DE2322128A1

DE2322128A1 - Enzympraeparate mit lipolytischer aktivitaet, verfahren zu ihrer herstellung auf mikrobiologischem wege und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2322128A1
Application number: DE2322128A
Authority: DE
Inventors: Fabrizio Aragozzini; Renato Craveri; Pier Luigi Manachini
Original assignee: Societa Italiana Resine SpA SIR
Current assignee: Societa Italiana Resine SpA SIR
Priority date: 1972-05-03
Filing date: 1973-05-02
Publication date: 1973-11-15
Also published as: NL7306031A; CH568390A5; FR2183253A1; US3898133A; FR2183253B1; CA995162A; YU36754B; GB1394410A; YU113573A; IT1048921B; JPS5722554B2; JPS4947584A

Description

SOCIETA¹ ITALIANA RESINE S.I.R. S.p.A. Mailand, Italien

¹¹ Enzympräparate mit lipolytischer Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung auf mikrobiologischem Wege und ihre Verwendung "

Priorität: 3. Mai 1972, Italien,"Nr. 23 850-A/72

Die Erfindung betrifft Enzympräparate mit lipolytischer Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung auf mikrobiologischen Wege und ihre Verwendung.

Die Enzympräparate der Erfindung weisen eine hohe lipolytische Aktivität auf. Ihr p^-Optimum liegt im Bereich von 7 bis 8,5 und ihr Temperaturoptimum bei 50 bis 60°C. Diese Präparate sind bei etwa 45°C in einem ρττ-Bereich von 4,5 bis 8,5 mindestens 60 Minuten stabil.

Das Verfahren zur Herstellung der lipolytisch wirkenden Enzympräparate mit einem Pjr-Optiraum im Bereich von 7 bis 8,5 und einem Temperatüroptimum von 50 bis 60⁰C ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismenstamm der Gattung Myriococcum I.P.V. F-520 unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium züchtet

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und das Enzympräparat aus der Gärmaische isoliert.

Die Züchtung wird vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 38 bis 45°C, bei ρττ-Werten von etwa 7 bis 8,5 und unter einer Luftzufuhr von etwa 0,2 bis 1 Liter/Liter/min unter Rühren durchgeführt. Die Züchtungsdauer beträgt vorzugsweise 48 bis 90 Stunden.

Der vorgenannte Mikroorganismus gehört zu den thermophilen Eumyceten. Er wurde aus Gartenerde isoliert und anschließend auf Agar gezüchtet, das Malz oder Kartoffelinfusion, Glucose und Hefeextrakt enthält. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm wurde bei der Mikroorganismensammlung des "Istituto di Patologia Vegetale della University degli Studi di Milano'/ unter der Nummer I.P.V.. P-52O (ATCC 20 374) hinterlegt.

Dieser Stamm v/eist folgende Eigenschaften auf: Kolonien: Nach 4 bis 5tägiger Züchtung bei 43 C auf einem Agarmedium weisen die gebildeten Kolonien ein baumwollartiges, ausgedehntes Wachstum auf, das aus gelblich-weißem vegetativem Mycel und einem weißlichen Luftmycel besteht.

Morphologie: Das Mycel besteht aus verzweigten, septierten Hyphen mit unterschiedlichem Durchmesser von 3 bis 12 - 15 u. Mit der Zeit treten kugelförmige Formationen von mehr oder weniger dunkelbrauner bis schwärzlicher Färbung in reifem Zustand auf, die einen Durchmesser von 200 bis 250 μ erreichen können. Diese Formationen weisen Y/ande mit runzeliger Struktur auf«. Sie lassen sich als Ascokarpien identifizieren, Ascosporen treten nicht in allen Fällen auf. Es läßt sich keine typische konidiale Reproduktionsphase beobachten. Die Reproduktion läuft im allgemeinen über eine Fragmentierung der Hyphen oder über Asco-

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sporen ab, die nach einem Bruch des Fruchtkörpers freigesetzt werden. Aufgrund seiner Eigenschaften wird der erfindungsgemäße Stamm unter die Gattung Myriococcum eingereiht.

Wachstum auf verschiedenen Agar-Nährmedien nach 6-tägiger Inkubation bei 43°C: Apar-Nährmedium Wachstum

Malz gut

Kartoffel + Glucose + Hefeextrakt gut

Sojabohnen gut

Hafermehl gut

Reisinfusion gut

Stärke + Hefeextrakt befriedigend

Glucose + Hefeextrakt befriedigend

Fleischextrakt + Glucose befriedigend ·

Asparagin + Glycerin befriedigend

Milch befriedigend

Fleischextrakt spärlich

Fleischextrakt + Hefeextrakt spärlich

Mistaufguß spärlich

Czapek-Agar sehr spärlich

Wachstumstemperaturen; Minimum etwa 30⁰C, Optimum 40 bis 45°C, IBximum etwa 55°C.

Sauerstoffbedarf: Aerobes Wachstum.

Pr,-Bedingungen: Gutes Wachstum im p^-Bereich von 6 bis 8.

Enzvmaktivitäten: lipolytisch, proteolytisch, Labaktivität,

Amylaseaktivitat.

Verwertung von Kohlenstoffquellen: Gute Verwertung von Glucose,

Fructose, Galactose, Xylose, Maltose, Lactose, Dextrin, Stärke,

Glycerin und Mannit; mäßige Verwertung von Saccharose und

Inulin.

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Verwertung von Stickstoffquellen: Gute Verwertung von Peptonen, Asparagin, Harnstoff, Kaliumnitrat und Ammoniumsulfat.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Enzympräparate mit lipolytischer Aktivität wird zuerst ein Inoculum hergestellt. Zu diesem Zweck wird eine Mycelsuspension, die aus einer Schrägagarkultur des Stammes I.P.V. F-520 gewonnen wird, in einen das entsprechende flüssige Nährmedium enthaltenden Erlenmeyerkolben überimpft. Es können übliche Nährmedien auf Mehlbasis verwendet werden. Spezielle Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Stärke, Dextrin, Maltose, Lactose oder andere gereinigte oder in verschiedenen Mehlsorten enthaltene Kohlenhydrate. Solche Kohlenhydrate finden sich in Mais, Sojabohnen, Erdnüssen, Baumwollsaat, Kleie oder in anderen Produkten, wie Molke, bei der Herstellung von pflanzlichen Ölen anfallende Preßkuchen, Melassen und pflanzliche Öle aus verschiedenen Samen.

Als Stickstoffquellen eignen sich Produkte aus den vorgenannten Mehlsorten, andere Proteinprcdukte, deren Hydrolyseprodukte oder anorganische Stickstoffquellen. Es können verschiedene Mineralsalze, wie Phosphate, Magnesiumsulfat, Zinksulfat oder Calciumchlorid zugesetzt werden.

Die im Impfkolben gebildete Impfkultur wird als Inoculum für einen Fermenter verwendet, der ein Nährmedium einer im wesentlichen gleichen Zusammensetzung oder auch einer unterschiedlichen Zusammensetzung enthält. Die in diesem Fermenter erhaltene Gärmaische wird wiederum als Inoculum für mehrere andere Fermenter verwendet.

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Die Nährmedien können mit üblichen Zusätzen, beispielsweise mit Antischaummitteln, versetzt werden. Die nach beendeter Fermentation erhaltene Gärmaische wird abzentrifugiert oder filtriert. Aus dem Filtrat erhält man nach üblichen Anreicherungsund Reinigungsschritten das erfindungsgemäße Enzympräparat. Die Anreicherung des Enzympräparats kann leicht durch Ausfällen mit Salzen, wie Ammoniumsulfat oder Chloriden, Tannin oder organischen Lösungsmitteln, wie Aceton oder Äthanol, vorgenommen werden.

Das erfindungsgemäße Produkt weist folgende Eigenschaften auf: p_H-Optimum: 7 bis 8,5; vgl. Fig. 1;

Temperaturoptimum: 50 - 60⁰C; vgl. Fig. 2; Stabilität: 45⁰C: im p_H-Bereich 4,5 bis 8,5 nach

60 Minuten 100 bis 95 Prozent Aktivität;

vgl. Fig. 3;

55⁰C: nach 30 Minuten bei p_H-Wert 4,5

etwa 85 Prozent Aktivität und bei

Ρττ-Wert 8,5 etwa 80 Prozent Aktivität;

vgl. Fig. 4
Löslichkeit: in wäßrigen, alkalischen Medien besser

löslich als in wäßrigen neutralen Medien;

unlöslich in Aceton, Äthanol, Methanol

und Diäthyläther.

Weitere Eigenschaften: Aktivierung durch Calciumionen und Na-

triumtaurocholat; keine Hemmung der enzymatischen Aktivität durch p-Hydroxymercuribenzoat; teilweise Hemmung durch das Natriumsalz von Äthylendiamintetraessig-

säure.
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— D -

Die lipolytische Aktivität wird auf folgende Weise gemessen: 500 mg in einem Mörser gepulvertes Rohenzym werden in einem Citrat-Phosphatpuffer vom p^-Wert 8 in einem 100 ml-Meßkolben gelöst, 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und schließlich auf das gewünschte Volumen aufgefüllt.

Getrennt davon wird eine das Substrat enthaltende Emulsion hergestellt. Dazu wird Citrat-Phosphatpuffer vom ρττ-Wert 8, der 2 Prozent Natriumtaurocholat enthält, mit 10 Prozent Olivenöl versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 15 Minuten bei Raumtemperatur homogenisiert.

1 ml der Enzymlösung wird durch Abzentrifugieren von unlöslichen · Rückständen befreit und zu 9 ml der vorgenannten Emulsion in einen mit einem Schliffstopfen verschlossenen 100 ml-Erlenmeyerkolben gegeben.. Das Substrat-Enzymgemisch wird in einem Wasserbad bei 55°C auf einer Schüttelmaschine mit einem Hub ^ron etwa 9 cm und 60 Schwingungen/min geschüttelt. Nach einer Stunde wird der Kolben mit Leitungswasser gekühlt. Die Enzymreaktion wird sodann durch Zusatz von 2 ml k m Salzsäure unterbrochen.

Das Reaktionsgemisch wird dreimal mit je 25 ml Diäthyläther extrahiert. Die Ätherextrakte werden vereinigt, dreimal mit je 15 ml destilliertem V/asser gewaschen und mit einer 0,02 m Lösung von Kaliumhydroxid in Äthanol gegen Phenolphthalein als Indikator titriert.

Ein Kontrollwert wird auf die gleiche Weise gewonnen. Dabei wird aber die Enzymlösung vorher 20 Minuten auf 100°C erhitzt, um die lipolytische Aktivität zu beseitigen. Auch die Kontrollprobe wird mit 0,02 m Lösung von Kaliumhydroxid in Äthanol gegen Phenolphthalein als Indikator titriert.

Die spezifische lipolytische Aktivität des Produktes wird in Iipolytischen Einheiten (LU)/mg Produkt nach folgender Gleichung

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erhalten:

LU/mg = AxO,02/5

in der A die Differenz des Verbrauchs an 0,02 m KOH in ml bedeutet. 1 LU ist die Enzymmenge, die in 1 Stunde bei 55⁰C und beim pu-Wert 8 ein Mikroäquivalent Säure freisetzt.

Die lipolytische Aktivität der Gärflüssigkeit wird auf die vorste
hend beschriebene V/eise nach dem Abtrennen des Mycels und von

anderen Feststoffen bestimmt.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Enzympräparate mit lipolytischer Aktivität in Waschmitteln, chemischen Produkten und Arzneipräparaten und zur Herstellung von Nahrungsmitteln.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Zur Herstellung eines Inoculums wird der Stamm I.P.V. P-520 3 Tage in zwei Schrägröhrchen auf einem Kartoffelinfusion, Glucose und Hefe enthaltenden Agar oder auf einem Malz enthaltenden Agar gezüchtet. Die erhaltenen Kulturen werden mit 10 ml physiologischer Kochsalzlösung ausgewaschen und in einen 750 ml Kolben, der 100 ml Nährmedium der folgenden Zusammensetzung enthält, überimpft:

Durch Extraktion von Sojabohnen erhaltenes Mehl 10 g Maismehl 10 g

Molkepulver 5 g

Leinsamenöl 0,5 g

Leitungswasser ad 1000 ml.

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Das Nährmedium wird vor der Inoculation auf den p^-Wert 7 eingestellt und 1/2 Stunde bei 121⁰C sterilisiert. Vor dem Beimpfen wird es auf 40 bis 45°C abgekühlt. Die Züchtung wird 36 bis 38 Stunden bei 40 bis 43⁰C unter linearem Schütteln (120 Schwingungen/min, 8 cm Hub) durchgeführt. Die Gärmaische aus 3 bis 5 Kolben wird als Inoculum für einen 10 Liter fassenden Fermenter, der 5 Liter des vorgenannten Nährmediums enthält, verwendet. Nach 36stündiger Inkubation bei 40 bis 43°C unter Rühren mit 500 U/min und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 Liter/Liter/min wird die erhaltene Gärmaische wiederum als Inoculum in einer. Menge von 10 Prozent für Fermentatoren von 20 Liter Fassungsvermögen, die 12 Liter des gleichen Nährmediums enthalten, verwendet. Züchtungsbedingungen: Temperatur 40 bis 43°C; Rührgeschwindigkeit 500 U/min; Belüftungsgeschwindigkeit 0,4 bis 0,6 Liter/Liter/min. Als Antischaummittel wird eine Silicon-Emulsion (Dow Corning antifoam FG-10) verwendet. Nach dem Erreichen eines pjj-V/erts von etwa 8,5 und einer Konzentration von 200 bis 220 LU/ml nach 48stündiger Züchtung wird die Inkubation abgebrochen.

50 Liter der auf diese Weise erhaltenen Gärmaische werden zur Abtrennung des Mycels und anderer unlöslicher Feststoffe äbzentrifugiert. Die Flüssigkeit wird anschließend mit 1 η HCl auf den pu-Wert 5 bis 5,5 gebracht und nach Zusatz von 150 g Tannin in 1000 ml Wasser 60 Minuten bei 4°C langsam gerührt.

Anschließend wird die Flüssigkeit in eine Säule gegeben, wo sich nach 4stündigem Stehen bei 4°C ein flockiges Produkt absetzt.

Etwa 10 Liter Flüssigkeit, die den Niederschlag enthalten, werden am Säulenboden abgenommen und bei 6000 U/min zentrifugiert.

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Der abgetrennte Niederschlag wird dreimal mit insgesamt 3 Liter Aceton gewaschen, anschließend zermahlen und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 75 g hellbraunes, amorphes Enzympulver mit einer spezifischen Aktivität von
110 LU/mg. Dieses Produkt weist ein ρττ-Optimum von 7 bis 8,5
auf (vgl. Fig. 1). Das Temperaturoptimum liegt zwischen 50 und
60⁰C (vgl. Fig. 2). Das Produkt ist für praktische Zwecke, beispielsweise zur Herstellung von Waschmitteln, ausreichend stabil, wie sich aus den Fig. 3 und 4 entnehmen läßt.

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Claims

Patentansprüche

Q). Verfahren zur Herstellung von Enzympräparaten mit lipolytischer Aktivität mit einem p^-Optimum von 7 bis 8,5 und einem Temperaturoptimum von 50 bis 60°C auf mikrobiologischem Wege _t dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismenstamm der Gattung Myriococcum I.P.V. F-520 unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium züchtet und das Enzympräparat aus der Gärmaische isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung 48 bis 90 Stunden bei 38 bis 45⁰C und in einem Ptr-Bereich von 7 bis 8,5 unter einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,2 bis 1 Liter/Liter/min durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Stärke, Dextrin, Maltose, Lactose oder andere aus Mais, Sojabohnen, Erdnüssen, Baumwollsaat, Kleie, Molke, bei der Herstellung von pflanzlichen Ölen anfallende Preßkuchen, Melassen oder Samenölen gewonnene Kohlenhydrate verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stickstoffquelle Proteine aus Mais, Sojabohnen, Erdnüssen, Baumwollsaat, Getreidekleie, andere Proteine oder deren Hydrolysate oder anorganische Salze verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ό.ζΖ ,«ran als Mineralsalze Phosphate, Magnesiumsulfat, Zinksulfat oder Calciumchlorid verwendet.

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6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gärmaische nach beendeter Züchtung durch Zentrifugation von Feststoffen befreit und aufarbeitet.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Enzymanreicherung durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Chloriden, Tannin, Aceton oder Äthanol vornimmt.
8. Enzympräparate mit lipolytischer Aktivität mit einem ρττ-Optimum im Bereich von 7 bis 8,5 und einem Temperaturoptimum von 50 bis 60⁰C, hergestellt nach Anspruch 1.
9. Verwendung der nach Anspruch 1 hergestellten Enzympräparate mit lipolytischer Aktivität in Waschmitteln, chemischen Produkten und Arzneipräparaten und zur Herstellung von Nahrungsmitteln.

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