JPS6339579A

JPS6339579A - リパ−ゼａｍｌの製造法

Info

Publication number: JPS6339579A
Application number: JP18473286A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Yokoe; 横江　正明; Tamio Mase; 民生間瀬
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1986-08-06
Filing date: 1986-08-06
Publication date: 1988-02-20
Anticipated expiration: 2010-10-04
Also published as: JPH0789913B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の目的〕産業上の利用分野本発明はシュードモナス属に屈しリパーゼＡＭＬ生産能
を有する菌株を栄養培地に好気的に培養して培養液中に
アルカリ領域においても界面活性剤、洗剤中で安定で活
性を示すリパーゼＡＭＬを生産せしめることを特徴とす
るリパーゼＡＭＬの製造法に関する。

細菌類を用いたリパーゼの製造法として、シュードモナ
ス属（Ｙ、ＫＯ３Ｌ１ｇｌ＋ジャーナル・オブ・ファー
メンテ−ジョン・テクノロジー（Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎｔ
。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、）　＋　４９巻、　９６８〜９８０頁
（１９７１）　）　、コリネバクテリウム属（Ｋ、Ｗｅ
ａｂｅｒ、アプライド・マイクロバイオロジー（八ｐｐ
１．　Ｍｉｃｒｏｂ、　）　＋　２１巻。

６３９〜６４２頁（１９７１）　）　、スタフィロコッ
カス属（Ｊ、八、Ｔｒｏｌｌｅｒ＋アプライド・マイク
ロバイオロジー　　（Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂ、　）
　　、　２０巻、　　４８０〜４８４頁（１９７０）　
）　、プロピオニオバクテリウム屈（Ａ、Ｏｔｅｒｈｏ
ｌｍ、アプライド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ、
　Ｍｉｃｒｏｂ、　）　　、　　２０巻、１６〜２２頁
＜１９７０）　）　　、アルカリゲネスＩＦＥ　（Ｙ、
Ｋｏｋｕｓｈｏ、　　アグリ力ルチャル・バイオロジカ
ル・ケミストリー（八ｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）　、　４６巻５号、　１１５９〜１１６４
頁（１９８２）　）等に属する菌を利用する方法が知ら
れており、特にシュードモナス属を利用する方法に関し
ては多くの方法が知られている（特公昭４１−７８３６
号、同５６−２８５１６号、同５６−２８５１７号、同
５７−４２３１２号。

同５７−４２３１３号、同５７−５２８３５号、同５７
−５９７５３号）。

一方、洗剤業界では洗剤の洗浄力増強の目的から、洗剤
組成物として酵素剤（プロテアーゼ、アミラーゼ等）を
配合しているが、一般に酵素は陰イオン界面活性剤等の
洗剤組成物に対し安定性が低く、特にリパーゼにおいて
は顕著である（Ｅ、Ｄ。

Ｗｉｌｌｓ、　　バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ。

、＋、　＞　、　６ｏ＠、　５２９頁（１９５５）　〕
。

更に、今日においても、汚こう中の油汚れの除去は困難
とされ、繊維の黄ばみの原因であるトリグリセライドの
除去は重要な課題である。

この様に洗剤組成物の阻害を受けず、洗浄条件下でも十
分にその活性を示すことの出来るリパーゼは、汚こう中
の油脂汚れの除去により、洗浄力を向上される有用な洗
剤組成物となりうる。

従来の技術リパーゼを洗剤組成物として応用し、洗浄力を増強しよ
うとする試みは古（から行われている。

リゾープス屈、キャンディダ屈、アスペルギルス屈、ム
コール屈及びバンクレアスの各リパーゼを検討した例Ｃ
１１，Ａｎｄｒｅｅ、ジャーナル・オブ魁アプライド−
バイオケミストリー（Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｃｍ。

＞　ｌ　２Ｓ、　２１８〜２２９頁（１９８０）　）で
はそれ等のリパーゼが中性及び１１＆アルカリ性でのみ
活性を示すことと、衣料用重質洗剤の主体である陰イオ
ン界面活性剤中で十分な活性を示すことが出来ないこと
から、洗浄力の増強はほとんど望めない。

又、アクロモバクタ−屈、キャンデイダ屈、ムコール属
及びパンクレアスの各リパーゼへの陰イオン界面活性剤
の影響を試験した結果においても、全てのリパーゼが強
くその活性を阻害された〔国生純孝、油化学、第２３巻
、９８〜１０４頁（１９７４）　）。

リパーゼを配合した洗剤による洗浄力試験（Ｔ。

１１ａｓｈｉｍｏｔｏ、　　浦化学、第３５巻、第４号
、６１〜６７頁（１９８６）　）においても報告があり
、キャンデイダ屈、リゾーガス属、シュードモナス属、
ムコール居及びバンクレアスの各リバ・−ゼについて報
告されているが、ｐＨ７での効果に比べｐＨｌ０での効
果が非常に少なく、洗剤存在下アルカリ側で十分その活
性を発揮出来るリパーゼが望まれる。

發只血解火りいとする間買持。

本発明は、洗剤組成物によりその活性がほとんど！訂害
されず１．洗浄条件下でも十分活性を発現し、。

油脂汚れ等を分解除去することで洗浄力を増強出来乙す
パーセを提供するものである。

〔発明の構成〕

問題点を解決するための手段本発明者等は、界面活性剤、洗剤に対し、アルカリ領域
においても安定性が高く、活性を十分発揮するりバーゼ
生産菌を見出すべく広く自然界からリパーゼを産生ずる
微生物を分離し、そのリパーゼの界面活性剤、洗剤に対
する性質を検討したところ、シュードモナス属に属する
階９２４菌がその目的に合う新規なリパーゼを産生ずる
ことを見い出し、本発明者等はこれをリパーゼＡＭＬと
命名した。

このリパーゼＡＭＬ生産９　ｍ　９２４は以下の如き菌
学的性質を有する。

（１）形態（ａｌ細胞の形及び大きさ；桿菌、約０．５μ×１．０
〜２．５　μ 山）多形性の有無：なしくＣ１運動性　　　：あり、極ヘン毛（ｄ）胞子　　　　：なしｔｅ＋グラム染色性：陰性（ｆ１抗酸性　　　：陰性（２）各培地における生育状態（ａｌ肉汁寒天平板培＃：円形、平滑、金縁、扁平状〜やや凸円状、半透明、混光
、無色〜淡黄茶色（ｂ）肉汁寒天斜面培＃、：中程度生育、糸状、扁平、半透明、無色〜淡黄茶色（Ｃ）肉汁液体培養：中程度生育、一様な混濁、沈渣なしくｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンを液化する。

（ｅ）リドマスミルク：わずかにアルカリ性、ペプトン化する。

（３）生理学的性質（ａｔ硝酸塩還元性　　：陽性（ｂ）脱窒反応　　　　：陰性ｔｅｌ　Ｍ　Ｒテスト　　　：陰性ｆｄ）　Ｖ　Ｐテスト　　　：陰性（ｅ）インドールの生成：陰性（ｆ）硫化水素の生成　：陰性（ｇ）デンプンの加水分［：陰性（ｈ）クエン酸塩の利用二にｏｓｅｒの培地とＣｈｒｉ
ｓｔｅｎ−ｓｅｎの培地で陽性。

＋１１無機窒素源の利用：硫酸アンモニウムと硝酸ナト
リウムを利用する。

（Ｊ）色素の生成　：　Ｋｉｎｇ　Ａ培地で色素生成な
し。

Ｋｉｎｇ　Ｂ培地で淡赤茶色の水溶性色素を生成する。

（ｋ）ウレアーゼ　：陰性（１）オキシダーゼ：陽性ｆｍｌカタラーゼ　：陽性＋ｎ）生育の範囲：ｐＨ５〜９で生育する。３７°Ｃで
生育するが４２°Ｃでは生育しない。

（０）酸素に対する態度：好気性ｆｐｌ　Ｏ−Ｆテスト：好気条件下でグルコースから酸
を生成する。

ｆｑ）糖類からの酸及びガスの生成：アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、
フラクトース、ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、
トレハロース、ソルビット、マンニット、イノジット、
グリセリンから酸を生成するが、ガスは生成しない。デ
ンプンからは酸もガスも生成しない。

以上の性質を（Ｂｕｃｈａｎａｎ、　Ｒ，Ｅ、　ａｎｄ
　Ｇｉｂｂｏｎｓ。

Ｎ、Ｅ、　：　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃ−ｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ＋　８ｔｈ、ｅｄ−＋　Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉ
ｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、＋（１９７４）　）、〔坂崎利−訳
：医学細菌同定の手びき（２版）、近代出版、（１９７
４）　）等を参考にして検索すると■グラム陰性、■桿
菌、■好気性、■極ベン毛による運動性、■カタラーゼ
陽性、■オキシダーゼ陽性、■好気的条件下で酸を生成
することからシュードモナス属に分類される。従って本
生産菌株をシュードモナスｓｐ、　Ｎ［Ｌ９２４　　（
Ｐｓｅｕ−ｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　１Ｉｈ９２４　）
と命名した。

本菌株は微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８８７９
号（ＦＥＲＭ−Ｐ隘８Ｂ７９）の受託番号で寄託されて
いる。

本菌株を培養し、リパーゼＡＭＬを生産するに際し使用
する培地として、まず炭素源としては可溶性澱粉等の多
糖類、デキストリン、マルトース等の三糖類、グルコー
ス等の単糖類が上げられ、窒素源としてはコーンステイ
ープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸
、酵母エキス等が上げられる。無機塩及び微量栄養源と
してはリン酸、マグネシウム、カリウム、鉄、カルシウ
ム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン界面活性剤、
消泡剤等の菌の生育やリパーゼＡＭＬの生産を促進する
ものであれば必要に応じて使用出来る。培養は好気的条
件で、培養温度は菌が発育しリパーゼＡＭＬが産生ずる
範囲であれば良く、好ましくは２５〜４０℃である。培
養時間は条件により異なるがリパーゼＡＭＬが最も産生
される時間まで培養すれば良いが通常１〜３日程度であ
る。リパーゼＡＭＬ培養終了後培養液より菌体及び固形
分を分離し、培養ろ液を採取する。

培養ろ液よりリパーゼＡＭＬを得るには通常酵素精製に
用いられるあらゆる方法が使用出来る。

例えばエタノール、アセトン、イソプロピルアルコール
等の有機溶媒による処理、硫安９食塩等による塩析、透
析、限外ろ適法、イオン交換クロマトグラフィー等によ
る各種精製法を行うことが出来る。

次に、こうして得られたリパーゼＡＭＬ部分精製品につ
いて酵素化学的性質について述べる。

（１１各種油脂に対する作用：表２に示す如（各種油脂に良（作用する。

なお各種油脂に対するリパーゼＡＭＬの作用条件は５０
℃、３０分（ｐ）１７．０）である。

（２）脂肪酸メチルエステルに対する作用：表３に示す
如く短鎖ないし長鎖に至る各種の脂肪酸に作用出来る。

なお各種脂肪酸メチルエステルに対するリパーゼＡＭＬ
の作用条件は４０℃、３０分（ｐｌ＋　７．０）である
。

（３）作用ｐＨ：ｐｌ（４〜１２に至る広いｐｉ領領域（図１に示す）作
用出来る。

（４）安定ｐＨの範囲：ｐ１１３〜１２に至る広いｐＨ領域で（図２に示す）安
定である。

（５）主通温度：５０゛Ｃ付近に至Ａ１ｍ５度を有しく図３に示す）７０
°Ｃでも６０％以上の比活性を持つ。

（６）金属塩の影″８Ｊ：Ｆｅ＋によりわずかに阻害される（表１に示す）のみで
ある。なお各種金属塩の濃度は１　ｍＦである。

（７）活性測定法：精製水１　ｍｌ及び酵素液１がを基質のオリーブ油エマ
ルジョン３ゴに加え、温度３７℃で２０分インキュベー
１．２Ｎ硫酸１ｍβを加えて反応を止め、ヘプタン−イ
ソプロパツール混液（１１：　４）　１５ｍｆを加え遊
離した脂肪酸を３０秒間振盪抽出したのち、上層５ｍｅ
を分取し、指示薬としてチモールブルーを用いてＮ　／
　１００アルコール性に○■（により滴定する。活性表
示法は、上記条件下１分間当り１μｍｏｌｅに相当する
脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とし、た。

（８）界面活性剤に対する性質：図４．５に示す如くムコール屈、シュードモナス属リパ
ーゼが陰イオン界面活性剤（０，０５％濃度）に強く阻
害されるのに比ベリパーゼＡＭＬはほとんど影響を受け
ない。

かつ、非イオン界面活性剤により活性が増大する傾向に
あった。

（９）洗剤に対する性質：図６に示す如く、標準使用濃度での各国の洗剤中におい
てリパーゼＡ　Ｍ　Ｌは十分な活性を示す。

（以下余白）表　１：金属塩の彩り（以下余白）表２：リバーゼＡＭＬの各種油脂に対する作用次に本発
明を実施例により説明する。

実施例１可溶性澱粉２％、脱脂大豆粉２％、尿素０．３％、リン
酸二カリウム０．５％及び大豆油１％を含む液体培地５
０ｍ１を５００ｔｎｅ容坂ロフラスコに取り、　１２１
”Ｃ，２０分間滅菌した後、シュードモナスｓｐ、　Ｎ
Ｑ９２４を１白金耳摺種し、３０℃に４８時間、振巾５
　ｃｍ毎分１３０回の往復振盪培養機で培養する。

培養終了後、遠心分離機で培養物中の菌体及び固形分を
除き、４０ｍ１の上澄液を得た。この液のリパーゼ活性
は３８０ｕ／−であった。

この粗リパーゼ液を５℃に冷却し、−１０℃に冷却した
エチルアルコール２００−を徐々に添加し、生じた沈゛
澱をろ別し、減圧下に乾燥して、２６８００ｕ／ｇのリ
パーゼＡＭＬ粉末３４０■を得た。

実施例２酵母エキス０．５％、ポリペプトン１．５％、グルコー
ス１．０％、尿素０．５％、硫酸マグネシウム０．０５
％、塩化カリウム０．０５％及び大豆油１．０％を含む
液体培地２０Ａを３０１容ジャーファーメンタ−に入れ
０．３％のアデカノールＬＧ１２６を添加し、１２１°
Ｃ２２０分間滅菌した後、同培地で培養したシュードモ
ナスｓｐ、　１１ｋＬ９２４の培養液２００＋ｍを接種
し、３０°Ｃで通気量１０β／分、攪拌２５Ｏｒｐｍの
条件下、４８時間通気培養した。

培養後、遠心分離機にて菌体を除去し、更にろ過により
清澄なリパーゼ液１７．！Ｍを得た。このリパーゼ活性
は３５８ｕ／−であった。

このリパーゼ液は限外ろ過膜により３１に濃縮後、５℃
に冷却した。−１０℃に冷却したエチルアルコール９１
を徐々に添加し、生じた沈澱をろ別後、減圧下に乾燥し
て、９８４５０ｕ　／　ｇのリパーゼ粉末３５ｇを得た
。

実施例３コーンステイープリカー３％、酵母エキス０．３％、グ
ルコース　１．０％、尿素０．５％、硫酸マグネシウム
０．０５％、塩化カリウム０．０５％及び大豆油２．０
％を含む液体培地５００１を８００１容培養槽にとり、
０．３％のアデカノールＬＧ１２６を消泡剤として加え
、１２１℃、３０分間滅菌した後、同培地で３０℃、２
４時間培養したシュードモナスｓｐ、　ｔ１ｈ９２４の
培養２βを接種し、３０°Ｃで通気量２００Ｊ／分、攪
拌２４０ｒｐｍの条件下４８時間通気培養した。

培養後、連続遠心機にて菌体を除去し、更にろ過により
清澄なリパーゼ液４５０１を得た。この液のリパーゼ活
性は４１２ｕ／ｍｅであった。

更に限外ろ過膜により５０ｊ２に濃縮ｆ＆　５℃に冷却
した。このリパーゼ濃縮液の活性は３２６５ｕ　／−で
あった。

一１５℃に冷却したエチルアルコール１５０１を徐々に
添加し生じた沈澱をろ別し、冷アセトンで脱水後、減圧
下に乾燥してリパーゼＡＭＬ粉末８５７ｇを得た。この
リパーゼＡＭＬ粉末のリパーゼ活性は１１２０００ｕ　
／　ｇであった。

発明の効果以上の如く本発明で得られるリパーゼＡＭＬは従来のリ
パーゼに比べ界面活性剤、洗剤中でも安定に十分活性を
発揮し、又界面活性剤の種類によってはその活性が増大
する。

これ等の性質を利用すれば洗剤組成物として洗浄力を増
強することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図１、第２図及び第３図は本発明のリパーゼＡＭＬ
の主通ｐＨ曲線、ｐＨ安定曲線及び至適温度曲線をそれ
ぞれ示すものであり、第４図は本発明リパーゼＡＭＬに
及ぼす各種界面活性剤の影響を示す図であり、第５図及
び第６図は、各種リパーゼに及ぼす陰イオン界面活性剤
及び洗剤の影響を示す図である。なお第１図において−
１−は０．ＩＮ塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、−ローは
０．ＩＮ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、−〇−は０．１
−Ｎ！−リス−塩酸緩衝液、−・−はＯ，ｌＮグリシン
−ＮａＯＨ緩衝液をそれぞれ用いた場合の曲線であり、
又第２図において一口〜は酢酸−酢酸ナトリウムｋＮ　
ｆＪｉ液、−０−はトリス−塩酸緩衝液、−〇−はグリ
シン−ＮａＯＨ緩衝液をそれぞれ用いた場合の曲線であ
る。更に第４図においてＡはＡＯ３（α−オレフィンス
ルホン酸ナトリウムの略である。）、ＢはＬＡＳ（直！
１Ｍアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムの略である
。）、ＣはＤＢＳ　（ドデシルベンゼンスルホン酸ナト
リウム、ハート型の略である。）ＤはＳＤＳ　　（ドデ
シル硫酸ナトリウムの略である６）Ｅはポリオキシエチ
レンアルキルフェニルエーテル硫酸ナトリウム、Ｆはタ
ウロコール酸すトリウム、Ｇはラウリルトリメチルアン
モニウムクロライド、Ｈはラウリルヘタイン、■は１゜
リドンＸ　−１００、Ｊばスパン６０、Ｋばポリオキシ
エチレン高級アルコールエーテル、Ｌはポリオキシエチ
レンノニルフェニルエーテルである。史に又第５図にお
いてＡはＡＯ３，Ｉ３はＬＡＳ、ＣはＤＢＳ、ＤはＳＤ
Ｓをそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】１　シュードモナス属に属しリパーゼＡＭＬ生産能を有
する菌株を栄養培地に培養し、リパーゼＡＭＬを培養液
中に畜積せしめ、これを採取することを特徴とするリパ
ーゼＡＭＬの製造方法。２　シュードモナス属に属する菌株がシュードモナスｓ
ｐ．Ｎｏ．９２４菌株である特許請求の範囲第１項記載
のリパーゼＡＭＬの製造法。