JPS59156282A - 新規耐熱性リパーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規耐熱性リパーゼの５・ノ造法に閑し、更
に詳しくは、リゾパス集に−するりソバス・キネンシス
（Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ　　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　　）を、
ｊ＝　；’ｊ’：することによって耐熱性およびｐＨ女
’＆柱の漱れな新規リパーゼを製造する方法に曲する。

リパーゼは、脂肪や脂肪酸エステルなどを分）腔する酵
素であり、従来、動物臓器、微生物などから抽出、製造
されている。しかし、これまでに肖られているリパーゼ
は、一般に熱に対して不安定であり、ｐＨ安定域が狭い
為、工業的利用に適していない。

たとえは、リゾバス←、に瘍、するリゾバス・キネンシ
スｉ（Ｉ　−Ｓ株を培零し、培養谷り１からリパーゼを
採取する方法は知られている（特公昭５６−４２’２６
６号公＠参＋１）。しかし、この方法で得られるリパー
ゼは５０℃を越える温度で失活し、また安定ｐｆ（領域
がｐＨ４，０〜８．０と秋いとい・う欠点を有している
。

本分ＢＩ：Ｉ者は、微生物ｌを生産するリパーゼについ
て研究を行った結果、リゾバス類に麿するリゾバス・キ
ネンシス（ＩＦＯ４７４５）の培養により得られるリパ
ーゼは、耐熱・計およびｐＨ安定性に作れていることを
見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の要旨は、リゾバス１氏に１だするリ
ゾバス・キネンシス（ＩＦＱ　　４７４５）を培養し、
培養液中に耐熱性リパーゼを虫酸、蓄積させ、培養、ｆ
から耐熱性リパーゼを採取することを特徴とする耐熱・
１キリバーゼの硬造圧に存する。

本発明で出いるリゾバス・キネンシスは、財１則法人分
・（ｐ研究所にＩＦＯ４７４５七して寄託された公昶菌
である。

不発つ）のにオ！造法においては、リゾバス・キネンシ
スを次の訂）゛、にして培養する。

培Ｕ（１は、液状でも固体でもよく、培養は、静置培ｒ
ト、振とう培４、通気ｆ２拌培養のいずれでも行えるが
、好ましくは液状培地を用い、振とぅ培″！テまたは通
気平押培養により行う。

炭素、原としては、グルコース、サッカロース、マンノ
ース、デ手ストリン、セルロース、デン粉、グリセリン
、ソルビット、ふすま、米ぬかなどがハ」いられる。

窒素源としては、ペプトン、内汁エキス、６”＋’母’
エキス、乾燥酵母、大豆粉、大豆粕、カゼイン、グルテ
ン、カサミノ酸、コーンスチーブＩｌカー、尿素、コー
ンスチーブミール、アンモニウム塩、イ＋ｌ’ｌ酸塩な
どが利用される。

ｉＨｉ　ｊす塩として（１、各、［重リン９塩、硫峻塩
、塩［浚塩などが用いられる。

これらのイｄＪに、所望によりビタミン類、核酸などを
培地に添加してもよい。

通常、菌は前培養を行った後、主培地に接種する。

培養温度は２０〜４０℃、培養［４妾（支）は２〜１０
日であり、培地は徴酸性ないし中１生か好ましい。

またＪ（イ）気は培地ＩＩ！当り０．５〜１１／分の命
が好ましい。

液ｊ本培シづＪの場合、ｉｔ熱外リパーゼは、主に培養
液中に祭、：騙される。従って、培り（物をρ過または
遠心分ｍｉｉシて菌体を除去し、ｆ液または上澄液から
リパーゼを採取する。

１１′ｉＩ′ｌ熱性リパーゼは、臼知の分■１．′柘１
！；」手段によりコ１゛叙することができる。たとえは
、旭技・塩（たとえば崎膏アンモニウム、１筬阪ナトリ
ウム、」〕゛化ナトリウムなど）による塩折、親水在有
椋、浣に一ζ（たとえはアルコール類、アセトンなど）
による分画沈澱、イオン交換樹脂などによる吸脱る、ク
ロマトグラフィ、モレキュラーシーブ江ミ、蛋白法４７
ｊ”１（たとえば核酸、タンニン、リンタングステン１
セ２など）による沈ｉ殿、等γ点沈！潰法、透析法、胃
気！６析法、電気泳、ｉｊ法などをリパーゼの分舗栢黛
」法として例示するこ七ができる。

本発明で得られる１［１Ｎ熱性リパーゼは、次の５故な
特異性質を有している。

＋］ｌｐＨ安定性 ＰＨ２，５〜１１という広い（ｉｆｆｉ　１ｆｆｌにお
いて１００％の残存活性を示し、ｐ　Ｈ安定性がよい（
第１図１参照）。

（２）温度安定性 ７５℃で１５分間の熱処理では余く失活せず、８０℃で
１２０分間の処理後に８０％、９０　’ｃて６０分間の
処理後に６ｏｏ１０の残存活性を示し、駒熱性か非常に
高い（男２図およびりう３りｉ参；’！（ｉ　）。

（３）作用最通ｐＨ ＰＨ６，５ないし中性付近に存在する（′第４ざ自参照
）。

１４）作／＋１拳通温Ｍ ４０〜６０℃とやや高温側に広い加通湿度範ンＩかある
（！梠５図参照）。

（５）トリグリセリドに対する位ｔ＋＃特異性トリグリ
セリドの１２よひ３位のエステル結合のみを切断し、２
位のエステル結合には作出しないというイ立置特昇１弓
：がある。

（６）単酸是トリグリセリドに対する脂肪・ド？蛤嵌性
トリオレインに対する分１９！活骨を１００とすると一
、　’ｉ１ｊ対分解活性は、トリカプリンに対して１５
４、トリラウリンに対して８９となる（ｙ６落ｉ参照）
。

（７）ヴまＩ（点 等一点１．．気体動法によれば９．２である。

（８）分子５ｒ Ｓ　ｌ）　Ｓ　ｉｔ；気泳アｈ法によれば３００００で
ある。

これらの１４１質は次の様にしてｙｌ１１１宇された。

ｔａ）リパーゼ活ｔ−実測定法 オリーブ油１グ、”！Ｉ　／　２０　ｉ’４　ｐｐ４．
Ｉ’Ｂｌ　手ｇｌ　（ｐ’Ｈ５，６）＋　Ａ・ｉ、／　
１００　Ｃａ　ＣＪ２　５　ｍｌを含む反応液を内径４
．４ｃｍ、高さ８．２　ｃｍのガラス容器に入れ、適宜
希釈した酵素欣（０，０５〜１ｍｌ！　）を加え、３０
℃で１時：預、５００　ｒｐｍで１を拝して反応させた
後、エタノール２０ｍ１！を加えて反応を終了させた。

酵紫力１３１ｊは、遊堝１ｒするｊ１旨肪峻をＮ／２０
水酸化勾リウムを用いてｐＬ−１Ｉ　Ｑを終点とするｌ
ｊＸ」定により求めた。１分曲に１マイクロ当造の脂肪
酸を遊ｆ’１ｉ１さぜる瞥、素字を１単位とした。

（ｉ））作）目汚適Ｐ目曲線の測定条件オリーフ゛ｌ由
１ｇおよび　Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ　籾４ｔｊｌＢｍｌ中
に、浚素ｍ液０．　ｓ　ｍｔ；を加え、３０℃て６０分
「ハ１．５００　ｒｐｍ　で乎拌して反応させ、最大活
ｒ生を１００として残存活性を求めた。

ＦＣ＋濡１ず安定性曲保の測定条件 まず、酵素性りりｉを３０．５０，６０．７０．．７５
．８０．９０．９５および１００℃で１５分ｉｈ１イ未
った後、５分曲水冷し、残存活性を上記ｉａ）の方法に
従って測定した。その結果を示したのが第２内である。

一方、酵素ｌ容雁を８０℃または９０℃で、０．３０．
６０．９０および１２０分１ｉｊｉ保った女、５分１ｉ
ｌｌｉ１氷冷し、向じく残存活性を測定した。その結果
を示したのが第３図である。

（ｄ）ｐＨ安定性曲Ｓμの測定条件 酵累イ容？＆を、ｐｔ−ｉ２−　４についてはグリシン
−憔峻緩衝夜、Ｐト１４〜７にライては、ＶＩＣＩ　ｌ
　ｖａｉｎｅ１ｔ２３ｍ液、ｐＨ７〜１２についてはグ
リシン−水酸化ナトリウム緩待ｉ、イダ中に揃え、３０
℃で１５時：加処理した後、残存活性をＬ記ｉａ）の方
法に従って測定した。

（Ｃ）作用最早１高度曲線のポ１定否件オリーフ゛、由
１７およびｆ４　／　２Ｑ　ｊ→’Ｆ嚢緩イー・行に９
　（ｐ”１５．６）十〜ｔ　／　ｌ　ｎ　Ｑ　Ｃａ　Ｃ
Ｚ　２５　Ｉｎ、ｉ’中（・こ−Ｉｆ　Ｘ　ｉ容？（交
を加え、３０〜８０℃のｅＦＡ　ＬＭ：て６０９　ｒｑ
ｊ、５００１’ｐ：ｎで代′拌して反応させ、最大活性
を１００として井１交ｔ／占１生を求めた。

本発明の製造法により；尋られるリパーゼ、′ま、上辻
の様に・ｉｉ′Ｉ＋烈性かよく、ｐＨ安定ｊＪ１″」域
も広いから、工業的に非常に有用である。たとえは、つ
’、（７６Ｊ時にハｊいると高温での作業が可能となり
、袖のＭｆ　ＲＪＩ・ｊ・１−が１上し、反応か容易に
なる。また、洗ｋｉｌ　Ｊ４」ｉ、’ｉ’＃　Ａ劣、消
化酵素としてもＮｔ＋・れたものである。

次に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。

］に施例 ペプトン５％、グ／Ｌ、：ｌ−ス２％、Ｎ　ａ　ＮＯ３
Ｑ、　１％、＋＜１−１２ＰＯ４０，１％、Ｐｗ１ｇｓ
ｏ４．７Ｉ１２゜０３０５％を含む培地をｐＩ−１（、
Ｑに調整した後、その６０ｍ１ずつを５００ｍＪ容坂ロ
’７７スー］５０本に分注し、フラスコ１本当り胞子数
１ｏ５イ１帽こなるように４ｉＷ閃し、２７℃で９６蛸
制辰とぅＦ記洋を行い、４０里位／ｍ４　（７）培ｉｐ
液３０００　ｍＪを得た。

この諷液に、最終８０％飽和になる杜に１４ｆ安を加え
、塩析法’１５ｉ　サセタ後、Ｓ　Ｐ−５ｃｐｂａｄｃ
ｘ　（商標）Ｃ−５０，５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００
，ｉ、占点−気泳劾の精製手段により、ディスクｃｉ″
ｉ気泳ρｉ＋的に均質なリパーゼを得た。回収率６０％
。

得られたリパーゼの活性は、比活性３０００ｍ位／ｍＦ
であった。

【図面の簡単な説明】

づ１区！は、馴ρ、！性リパーゼのｐＨ父定・ｄ：曲線
、躬２図および栗３図は、耐熱・詫リパーゼの熱安定性
曲線、 ３Ｖ　４抹・は、ＦＢ１１１７呉′；生すベーゼの作用
３トン琳（ｉ　ｐｉ−１！巾ｊ、：・？、第５ネ１は、
耐熱′（生リパーゼの１′乍用４５ハｒこ冒・、−１し
、ぜ晶；・“ｙ）、および 第６図１は、Ｌ７馴浚力号トリグリセリド（こ文・げる
ＩＩ旨ｅ方駿特異性を示す１図である。 特許１出）ｌｌｇｊ人　タイギン工業株式会ｔｅｌ：（
外２名）代理人　弁υ」ｊ十′１ｉｊ−山保（外２名）
−（％）−耐磁すＶ −（％＞ｂｐ眉ｖ″！ｔｉ 手続補正書（、え） 昭和５８年１０月１９日 特許庁　長　官　殿 １事件の表示 昭和５８年特許願第　０３１３８８　　　　号２発明の
名称 新規耐熱性リパーゼの製造法 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　人昆（１１１人、７（市ｉ１．；　ｆ４　ｉｉ、
ｆｆ　ｉｌｉ　１ＴｉＩ４２　：’Ｉｆ　３９シ゛ト、
１１ス思どル名称　　（２８５）　　ダイキン」ニニ′
；１体式会社代表者　　　山　　１）　稔 （ほか２名） ４代理人 ５補正命令の日付：（自　発） ７、補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄中、次の個所を補正しま
す、 （１）７頁８行、「酸素」を「酵素」と訂正。 （２）７頁１０行、「沙存活性」を「相対活性」と訂正
。 （３１’８頁下から７行、「、リパーゼ」を「リノｆ−
ゼ」と訂正。 以上 手続補正書、１３．。。 昭和５９年５月１９日 特許庁長官　殿　　　　　下胴ゝ・ １　事件の表示 昭和５８年特許願第　（’１３１３８８　　　　号２、
発明の名称 新規耐熱性リパーゼ第３よびその製造法３補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所−大阪府大阪市北区梅１ｆ１１丁目１２番３９号新
阪急ビル４４、オ　ッ、　　　　　　　　　　　　　　
′はが′５、補正命令の日付　：自　発 °７．補正の内容 明ｔ’４Ｈ書中次の箇所を補正します。 １、発明の名称の欄 「新規耐熱性リパーゼの製造法」とあるを、「新規耐熱
性リパーゼおよびその製造法」と訂正する。 ■、特許請〕ｊミの１′１Ｌ囲の（閃 別紙の通り。 １１１、発明の詳細な説明の（’；Ａ （１）第２頁第１．５行、「要旨は、」の後に、ｌ−３
＋）〜３０　”Ｃの温度で１５分間処理した後生なくと
も９５％の残存活性を示すことを特徴とする新規耐熱性
リパーゼ、および」を挿入する。 （２）第２頁第１９行と第２０行の間に改行し、て次の
支承を挿入する： ［本発明の耐熱性リパーゼの中でも一定の高温条件では
長時間の熱処理後番こより高い残存活性を示すものかよ
り好ましく、また一層高温で高い残存活性を示すものが
好ましいことはＬうまでもない。たとえば ３（）〜８０℃の温度で１５分間処理した後１００％の
残存活性を示すもの、 ８０℃で６０分間処理した後生なくとも９５％の残存活
性を示すもの、 ８０　’Ｃで１２０分間処理した後生なくとも８０％の
残存活性を示すしの、 ９０°Ｃで６０分間処理した後生なくとも６０％の残存
活性を示すもの、さら゛に ９０’Ｃで１２０分間処理した後生なくとも３５％の残
存活性を示すものなどが好ましい本発明の耐熱性リパー
ゼである。」。 以上 特許請求の範囲 １−リゾバス属Ｗ属するリゾパス・キネンシス（ＩＦＯ
’４７４５’、ｌを培養し、培養液中（こ耐熱性リパー
ゼを生成、蓄積させ、培養液から耐熱性リパーゼを採取
することを特徴とする耐熱性リパーゼの製造法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ：１）リゾバス￥に屈するリゾバス・キネンシス（ＩＦ
   Ｏ４７４５）を培養し、陪従液中に耐熱・四リパーゼを
   生成、蓄積させ、培５４液から耐、−、、、、凛リパー
   ゼを採取することを特徴とする耐熱ｊ生すパーゼの製造
   法。