); US-PS 4 123 329)5 Mutanten, die empfindlich gegen Threonin oder Methionin sind (PE-PS 1 200 353; I- Shiio und υ. Miyajima, J. Gen. Appl. Microbiol., Vol. 15, 267 (1969).

L-Valin erzeugende Stämme sind beispielsweise im folgenden aufgeführt. Auxotrophe, die (1) Isoleucin, (2) Leucin, (3) Threonin, (4) Homoserin oder Threonin plus Methionin oder (5) Arginin erfordern (E. Ishii et al., J. Gen. Appl. Microbiol., Vol. 13, Seite 217 (1967); US-PS 3 700 556); Mutanten, die-resistant gegen oc-Aminobutyrat oder 2-Thiazolalanin sind (M. Xisumi, J. Bacteriol., Vol. 106, Seite 493 (1971); JA-AS Mr. 44877/1973 und Hr. 68794/1973).

L-Threonin erzeugende Stämme sind beispielsweise im folgenden aufgeführt. Auxotrophe, die eine oder mehrere der folgenden Aminosäuren erfordern: Methionin, Isoleucin, Lysin, Diaminopimelinsäure (PE-PS 1 489 910; GB-PS 1 190 687; S¹E-PS 1 591 232; GB-PS 1 817 666); Mutanten, die resistent gegen L-Threonin-Analoge sind wie a-Amino-ß-hydroxyvaleriahsäure (ABV) (US-PS 3 582 471).

L.Glutaminsäure erzeugende Stämme sind, neben den vorstehend als Beispiele aufgeführten, im folgenden angegeben:

Mutanten, die Glyzerin benötigen (T. Nakano et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 34, 1875 (1970); Mutanten, die ölsäure benötigen ( Okazaki et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 31, Seite 1314 (1967).

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L-Isoleucin erzeugende Stämme sind "beispielsweise im folgenden aufgeführt: Mutanten, die resistent gegen L-Isoleucin-Analoge sind, α-AHV, oc-Aminobuttersäure oder Isoleucinhydroxamat.

L-Leucin erzeugende Stämme sind beispielsweise im folgenden aufgeführt: Auxotrophe, die L-Isoleucin oder α-Aminobutyrat benötigen (E. Ishii et al., J. Gen. Appl. Microbiol., YoI.'13, Seite 217 (1967); S¹. Xoshinaga et al., ibid., Vol. 13, Seite 25 (1967); Mutanten, die resistent gegen 2-Ihiazolalanin sind (T. Tsuchida et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 38, 1907 (1974) oder Leucin-Analoge (R. A. Calvo und J. M. Calvo, Science, Vol. 156, 1107 (1967)).

L-Tyrosin erzeugende Stämme sind beispielsweise im folgenden aufgeführt: Auxotrophe, die L-Phenylalanin benötigen (K. Nakayama et al., J. Agr. Chem« Soc. Jpn, Vol. 35, Seite 142 (1961)); Mutanten, die resistent gegen 5-Methyltryptophan sind (I. Shiio et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 36, Seite 2315 (1973))·

L-Tryptophan erzeugende Stämme sind beispielsweise im folgenden aufgeführt: Mutanten, die resistent gegen 5-Methyltryptophan sind (JA-AS 18828/1973 und 39517/1978); Auxotrophe, die L-Tyrosin und L-Phenylalanin benötigen (H. Hagino et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 39, Seite 343 (1975)).

Der Zusatz von Anthranilsäure oder Indol, ein Vorläufer der L-Tryptophan-Biosynthese, zu dem Permentationsmedium während des Kultivierens verbessert wirksam die Ausbeute der L-Tryptophanherstellung.

Ir-Phenylalanin erzeugende Stämme sind "beispielsweise im folgenden aufgeführt: Auxotrophe, die L-Tyrosin "benötigen (US-PS 3 759 790); Mutanten, die resistent gegen p-Fluorphenylalanin sind (S. Sugimoto et al., Agr. Biol. Chern., Vol. 37, Seite 2327 (1973)).

L-Arginin erzeugende Stämme sind "beispielsweise im folgenden aufgeführt: Mutanten, die resistent gegen Argininhydroxamat oder 2-Thiazolalanin sind (M. Kizumi et al., Appl. Microbiol., Vol. 22, Seite 987 (1971); K. Nakayama und H. Yoshida, Agr. Biol. Chem., Vol. 36, Seite 1675 (1972); K. Kubota et al., J. Gen. Appl. Microbiol., Vol. 19, Seite 339 (1973))·

Milchsäure-Mikroorganismen, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, umfassen Bakterien, die häufig kollektiv als "Milchsäurebakterien" "bezeichnet werden und Mikroorganismen, die der Gattung Ehizopus angehören, bei der es sich um eine Pilzart handelt; sie gehören beispielsweise zu der Gattung Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetracoccus, Bacillus und Ehizopus.

Repräsentative Beispiele für Milchsäure-Mikroorganismen sind im folgenden aufgeführt:

Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Lactobacillus acidophilus Lactobacillus japonicus Lactobacillus thermophilus Lactobacillus plantarum Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus pentosus Streptococcus cremoris Streptococcus thermophilus Streptococcus lactis Leuconostoc dextranicum Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus Pediococcus soyae Tetracoccus soyae Bacillus coagulans Bacillus laevolactici Rhizopus oryzae

IFO-3533 IFO-12004 IFO-3532 IAM-10068 IFO-3863 IFO-12006 IFO-3534 IFO-4758 IFO-3427 IFO-3535 IFO-12007 IFO-3347 IFÖ-3884 IFO-3891

IFO-12172 ATCC-21787 IFO-3887 ATCC-23492 IFO-4706

Beim erfindungsgemäßen Verfahren können Milchsäure-Mikroorganismen allein oder in Kombination von mindestens zweien verwendet werden. Beispielsweise ist es bekannt, daß eine Symbiose zwischen Lactobacillus bulgaricus und Streptococcus thermophilus besteht und daher ist die Kombination auch beim erf indungs gemäß en Verfahren wirksam. Milchsäure-Mikroorganismen werden in zwei Gruppen klassifiziert, d. h. homo fermentative Mikroorganismen, die nur Milchsäure aus Kohlenhydraten herstellen und heterofermentative Mikroorganismen, die Kohlendioxid, ein Acetat und/oder Äthanol aus Kohlenhydraten erzeugen; homofermentative Mikroorganismen sind beim erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt. Venn heterofermentative Mikroorganismen beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, werden voraussichtlich ein Acetat und A'thanol, die ebenfalls hergestellt werden durch Aminosäure erzeugende Mikroorganismen neben der erzeugten Milchsäure verwertet; in diesem ITaIIe jedoch stellt Kohlendioxid, bei dem es sich um einen der Metaboliten handelt, einen Verlust der Kohlenstoffquel-' len dar.

Stämme, die gegen Antibiotika oder Aminosäure-Analoge resistent sind, die erhalten werden, wenn man die. vorstehenden Milchsäure-Mikroorganismen mutagenen Behandlungen unterzieht, können ebenfalls beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können bei der L-Lysin-Herstellung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Stämme verwendet werden, die beständig gegen S-AEC, ein L-Lysin-Analoges, sind, das erhalten wird durch mutagene Behandlung von Milchsäure-Mikroorganismen, die zur L-Lysin-Erzeugung verwendet werden. Als Milchsäure-Mikroorganismen, die für die

L-Threonin-Hersteilung verwendet werden, können Stämme verwendet werden (resistente Stämme), die geeignet sind in Anwesenheit von S-AEC und L-Threonin zu wachsen oder Stämme, die resistent sind gegen α-AHV, einem L-Threonin-Analogen. Die wirksame Erzeugung von L-Glutaminsäure wird ermöglicht durch Verwendung von Milchsäure-Mikroorganismen, die resistent gegen Antibiotika sind, wie Penicilline, oder Arzneimittel, die dem Kulturmedium zugesetzt werden. Diese Stämme, die arzneimittelresistent sind, können leicht vom Fachmann erzeugt werden.

Wenn derartige Milchsäure-Mikroorganismen, die eine antimikrobielle Substanz erzeugen, wie Streptococcus lactis und Streptococcus cremoris, verwendet werden, ist vorzugsweise ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus, der in Kombination verwendet werden soll, beständig gegenüber der antimikrobiellen Substanz. Zur Erzielung des Aminosäure erzeugenden Mutantenstamms wird ein Aminosäure erzeugender Stamm üblichen mutagenen Behandlungen unterzogen, gefolgt von der Gewinnung eines Stamms, der in einem Medium (flüssig oder fest) wachsen kann, das eine Kulturbrühe des Milchsäure-Mikroorganismus enthält, der eine antimikrobielle Substanz erzeugt (die Kulturbrühe des Milchsäure-Mikroorganismus wird als solche verwendet, da deren Sterilisation durch Erwärmen die antimikrobielle Substanz inaktivieren kann); diese Verfahrensweise kann vorteilhaft sein, da eine Verunreinigung durch fremde Mikroorganismen verhindert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren, ein Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Aminosäuren, wird im folgenden genauer erläutert.

Zuerst werden Verfahren für Impfkulturen bzw. Vermehrungskulturen beschrieben.

Ein oder mehrere Stämme von Milchsäure-Mikroorganismen werden in ein Nährmedium für die Milchsäurefermentation inokuliert, das einen Zucker wie Glucose, Fructose, Saccharose, Lactose usw.; oder Melassen, Molke oder Stärkehydrolysate, die diese Zucker enthalten; zusammen mit einer organischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit (C.S.L.), und Pepton enthält, inokuliert und bei 25 bis 55 ⁰C kultiviert. Beispielsweise wird ein Mhrmedium, das Hefeextrakt und/oder CS.L. zusätzlich zu Käse- oder Caseinmolke enthält, als ein geeignetes Medium verwendet. Das Kultivieren erfolgt gewöhnlich anaerob, wie durch stationäre Kultur, jedoch kann auch eine aerobe Kultur angenommen werden. Die Kulturbrühe, die man so erhält, wird als erste Animpf- bzw. Vermehrungskultur verwendet.

Es ist auch möglich, Mikrobenzellen zu verwenden die erhalten werden durch Milchsäurefermentation, nachdem sie in oder an einem Trägermaterial immobilisiert werden, wie"Gel-induzierende Eeagentien, beispielsweise Carragheenin, Calciumarginai/ und Polyacrylamid. Die immobilisierten ganzen Zellen können nach dem Sammeln durch filtrieren nach beendeter Fermentation erneut verwendet werden. /⁺ bzw. Calciumalginat

Andererseits kann die Animpf- bzw. Vermehrungskultur der Aminosäure erzeugenden Stämme als zweite Animpf- bzw. Vermehrungskultur wie folgt hergestellt werden:

Zwar kann auch das übliche Nährmedium zum Kultivieren von Mikroorganismen als ein Kulturmedium verwendet werden,

jedoch führt die Animpf- bzw. Vermehrungskultur, die man erhält durch aerobes Kultivieren eines Aminosäure erzeugenden Mikro organisms, in einem Nährmedium , das 0,2 bis 5 % Gew./Vol. Milchsäure (L oder DL) oder ihrer Salze enthält, zu einer wirksamen Erzeugung von Aminosäuren.

Als ein Bahrmedium zur Herstellung der zweiten Animpfkultur kann zweckmäßig auch ein Nährmedium verwendet werden, das hergestellt wird durch Einstellen einer Kulturbrühe, erhalten durch Fermentation.(gewöhnlich anaerob) von Milchsäure-Mikroorganismen, die für die Aminosäurefermentation verwendet werden sollen, unter Erzielung einer Milchsäurekonzentration von 0,2 bis 5 % (vorzugsweise 0,5 "bis 2 % Gew./Vol.), gefolgt von einer Ergänzung mit Kohlenstoffquellen, wie Kohlenhydrate und Alkohole, anorganischen Salzen, organischen oder anorganischen Stickstoffquellen usw.. Der pH-Wert während des Kultivierens beträgt 5»5 "bis 8,0.

Die zwei Arten von Animpfkulturen, die man so erhält, werden in ein Permentationsmedium für die Aminosäureherstellung inokuliert.

Das Verhältnis zwischen den Mengen der Animpf- bzw. Yermehrungskulturen, die inokuliert werden sollen, ist zwar nicht speziell begrenzt, liegt jedoch gewöhnlich bei 10 (Vol.) Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen zu 0,1 bis 10 (Vol.) Milchsäure-Mikroorganismen. Veist ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus eine relativ geringe !Fähigkeit zum Assimilieren von Milchsäure auf, so sollte die Menge an Milchsäure-Mikroorganismus, die inokuliert wird, gering sein, um die Milchsäureproduktion und die Milchsäureassimilation gegeneinander im Gleichgewicht zu halten für ein wirksames Portschreiten der Aminosäurefermentation. Ist beispielsweise die

inokulierte Menge des Milchsäure-Mikroorganismus zu groß, so schreitet die Milchsäurefermentation so rasch fort, daß die Milchsäureproduktion und die Assimilationsrate ins Ungleichgewicht kommen mit dem Ergebnis, daß sich die Fermentation zur Milchsäureproduktion hin richtet und daher die Aminosäureproduktion abfällt.

Die beiden Arten der Animpf- bzw. Vermehrungskulturen werden gewöhnlich gleichzeitig inokuliert, jedoch ist es auch möglich, das Inokulieren einer der beiden zu verschieben. Beispielsweise wird der Milchsäure-Mikroorganismus in das Medium inokuliert, nachdem ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus aerob während eines vorgegebenen Zeitraums (z. B. 2 bis 20 Stunden) in einem ITährmedium, das geringe Mengen (z. B. 0,5 bis 2,0 g/dl) ergänzende Kohlenstoffquellen, die assimilierbar durch den Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus sind, zusätzlich zu der Hauptkohlenstoffquelle, enthält, aerob präkultiviert wurde. Die Fähigkeit eines Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus Milchsäure zu assimilieren, kann induziert werden zur stabilen Fermentation durch Präkultivieren in einem Nährmedium, das 0,2 bis 1,0 g/dl Milchsäure sowie die ergänzende Kohlenstoffquelle aufweist. Beispiele für die ergänzende Kohlenstoffquelle sind Zucker wie Glucose und Fructose und Alkohole wie Äthanol.

Es ist auch möglich sowohl den Milchsäure-Mikroorganismus als auch den Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus kombiniert in der Stufe der Impf - Kultivierung zu verwenden. Um ein Beispiel zu nennen, werden die beiden Arten von Mikroorganismen inokuliert in und aerob kultiviert in einem wäßrigen Nährmedium, das 2 bis 5 % Gew./Vol. eines Kohlenhydrats enthält, das als Hauptkohlenstoff quelle bei der Aminosäureherstellung

verwendet werden soll. Die Fermentationsbedingungen in diesem Falle sind gleich "bzw. ähnlich denen der Aminosäureherstellung, die nachstehend "beschrieben wird. Die Kulturbrühe, die die "beiden Arten von Mikroorganismen, die so erhalten wurden, enthält, wird in ein Kulturmedium zur Aminosäureproduktion inokuliert.

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren als Hauptkohlenstoffquelle verwendete Kohlenhydrat ist eines, das durch den Milchsäure-Mikroorganismus assimilierbar, jedoch nicht assimilierbar oder gering assimilierbar durch den Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus ist und umfaßt Glucose, Fructose, Saccharose, Melassen, Stärkehydrolysate, Cellulosehydrolysate, Hydrol Lactose, Lacotsehydrolysate, Fruchtsaft, Caseinmolke, Käsemolke, Sojabohnenmolke, Dextrin und Stärke.

Die vorstehenden Molken schließen saure Molke, süße Molke, entproteinierte Molke (UF-Permeat) (eine Ultrafiltrationsmembran wird für das Deproteinieren verwendet) und entmineralisierte Molke ein.

Zwei oder mehrere der vorstehend veranschaulichten Kohlenhydrate können beim erfindungsgemäßen Verfahren in Kombination verwendet werden.

Die Art des Milchsäure-Mikroorganismus muß nach der Art des angewendeten Kohlenhydrats gewählt werden. Beispielsweise sind Streptococcus cremoris und Streptococcus thermophilus geeignet für Lactose oder Molken; Lactobacillus delbrueckii und Streptococcus thermophilus sind geeignet für Melassen; Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus japonicus und Ehyzopus oryzae sind jeweils geeignet zur Erzeugung von Milchsäure ⁺/ Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei,

aus Stärke oder Dextrin.

Werden Stärke oder Dextrin als Kohlenstoffquelle verwendet, so kann die fermentative Erzeugung von Aminosäuren wirksam durchgeführt werden durch Zusatz von Amylase zu dem wäßrigen Nährmedium und vorzugsweise unter Verwendung eines Milchsäure-Mikroorganismus mit einer Amylasewirksamkeit. Zur Verwendung geeignete Amylase kann man erhalten "beispielsweise durch Auflösen von handelsüblicher Amylase in Wasser , gefolgt vom Filtrieren der Lösung durch eine Membran mit einer Porengröße von kleiner als 0,5 V^- bzw. yU, wie ein Millipore-FiIter.

Stickstoff quellen in dem Nährmedium schließen Ammoniakwasser, Ammoniakgase, Harnstoff und organische oder anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumlactat ein.

Anorganische Substanzen in dem Nährmedium schließen Salze von Natrium, Kalium, Mangan, Magnesium, Calcium, Kobalt, Nickel, Zink, Kupfer und Eisen mit Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure und Phosphorsäure ein.

Zu dem wäßrigen Nährmedium fügt man neben diesen Nährstoffe, wie Vitamine, und Aminosäuren, die für das Wachstum der Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen erforderlich sind, Hefeextrakte, Pepton, Caseinhydrolysate, Sojabohnen-Proteinhydrolysate, Maisquellflüssigkeit (C.S.L.), Molke oder Molkehydrolysate, die Vitamine, Aminosäuren oder Nucleinsäure-verwandte Substanzen, zur Beschleunigung des Wachstums der Milchsäure.

Zur Erzeugung von Glutaminsäure aus Melassen oder Molken verbessert der Zusatz von Chemikalien, wie Penicillinen und oberflächenaktiven Mitteln zu dem wäßrigen Nährmedium die Ausbeute an Produkt (US-PS 3 080 297; K. Takami'et al., Agr. Biol. Chem., Vol. 27, Seite 858 (1968)). Die Chemikalien werden während eines Zeitraums von 4 bis 24 Stunden nach Beginn der Kultur zugesetzt. In diesem Palle ist der zu verwendende Milchsäure-Mikroorganismus vorzugsweise einer, der gegenüber den zugesetzten Chemikalien resistent ist. Die Konzentrationen oder die Methoden für die Zugabe der Nährstoffe und der Chemikalien sind gleich denen einer üblichen Einzelkultur von Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen; jedoch sollte deren optimale Menge unter Bedingungen der Mischkultur bestimmt werden, da der Metabolismus durchMilchsäure-Mikroorganiernen einen Einfluß darauf haben kann.

Die Kultur wird unter aeroben Bedingungen einer Schüttelkultur oder Belüften unter Rühren usw. durchgeführt.

Der pH-Wert wird während der Kultur vorzugsweise auf 4,5 "bis 7j5i besonders bevorzugt 5i5 bis 7»0» eingestellt. Ammoniakwasser, Calciumcarbonat, Harnstoff usw. können als Neutralisationsreagens zugesetzt werden. Man führt die Kultur bei einer Temperatur von 25 bis 55 ⁰C durch.

Die Unterschied zwischen den Ausmaß der Milchsäureproduktion und dem Ausmaß des Milchsäurevorbrauchß wird als die akkumulierte Konzentration an Milchsäure bestimmt, die vorzugsweise so gesteuert werden kann, daß sie nicht mehr als 1,5 % (Gew./Vol.), besonders bevorzugt nicht mehr als 1,0 % (Gew./Vol.) beträgt;

mit anderen Worten ist es wichtig, die akkumulierte Menge an Milchsäure auf ein Minimum herabzusetzen. Wenn ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus mit einer großen Fähigkeit zur Assimilation von Milchsäure verwendet wird, so stellt man fest, daß die Milchsäurekonzentration bei einem Wert vernachlässigbarer Größenordnung gehalten wird, selbst ohne spezielle Steuerung. Die Steuerung der Konzentration der Milchsäure führt man durch durch Hegeln der Kulturtemperatur, des pH-Werts des Kulturmediums, des Ausmaßes der Sauerstoffzufuhr zu dem Kulturmedium, Nachmessung der Milchsäurekonzentration in dem Medium (beispielsweise wird zur Messung Lactatdehydrogenase verwendet). Beispielsweise senkt eine Erhöhung des pH-Werts auf einen Bereich von leicht sauer bis schwach alkalisch das Ausmaß der Milchsäurefermentation und daher die Milchsäurekonzentration; darüber hinaus wird durch eine Steigerung der Sauerstoffzufuhr die Milchsäurekonzentration verringert.

Nach beendeter Kultur wird die erhaltene Kulturbrühe bei einer Temperatur von 75 bis 100 ⁰C erwärmt; die Wärmebehandlung führt zur Koagulation der in der Wärme koagulierenden Proteine und erleichtert die Abtrennung der Mikrobenzellen. Mikrobenzellen.und in der Wärme koagulierende Proteine usw. werden durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt.

Eine in der Brühe vorhandene Aminosäure wird durch mikrobiologische Assay-Methoden oder colorimetrische Methoden, basierend auf einer Uinhydrinreaktion, bestimmt.

Eine Aminosäure kann nach den üblichen Verfahren

aus dem Piltrat oder der überstehenden Lösung isoliert

werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Lactobacillus bulgaricus (ΓΕΌ-3533) und Streptococcus thermophilus (ΙΪΟ-3535) wurden jeweils aus stab-Kulturen in einem Agarmedium in jeweils 10 ml eines Mediums (Medium A) der folgenden Zusammensetzung inokuliert:

Medium A (zur Animpf- bzw. Vermehrungskultur)

g/A

Glucose 10

Pepton 12.5

Hefeextrakte 7.5

MgSO₄-7H₂O '■ 0.8

NaC£ 5.0

'4H₂O 0.14

FeSO₄-7H₂O 0.04

Tween 80 0.2

pH — 6.8 (nach dem Sterilisieren

bei- 120^eC für 15 min)

■» C fr-Sl» *

Die "beiden Inokulate mirden jeweils 20 Stunden "bei 57 ⁰C inkubiert. 3 ml jedes Inokulums vrurden zu 100 ml des zweiten Mediums (Medium B) folgender Zusammensetzung gefügt:

Medium B (zur Animpf- t)zw. Termehrungskultur)

g/i

Käsemolke (als Lactose)- 30

KH₂PO₄ ---" χ

■ Eefeextrakte 6

MgSO₄.7H₂O : — 0.5

CaCO₃ 30

pH 6.5 (nach dem Sterilisieren

120⁰C für 15 min)

Eine stationäre Kultur für die Milchsäurefermentation wurde 24- Stunden "bei 37 °C durchgeführt. Die resultierende Kultur wurde als ein Inokulum (Animpfung A) für eine gemischte Kultur mit Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen, die in'der Tabelle 1 aufgeführt sind, verwendet.

Die Aminosäure erzeugenden Mikroorganismen wurden jeweils aus einer Agarsehrägkultür in 5 ml eines Mediums (Medium C) mit folgender Zusammensetzung inokuliert:

Medium C (zur Animpf- "bzw. Vermehrungskultur)

■■-·"' ; g/z Glucose ίο

Pepton —-— ίο

!Fleischextrakt© 5

NaCA . 5

Lactat 3 »u

pH 7.0 (nach dem Sterilisieren

"bei 120⁰C für 15 min)

*) Eine Kulturbrühe, erhalten durch Kultivieren von Sc. thermophilus plus L. bulgaricus in einem Medium (Medium B, lactose 40 bis 50 g/l) bei 37 ⁰C während 72 Stunden wurde als Milchsäurequelle verwendet.

Es wurde 20 Stunden bei 30 ⁰O aerob geschüttelt. Ein ml der resultierenden Kultur wurde anschließend in 20 ml eines Fermentationsmediums (D) mit folgender Zusammensetzung inokuliert.

Medium D (zur Fermentation)

- g/A

Käsemolke (ale Lactose) 50

Glucose 10

KH₃PO₄ ■

KtiTjr» η *»

^tlC\J · —-.—-.·. — —. — ·-·- — ·-·"—"-· — -· — ·- — "- V/. J

MgSO₄ ·7Η₂Ο —

FeSO₄ · 7H₂O 0.02

MnSO₄-4H₂O 0.01

6/1

ZnSO₄* 7H₂O 0.01

(NH₄J₂SO₄ 25

CaCO₃ {getrennt; sterilisiert) 50

Anfangs-pH-Wert 6,7 für Bakterienstämme

6,0 für Hefestämme

Die Fermentation wurde durchgeführt durch Kultur bei 30 ⁰C unter aerobem Schütteln während 16 Stunden und anschließend wurden 3 Vol.% des Inokulums der Milchsäure-Mikroorganismen (Animpfung A) in das Fermentationsmedium inokuliert.

Die Fermentation wurde unter aerobem Schütteln bei 30 ⁰C während weiterer 60 Stunden fortgesetzt. Der pH-Wert des Mediums wurde auf 4,5 bis 6,5 für Hefestämme und 5»0 bis 7»0 für Bakterienstämme mit Hatriumhydroxid- oder Chlorwasserstoffsäurelösung während des Eultivierens eingestellt. Mach beendeter Kultur wurde die erhaltene Kulturbrühe 5 Minuten bei 95 ⁰C erwärmt. Diese Verfahrensweise macht Mikrobenzellen und Ausfällungen, wie durch wärmekoagulierende Proteine, leicht durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernbar.

Tabelle I
Aminosäurenfermentation unter Verwendung von Molke

Mikroorganismus	Assimilierbarkeit*	gemis cht e-Kultur	Monokultur .-
Alkaligenes faecalis IFO-3160	Milchsäure Lactose	Zellwachstum* *Aminosäuren	Zellwachstum* *Aminosäuren
Acinetobacter 38-15 FERM-P~2188 (S-AEC resistent) '	' + -	"L-Lys 250mg/Ä 7.5g/A L-VaI 200 L-Ileu 400	l Se/!. weniger als . ^λ'^5&η 100mg/£
Arthrobacter No.18 FERM-Ri-1481 (Threonine resistent)	+ t	L-Lys 4500 ._n I L-VaI 300 ^1Ug/Z L-Ileu 200 L-Leu 100	vernachläs- weniger als sigbar i00mg/Ä
Bacillus circulans · IFO-3329	+ -	L-Lys 1200 8g/Ä L-VaI · 200 L-Ileu 500	vernachläs- weniger- als sigbar . lOOmg/Ä
Bacillus subtilis IAM-1071	+ . ±	7g/A ¹^^{3 35}°	. weniger als ^J8/Ä 100mg/A
Brevibacterium alkaneIytlcum IFO-12922	+	L-Lys 150 ft ς»/» L-GIu 500 ⁶*^5ε/Α DL-AIa 400 L-VaI 200	, c_/ff weniger als 1.5g/Ä lOOmg/Ä *
Brevibacteriura flavum ATCe?13826 ·	+ " -	L-Lys 200 12&/A L-GIu 2500 L-VaI 300	weniger als vernachläs- ^100mg/A sigbar
+	;· ' :.· :l-giu 1500 L-Lys 450 L-VaI 600 lOg/Ä DL-AIa 300 ¹ L-Leu 200 L-Ileu 150 Glycin 200	·> Ii,to ¹^"⁰¹⁰ ' 300mg/£ · ";. 2.5g/Ä _L__Val .. ₁₅₀ „. .

CD CO CO

	Tabelle I	I	♦ . -	(Fortsetzung)	Kultur	L-GIu DL-AIa L-Ileu L-Phe.... L-Lys	500mg/A 2500 800 300 ...500. 700	Monokultur	Ατίΐτ noRfniTv	au,,,. -
Mikroorganismus ■*	Assimilierbarkeit*		>	gemisehte	Zellwrä^hatum* ♦AmiiiosäuT'ßii	L-GIu	1500 -. 150 .		200 300
Brevibacterium lactofermentum ATCC-21420 (Tyro s ine-auxo troph)	Milchsäure Lactose		9.5g/Ä	L-Ileu	. ...500 200 150	2 *Oe/l* ^L~^Glu ²*°^8/Ä DL-AIa		als
Corynebacterium hydrocarboclastum . ATCC-15592	<■{· -1·	+ ±	llg/A	L-Lys	■ 250	vernäcHläs- ,	weniger- lOOmg/A	als
Corynebacteriura acetoacidophilum ATCC-13870	♦	8g/A	L-Lys · L-VaI L-Ileu	- 200 200 300	1.5g/A	weniger. 100mg/Z	als
Flavobacterium lutescens IFO-3085	+ T	7g/A	L-GIu L-Lys	2500 150	,O₈/,	weniger lOOmg/A	als
Micrococcus roseus IFO-3768	9g/Ä	. L-Lys DL-AIa	AOO	1.5g/Ä	lOOmg/A	als
Nocardla erythropolis IAM-I2122	12g/A	L-Lys L-VaI ·	250 •■■200	sigba?^ll3f^S'"	weniger lOOmg/Ä	als
Serratia plymuthicum IFO-3055	lOg/i.	DL-AIa L-GIu L-As ρ	,. 500 • 500 300	3.0g/A	weniger- lOOmg/A	als
Proteus morganii ' IFO-38A8 .	8 g/ SL		2.0g/Ä	weniger· 100mg/A	als
Saccharomyces cerevislae IFO-0971	8.5g/Ä

OO CD CO

Tabelle I (Fortsetzung)

Mikroorganismus .	Assimilierbarkeit *	gemischte Kultur	Monokultur ■
Saccharomyces oviformis IAM-4325	Milchsäure' Lactose	Zellwachstum* *Aminosäuren	Zellwachstum* *Aminosäuren
Sporoboromyces roseus IFO-1037	+	DL-Ala 2500mg/A 12g/A L-GIu 1000 L-VaI 200	ο e„/» weniger als ³*^5g/Ä lOOmg/A
Candida h'umicola IFO-1577	+	lOe/A ^DL"^{Ala 150}° ^iU8/Z L-GIu 500	3 5e/j weniger als - ³'^5gn 100mg/A
Schizosaccharomyces pombe IFO-6170	+ +	■ DL-Ala 500 15«/A ^L"^{Glu 150}° · ¹³S'* _L_val 200 L-Asp 500	ο . L-GIu 800rag/A ^ög/* L-Asp 300
+	_ft . DL-Ala 500 ⁰S/* L-GIu 1500	,„,/„ weniger als . -³S'* . 100mg/A

Anmerkungen: '*

* Assimilierbarkeit +: assimilierbar, i: schwach assimilierbar, -: nicht assimilierbar Zellwachstum Eine Zunahme des Gewichts an Ausfällungen (Trockengewicht) in der

Brühe nach dem Auflösen von Calciumcarbonate durch Zusatz von Chlorwasserstoffsäure wird als ein Indikator für das Zellwachstum angesehen

Abkürzungen der
Aminosäuren

Lys Lysin VaI GIu Glutamat Leu AIa Alanin Asp

Valin Heu
Leucin Phe
Asparaginsäure

Isoleucin
Phenylalanin

i. :

'L 40 -

Beispiel 2

Brevibacterium flavum (ATCC-13326), Corynebacterium glutamicum (ATCC-13032), Micrococcus lysodeikticus (IAM-3333), Micrococcus roseus (ΙΙΌ-3768), Brevibacterium lactofermentum (ATCC-13869)j Brevibacterium linens (ΙίΌ-12142) und Microbacterium ammoniafilm (AiECC-1535²O wurden jeweils in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 kultiviert, mit der Ausnahme, daß 4- I.E. bzw. I.U. pro Milliliter des Kaliumsalzes von Penicillin G 16 Stunden nach, Beginn der Kultur zugesetzt wurden, zusammen mit dem im Beispiel 1 verwendeten Milchsäure-Mikroorganismus und der pH-Wert des Mediums wurde auf 6,0 bis 7jO eingestellt. Es bestätigte sich, daß die verwendeten Milchsäurebakterien resistent gegen . ' 5 I.E. bzw. I.U./ml Penicillin G unter den vorliegenden Kulturbedingungen waren. Die Mengen an L-Glutaminsäure, die in der Kulturbrühe nach 3 Tagen Kultur akkumuliert waren, sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Mikroorganismus akkumulierte

L-Glutaminsäure

Brevibacterium flavum ;.. · .../18.0 .

ATCC-13326

Corynebacterium glutamicum 17.0

ATCC-13032

Micrococcus roseus „8.5

IFO-3768

Brevibacterium lactofermentum 15.0

ATCC-13869.

Brevibacterium linens 6.0

IFO-12142

Microbacterium ammoniafilm 14.0

ATCC-15354

Micrococcus lysodeikticus 5.0

IAM-3333

Beispiel 3

Ein L-Lysin erzeugender Stamm, Brevibacterium flavum (ATCO-13326 , Homoserinbedarf) der mutierend von dem Elternstamm, Brev. Flavum (A_CC-13826) stammte, wurde unter aerobem Schütteln in 30 ml eines Mediums (Medium C in Beispiel 1) 24 Stunden bei 30 ⁰C inkubiert.

3 ml der resultierenden Kulturbrühe und 0,5 ml eines Inokulums eines Milchsäurebakteriums (Animpfung A des Beispiels 1) wurden in 27 ml Fermentationsmedium (Medium E) folgender Zusammensetzung inokuliert:

Medium E (zur Fermentation)

g/A

Käsemolke (als Lactose) 80

Glucose 20

K₂HPO₄ — 0.5

MgSO₄-7H₂O .0.5

FeSO₄* 7H₂O 0.02

ZnSO₄-7H₂O 0.01

MnSO₄-VH₅O 0.01

(NH₄) ₂SO₄ · 35

C.S.L. —————·---——'—·»——"·—·—————"-—~—·" /«5

CaCO₃ _: · 50

L~Homoserin — 0.2

*- 42 -

Der pH-Wert wurde nach, dem Sterilisieren "bei 120 ⁰C •während 15 Minuten auf 6,7 eingestellt.

In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde eine gemischte Kultur durchgeführt. Nach 72 Stunden Kultur "betrug die Konzentration an L-Lysin in der resultierenden Kulturbrühe 24,5 g/l (als Hydrochlorid). 5 g L-Valin pro Liter fanden sich ebenfalls in der Kulturbrühe.

Beispiel 4

Eine gemischte Kultur wurde durchgeführt unter Verwendung von jeweils als Aminosäure erzeugendem. Mikroorganismus Ton Corynebacterium acetoacidophilum (ATCC-21476, Homoserinbedarf) und Corynebacterium glutamicum (ATCC-13287, Homoserinbedarf) in der gleichen Weise wie in Beispiel 3· Hach 3 Tagen Kultur betrug die Menge an erzeugtem L-Lysin 22,0 und 12,0 g/l.

Beispiel 5

Eine gemischte Kultur wurde unter Verwendung von Brevibacterium lactofermentum (ΪΈΒΜ-Ρ-1945, 2-Thiazolalaninresistent) als ein Aminosäure erzeugender Mikroorganismus in gleicher Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt, wob.ei jedoch das L-Homoserin im Medium E weggelassen wurde. Hach 4 Tagen Kultur betrug die erzeugte L-Valinmenge 12 g/l. Andererseits betrug im Falle einer Monokultur unter Verwendung des gleichen Stammes als einem Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus, die Menge an erzeugtem L-Valin 1,5 g/l.

Beispiel 6

Es wurde eine gemischte Kultur durchgeführt jeweils unter Verwendung als L-Threonin erzeugender Mikroorganismus von einer L-Isoleucin erfordernden Mutante (ATCC-I956O) abgeleitet von Corynebacterium hydrocarboclastum (ATCC-15592) und einer L-Threonin-Analogenresistenten Mutante (ATCC-EI269) abgeleitet von Brevibacterium flavum (ATCC-13826) in gleicher Weise wie in Beispiel 1, wobei jedoch Streptococcus cremoris (liO-3427) als Milchsäure-Mikroorganismus anstelle von Sc. thermophilus verwendet wurde und 100 mg/1 L-Isoleucin dem Fermentationsmedium zugesetzt wurden. Das nach 3-tägiger EuItür erzeugte.L-Threonin betrug 1,2 g/l bzw. 3,2 g/l.

Beispiel 7,

Nocardia alkanoglutinosa Nr. 223-59 (ATCC-31220, S-AEC-resistent) wurde als ein L-Lysin erzeugender Stamm verwendet. Der Stamm wurde erhalten durch Mutationsbehandlung aus einem Kohlenwasserstoff assimilierenden Stamm, der aus Erdboden isoliert wurde (US-PS 4 123 329). Der Stamm kann Kohlenwasserstoffe, Milchsäure, Brenztraubensäure oder Essigsäure, jedoch nicht Lactose oder Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle verwerten. Die Assimilation von Glucose ist gering. Der Stamm wurde aus einer Agarsehrägkultur in 50 ml eines Mediums (Medium E) mit der folgenden Zusammensetzung inokuliert.

Medium E (zur Animpf- bzw. Vermehrungskultur)

■ ■ " g/i

Fructose r 15

Pepton · 5

(NH₄J₂SO₄ :—_—_- 4

K₂HPO₄ 1

j po . ·.———————————«.——————______ j_

MgSO₄ '7H₂O .

FeSO₄-7H₂O 0.02

MnSO₄-4H₂O · 0.01

ZnSO₄-7H₂O ^^^: _: 0.01

Milclisäure * 6^7

pH —.

♦ Es wurde die gleiche Eulturbrühe wie im Medium C des Beispiels Λ verwendet.

Die Kultur wurde unter aerobem Schütteln bei 30 ⁰C während 24 Stunden durchgeführt.

Außerdem wurde ein Inokulum von Lactobacillus bulgaricus unter Verwendung der Kulturmedien A und B in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

1 ml jedes Inokulums wurde in ein Fermentationsmedium (Medium F) der folgenden Zusammensetzung inokuliert.

Medium I¹ (zur Fermentation)

Glucose — 100

KH₂PO₄ ■--- 0.5

K₂HPO₄ 0.5

MgSO₄ -7H₂O 0.5

NaC£ ■ 1

FeSO₄-7H₂O '· 0.02

MnSO₄-4H₂O 0.01

ZnSO₄-7H₂O 0.01

(NH₄J₂SO₄ — .35

Pepton 5

CaCO₃ · · 50

Der pH-Wert wurde nach dem Sterilisieren "bei 120 ⁰C während 15 Minuten auf 6,7 bis 6,8 eingestellt.

Die gemischte Kultur wurde unter aerobem Schütteln 4 Tage bei 30 ⁰C durchgeführt.

Bei einem Kontrollversuch wurde nur ein Inokulum von Hocaxdia alkanoglutinösa ATCC-31220 in das Medium Έ inokuliert und es wurde eine Monokultur durchgeführt durch Schütteln während 4 Tagen bei 33 ⁰C.

Die akkumulierten Mengen an L-Lysin betrugen 14,8 g/l bzw. 2,1 g/l bei der gemischten Kultur bzw. der Monokultur.

Beispiel 8

Gemischte Kulturen vrurden durchgeführt unter Verwendung verschiedener Stämme von Milchsäure-Mikroorganismen in gleicher Weise wie in Beispiel 7. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Stämme	IFO-3532 .	L-Ly s in BC £
(Monokultur)	IFO-12004	2.2 g/l
(gemischte Kultur)	IFO-3863
Lactobacillus acidophilus	IFO-3534	14.2
Lactobacillus casei	IFO-12006	10.5
Lactobacillus thermophilus	IFO-3427	8.5
Lactobacillus delbrueckii	IFO-3535	4.1
Lactobacillus plantarum	IFO-3347	8.1
Streptococcus cremoris	IFO-3426	14.5
Streptococcus thermophilus	IFO-3887	14.1
Leuconostoc dextranicum	IFO-12172	4.1
Leuconostoc mesenteroides·	IFO-3891	3.5
Bacillus coagulans ·	IFO-4706	3.5
Pediococcus soyae	8.0
Pediococcus pentosaseus	4.5
Rhizopus oryzae	7.5

Beispiel 9

Lactobacillus delbrueckii (IK)-353^ZO und Streptococcus thermophilus (IS¹O 3535) wurden jeweils in ein Medium (Medium A) inokuliert und die Inokula wurden jeweils bei 37 ⁰C während 20 Stunden inkubiert. 3 ml jedes Inokulums wurden zu 100 ml eines Kulturmediums gefügt, das 2,5 g/dl Eohrzuckermelassen (als Zucker), 0,1 g/ dl KH₂PO₄, 0,05 g/dl MgSO^.TH₂O, 0,5 g/dl Hefeextrakt, 0»5 g/dl Pepton und 3 g/dl CaCO, enthielt, und einen Anfangs-pH-Wert von 6,8 aufwies. Es wurde 24· Stunden bei 37 ⁰C kultiviert.

Außerdem wurde ein Inokuluin eines L-Lysin erzeugenden Stammes, Nocardia alkanoglutinösa (EEEM-P-604-6) nach der Verfahrensweise des Beispiels 7 hergestellt.

2 ml des so erhaltenen Inokulums und 0,5 ml des Inokulums der vorstehend beschriebenen Milchsäurebakterien wurden in 28 ml eines Permentationsmediums inokuliert, das 8 g/dl (als Zucker) Eohrzuckermelassen, 2 g/dl (als Lactose) Käsemolke, 0,05 g/dl K₂HPO₄, 0,05 g/dl KH₂PO₄, 0,05 g/dl MgS0₄.7H₂0, 1,0 g/dl C.S.L., 0,2 g/ dl Caseintiydrolysate, 3»5 g/dl (HH^)₂SO₄ und 5*0 g/dl CaCO, enthielt und einen Anfangs-pH-Wert von 6,8 aufwies.

Es wurde eine gemischte Kultur unter aerobem Schütteln bei 34· bis 35 ⁰C während 94- Stunden durchgeführt. Die erzeugte L-Lysinmenge betrug 26,5 g/l (als HydroChlorid).

Beispiel 10

Lactobacillus bulgaricus (ΙΪΌ-3533) und Streptococcus thermophilus (ΓΕΌ-3535) (Inokulationsverhältnis 1:1)

wurden in 100 ml Medium A inokuliert und "bei 37 ⁰C über Nacht kultiviert. Die Mikrobenzellen wurden durch Zentrifugieren geerntet, mit sterilisiertem Salzwasser gewaschen und in 10 ml sterilisiertem Salzwasser suspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 20 ml sterilisierter Lösung von 3 g/dl Natriumalginat (ein Gel-induzierendes Reagens) vermischt.

Die Suspension wurde dann tropfenweise in eine 2 %ige ("bezogen auf das Gewicht im Volumen) Lösung von CaCIp gefügt. Die gebildeten Perlen wurden mit sterilisierter Salzlösung gewaschen.

2 ml eines Inokulums von Nocardia alkano glutinös a 223-59 erhalten nach der gleichen Verfahrensweise wie in Beispiel 7 beschrieben, wurden in 30 ml eines Fermentations mediums (Medium D) inokuliert, das Käsemolke und Glucose enthielt.

Etwa 20 Tröpfchen der vorstehend erhaltenen Perlen, in denen Zellen des Milchsäure-Mikroorganismus immobilisiert waren, wurden aseptisch in das Fermentationsmedium gefügt.

Es wurde eine gemischte Kultur während 70 Stunden bei 33 . C durchgeführt. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde während der Kultur bei 6,0 bis 6,8 gehalten. Die nach 3-tägiger Kultur erzeugte L-Lysinmenge betrug 8,5 g/l (als Hydrochlorid).

Beis-piel 11

In einem 2-1-Schüttelfermentor wurde L-Lysin aus Molkepermeat hergestellt. Die Molkeprobe war ein Produkt,

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erhalten durch Ultrafiltrieren von Käsemolke (die getrocknete Probe enthält 84 % Lactose und 9 % Asche).

Ein Inokulum von Nocardia alkanoglutinosa 6064) wurde nach der gleichen Weise wie in Beispiel 7 hergestellt, 50 ml des Inokulums wurden zusammen mit 30 ml des Inokulums von L. bulgaricus plus Sc. thermophilus (Animpfung A des Beispiels 1) in 1000 ml eines Fermentationsmediums der folgenden Zusammensetzung inokuliert: 10 g/dl (als Lactose) Käsemolkepermeat, 0,4 g/dl Äthylalkohol, 0,05 g/dl K₂HPO₄, 0,05 g/dl ' KH₂PO₄, 0,05 g/dl MgSO₄.7H₂O, 0,5 g/dl C.S.L., 0,5 g/dl Pepton, 0,2 g/dl Caseinhydrοlysate, 1,75 g/dl (HH₄)₂S0₄ mit einem Anfangs-pH-Wert von 6,8.

Die gemischte Kultur wurde unter Rühren (1000 Upm) unter Belüften (1,0 V.V.M.) durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums wurde 24 Stunden bei 6,6 bis 6,8 vom Beginn des Kultivierens an mit Schwefelsäure gehalten und anschließend mit Ammoniakwasser auf 6,0 bis 6,2 eingestellt. Während des Kultivierens wurde der Milchsäuregehalt in dem Kulturmedium durch eine enzymatische Methode unter Verwendung von Lactatdehydrogenase bestimmt.'

In der Anfangsstufe der Kultur stieg die Konzentration an L-Milchsäure bis zu 0,5 g/dl (12 Stunden Kultur) ■ an und fiel anschließend rasch auf weniger als 0,1 g/dl ab. Die erzeugte L-Lysinmenge nach 50 Stunden Kultur betrug 30,5 g/l (als Hydrochlorid).

Die Kulturbrühe wurde 15 Minuten bei 95 °C erwärmt unter Bildung von 21 g getrockneten Zellen aus 1 1 der Kulturbrühe.

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Das L-Lysin wurde nach einer üblichen Verfahrensweise unter Anwendung eines Ionenaustauscherharzes von dem Filtrat abgetrennt und gereinigt unter Bildung von 11,5 g L-Lysinhydrοchlorid aus 500 ml des Filtrats.

Beispiel 12

2 ml eines Inokulums von Nocardia alkano glutinös a (ΙΈΕΜ-Ρ-6064), hergestellt nach der Verfahrensweise des Beispiels 7₅ und 0,5 ml eines Inokulums von L. bulgaricus plus Sc. thermophilus (Animpfung A), beschrieben in Beispiel 1, wurden in ein Medium inkubiert, das 10 g/dl lösliche Stärke, 3,5 g/dl (UH₄) ₂S0 0,05 g/dl KH₂PO₄, 0,05 g/dl K₂HPO₄, 0,05 g/dl MgSO₄. 7H₂O, 2 mg/dl PeSO₄.7H₂O, 1 mg/dl MnSO₄.AH₂O, 1 mg/dl ZnSO₄.7H₂O, 0,3 g/dl Caseinhydrolysate, 0,4 g/dl Pepton und 5 g/dl CaCO^ enthielt und einen Anfangs-pH-Wert von 6,8 aufwies.

Vor Beginn der Kultur wurden 5 Einheiten pro Gramm Stärke von Glucoamylase (eine Einheit: die Menge, die 10 mg Glucose durch Reaktion während 30 Minuten bei 4-0 ⁰C beim pH-Wert 4,5 ergibt) aseptisch zu dem Permentationsmedium gefügt. Ein Filtrat (mit einem Membranfilter (Millipore-Pilter; Porengröße 0,22 um bzw. von Glucoamylase wurde verwendet.

Die gemischte Kultur wurde unter aerobem Schütteln bei 35 °C während 90 Stunden durchgeführt. Die erze Ii-Lysinmenge betrug 25,0 g/l (als Hydro chlor id).

Claims

Dr. Ing. Dr. jur. F. Dr. rer. nat. B. "fJivrer. -^at-u- -uipUthg. Ch. PATENTANWÄLTE Professional Representatives before the European Patent Office Γ ~l Telefon (0211) 7150 39 Telex 8 582 841 rrtg d Telegramme: Returgi Düsseldorf Bruckner Straße 20 D-4000 Düsseldorf 13 L J Ihr Zeichen: Unser Zeichen: D*tum: T 52 914 Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren auf fermentativem Wege Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure, dadurch ■gekennzeichnet, daß man einen Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, Milchsäure zu assimilieren, in der Anwesenheit von mindestens einem Milchsäure-Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium aerob kultiviert, das mindestens ein Kohlenhydrat, das durch den Milchsäure-Mikroorganismus assimilierbar ist, jedoch durch den Amino- J" säure erzeugenden Mikroorganismus nicht assimilier- I bar oder schwach assimilierbar ist, als Hauptkohlenstoff quelle enthält, die Aminosäure in der resultierenden Kulturbrühe akkumuliert und die Aminosäure aus der Kulturbrühe gewinnt.

Konten· nutsche Bank AQ.. Düsseldorf, (BLZ 300 70010) KoMo-Nr. 8033 51* · Stadtsnarknssß Düsseldorf. (BLZ 300 501101 Kontn-Nr. SMXlO BM

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe von L-Lysin, L-Valin, L-Threonin, L-Gutaminsäure, Ir-Isoleucin, L-Leucin, DL-Alanin, L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Tryptophan, L-Arginin, L-Histidin, L-Serin, L-Glycin und L-Asparaginsäure.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus verwendet, der einer Gattung angehört, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Alkaligenus, Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Microbaeterium, Nocardia, Proteus, Serratia, Candida, Saccharomyces, Sporoboromyces und Schizosaccharomyces.

4·. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus auswählt aus der Gruppe der Arten Alkaligenes faecalis, Alkaligenes marshallii, Acinetohacter sp-38-15» • Acinetobacter calcoaceticus, Arthrohacter paraffi-, neus, Arthrobacter citreus, Arthrobacter sp-18, Bacillus circulans, Bacillus megatherium, Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes, BrevilDacterium acetylicum previbacterium thiogenitalis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium hydrocarboclasturn, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium glutamicum, Flavobacterium lutescens, Micrococcus luteus, Micrococcus roseus, Microbacterium ammoniafilm, Nocardia alkanoglutinosa, Nocardia erythropolis, Nocardia lyena, Proteus morganii, Serratia marcescens, Serratia plymuthicum, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces oviformis, Candida humicola, Candida lypolitica, Sporoboromyces roseus, Schizosaccharomyces pombe.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Milchsäure-Mikroorganismus verwendet, der einer Gattung angehört, ausgewählt aus der Gruppe von Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetracoecus, Bacillus und Ehizopus.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Milchsäure-Mikroorganismus verwendet, ausgewählt aus der Gruppe der Arten Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus japonicus, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus pentosus, Streptococcus cremoris, Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis, Leuconostoc dextranicum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus soyae, Tetracoccus soyae, Bacillus coagulans, Bacillus laevolactici und Bhizopus oryzae.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Milchsäure-Mikroorganismus in Form von lebenden Zellen verwendet, die in oder auf einem Trägermaterial immobilisiert sind.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Milchsäure-Mikroorganismus einen Mutanten-Stamm verwendet, der resistent gegenüber Antibiotika oder Aminosäure-Analogen ist.

9..Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kohlenhydrat auswählt aus der Gruppe von Glucose, Fructose, Saccharose, Melassen, Stärkehydrolysaten, Cellulosehydrolysaten, Hydrol,

lactose, Lactosehydrolysaten, Fruchtsaft, Caseinmolke, Käsemolke, Sojabohnenmolke, Dextrin und Stärke.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Impfkultur, erhalten durch Kultivieren des Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium, das Milchsäure, ihr Salz oder eine Kulturbrühe des Milchsäure-Mikroorganismus enthält, in das wäßrige iTährmedium für die Aminosäureherstellung inokuliert.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kultivieren durchführt durch Inokulieren des Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus in das wäßrige Uährmedium für die Aminosäureherstellung, das Milchsäure enthält, gefolgt von einem Präkultivieren des Mikroorganismus vor dem Inokulieren des Milchsäure-Mikroorganismus in das wäßrige Nährmedium.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Impfkultur, erhalten durch aerobes Kultivieren sowohl des Aminosäure erzeugenden Mikroorganismus als auch des Milchsäure-Mikroorganismus in einem wäßrigen ÜTährmedium, das Kohlenhydrat enthält, •in das wäßrige Nährmedium für die Aminosäureherstellung inokuliert wird. ·

13· Verfahren nach Anspruch 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Milchsäure,die in. dem Kulturmedium während des Kultivierens akkumuliert wird, so gesteuert wird, daß sie im Berecch von nicht mehr als 1,5 % Gew./Vol. liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Steuerung der Milchsäurekonzentration durchführt durch Regulieren der Kultivierungstemperatur, des pH-Werts des Kulturmediums, der Rate der Sauerstoffzufuhr zu dem Kulturmedium, oder einer Kombination davon.

15· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert von 4,5 "bis 7j5 kultiviert.

16. Verfdahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 1
tiviert.

daß man bei einer Temperatur von 25 bis 55 C kul-

17· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenhydrat Stärke oder Dextrin verwendet, und Amylase zu dem wäßrigen Fährmedium zugesetzt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Milchsäure-Mikroorganismus verwendet, der eine antimikrobielle Substanz erzeugt und daß der Aminosäure erzeugende Mikroorganismus ein Mutanten-Stamm ist, der resistent gegen die antimikro-. Meile Substanz ist.