JPS6279782A - 耐熱性リパ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、耐熱性リパーゼに関するものである。

（従来の技術） リパーゼは、脂肪を加水分解し、あるいはその逆反応を
行う酵素の総称であり、従来動物臓器。

微生物などから抽出、製造されている。リパーゼの用途
は、医療用（消化剤、臨床検査）、洗剤用。

脂肪酸製造１食品用など多岐にわたり、さまざまの種類
のものが開発されている。

食品におけるリパーゼの利用法としては、フレーバー酵
素と通称されるように、まず、ミルクフレーバーの製造
があげられる。ミルクフレーバーの製造には、パンクレ
アチンリパーゼやオーラルリパーゼ等の動物由来のリパ
ーゼが使われていたが、低級脂肪酸の生成が多いため、
チーズフレーバ一様になり、特に酪酸なども生成するた
め酸敗臭が生じ、好ましくない。そのため、微生物リパ
ーゼの利用がはかられ３例えば、油化学第３１巻。

１０号７４４頁（１９８２年）には、リゾープスデレマ
−（Ｒｈｉｚｏ　ｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ）が上記目的に
最適であったと述べられているが、長時間作用させると
異臭が発生することが記載されている。また。

リゾープス　デレマーもその基質特異性が広く。

加水分解反応の結果、油脂より酢酸、酪酸を遊離するの
で、フレーバー、アロマ−の点よリフレーバー酵素とし
て好ましくない。

一方１食品衛生上の観点から、雑菌汚染の起こらない条
件での食品加工が強く求められるようになってきている
。そのため、雑菌汚染の危険が少ない高温で酵素反応を
行うことが望まれているが。

市販のリパーゼはそのほとんどが熱に対して不安定であ
り、実用的でない。このため、特公昭５３−４５３９４
号公報や特開昭５９−１５６２８２号公報には、耐熱性
リパーゼが提案されている。

（発明が解決しようとする問題点） これら耐熱性リパーゼは、熱に安定であるため。

脂肪酸製造等の工業用用途に関してそのメリットは絶大
であるが、やはり基質特異性が広く、前記したごとく、
低級脂肪酸の生成が多いため、チーズフレーバ一様にな
り、特に酪酸なども生成する性質があるので、フレーバ
ー酵素としては適していなかった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、これらの実状に鑑み、フレーバー酵素し
て滴し２食品衛生上の観点から雑菌汚染の可能性の低い
、高温でも充分酵素活性を示す耐熱性リパーゼを提供す
ることを目的として鋭意研究した結果９石川県小松市井
口町の温泉土壌より分離したサーモマイセス（ハ肛匹肚
９回属に属する微生物に、上記の目的が達成されるリパ
ーゼが存在することを見出し１本発明を完成した。

すなわち１本発明は、トリアセチンまたはトリブチリン
に作用しない基質特異性を有する耐熱性リパーゼである
。

本発明のリパーゼは、極めて熱安定性の高いものであり
２次の理化学的性質を有する。本発明にいう耐熱性リパ
ーゼとは、後記（ｅ）に示す耐熱性試験において、第５
図に示す実質的に活性が低下しないリパーゼをいう。

（１１作用 脂肪を加水分解し、脂肪酸とグリセロールとを遊離する
。

（２）基質特異性 第１表　　天然油脂に対する基質特異性（オリーブ油に
対する活性を１００とした。）第２表　　単酸基ト１坊
ＩＪ　セＩＪ　Ｆに対する基質特異性（トリオレインに
対する活性を１００とした。）この第２表の結果を図に
示すと、第１図になる。この第２表および第１図からみ
て２本発明のリパーゼは、トリアセチンやトリブチリン
にはまった（作用しない顕著な特色を有している。

（３）至適ｐＨおよび安定ｐ　Ｈの範囲ｐＨ７付近に反
応至適ｐ）（を有する（第２図参照。）。ｐＨ７〜８で
安定である（第３図参照。）。

（４）作用最適温度および温度安定性 ６０〜７０℃に最適温度がある（第４図参照、）。

６０℃、１時間の処理ではまったく失活せず（第５図参
照。）、６５℃、１５分の処理で２０％の残存活性を示
す（第６図参照。）。

（５）活性化剤および阻害剤 塩化ナトリウムにより若干の活性化が認められる。塩化
第二水銀および塩化亜鉛により強く阻害を受ける。塩化
マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄によっても
若干の阻害を受ける。

（６）分子量 ＳＤＳ電気泳動法では３５０００であり、セファデック
スＧ−１００を用いたゲル濾過では２５０００であった
。

（７）力価の測定方法 （ａ）　　リパーゼ力価測定法 ポリビニルアルコールを乳化剤として、水に分散させた
オリーブ油乳化液（オリーブ油１０％、ｗ／ｖ）４ｍＣ
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）５　ｍ　ｌ
を含む反応液に適宜希釈した酵素液１ｍｌを加え、４５
℃で２０分反応させた後、エタノールアセトン混液（１
：　１．　ｗ／ｖ）　１０ｍｊ＋を加えて反応を終了さ
せ。

遊離する脂肪酸を０．０５Ｎの水酸化ナトリウムにより
滴定して力価を求めた。１分間に１マイクロ当量の脂肪
酸を遊離させる酵素量をＬ単位とした。

（ｂ）　　作用ｐＨ曲線の測定条件 ｐＨ４〜８は？−７キルバイン（Ｍａｃ　Ｉ　ｌ　ｖａ
　ｉ　ｎ）緩衝液、ｐＨ８〜１１は、０．１Ｍアンモニ
ア緩衝液中で各々４５℃で２０分間反応させて生じた脂
肪酸を前記の水酸化ナトリウム滴定法により測定した。

（Ｃ）　　安定ｐＨ曲線の測定条件 上記ｆｂ）で示したものと同じ緩衝液を用い。

各緩衝液中で４０℃で１時間処理した後、残存する活性
を前記（ａ）の方法に従って測定した。

（ｄｌ　　作用最適温度の測定条件 前記（ａｌで示した測定条件のうち１反応温度を２０℃
〜８０℃まで１０℃きざみに変化させ、他は同様にして
測定した。

［ｅｌ　　熱安定性曲線の測定条件 酵素液を５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で
５０℃および６０℃の各温度で保持し、１０分ごとにサ
ンプリングして残存する活性を前記（ａ）の方法にて測
定した。その結果を第５図に示す。

一方、酵素液を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ８，
０）中で３０．４０，５０．６０゜７０および８０℃で
１５分間保った後、残存する活性を前記（ａ）の方法で
測定した。その結果を第６図に示す。

（８）酵素の精製方法 本発明のリパーゼは９次の方法により単一に精製できる
が、他の方法による精製も可能である。

まず、菌の培養液から濾過により菌体を除き。

得られた濾液に冷アセトンを６０ｖ／ｖ％濃度となるよ
うに加えて、生じる沈澱を回収する。得られた沈澱を２
０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁してＤＥ
ＡＥ−セルロースのカラムに吸着させた後、　　Ｋ（１
！の直線的濃度勾配により溶出を行う。得られた活性面
分（ＫＣＩ！２０〜１００ｍＭ区分）を集めて限界濾過
により濃縮し、セファデックスＧ７５のカラムを用いた
ゲル濾過クロマトグラフィーにより単一なリパーゼ標品
を得る。

本発明のリパーゼを得るには１例えば好熱性カビを培養
し、培養物から採取すればよい。本発明に用いる好まし
い好熱性カビとしては、サーモマイセス属のカビがあげ
られる。その具体的菌体としては、サーモマイセス　ラ
ンギノーサス（Ｔｈｅｒｍｏｍ　ｃｅｓ　１ａｎｕ　１
ｎｏｓｕｓ）　Ｕ　Ｋ　Ｗ　−５１０株（微工研菌寄第
８３１９号）をあげることができる。この菌株は石川県
小松市井口町の温泉土壌から、オリーブ油を基質として
用いた寒天平板法にて分離された新菌株である。この苗
字の菌学的性質を以下に示す。

（１）各培地における生育状態 ■　麦芽汁寒天培地によく生育し、寒天は赤褐色に染ま
る。

■　サブロー寒天培地によく生育する。

■　オートミール寒天培地によく生育し、菌は灰白色を
経て暗緑色となる。胞子形成は旺盛で、寒天培地は黒灰
色となる。

■　ＹｐＳｓ寒天培地によく生育する。気菌糸は隔壁を
有し、１．５〜４μｍの幅である。

分生胞子柄は分岐しておらず、基体菌糸から直角に出て
おり、１０〜１６μｍの長さである。分生胞子は、各分
生胞子柄に１つづつ存在し１分生胞子形成法はアレウロ
型である。分生胞子は９球形であり２表面はイボ状の突
起を有する。

■　バレイジョブドウ糖寒天培地によく生育し、白色か
ら暗緑色となる。アレウロ分生胞子柄は基土菌糸から直
角に出ている。アレウロ分生胞子は、直径５．５〜１０
μｍの球形であり、イボ状の突起を有する。

（２）生理的特徴 ■　最適生育条件 ｐＨ６，５〜８．５．温度４５℃付近、好気性■　生育
の範囲 ｐＨ４，０〜１０．　Ｏ、温度３０〜６０℃、好気性 以上の結果から２本菌株はサーモマイセス　ランキノ−
サス（ユ肛恕亙憇しユ鉦旦旦匹旦）ト同定されるが、脂
肪中の酢酸、酪酸の低級脂肪酸鎖に作用しない特色を持
つ１本発明のリパーゼ生産性を持つ１変種と考えられる
ので、サーモマイセス　ランギノーサスＵＫＷ−５１０
と命名し、昭和６０年６月１９日に通産省工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託した（微工研菌寄第８３１９
号）。

本発明に用いられる菌株を培養するについては。

培養温度を４５℃とすることと、リパーゼ生産を誘導す
るため培養地に脂肪を添加することの他には２通常のカ
ビを培養するのと同様の培地、培養方法を用いればよい
。そのような適当な培地の例としては、オリーブ油０．
５ｗｔ％、　Ｔｗｅｅｎ　８０　０．５ｗｔ％、ペプト
ン０．４ｗｔ％、酵母エキス０．２０ｗｔ％。

Ｋ　ＨＩＰ　０４　０．１０ｗｔ％、ＮａｚＨＰＯａ・
１２ａｑＯ，１０ｗｔ％、　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ＜　・７　
ＨｚＯＯ，０５ｗｔ％をあげることができる。微量元素
として、　Ｍｎ、Ｆｅ＋Ｃａ　＋　Ｃｕ　＋　Ｚ　ｎ　
＋　Ｍ　ｏ　＋　Ｃｏを加えてもよい。また、培養のｐ
Ｈは、４．０〜８．５．温度は４０〜５５℃が適当で、
好気的に約２０〜３０時間培養し、菌体増殖の静止期に
至ると、リパーゼが実質的に培養液中に蓄積されるので
、培養を中止し、濾過、遠心分離などの常法で菌体を除
けば、リパーゼを含有した培養液上澄を得ることができ
る。

このようにして得た酵素液からリパーゼを回収するには
９例えば、限外濾膜で濃縮した後、そのまま乾燥して粗
酵素粉末を得てもよいが、塩析。

有機溶媒沈澱、樹脂による吸着、溶出等、すでに工業的
に広く用いられているさまざまの精製方法を利用するこ
とができる。

（実施例） 次に９本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ オリーブ油０．５ｗｔ％、ペプトン０．４ｗｔ％、酵母
エキス０．２ｗｔ％、　Ｔｗｅｅｎ　８００．５　ｗｔ
％、ＫＨ，Ｐｏ。

０．１ｗｔ％、ＮａｚＨＰＯ４・１２Ｈ２００，１ｗｔ
％。

ＭｇＳ　０４　・７　ＨｚＯ０，０５ｗｔ％を含む培地
（ｐＨ４，５）を５００ｍｊ！三角フラスコに１００ｍ
ｊ！加え、１２１℃で１気圧加圧下１０分間オートクレ
ーブで殺菌した。この培地に同組成の寒天平板に生育し
たサーモマイセス　ランギノーサスＵＫＷ−５１０株（
微工研菌寄第８３１９号）を１白金耳接種し、４５℃で
回転振温培養（高崎製作所製ＲＧＲ−Ｎ１２型）した。

培養２４時間目の培養物のリパーゼ活性を測定した所、
１５単位／　ｍ　１　テあった。

このようにした得たリパーゼは、前記した理化学的性質
を有していた。

実施例２ 実施例１で得た菌体を含む培養物２１を、実施例１と同
様の培地２０１を含む３（ｌ容ジャーファーメンタ−（
丸菱理化製ＭＳＪ−３０Ｕ型）１台に接種し、温度４５
℃２通気ｉ１１　ｖ、ｖ、ｍ、　、攪拌速度２００〜４
００ｒ、ｐ、ｍ、で３０時間培養し、１８．３単位／　
ｍ　Ａの培養濾液１０．７Ａを得た。

この濾液に、最終３０％飽和となるように硫安を加え、
生じた沈澱を遠心分離により除去し、さらに硫安を加え
て７０％飽和として、遠心分離によって上澄液を除去し
た。得られた沈澱物およびペースト状の浮遊物を１１の
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し、冷
アセトン１．２１を加えて生ずる沈澱を集め、２０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した後、同緩衝
液で透析してアセトンを除去した。

得られた粗酵素液をＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン
社ＤＥ・５２）のカラム（１５０ｍＡ。

２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液、ｐＨｓ、ｏで調整）に吸着
させ、ＫＣＩの直線的濃度勾配で溶出させた。

リパーゼ活性は、ＫＣＮ濃度が２０〜１００ｍＭの両分
に溶出した。この活性画分を集めて限外濾過により濃縮
し、セファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過クロマト
グラフィーを行い、活性画分を回収した。

得られたリパーゼ標品は、電気泳動的に単一であり、活
性は、１７５０単位／■、収率１１．２％であった。ま
た、このリパーゼは、前記した理化学的性質を有してい
た。

参考例１ 実施例１で得られた精製リパーゼ標品を用いて乳脂の加
水分解を行った。

すなわち、乳脂３ｇ、蒸溜水１ｍｌからなる反応液に精
製リパーゼ標品１ｍｊ２（３５０単位）を加え、３０℃
、３時間、　　５００ｒ、ｐ、ｍ、で攪拌したところ、
良質のバターフレーバーが発生することが認められた。

さらに反応時間を長くして８時間反応させた後も異臭の
発生は認められず、良好なバターフレーバーが保たれて
いた。

（発明の効果） 本発明の耐熱性リパーゼは、トリアセチンまたはトリブ
チリンに作用しないため、油脂を加水分解させても酢酸
または酪酸が遊離しない。そのため１食品用のフレーバ
ー酵素として用いることができ、また、耐熱性であるた
め、雑菌汚染の可能性の少ない高温域において良好なミ
ルクフレーバーの製造が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の耐熱性リパーゼの基質特異性を、第２
図は至適ｐ）（を、第３図はｐＨ安定性を。 第４図は作用最適温度を、第５図および第６図は耐熱性
を、それぞれ示す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）トリアセチンまたはトリブチリンに作用しない基
   質特異性を有する耐熱性リパーゼ。
2. （２）好熱性カビから産生される特許請求の範囲第１項
   記載のリパーゼ。
3. （３）好熱性カビが、サーモマイセス（￥Ｔｈｅｒｍｏ
   ｍｙｃｅｓ￥）属に属するカビである特許請求の範囲第
   ２項記載のリパーゼ。
4. （４）サーモマイセス属に属するカビが、サーモマイセ
   ス　ランギノーサス（￥Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ￥　￥
   ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ￥）ＵＫＷ−５１０（微工研菌
   寄第８３１９号）である特許請求の範囲第３項記載のリ
   パーゼ。