JPS6015311B2 - ストレプトミセス属の生産するコレステロ−ル・エステラ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はストレプトミセス属に属し、コレステロール・
ヱステラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養液よ
りコレステロール・ヱステラーゼを抽出、精製すること
よりなるコレステロール・ェステラーゼの製造方法に関
する。

血中コレステロールの定量は医学的な診断法として非常
に重要である。

例えば、高コレステロール皿症の場合には、コレステロ
ール値の低い場合よりも冠状機能不全および心筋硬塞が
生じやすい。この場合、適正時の治療の為には、高コレ
ステロール血症を早期にみつけ出さねばならない。また
、血中高コレステロール値はネフローゼ症懐群、糖尿病
、甲状腺機能低下、胆道閉塞等の場合にも生じやすい。
血中低コレステロール値は悪液質、甲状腺機熊冗進症、
アジソン氏病、組織実質性疾患等の場合に生じやすい。
このように重要な医学的意味を有する血中コレステロー
ルの定量には迅速かつ正確な方法が求められる。血中コ
レステロール値の定量法については、リーバーマン・バ
ーチヤード反応（Ｃｈｅｍ、Ｚｅｎｔｒａｌｂ１ ６１
，２５，１８９０）、キリアニ反応（臨床化学分析ｍ
Ｐ５７東京化学同人 １９６６）等がある。これらの方
法を用い、皿中コレステロール値を測定することが可能
であるが、これらの方法では濃硫酸、無水酢酸、氷酢酸
といった腐食性のある酸を使用しなくてはいけないとい
う欠点を有する。そこで、コレステロールの３８基を酸
化するコレステロール・オキシダーゼを用いた、血中コ
レステロール定量法（ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０，４７
０，１９７４）が考えられてきた。コレステロール・オ
キシダーゼは遊離のコレステロールの３３基を酸化して
、コレスト−４ーェンー３ーオンおよび過酸化水素を生
ずる。この結果、生じたコレストー４ーェンー３−オン
または過酸化水素を測定する事により遊離のコレステロ
ールの定量が可能である。しかしコレステロ−ル・オキ
シダーゼは遊離のコレステロールにしか働かず、ェステ
ル型のコレスチロールは定量不可能である。ェステル型
のコレステロールを加水分解する為には、アルコール性
苛性加里を用いる方法（ＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９，１
３５０，１９７３）もあるが、操作が非常に煩雑で危険
も伴う。ケン化によるコレステロールェステルの加水分
解に代るものとしてはコレステロール・ェステラーゼに
よる酵素的加水分解が考えられる。コレステロール・ェ
ステラーゼは主そして動物の総脇等に存在することが知
られており（ＬｉｐｏｌｙｔｉｃＥｍＭｍｅｓＰ１７７
，１９７４ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、この解繊由
来の酵素を用いることによっても、皿中の総コレステロ
ールを定量する事が可能である。しかし、動物由来の酵
素は資源が限られており、需要の増加等があった場合、
すぐには増産が不可能である。微生物を用いてコレステ
ロール・ェステラーゼが生産できれば、必要な時、必要
なだけ酵素を得ることが可能である。本発明者等はこの
ような考えに立ち、微生物よりコレステロール・ェステ
ラーゼを得る為に、各種微生物の検索を行なった。方法
としてはコレステロールェステルを唯一の炭素源として
寒天平板上に生育する菌を選択し、選択された菌を、コ
レステロールェステルを唯一の炭素源とする液体培地で
生育させた場合、菌体外にコレステロール・ェステラー
ゼを生産する菌を選択した。

この検索の結果、ストレプトミセス属の一菌株が菌体外
に著量のコレステロール・ェステラーゼを生産する事を
見出し、コレステｏ−ル・ェステラーゼを抽出、精製す
ることに成功し、本発明を完成した。本発明に使用する
菌株としてはストレプトミセス属に属し、コレステロー
ル・ェステラーゼを生産する菌株であれば、いずれも使
用可能であるが、特に好適な菌株としては次のような菌
があげられる。

その菌学的性質は次の通りである。

‘１１ 形能：本菌株は顕微鏡下でよく分枝した基中菌
糸より鈎状Ｒｅｔｉｎｏｃ山ｉａｐｅｎｉ）あるいは螺
旋状（ＣｌｏｓｅｄＳｐｉｒａｌｓ）の気菌糸を形成し
、輪生枝はみとめられない。

成熟した胞子鎖は１の固以上の胞子の連鎖をみとめ、胞
子の大きさは０．６〜０．８×１．０〜１．４ミクロン
位で胞子の表面は平滑である。‘２｝ 各種培地におけ
る生育状態；色の記載について）内に示す標準はコンテ
ィナー・コーポレーション・オプ・アメリカのカラー・
ハーモニイ．マニュアル（ＣｏｎｔａｉＭｒＣｏｒｐｏ
ｒａｔｊｏｎｏｆＡｍｅｒｉｃａのＣｏｌｏｕｒｈａｍ
ｏｎｙｍａｎｎ雌１）を用いた。

１） シュークロース硝酸塩寒天塔地（２７０培養）：
無色の発育上にピンク灰の気菌糸をうっすらと着生し、
溶解性色素はみとめられない。

２） グルコール・アスパラギン寒天培地（２７℃培養
）：無色〜うす黄の発育上に白の気菌糸を着生し、溶解
性色素はみとめられない。

３）グリセリン・アスパラギン葵夫培地 （ＩＳＰ−培地５，２７０培地）：無色の発育上にピン
ク灰（鴇ｅ，Ｒｏｓｅｗｏｏｄ）の気菌糸を着生し、溶
解性色素はみとめられない。

４） スターチ無機塩寒天培地（ＩＳＰ堵地２７℃培養
）：うすし、黄茶の発育上に明るい茶灰の気菌糸を着生
し、溶解性色素はみとめられない。

５） チロシン寒天塔地（ＩＳＰ−培地７，２７００培
養：うす黄茶の発育上に白の気菌子を着生し、溶解性色
素は、わずかに茶色味をおびる程度である。

６） 栄養寒天塔地（２７ｑ０培養）：発育はうす黄茶
（紬ｇ，ＹｅｌｌｏｗＮねｐｉｅ）を呈し、気菌糸は着
生せず、溶解性色素はわずかに茶色味をおびる程度であ
る。

７）イースト・麦芽寒天塔地（ＩＳＰ培地２，２７００
培地）：うす黄茶（虫ｅ，ＹｅｌｌｏｗＮＥｐｌｅ）の
発育上に明るい茶灰の気菌糸を着生し、溶解性色素はみ
とめられない。

８） オートミール寒天培地（ＩＳＰ−３，２７００培
養）；うす黄茶（飢ｇ，ＹｅｌｌｏｗＮｂｐｌｅ）の発
育上にピンク灰（聡ｅ，Ｒｏｓｅｗｏｏｄ）の気菌糸を
着生し、溶確性色素はみとめられない。

９） グリセリン・硝酸塩寒天塔地（２７ｑ０培養）：
うす黄茶の発育上に白の気菌糸をうっすらと着生し、溶
解性色素はみとめられない。

１０） スターチ 寒天培地（２７ｑ０培養）：うす黄
茶（２１ｇ，Ｍ雌ｔａｒｄＴａｎ）の発育上にピンク灰
（５袋，Ｒｏｓｅｗｏｏｄ）の気菌糸を着生し、溶解性
色素はみとめられない。

１１） リンゴ酸・石灰寒天塔地（２で○培養）；無色
の発育上にピンク灰の気菌糸を着生し、溶解性色素はみ
とめられない。

１２） セルロース（２７０培養）：発育はみとめられ
ない。

１３） ゼラチン穿刺培養：グルコース・ベプト・ゼラ
チン培地（２７ｑ０培養）では、うす黄茶の発育上に明
るい茶灰の気菌糸を着生し、溶解性色素は黄茶味を呈す
る。

１４） 脱脂牛乳（３７０培養）：発育はうす黄茶〜黄
茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素はうす黄茶を呈する
。

‘３｝ 生理的性質 １） 生育温度範囲：スターチ・イースト寒天（可溶性
澱粉、犬印１．０％、イーストエキス大五栄養化学Ｋ．
Ｋ．０．２％、細寒天３．５％、ＰＨ７．０）を用い２
０００，２４ｏＣ，３０午０，３７０，５０℃、の各温
度で試験の結果、何れの温度でも生育するが、最適温度
は３０ｑｏ付近と思われる。

２）ゼラチンの液化（グルコース、ベプトン、ゼラチン
培地２７０培養）：培養１７日後から、わずかに液化が
始まり、その作用は弱い方である。

３）脱脂牛乳の凝固、ベプトン化（脱脂牛乳、３７ｏ０
培養）：培養後１１日目項から凝固が始まり、凝固完了
後べプトン化は１３日目項より始まる。

その作用は中程度である。４） スターチの加水分解（
スターチ、無機塩寒天培地およびスターチ寒天培地、２
で○培養）：培養後、１０日目項からわずかに水鱗性が
みとめられ、その作用は弱い方である。

５） メラニン様色素の生成（トリプトン、イースト・
ブロスＩＳＰ培地、チロシン寒天堵地、ＩＳＰ塔地７、
ベプトン、イースト、鉄寒天培地、ＩＳＰ培地６、何れ
も２７０培養）：べプトン、イースト鉄寒天塔地で陽・
性、またチロシン寒天培地では、かすかにメラニン様色
素の生成がとめられる。

トリプトン、イーストプロスでは陰性である。６） 炭
素源の利用性（プリドハム、ゴトリーブ寒天塔地、ＩＳ
Ｐ培地９，２７ｏ０培養）：Ｄ−グルコース、サリシン
をよく利用して生育し、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、シユークロース、メソーイノシトール、Ｌーラム
ノース、ラフイノース、Ｄーマンニトールは利用しない
。

Ｄーフラクトースは、おそらく利用しないと判定される
。７） 硝酸塩の還元反応（１％硝酸力ＩＪ含有べプト
ン水、ＩＳＰ塔地８，２７℃培養）；陽性ではあるが、
その作用は弱い方である。

８） リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天培地、２
７ｑ０培養）：発育周辺のリンゴ酸石灰を溶解し、その
作用は中程度である。

以上の性状を要約すると本菌株はスト・レプトミセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、気菌糸は釣状、
あるいは螺旋状、胞子の表面は平滑である。

培地上で発育は無色〜うす黄茶、気菌糸は白〜ピンク灰
、または明るい茶灰、溶解性の色素はほとんど産生しな
いか、産生する場合は茶色味を呈する程度である。メラ
ニン様色素は陽性と判定され、スターチ水解性は弱い方
、蛋白分解力は弱い〜中等度である。これらの性状より
既知菌種を検索するとＩＳＰ記載からストレプトミセス
・ラベンド レ （ ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅＳ Ｌａ
ｖｅｎｄｕｌａｅ ， Ｇ．Ｓ艦ｔｅｍａｔｉｃＢａｃ
にてｉｏｌｏ鮫１８，１３８１９６８）が最も近縁の種
としてあげられる。表１に示すように両者はかなりよく
一致している。従って本菌株はストレプトミセス・ラベ
ンドし‘こ極めて近縁の種と考えられストレプトミセス
・ラベンドレ Ｈ−６４６−ＳＹ２と同定した。なお本
菌株を工業技術院微生物工業技術研究所に昭和５２王１
月１８日に保管委託申請し、受託番号は３８８ぴ号であ
る。放線菌は人工的に、また自然界で変異を起こしやす
いが、本発明にいうストレプレミセスラベンドレ 日−
６４６一ＳＹ２はそれらの変異菌のすべてを包括する。
表１ 文献記載 コレステロール・ェステラーゼの葛生産は公知の方法、
例えば単胞子培養、紫外線、Ｘ線、変異誘起物質等で酵
素の生産菌を処理して生産館の高い菌株を選択し、これ
らの菌株に適当な培養基および培養条件を求めることに
より得ることが可能である。

本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機物、その
他の栄養素が好適比で存在する培地であれば、合成塔地
または天然培地のいずれも使用可能である。

コレステロール・ェステラーゼの生産に適した培地とし
ては炭素源としてコレステロールェステル、コレステロ
ールヱステルを含むと考えられる天然物、大豆油、オリ
ーブ油、牛脂、豚脂、肝油、脂肪酸等を使用する。

窒素源としては硝酸ナトリウム、硫安、尿素、コーンス
テイープリカー、酵母抽出物、ソーヤミール、コーング
ルテンミール、フイツシユミール、フアーマメデーイア
、肉エキス、ＮＺーアミン、各種アミノ酸等を使用する
。無機物としては燐酸第一カリ、燐酸第二カリ、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、塩化亜鉛、塩化カリ、炭酸カリシウム等を使用する
。培養の形態は固形培養でも液体培養でもさしつかえな
いが液体培養の場合、工業的には通気鍵梓培養を行なう
のが有利である。

培養温度は２５〜３７℃であればよいが２７℃位が好適
である。培地ＰＨは４〜９位であればよいが中性付近の
ＰＨが好適である。通常コレステロール・ェステラーゼ
は１〜１４日程の培養により生産される。

コレステロール・ェステラーゼの分離精製は、まず菌体
を炉過または遠Ｄ分離により除く、この炉液に硫酸アン
モニウムを加え分画し、得られた分画を更にアセトンで
分画する。

この分函をセファロースＣＬ−姫でゲル炉過するか、Ｄ
ＥＡＥーセルロースカラムクロマトグラフィ−により精
製することが可能がある。

塩を含んで酵素溶液は蒸留水に対し透析するか、セフア
デツクスＧ−２嶺静こよりゲル炉過する事により脱塩が
可能である。脱塩を行なった酵素溶液は凍結乾燥により
乾燥粉末になる。菌体よりコレステロール・ェステラー
ゼを得る為には函体を凍結、融解により破壊し、酵素を
０．０１Ｍ，ＰＨ７．０燐酸緩衝液により抽出する。以
後の操作は培養炉液の場合と同様にして行なうことが可
能である。本発明により得られたコレステロール・ェス
テラーゼとストレブトミセス・バイオレツセンスより得
られたコレステロール・オキシダーゼ（Ｊ．ＢｉＭｈｅ
ｍｉｓｔり，Ｔｏｋｙｏ，７９，９０３１９７６）を組
み合わせ、人血清中の総コレステロールの定量が可能で
あった。

＊ 本願発明によるコレステロール・ェステラーゼの酵
素学的性質は次の通りである。

（１’作用 コレステロールエステル コレステロール 脂肪酸 ■ 酵素活性測定法 １） セラコール（４・野薬品、商品名）に含まれるコ
レステロールェステルを基質とする。

コレステロール・エステラーゼによりコレステロールェ
ステルより生じた遊離コレステロールをストレブトミセ
ス・バイオレツセンスの生産するコレステロール・オキ
シダーゼ（Ｊ．Ｂｉｏｈｅｍ，Ｔｏｋｙｏ，７９，９０
３１９７６）により酸化させる。

この反応の際コレステロールの酸化物であるコレストー
４−ェン−３−オンと同時に生成する過酸化水素を４−
アミノアンチピリン、フェノール、ホースラデイツシユ
・バーオキンダーゼと共にカップリングさせキノネィミ
ン色素を生じさせる。この色素を５０瓜ｍで測定し、酵
素力価を測定する。反応液の組成基質 セラコール ２５仏〆 反応液 ４−アミノアンチピリン ０．８２ｈＭフエノー
ル １４ｍＭコール酸ナトリ
ウム ２仇ｈＭホースラデイツシユ・ パーオキシダーゼ １９００Ｕ／〆コレステロ
ー′レ・オキシダーゼ ３７Ｕ／そ上記
試薬を含んだ０．１Ｍ燐酸緩衝液 （ＰＨ６．８）の溶液、２の【 操作 定量性のあるコレステロール・ェステラーゼを入れた反
応液を３７０で３分間、前保温した後、セラコ−ル２５
ムクを加え、３７ｑ０で３戊分間、反応を行ない、５０
肌血で測定を行なう。

酵素力価酵素力価は１分間にｌｒｍｏｌｅのコレステロ
ールェステルを加水分解する酵素量を１単位とする。

２） １）の方法はストレプトミセス・バイオレツセン
スの生産するコレステロール・オキシダーゼ、ホースラ
デイツシユ・／ぐーオキシダーゼを組み合わせ定量を行
なう為、迅速、簡便で、培地中のコレステロール・ヱス
テラーゼの生産量を知る為や、精製段階での回収率を知
るのに適している。

しかし、酵素化学的性状をしらべる為には、コレステロ
ール・ェステラーゼ以外の酵素の影響が入る為、１）の
方法は適していない。

この為、酵素化学的性状の検討には以下に述べる方法を
用いた。コレステロール・リノール酸を基質としコレス
テロール・ェステラーゼを作用させ、生じたりノール酸
をＴＡＣ法（臨床化学１，４４７，４９７２）により測
定し、この価より酵素量を求める。反応液の組成（基質
） コレステロール・リノール酸 ｌｍＭ トライトンＸ−１００ １％上記の試薬
を含む０．１Ｍ，クエン酸，燐酸緩衝液（ＰＨ６．２）
操作定量性のある濃度のコレステロール・ェステラーゼ
を入れた酵素液０．１の‘を３７０で３分間、前保温し
た後、基質０．５の‘を加え、３７℃で１５分間、反応
を行なう。

ｎーヘプタン、クロロホルム１：１の混液で酵素反応の
停止を行ない、反応の結果生じた脂肪酸をＴＡＣ法で測
定する。‘３１ 基質特異性 種々の脂肪酸のコレステロールェステルを基質にして、
コレステロール・ェステラーゼによる加水分解性をみた
結果を表２に示す。

コレスナロール・リノール酸に対する水解率を１００と
した場合の各種ヱステルに対する水鱗率を相対活性で示
した。表２より明らかなように本酵素は不飽和長鎖脂肪
酸に対し、よい基質特異性を示す。表２【４｝ 至適Ｐ
Ｈ 図表１に本願酵素のＰＨ活性曲線を示す。

図より明らかなように至適ＰＨ‘ま９付近にある。｛５
’ＰＨ安定性図表２に本願酵素のＦＨ安定曲線を示す。
図より明らかなように、ＰＨ５〜８にかけ本酵素は安定
である。‘６｝ 至適温度 図表３に本願酵素の至適温度を示す。

図より明らかなように、至適温度は５０℃付近にある。
‘７｝ 温度安定性図表４に本願酵素の温度安定性を示
す。

図より明らかなように、５０ｑｏ迄、本酵素は安定であ
る。■ 阻害剤に対する挙動 本酵素に対する種々薬剤の影響を表３に示す。

ｌｍＭの各薬剤と本コレステロール・ェステラーゼを３
７０で１０分間、前保温した後、‘２１，２）の項で述
べた方法で活性を測定した。Ｈｇ＋２イオンおよびＡｇ
＋イオンでよく阻害される。

また、セリン酵素阻害剤であるＤＥＰでよく阻害される
。表３ 実施例 １ ５００の‘客の坂口フラスコにコレステロール・パルミ
チン酸、０．５％、ＮａＮｏ３、０．２％、Ｋ２ＨＰ０
４、０．１％、ＭｇＳｏ４・７日が、０．０５％、Ｋｃ
ｌ、０．０５％を含む培地（ＰＨ７．０）６０の‘を入
れ、１２０℃で２０分間、加熱滅菌した後、ストレプト
ミセス・ラベンドレ日６４６一ＳＹ−２（徴工研菌寄第
災紙び号）を１ェーゼ接種し、２７０で２適間、培養し
た。

培養液と菌体に含まれるコレステロール・ェステラーゼ
の力価は、それぞれ０．３単位／私、０．０２単位／夕
であつた。実施例 ２ ２５そ客のジャーファーメンターにパルミチン酸１％、
フアーマメデイア０．４％、ＮａＮ０３ ０．２％、Ｋ
２ＨＰ０４、０．１％ ＭｇＳ０４・７日２０ ０．０
５％、Ｋｃｌｏ．０５％を含む培地（ＰＨ７．０）１２
そを仕込み、常法により培地を殺菌した。

実施例１で使用した培地で培養したストレプトミセス・
ラベンドレ日私６−ＳＹ−２の種培養液５００の‘を移
植し、通気量毎分１０そ、麓拝数２５仇ｐｍ、２７ｏ０
で４自問、通気渡洋培養して、培養炉液１１そ（ＰＨ７
．６）を得た。

培養炉液と菌体に含まれるコレステロール・ェステラー
ゼの力価は、それぞれ１単位／の‘、０．０２単位／ぷ
であった。実施例 ３ 実施例２と同様の操作で得られた培養炉液１０そ（１０
００の単位のコレステロール・ェステラーゼを含有する
）に３．８ｋ９の硫安（０．４飽和になる）を加え遠沈
し、上燈１１〆を得た。

この上燈に対し２．２ｋ９の硫安（０．７飽和になる）
を更に加え、一夜放置した後、遠沈し沈澱を得た。

得られた沈澱は蒸留水１００机に溶解した。酵素液を氷
冷下において、アセトン５４机（３５％濃度）を加え、
生じた沈澱を遠沈により除き、上燈１４０の【に更にア
セトン１総似（７０％濃度）を加え、遠沈を行ない沈澱
を得た。この沈澱を０．０１Ｍ、ＰＨ７．０のトリス塩
酸緩衝液５０の‘に溶解し、同緩衝液で平衡したセファ
ロースＣＬ−ののカラム（直径１０仇、長さ１００仇）
でゲル炉週を行なった。活性分画を集め５０の‘迄、限
外炉過により濃縮し、大量の蒸留水に対し透析を行なっ
た。透析物は凍結乾燥し、乾燥粉末１．０夕を得た。こ
の粉末の比活性は５単位／雌であった。

精製の各段階の蛋白量、総活性、比活性及び収量は表４
に示した。

表４ 実施例 ４ 実施例３のアセトン分画で得た分画を０．１Ｍのトリス
塩酸緩衝液（ＰＨ８．０）で平衡したＤＥＡＥーセルロ
ースカラム（直径５肌、長さ５瓜九）に通して、酵素を
吸着させ、同緩衝液でカラムを洗浄した後、０〜０．９
Ｍの食塩を含む上記緩衛液によりグラディェント溶出を
行なった。

溶出液中の活性分画を集め、限外炉週により濃縮を行な
った。その後の操作は実施例３と同一である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本願酵素のｐＨ活性曲線を示す。 第２図は本願酵素のｐＨ安定曲線を示す。第３図は本願
酵素の温度活性曲線を示す。第４図は本酵素の温度安定
曲線を示す。第１図第２図 第３図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス属に属し、コレステロール・エス
   テラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養液よりコ
   レステロール・エステラーゼを抽出、精製することより
   なるコレステロール・エステラーゼの製造法。