DE1931139A1 - Verfahren zur Herstellung von Zell-lytischen Enzymen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Zell-lytischen Enzymen

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DE1931139A1
DE1931139A1 DE19691931139 DE1931139A DE1931139A1 DE 1931139 A1 DE1931139 A1 DE 1931139A1 DE 19691931139 DE19691931139 DE 19691931139 DE 1931139 A DE1931139 A DE 1931139A DE 1931139 A1 DE1931139 A1 DE 1931139A1
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Noboru Mukai
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Description

Patentanwälte
Dr.-Ing. HANS RUSCHKE . ft
Dipl.-Ing. HEINZ AGULAR ■»· αΙΙΠ11969
8 München 80, Pienzenouersir 2
Sch/Gl
Kyowa Sakko Kogyo Co.» Ltd., Tokio / Japan
Verfahren zur Herstellung von Zell-lytischen Snzymen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ZeIl-Iytischen Enzymen. Insbesondere "besieht sich die Erfindung auf ein Verfahren 'zwe Herstellung von Enzymen, die dazu in der Lage sind, die Zellwände von Mikroorganismen aufzulösen, und zwar uurch Züchten von Stämmen, die zu dem Genus Ooprinus gehören, in einem geeigneten Nahrmedium. Insbesondere befasst sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung von Enzymen, die dazu in der Lage sind, die Zellwände von Hefen und Schimmelpilzen aufzulösen, und zwar durch Züchten von Goprinus-Stämmen unter entsprechenden Bedingungen.
909884/U79 B*D ORIGINAL
— ρ ~
Enzyme* * die dasu in der Lage sind, die Zellwände von Mikroorganismen aufzulösen, werden unter anderem auch als bakteriolytische Enzyme bezeichnet. Das Elweiss-lysozym ist ein bekanntes Beispiel für derartige Enzyme. Jedoch löst dieses Enzym nur die Zellwände von bestimmten Bakterienarten auf und besitzt kein Auflösungsvermögen für Zellwände von Schimmelpilzen und Hefen. Bakterioly tische Enzyme, die aus Mikroorganismen erzeugt worden sind, sind bereits bekannt. Beispielsweise können sie unter Verwendung von Streptomyces (vergleiche die japanische Patentveröffentlichung 9933/1958), durch die Verwendung von Brevibacterium (vergleiche die Japanische Patentveröffentlichung 9935/1963) oder dergleichen hergestellt werden. Jedoch besitzen die bakterioly tischen Enzymet die von diesen Mikroorganismen abstammen, praktisch immer die Eigenschaft, dass sie Actinomycetes und Bakterien auflösen, jedoch gegenüber Schimmelpilzen und Hefen kaum eine Wirkung zeigen.
Daher kommt den bekannten bakterioly tischen Enzymen ein begrenzter Wirkungsradius zu. Enzyme, welche dazu in der Lage sind, in ausreichendem MaBe die verschiedensten Arten von Zellwänden aufzulösen, sind bisher unbekannt. Es hat sich als besonders schwierig herausgestellt, die Zellwände von Schimmelpilzen und Hefen aufzulösen. Können diese Wände etwas unter Verwendung der bisher bekannten Enzyme aufgelöst werden, so ist dennoch die Wirkung äusserst unbefriedigend. Darüber hinaus haftet den bisher bekannten Enzymen der Fachten an, dass, falls die Konzentration an Salzen in einer Reaktionelöeung hoch wird, beispielsweise in einer physiologischen Kochsalzlösung, die Aktivität der Enzyme kaum mehr wahrnehmbar ist.
Ziel der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von Enzymen* welche dazu in der lege sind» ver-
909884/1479.
Bchiedene 5Dypen von Zellwänden, einsehliesslich von Hefen mid Schimmelpilzen, aufzulösen. Durch das erfindungsgemässe Verfahren werden die den bisher bekannten Methoden anhaftenden Nachteile beseitigt.
Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Zell-lytisehen Enzymen zur Verfugung gestellt, das in wirksamer und relativ einfacher Weise durchgeführt werden kann. Dabei werden Enzyme erhalten, die dazu in der* Lage sind, die Zeil- f wände von verschiedenen MikroOrganismen, einsohliesslich von Hefen und Schimmelpilzen, aufzulösen. Ausserdem besitzen diese Enzyme eine extrem hohe Widerstandsfähigkeit gegen Salze.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass Enzyme, die durch ZHöhten eines Schimmelpilzes, der zu der Klasse Baeidiomyoetes gehört, den vorstehend geschilderten Anforderungen entsprechen. Die erfindungsgemässen Enzyme werden durch Züchten von Stämmen hergestellt, welche zu dem Qenus Goprinus gehören, beispielsweise Coprinus macrorhizus var. microsporojfe, Ooprinus radians, Coprinus mioaoeus und dergleichen, und zwar in einem festen oder flüssigen Kulturmedium. Dabei kann man j entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium zum Züchten der Stämme verwenden, die erfindungsgemäsB eingesetzt werden, vorausgesetzt, daes die Medien die Nährmittel enthalten, welche für das Wachstum des verwendeten Stammes notwendig sind. Derartige Nährmittel sind bekannt. Es handelt sich beispielsweise um Substansen, wie eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoff quelle, anorganische Yerb.indungen oder dergleichen. Derartige Substanzen v/erden von dem eingesatstsr. Ιϋϋ.Λroorganisnus in entsprechenden Mengen verbraucht.
Als .Kohlens-fcoiicnv-: '■& kommen bsiprrielaveifle Kohl el v? ar ate. w
909884/1479 - BAD
z.B. Glukose, Fruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysate, Abfallmelassen, Dextrin, Laktose, verzuckerte Heizflüssigkeit odor dergleichen in Präge. Ferner kann man auf Jede andere geeignete Kohlenstoffquelle zurückgreifen, beispielsweise auf organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure oder dergleichen. Diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden. Als Stickstoff quelle kommen verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen in Frage, beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat oder dergleichen. Ausserdem kann man Nitrate oder natürliche Substanzen, welche Stickstoff enthalten, einsetzen, beispielsweise Maisflüssigkeit, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Fleischbrühe, Easeinhydrolyeate, Casaminosäure, lösliche Fischbestandteile, lösliche Destillationsbestandteile, Sojabohnenpulver, Weizenkleie oder dergleichen. Auch diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Kombination aus zwei oder mehreren Substanzen eingesetzt werden.
Zusätzlich zu diesen verschiedenen Substanzen eignen sich bestimmte Materialien, wie beispielsweise Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Reiskleie oder dergleichen, als Gärungabeschleuniger. Die Zugabe von Pflanzenhormonen, beispielsweise Auxiaen, wie 2.B. Indolessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Haphthalinessigsäure oder dergleichen, Gibberellin, Kinetin oder dergleichen, hat ebenfalls in wirksamer Weise eine.Beschleunigung der Gärung zvr Folge.
Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Kaliumsulfat,
0 9884/U 79
Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Eisensulfat, Hanganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat oder dergleichen.
Ein Beispiel für eine "bevorzugte Zusammensetzung des erfindungsgemäss einzusetzenden Kulturmediums, und zwar für den Pail eines festen Nährmediums, ist eine Kombination aus Weizenkleie und Reiskleie. Soll ein flüssiges Kulturmedium -verwendet werden, dann "besteht eine geeignete Zusammensetzung aus Rohr- ™ zucker, löslichen Destillationsbestandteilen, getrockneter Hefe, Auxinen und anorganischen Salzen.
Die Gärung oder das Züchten der Mikroorganismen wird bei einer !Eemperator von. beispielsweise ungefähr 20 - 350G sowie bei einem pH von beispielsweise ungefähr .4-8 durchgeführt. Das Züchten in einem festen Hährjnedium wird gewöhnlich während einer Zeitspanne von 3-15 lagen durchgeführt. Verwendet man ein flüssiges Medium, dann wird das Züchten unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur, und swar während einer Zeitspanne von 2-5 Sagen«, (
Die erfindungsgemässen Enzyme reichern sich in den erhaltenen Kulturmedien an. Eine Enzymlösung wird in der Weise erhalten, dass das erhaltene Enzym mit Wasser oder mit verdünnten Salzlösungen im Ealle eines festen Kulturmediums extrahiert wird, während im Falle eines flüssigen Kulturmediums die Mikroorganismenzellen von der Kulturbrühe durch Filtration oder Abzentrifugieren abgetrennt werden. Das erfindungsgemässe Enzym lässt sich in einfacher Weise aus der auf diese Weise erhaltenen Enzymlösung nach üblichen Enzymreinlgüngsmethoden konzentrieren oder verfestigen. Erwähnt seien eine Ausfällung durch organische
909884/ UT9
lösungsmittel, ein Aussalzen, eine Konzentrierung unter ver~ mindertem Druck oder eine Adsorption oder Desorption mittels eines Ionenaustauschers. Beispielsweise wird am zweokmässigsten eine Methode angewendet, welche darin besteht, anorganische Salze, wie beispielsweise Asmioniumsulfat, Ammoniumchlorid oder dergleichen, oder organische lösungsmittel, wie "beispielsweise Aceton, Alkohol oder dergleichen, zuzusetzen. Die Mengen an _ anorganischen Salzen oder organischen !lösungsmitteln, welche ™ zugesetzt werden, hängen von dem jeweiligen Additiv ab. Beispielsweise wird Ammoniumsulfat gewöhnlich in einer solchen Menge zugesetzt, dass die ^ndkonzentration 50 - 65 $ (Gewicht/ Volumen) beträgt. Die organischen Lösungsmittel werden zur Er~ zielung einer Eadkonzentration von 50 - 75 $ (Yolumen/Volumen) zugefügt. .
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro 1 Wasser.
Beispiel 1
w Stämme: > Coprinus macrorhizus
var. microsporo|is AEOÖ 20120
Ooprinus radians A5JC0 20014 Coprinus micaceus AiDOO 20122
Kulturmedium: 3 $> Rohrzucker
3 % lösliche Destillatbeatandteile 1 % getrocknete Hefe
0,5 # ^2^4
0,05 5δ MgSO4 . 7H2O
[Der pH des Mediums beträgt 5,5. Das Medium wird bei 1200O während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert]
90988A/U79
Die vorstehend angegebenen Stämme werden jeweils auf Kulturmedien auf ge impft, die sich in verschiedenen Kolben befinden. Das Züchten wird unter Belüften und Rühren bei 28°C während einer Zeitspanne von 3 !Tagen durchgeführt. Durch Abfiltrieren der erhaltenen Kulturbrühen werden Enzymlösungen erhalten. Ammoniumsulfat wird in einer Menge von 60 # (Gewicht/Volumen) zugesetzt. Die erhaltenen Lösungen werden gut gerührt und über Nacht stehen gelassen. Die erzeugten Niederschläge werden mittels einer Zentrifuge (10000 UpM) kontinuierlich abgetrennt und mittels eines Zellophanrohres bei 0°0 über Nacht dialysiert. Die inneren Lösungen der Dialyse werden zur Entfernung von unlöslichen Bastandteilen filtriert. Dabei werden klare Enzymlösungen erhalten. Durch Gefriertrocknen der erhaltenen Enzymlösungen wird ein dunkelbraunes rohen Enzympulver erhalten.
Die Zell-lytischen Aktivitäten der jeweiligen Enzyme auf eine Alkoholgärungshefe, und zwar Saccharomyces cerevisiae, werden in der folgenden Weise gemessen. Die Mikroorganismenzellen von Saocharomyces cerevisiae werden unter Erhitzen bei 8O0C während einer Zeitspanne von 15 Minuten behandelt und in einer 0,04 m-Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7»3 suspendiert. Zu 4 ml dieser Suspension wird 1 ml einer Enzymlösung gegeben, die durch Auflösen des vorstehend erwähnten Rohenzyme in dar Pufferlösung erhalten worden ist. Die Abnahme der relativen Trübung wird mittels eines photoelektrischen Kolorimeters während der Zeitspanne gemessen, während welcher eine Reaktion bei 37°0 erfolgt. Die Trübung, welche in 60 Minuten um die Hälfte reduziert worden ist, wird als 1 Einheit (E) angegegen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst, und zwar bezogen auf die Menge des Rohenzyms pro Einheitsmenge }
9 0 98 84/14t9
Coprinus maororhizus var. microsporoyts ASOG 20120
Coprinus radians ATCO 20014
Coprinus micaceus ATCC 20122
Tabelle,I
Menge des Menge des Bakteriolytische
Kultur- Eohenzyras Aktivität
filtrats (g) (E/mg) (ml)
1500 6,0 9,0
1400 5,6 7,5
1400 4,4 6,8
Hohe Enzyme werden durch Züchten der drei in Beispiel 1 beschriebenen Stämme in Kulturmedien erhalten, die durch Zugabe von 0,05 £ Indolessigsäure zu dem gleichen Kulturmedium, vie es in Beispiel 1 beschrieben wird, sowie nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt worden sind. Die ZeIl-Iytischen Aktivitäten bezüglich Saccharomyces cerevisiae werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II
Menge des Menge des Bakteriolytische KuIturfiltrats Rohenzyms Aktivität (ml) (g) (E/mg)
Coprinus micaceus
ATGC 20122 1650
Coprinus radians
ATCC 20014 1500
Coprinus macrorhiziis
var. microsporojiis 1500
AICC 20120
9,0 11,3 11,8
12,6 15,2 19,1
90 98 84 / 1.4 7-9
BAOOBSOiWAL
Beispiel 5
Die Wirkung der Rohenzyme, die gemäss Beispiel 1 erhalten werden, in Bezug auf die Mikroorganismenzellen von Escherichia coli (Bakterium), Aspergillus oryzae (Schimmelpilz) und Saccharomyoes cerevisiae (Hefe) wird in der gleichen Welse wie in Beispiel 1 gemessen. Die Abnahme der relativen Trübung in Abhängigkeit von der Zeit geht aus den Figuren 1,2 bzw. 5 hervor. In der beigefügten Zeichnung bedeutet die Linie 1 Coprinus micaceus, die Linie 2 Coprinus radians und die Linie 3 Coprinus maerorhizus var. microsporojfe,
Die jeweils als Substrate verwendeten Zellkörper werden in der folgenden Weise hergestellt:
Bakterium: Mikroorganismenzellen von Escheriohia coli £-12 werden unter Erhitzen auf 80°0 während einer Zeitspanne von 15 Minuten behandelt.
Schimmelpilz:
■' Mikroorganismenzellen von Aspergillus oryzae werden durch eine Homogenisierungsvorrichtung zerteilt, gewaschen und in einer m/25-Phosphatpufferlösung suspendiert. Dann wird eine kleine Menge einer Bakterienprotease sowie Toluol zugesetzt. Sie erhaltene Suspension wird 4 Sage lang bei 300C stehengelassen. Auf diese Weise werden die Zellen entfernt. Die zurückbleibenden Zellmembranen werden gewaschen.
Hefe: Mikroorganismenzellen von Saccharomyces cerevisiae werden durch Erhitzen auf 80°0 während einer Zeitspanne von 15 Minuten behandelt.
Diese Versuche zeigen, dass die Zellmembranen von Mikroorganis-
909884/U79
men in einer kurzen Zeitspanne durch die Rohenzyme aufgelöst werden, welche durch Züchten der vorstehend erwähnten drei Stämme hergestellt worden sind. Dies hat zur Folge, dass die Mikroorganismenzellen zusammenbrechen. Zu Vergleichszwecken wird eine Lösung verwendet, die durch Behandlung der vorstehend erwähnten jeweiligen Enzyme durch Erhitzen auf 1000C während einer Zeitspanne von 10 Minuten zur Zerstörung ihrer Aktivität hergestellt worden ist.
Beispiel 4
Die Wirkung der rohen Enzyme, die gemäss Beispiel 1 erhalten worden sind, auf lebende Zellen verschiedener Bakterien und Hefen wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 gemessen und mit derjenigen von Eiweiss-Lysozym verglichen. Dabei stellt man fest, dass die erfindungsgemassen Enzyme einen wesentlich breiteren Wirkungsbereich als Eiweiss-Lysozym besitzen, wobei sie insbesondere dazu in der Lage sind, die. Zellen von Hefen aufzulösen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III zusammengefasst.
Tabelle III
Eiweise- Erfindungsgemässe Lyaozvm
Aerobacter aerogenes
Arthrobacter globiformis
Bacillus cereus
Bacillus megaterium
Bacillus subtilis
Brevibacterium ammoniagenes - -H-
Cellulomonas flavigena -
Corynebacterium fasciane -
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Micrococous caseolyticus - +
PseudoiaonaB aeruginosa - . *
Escheriohia ooli - (+)
Candida albicans - -
Candida utilis - ++++++
Sacoharomyces cerevisiae - ++
Bemerkung: Die Abnahmen (#) der relativen ürübung nach Minuten wird wie folgt gekennzeichnet:
0 - 8: - : 8 - 10: (+) J 10 - 20: + j (darunter) (darunter) (darunter)
20 - 40: ++ j 40 - 60: +++ ; 60 - 80: ++++ (darunter) (darunter) (darunter)
80 oder mehr: +++++.
Beispiel g
Zur Bestimmung der auflösenden Viirkung der in Beispiel 1 erhaltenen Roiieneyma in Gegenwart ajjies Salzes vfird die in Beispiel 1 beschriebene Methode wiederholt, wobei jedoch natriumchlorid dor Reaürbionslösung zugesetzt wird, und zwar in einer solchen Menge, dass eine Endkonsentration von 0 - 0,3 m eingestellt wird. JJLe Abnahme der Aktivität (%) geht aus Figur 4 der beigefügten Zeichnung hervor (100 bedeutet den Pail, dass kein Natriumchlorid der lösung zugesetzt worden ist). In Figur 4 gibt die Linie 1 das von Goprinus micaceus abgeleitete Enzym wieder, die Linie 2 bedeutet Goprinus radians, die Linie 3 steht für Coprinus macrorhizus var. microsporo^js und die Linie 4 gibt ein bakteriolytisches Enzym wieder, das von einem Brevibacterium-Stamm abstammt. Man sieht, dass die erf Indungagemässen Enzyms sich erheblich von den bekannten
909 8 8A/U79
Zell-lytischen Enzymen, die von Bakterien abstammen, unterscheiden, wobei sie ausserdem eine sehr hohe .Salzbeständigkeit aufweisen.
Beispiel 6
Stämme:
Coprinus macrorhisua
var. microsporojife ATOO 20120 Coprinus radians ATCC 20014 Coprinus micaceus ATCC 20122
Kulturmedium:
1 $
0,5
3 %
0,5
0,05
Glukose
Casaminosäure getrocknete Hefe
7H2O
MgSO
[Der pH dea Mediums beträgt 5»5. Das Medium wird durch Erhitzen auf 1200C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert]
Die vorstehend angegebenen drei Stämme v/erden auf das beschriebene Kulturmediuni, das sich jeweils in einem Kolben "befindet, auf ge impft, worauf das Zlichten unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30°C während einer Zeitspanne von 7 Tagen durchgeführt wird. Die Enzymlösungen, welche durch Abfiltrieren der Eulturbriihen erhalten werddn, werden in einem kalten Zimmer (O0C) abgekühlt, worauf auf -200C abgekühltes Aceton allmählich unter leichtem Rührem zugesetzt wird. Die Acetonzugabe ist derart, dass eine Konzentration von 70 ?S (Volumen/Volumen) eingestellt wird. Die Reaktionslösungen werden über Nacht in einem kalten Zimmer stehen gelassen. Die ausgefallenen Niederschläge werden filtriertr gesaraaelt und unter Vakuum getrocknet. Dabei werden rohe Enzyme erhalten.
9 0 9 8 8 4 /U 7 9
Die Aktivitäten eier rohen Enzyme werden In der gleichen Vfeise wie in Beispiel 1 gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind In der tabelle IV zusammengefasst.
Tabelle IY
Menge des Menge des Bakterioly-Kulturfiltrats Rohenzyms tische Aktl- i)U) vität (E/mg)
0,7 0,7
0,6
Die gleichen drei Stämme wie in Beispiel 1 werden auf Kulturmedien aufgeimpft, die durch Vermischen von 10 Teilen Weisenkleie mit 1 Teil einer entfetteten Reiskleie, gründliches Anfeuchten der Mischung mit V/asser und Sterilisierung bei 1200C während einer Zeitspanne von 30 Minuten hergestellt worden sind» Dann wird während einer Zeitspanne von 15 Tagen bei einer Temperatur von 300C ein Züchten in ruhendem Zustand durchgeführt.
Ein Kulturmedium, in welchem die Hyphen gut wachsen, wird ausgewählt. Die Medien werden fein aerteilt, worauf Yfasser in einer 5-fachen Menge zugesetzt wird. Die Medien werden anschlieasend bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 2 Stunden extrahiert. Hach der Extraktion wird die Lösung abfiltriert, worauf sie klar ist. Sie wird dann in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt.
Coprinus macrorhizus
var, microsporoafe
ATCC 20120		 400 17,0
Coprinus radians
ATCC 20014		 500 18,9
Goprlnus micaceus
ATCC 20122		 500 14,7
Beispiel 7
90 9884/1479
BAD ORIGINAL
Es werden rohe Enzyme erhalten, welche praktisch die gleichen Aktivitäten besitzen, wie sie in Beispiel 1 angegeben werden.
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Claims (20)

Patentansprüche
1. Verfaliren zur Herstellung eines Zell-lytischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroorganismus, der ein ZeIllytisch.es Enzym zu erzeugen vermag und zu dem Genus Coprinus gehört, in einem Nährmedium gezüchtet wird, worauf das ZeIl-Iytische Enzym aus der erhaltenen Kulturbrühe abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus Coprinus macrorhizua var, microsporojifs ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aue Coprinus radians "besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete MikroOrganismus aus Coprinus micaceus besteht.
5. Verfaliren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ztlchten .in einem wässrigen Hährmedium unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird. i
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Medium aus Rohrzucker, löslichen Destillatbestandteilen, getrockneter Hefe, Auxinen oder anorganischen Salzen besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dasβ das Zückten in einem festen Kulturmedium durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass daa Medium aus Weizenkleie oder Reiakleie "besteht.
909884/U79
BAD
9. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, dass Hefeextrakt, getrocknete Hefe oder Reiskleie dem Medium zur Beschleunigung der Gärung augesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1f dadurch gekennzeichnet, dass ein aus Indolessigsäure, 2,4-Biehlorphenoxyessigsäure, Naphthalinessigsäure. Gibberellin oder Eine tin bestehendes Pflanzenhormon dem Medium zur Beschleunigung der Gärung zugesetzt wird.
11. Verfahren zur Herstellung eines Zell-lytischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus Coprinus macrorhisus rar, microsporojlfe, Coprinus radians oder Ooprinus mieaeeus beste», hender Mikroorganismus in einem Nährmedium bei einer Temperatur von ungefähr 20 - 35°C sowie bei einem pH von ungefähr 4-8 gezüchtet wird, worauf das Zell-ly tische Enzym aus der erhaltenen Kulturbrühe abgetrennt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Ooprinus macrorhizus var. microsporojife A(DGO 20120 besteht,
13. Verfahren, nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Coprinus radians ATOC 20014 besteht.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete "Mikroorganismus aus Ooprinus micaceua Al1GC 20122 besteilt.
15. Verfahren naoli Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Hefeextrakt, getrocknete Hefe oder Reiskleie dem Medixua zur Beschleunigung der Gärung angesetzt wird,
9 0 9884/U7 9
16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus Indolessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Naphthalinessigsäure, Gibberellin oder Kinetin bestehendes Pflanzenhormon dem Medium zur Beschleunigung der Gärung zugesetzt wird.
17y Zell-lytisches Enzym, dadurch gekennzeichnet, dass es nach dem Verfahren gemäss Anspruch 11 hergestellt worden 1st.
18. Verfahren zur Auflösung von Mikroorganismenseilen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Suspension der Mikroorgahismenzellen mit einem Zell-lytischen Enzym behandelt wird, das durch Züchten eines aus Ooprinus macrorhizus var. microsporo^fs, Ooprinus radians oder Ooprinus micaceus bestehenden Mikroorganismus in einem STährmedium bei einer Temperatur von ungefähr 20 - 35 8C sowie bei einem pH von ungefähr 4 - 8 und anschliessende Abtrennung des Zell-lytischen Enzyms aus der erhaltenen Kulturbrühe hergestellt worden ist.
19» Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bsi einer !Temperatur von ungefähr 370O durchgeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der zur Herstellung des Zell-lytischen Enzyms verwendete Mikroorganismus aus Coprinus macrorhizus var. inicrosporojlfe ATGC 20120, Goprinus radians Al1OC 20014 oder Goprinus micaceus ATCC 20122 besteht.
909884/1479
ORIGINAL
'4S-
L e e r s e i t e
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