JP3055041B2 - α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およびその生産菌 - Google Patents
α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およびその生産菌Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はα−マンナンなどのα−
１，２−マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ糖
のα−１，２−マンノシド結合に特異的に作用する新規
な酵素α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およ
びその生産菌に関するものである。
１，２−マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ糖
のα−１，２−マンノシド結合に特異的に作用する新規
な酵素α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およ
びその生産菌に関するものである。
【０００２】α−１，２−マンノシダーゼはαマンナン
のα−１，２−マンノシド結合に特異的に作用すること
から、酵母マンナンをはじめ多くのα−マンナンの構造
決定のための生化学試薬として、或いはヒトの糖代謝の
異常により引起こされる遺伝病で尿中にマンノースを含
むオリゴ糖を排泄するマンノシドーシスの診断或いは治
療のため、更には酵母表層を覆っているマンナン類を改
変してその物性を変化させることで種々の酵母を利用す
る生産技術の発展を図るためなど多くの用途が考えられ
る。
のα−１，２−マンノシド結合に特異的に作用すること
から、酵母マンナンをはじめ多くのα−マンナンの構造
決定のための生化学試薬として、或いはヒトの糖代謝の
異常により引起こされる遺伝病で尿中にマンノースを含
むオリゴ糖を排泄するマンノシドーシスの診断或いは治
療のため、更には酵母表層を覆っているマンナン類を改
変してその物性を変化させることで種々の酵母を利用す
る生産技術の発展を図るためなど多くの用途が考えられ
る。
【０００３】また、加水分解の逆反応（脱水縮合反応）
を利用してα−１，２−マンノシド結合を含む高マンノ
ース型オリコ糖の合成への利用も考えられる。
を利用してα−１，２−マンノシド結合を含む高マンノ
ース型オリコ糖の合成への利用も考えられる。
【０００４】
【従来の技術】微生物から生産されるα−マンナンのα
−１，２−マンノシド結合に作用する酵素α−１，２−
マンノシダーゼとして例えばアスペルギルス属に属する
糸状菌由来のものが知られている（特開昭５７−５４５
８８号公報参照）。
−１，２−マンノシド結合に作用する酵素α−１，２−
マンノシダーゼとして例えばアスペルギルス属に属する
糸状菌由来のものが知られている（特開昭５７−５４５
８８号公報参照）。
【０００５】この従来知られているアスペルギルス属に
属する糸状菌由来の酵素α−１，２−マンノシダーゼは
前記用途に供することが可能で有用であるが、更に酵素
活性が強く、精製も容易である新規なα−１，２−マン
ノシダーゼが求められている。
属する糸状菌由来の酵素α−１，２−マンノシダーゼは
前記用途に供することが可能で有用であるが、更に酵素
活性が強く、精製も容易である新規なα−１，２−マン
ノシダーゼが求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、従来知られている公知のα−１，２マンノ
シダーゼは酵素活性が弱く、培養および精製が容易でな
い、という点である。
する課題は、従来知られている公知のα−１，２マンノ
シダーゼは酵素活性が弱く、培養および精製が容易でな
い、という点である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、前記課題を解
決するためになされたもので、α−マンナンなどのα−
１，２−マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ糖
のα−１，２−マンノシド結合に特異的に作用する新規
な酵素α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およ
びその生産菌を提供するものである。以下に本発明を詳
しく説明する。
決するためになされたもので、α−マンナンなどのα−
１，２−マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ糖
のα−１，２−マンノシド結合に特異的に作用する新規
な酵素α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およ
びその生産菌を提供するものである。以下に本発明を詳
しく説明する。
【０００８】本発明である酵素α−１，２マンノシダー
ゼの生産に用いる微生物は、本酵素の生産能を有するバ
チルス属細菌であればいずれの菌株でもよいが、殊に、
本発明の実施例に用いたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
ｓｐ．Ｍ−９０菌株は本発明者らが酵母マンナン資化性
菌（酵母マンナンを主炭素源とする培地に生育可能で、
培地中の酵母マンナンを分解する菌）の検索によって宮
城県下の土壌から分離した新菌株であり、その菌学的性
質は次の通りである。
ゼの生産に用いる微生物は、本酵素の生産能を有するバ
チルス属細菌であればいずれの菌株でもよいが、殊に、
本発明の実施例に用いたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
ｓｐ．Ｍ−９０菌株は本発明者らが酵母マンナン資化性
菌（酵母マンナンを主炭素源とする培地に生育可能で、
培地中の酵母マンナンを分解する菌）の検索によって宮
城県下の土壌から分離した新菌株であり、その菌学的性
質は次の通りである。
【０００９】（イ）形態学的性質 グラム染色性 ： 陽性 細胞の形状（大きさ） ： 桿菌（長径０．５〜０．
７μｍ×短径０．２〜０．３μｍ） 運動性の有無 ： 有り（周鞭毛） 胞子形成 ： 陽性（芽胞染色および電子顕微鏡に
て確認された）
７μｍ×短径０．２〜０．３μｍ） 運動性の有無 ： 有り（周鞭毛） 胞子形成 ： 陽性（芽胞染色および電子顕微鏡に
て確認された）
【００１０】（ロ）各培地における生育 肉汁寒天平板培養（栄養寒天培地） ［２４時間後］淡黄色、透明できわめて小さい。 ［数日後］淡黄色、透明で、円形、表面は滑らかで薄い
凸状態で培地の表面にだけ生育していた。
凸状態で培地の表面にだけ生育していた。
【００１１】（ハ）生理学的特性 カタラーゼ生産能力 ： 陽性 オキシターゼ生産能力 ： 陰性 酸素に対する態度 ： 好気的
【００１２】（ニ）生育温度 好適生育温度は３０℃前後であり、温度が下がって２５
℃になると生育が遅くなり、温度が上がって３７℃にな
ると生育が困難となった。
℃になると生育が遅くなり、温度が上がって３７℃にな
ると生育が困難となった。
【００１３】このような菌学的性質を有するＭ−９０株
の分類学上の位置を、バージェイズ・マニュアル・オブ
・システマテック・バクテリオロジー（第１版、第２巻
（１９８６年））を参照して検討すると、本菌は運動性
を有する好気性グラム陽性桿菌で芽胞を形成してα−
１，２−マンノシダーゼ生産能を有していることから、
バチルス属の新菌株と判定された。
の分類学上の位置を、バージェイズ・マニュアル・オブ
・システマテック・バクテリオロジー（第１版、第２巻
（１９８６年））を参照して検討すると、本菌は運動性
を有する好気性グラム陽性桿菌で芽胞を形成してα−
１，２−マンノシダーゼ生産能を有していることから、
バチルス属の新菌株と判定された。
【００１４】尚、このＭ−９０株は工業技術院微生物工
業技術研究所に微生物受託番号、微工研菌寄第１２４３
９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４３９）として寄託されてい
る。
業技術研究所に微生物受託番号、微工研菌寄第１２４３
９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２４３９）として寄託されてい
る。
【００１５】本発明の新規なα−１，２−マンノシダー
ゼは、該酵素を生産するバチルス属の細菌を適当な培地
に接種して培養し、培養後の培養物（液体培養の時は培
養液）から菌体を分離除去し（遠心分離、凝集分離、濾
過など）、次いで一般的な酵素の分離精製法（例、「入
門酵素化学」、昭和４８年７月１日、（株）南江堂発行
参照）を適用することによって必要とされる精製度の
酵素標品として採取される。
ゼは、該酵素を生産するバチルス属の細菌を適当な培地
に接種して培養し、培養後の培養物（液体培養の時は培
養液）から菌体を分離除去し（遠心分離、凝集分離、濾
過など）、次いで一般的な酵素の分離精製法（例、「入
門酵素化学」、昭和４８年７月１日、（株）南江堂発行
参照）を適用することによって必要とされる精製度の
酵素標品として採取される。
【００１６】前記バチルス属細菌の培養は、該菌が資化
可能な炭素源（酵母マンナンなど）、窒素源（酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大
豆粕などの有機窒素源；硫安、尿素、硝酸アンモニウム
などの無機窒素源）、無機塩（鉄、マグネシウム、カル
シウム、カリウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩な
ど）などを含む培地中で好気的な培養法（振盪培養、攪
拌培養、通気培養など）によって生育に適した温度で８
時間〜数日間培養することによって培地中に酵素を生産
させることができる。培養に際し、培地に酵母エキスを
添加すると生育が盛んになり、培地単位体積あたりの酵
素活性を上昇させることができる。
可能な炭素源（酵母マンナンなど）、窒素源（酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大
豆粕などの有機窒素源；硫安、尿素、硝酸アンモニウム
などの無機窒素源）、無機塩（鉄、マグネシウム、カル
シウム、カリウムなどの硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩な
ど）などを含む培地中で好気的な培養法（振盪培養、攪
拌培養、通気培養など）によって生育に適した温度で８
時間〜数日間培養することによって培地中に酵素を生産
させることができる。培養に際し、培地に酵母エキスを
添加すると生育が盛んになり、培地単位体積あたりの酵
素活性を上昇させることができる。
【００１７】菌体を分離除去した液体培養後の培養液か
ら、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による
塩析；エタノール、アセトン、イソプロパノール、テト
ラヒドロフラン等の有機溶媒による沈澱法；ヒドロキシ
アパタイト（水酸化リン酸カルシウム）等による吸着ク
ロマトグラフ法；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
基、トリエチルアミノエチル基等の交換基を有する陰イ
オン交換体等によるイオン交換クロマトグラフ法；アフ
ィニティークロマトグラフ法；ゲル濾過クロマトグラフ
法；分子ふるい膜等による限外濾過法；電気泳動法など
公知の酵素精製法によって目的とする精製度の酵素標品
を得ることができる。
ら、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による
塩析；エタノール、アセトン、イソプロパノール、テト
ラヒドロフラン等の有機溶媒による沈澱法；ヒドロキシ
アパタイト（水酸化リン酸カルシウム）等による吸着ク
ロマトグラフ法；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
基、トリエチルアミノエチル基等の交換基を有する陰イ
オン交換体等によるイオン交換クロマトグラフ法；アフ
ィニティークロマトグラフ法；ゲル濾過クロマトグラフ
法；分子ふるい膜等による限外濾過法；電気泳動法など
公知の酵素精製法によって目的とする精製度の酵素標品
を得ることができる。
【００１８】例えば、バチルスｓｐ．Ｍ−９０菌株を酵
母マンナンを主要な炭素源とし、酵母エキスを添加した
培地中、好気的条件下で培養した培養液から菌体を分離
除去し、次いでＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（商品
名；東ソー（株）製）によるイオン交換クロマトグラフ
ィーおよびトヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品名；東ソー
（株）製）によるゲル濾過クロマトグラフィーの各段階
を経て精製し、電気泳動的にほぼ均一な精製酵素標品を
高収率（培養液中の酵素活性の４７％を回収）に得るこ
とができる。
母マンナンを主要な炭素源とし、酵母エキスを添加した
培地中、好気的条件下で培養した培養液から菌体を分離
除去し、次いでＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（商品
名；東ソー（株）製）によるイオン交換クロマトグラフ
ィーおよびトヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品名；東ソー
（株）製）によるゲル濾過クロマトグラフィーの各段階
を経て精製し、電気泳動的にほぼ均一な精製酵素標品を
高収率（培養液中の酵素活性の４７％を回収）に得るこ
とができる。
【００１９】精製の各段階の粗酵素および精製酵素のα
−マンノシダーゼ活性の測定は、酵母マンナンを基質と
して反応を行い、遊離するマンノース測定することによ
って行なった。すなわち、酵母マンナン（終濃度０．１
％）と酵素液を含む反応液（０．４Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．０）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後
マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Ｎ
ｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｉ）法によって測定したＢｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６５８，４５−
５３，（１９８１）参照）。
−マンノシダーゼ活性の測定は、酵母マンナンを基質と
して反応を行い、遊離するマンノース測定することによ
って行なった。すなわち、酵母マンナン（終濃度０．１
％）と酵素液を含む反応液（０．４Ｍリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．０）中、３７℃で１０分間、反応を行い、反応後
マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ（Ｎ
ｅｌｓｏｎ−Ｓｏｍｏｇｉ）法によって測定したＢｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６５８，４５−
５３，（１９８１）参照）。
【００２０】酵素活性の単位は、上記反応において１秒
間に１モルのマンノースを遊離する酵素量を１カタール
（ｋａｔａｌ；以下「ｋａｔ」と略す）とした。
間に１モルのマンノースを遊離する酵素量を１カタール
（ｋａｔａｌ；以下「ｋａｔ」と略す）とした。
【００２１】次に本発明の新規な酵素α−１，２−マン
ノシダーゼの理化学的性質を示す。測定は実施例で得ら
れた精製酵素を用いて行なった。
ノシダーゼの理化学的性質を示す。測定は実施例で得ら
れた精製酵素を用いて行なった。
【００２２】（１）作用 （ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナン
（例えばパン酵母マンナン、清酒酵母マンナン）または
オリゴ糖（例えば前記酵母マンナンの側鎖のオリゴ糖）
を基質とした場合、該糖類の非還元末端位のα−１，２
−マンノシド結合を特異的に加水分解してマンノースを
遊離する。
（例えばパン酵母マンナン、清酒酵母マンナン）または
オリゴ糖（例えば前記酵母マンナンの側鎖のオリゴ糖）
を基質とした場合、該糖類の非還元末端位のα−１，２
−マンノシド結合を特異的に加水分解してマンノースを
遊離する。
【００２３】（ｂ）マンノースを基質とした場合、マン
ノースの脱水縮合によってα−１，２−マンノシド結合
を含むオリゴ糖を生成する。例えば、過剰量（１０％）
のマンノースを基質として３７℃で２４時間反応させる
とα−１，２−マンノビオースの生成が確認された。
ノースの脱水縮合によってα−１，２−マンノシド結合
を含むオリゴ糖を生成する。例えば、過剰量（１０％）
のマンノースを基質として３７℃で２４時間反応させる
とα−１，２−マンノビオースの生成が確認された。
【００２４】（２）基質特異性 （ａ）α−マンナンに対しては、α−１，２−マンノシ
ド結合からなる側鎖を非還元末端から加水分解するが、
非還元末端部位がα−１，３−マンノシド結合である側
鎖またはα−１，６−マンノシド結合からなる主鎖を加
水分解しない。すなわち、最長側鎖としてＭａｎα１→
３Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２Ｍａｎを有するパン酵
母の野生株に由来するマンナンと、そのような側鎖のな
い変異株（Ｘ２１８０−１Ｂ４）由来のマンナンを本酵
素で分解し、その加水分解物を１ Ｈ−ＮＭＲで分析し
たところ、前者を基質とした場合には上記最長側鎖は分
解されなかったが、後者を基質とした場合は側鎖が分解
され、α−１，６−マンノシド結合からなる主鎖だけが
残った。なお、パン酵母（野生株）由来のマンナンを基
質として測定したミハエリス定数Ｋｍは０．０２％で、
最大速度Ｖｍａｘは１５μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇであっ
た。
ド結合からなる側鎖を非還元末端から加水分解するが、
非還元末端部位がα−１，３−マンノシド結合である側
鎖またはα−１，６−マンノシド結合からなる主鎖を加
水分解しない。すなわち、最長側鎖としてＭａｎα１→
３Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２Ｍａｎを有するパン酵
母の野生株に由来するマンナンと、そのような側鎖のな
い変異株（Ｘ２１８０−１Ｂ４）由来のマンナンを本酵
素で分解し、その加水分解物を１ Ｈ−ＮＭＲで分析し
たところ、前者を基質とした場合には上記最長側鎖は分
解されなかったが、後者を基質とした場合は側鎖が分解
され、α−１，６−マンノシド結合からなる主鎖だけが
残った。なお、パン酵母（野生株）由来のマンナンを基
質として測定したミハエリス定数Ｋｍは０．０２％で、
最大速度Ｖｍａｘは１５μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇであっ
た。
【００２５】（ｂ）α−１，２−マンノビオースを加水
分解するが、α−１，３−マンノビオースまたはα−
１，６−マンノビオースには実質的に作用しない。即
ち、図１に示すα−１，２−マンノビオース（Ａ）、α
−１，３−マンノビオース（Ｂ）、α−１，６−マンノ
ビオース（Ｃ）の各基質に本酵素を作用させ、酵素反応
による加水分解物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）によるゲル濾過によって測定した。その測定結果
からα−１，２−マンノビオースのみを分解することが
判る。
分解するが、α−１，３−マンノビオースまたはα−
１，６−マンノビオースには実質的に作用しない。即
ち、図１に示すα−１，２−マンノビオース（Ａ）、α
−１，３−マンノビオース（Ｂ）、α−１，６−マンノ
ビオース（Ｃ）の各基質に本酵素を作用させ、酵素反応
による加水分解物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）によるゲル濾過によって測定した。その測定結果
からα−１，２−マンノビオースのみを分解することが
判る。
【００２６】（ｃ）α−１，２−マンノシド結合のみか
らなるマンノースオリゴ糖を加水分解するが、非還元末
端部位がα−１，３−マンノシド結合であるマンノース
オリゴ糖には実質的に作用しない。
らなるマンノースオリゴ糖を加水分解するが、非還元末
端部位がα−１，３−マンノシド結合であるマンノース
オリゴ糖には実質的に作用しない。
【００２７】すなわち、図２に示すパン酵母マンナンの
側鎖オリゴ糖混合物〔Ｍａｎα１→３Ｍａｎα１→２Ｍ
ａｎα１→２Ｍａｎ（Ｄ）、Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１
→２Ｍａｎ（Ｅ）、Ｍａｎα１→２Ｍａｎ（Ｆ）の混合
物〕に本酵素を作用させて得た加水分解物のＨＰＬＣパ
ターンから、ＥおよびＦのみ分解され、Ｄは分解されな
いことが判る。
側鎖オリゴ糖混合物〔Ｍａｎα１→３Ｍａｎα１→２Ｍ
ａｎα１→２Ｍａｎ（Ｄ）、Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１
→２Ｍａｎ（Ｅ）、Ｍａｎα１→２Ｍａｎ（Ｆ）の混合
物〕に本酵素を作用させて得た加水分解物のＨＰＬＣパ
ターンから、ＥおよびＦのみ分解され、Ｄは分解されな
いことが判る。
【００２８】また、本酵素のマンノテトラオース〔Ｍａ
ｎα１→３Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２Ｍａｎ
（Ｇ）、Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２
Ｍａｎ（Ｈ）〕に対する作用を比較したところ、Ｈを加
水分解してマンノースを遊離するが、Ｇは分解しなかっ
た。
ｎα１→３Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２Ｍａｎ
（Ｇ）、Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２Ｍａｎα１→２
Ｍａｎ（Ｈ）〕に対する作用を比較したところ、Ｈを加
水分解してマンノースを遊離するが、Ｇは分解しなかっ
た。
【００２９】（ｄ）ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マン
ノシドには実質的に作用しない。
ノシドには実質的に作用しない。
【００３０】（ｅ）β−マンノシド結合には作用しな
い。
い。
【００３１】（ｆ）可溶性澱粉を加水分解しない。
【００３２】（ｉ）以上の結果から、本酵素は、非還元
末端部位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に認識
して作用し、非還元末端からα−１，２−マンノシド結
合をｅｘｏ型に加水分解すること、およびα−１，３−
マンノシド結合、α−１，６−マンノシド結合、β−マ
ンノシド結合、グルコシド結合にはいずれも作用しない
ことが判る。
末端部位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に認識
して作用し、非還元末端からα−１，２−マンノシド結
合をｅｘｏ型に加水分解すること、およびα−１，３−
マンノシド結合、α−１，６−マンノシド結合、β−マ
ンノシド結合、グルコシド結合にはいずれも作用しない
ことが判る。
【００３３】（３）至適ｐＨ 本酵素についてブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ
−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用いて３７℃、１
０分間の酵素反応を行い至適ｐＨを調べたところ、図３
に示すようにほぼｐＨ５．５〜７．０、特にｐＨ６．０
付近であった。
−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用いて３７℃、１
０分間の酵素反応を行い至適ｐＨを調べたところ、図３
に示すようにほぼｐＨ５．５〜７．０、特にｐＨ６．０
付近であった。
【００３４】（４）安定ｐＨ範囲 本酵素についてブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ
−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用いて終濃度２０
ｍＭで、４℃、２４時間の処理を行なった後、３７℃、
１０分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を調
べたところ、安定ｐＨ範囲は図４に示すようにｐＨ５．
０〜８．０であった。
−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用いて終濃度２０
ｍＭで、４℃、２４時間の処理を行なった後、３７℃、
１０分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を調
べたところ、安定ｐＨ範囲は図４に示すようにｐＨ５．
０〜８．０であった。
【００３５】（５）至適温度 本酵素について２０〜６０℃の各温度でリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）中、１０分間反応させて至適温度を調べ
たところ、図５に示すように４０〜５０℃、特に４５℃
付近であった。
（ｐＨ７．０）中、１０分間反応させて至適温度を調べ
たところ、図５に示すように４０〜５０℃、特に４５℃
付近であった。
【００３６】（６）安定温度範囲 本酵素について８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
中、０〜５０℃の範囲で１０分間処理した後、３７℃、
１０分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を調
べたところ図６に示すように４０℃で安定であった。
中、０〜５０℃の範囲で１０分間処理した後、３７℃、
１０分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を調
べたところ図６に示すように４０℃で安定であった。
【００３７】（７）阻害および活性化 本酵素について無機イオンおよび阻害剤による影響を、
これらを反応系に添加して３７℃、１０分間の酵素反応
によって調べた。表１に示すようにエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）によって活性が１００％、Ｈｇ２＋に
よって活性が９０％阻害され、Ｃａ２＋によって僅かに
（１０％）活性化される。
これらを反応系に添加して３７℃、１０分間の酵素反応
によって調べた。表１に示すようにエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）によって活性が１００％、Ｈｇ２＋に
よって活性が９０％阻害され、Ｃａ２＋によって僅かに
（１０％）活性化される。
【００３８】
【表１】
【００３９】（８）分子量 本酵素についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ラウリル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法によって分
子量を調べたところ、図７に示すとおり約１９０，００
０ダルトンであり、ゲル濾過法（図８）によって分子量
を調べたところ、約３８０，０００ダルトンであった。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは常法通り、スラブゲルで５％
Ｔ（アクリルアミドと架橋剤の総濃度％（Ｗ／Ｖ））で
行なった。ゲル濾過はＳｈｏｄｅｘ ＷＳ−８０３Ｆ
（昭和電工（株）製）カラムを用いてＨＰＬＣ法で行な
った。
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）法によって分
子量を調べたところ、図７に示すとおり約１９０，００
０ダルトンであり、ゲル濾過法（図８）によって分子量
を調べたところ、約３８０，０００ダルトンであった。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは常法通り、スラブゲルで５％
Ｔ（アクリルアミドと架橋剤の総濃度％（Ｗ／Ｖ））で
行なった。ゲル濾過はＳｈｏｄｅｘ ＷＳ−８０３Ｆ
（昭和電工（株）製）カラムを用いてＨＰＬＣ法で行な
った。
【００４０】なお、図７および図８から明らかなように
実施例で得られた本酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一の
バンドを示し、ゲル濾過で単一のピークを示したことか
ら単一の酵素蛋白として精製されたことが判る。
実施例で得られた本酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一の
バンドを示し、ゲル濾過で単一のピークを示したことか
ら単一の酵素蛋白として精製されたことが判る。
【００４１】（９）等電点 本酵素について等電点（ｐＩ）を等電点電気泳動法によ
って求めたところｐＩは３．６であった。ｐＩの測定
は、水平型泳動装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用し、
０．０４ｍｍポリアクリルアミドゲルで、６ｗ定電力で
泳動させ、ｐＩマーカーと比較することによって行なっ
た。
って求めたところｐＩは３．６であった。ｐＩの測定
は、水平型泳動装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を使用し、
０．０４ｍｍポリアクリルアミドゲルで、６ｗ定電力で
泳動させ、ｐＩマーカーと比較することによって行なっ
た。
【００４２】（１０）アミノ酸分析 本酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製した後、ＰＶＤ
Ｆ膜に転写し、気相シークエンサでＮ−末端のアミノ酸
配列を以下の（１）または（２）に示す通り決定した。
尚、式中、Ｘａａはアミン酸の種類が不明であることを
示す。
Ｆ膜に転写し、気相シークエンサでＮ−末端のアミノ酸
配列を以下の（１）または（２）に示す通り決定した。
尚、式中、Ｘａａはアミン酸の種類が不明であることを
示す。
【００４３】（１） Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ ＸａａＸａａ Ｐｈｅ （２） Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ ＸａａＸａａ Ｉｌｅ
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｙｒ ＸａａＸａａ Ｐｈｅ （２） Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ ＸａａＸａａ Ｉｌｅ
【００４４】（１１）保存安定性 本酵素は、水溶液の状態で４℃において少なくとも３カ
月、凍結乾燥の状態で−２０℃において１年以上安定で
あった。
月、凍結乾燥の状態で−２０℃において１年以上安定で
あった。
【００４５】
【実施例】次に実施例により本発明を更に詳しく説明す
るが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、こ
れに限定されるものではない。
るが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、こ
れに限定されるものではない。
【００４６】パン酵母マンナン２ｇ、硫酸アンモニウム
［（ＮＨ4）2 ＳＯ4］５００ｍｇ、硫酸第二鉄［Ｆｅ2
ＳＯ4］ ２０ｍｇ、硫酸マグネシウム［ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ］ ４００ｍｇ、塩化カルシウム［Ｃａｃｌ2
・２Ｈ2Ｏ］ ６０ｍｇ、酵母エキス １ｇ、第二リ
ン酸カリウム［Ｋ2 ＨＰＯ4］ ７．５４ｇ、第一リン
酸カリウム［ＫＨ2 ＰＯ4］ ２．３２ｇに水を加えて
１Ｌとした液体培地（ｐＨ７．０）８００ｍｌにバチル
スｓｐ．Ｍ−９０菌株（一昼夜培養したもの）を植菌
し、４０時間好気的に培養して得られた培養液を遠心分
離して菌体を除き、上澄液を０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に対して１２時間透析して粗酵素液を得
た。
［（ＮＨ4）2 ＳＯ4］５００ｍｇ、硫酸第二鉄［Ｆｅ2
ＳＯ4］ ２０ｍｇ、硫酸マグネシウム［ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ］ ４００ｍｇ、塩化カルシウム［Ｃａｃｌ2
・２Ｈ2Ｏ］ ６０ｍｇ、酵母エキス １ｇ、第二リ
ン酸カリウム［Ｋ2 ＨＰＯ4］ ７．５４ｇ、第一リン
酸カリウム［ＫＨ2 ＰＯ4］ ２．３２ｇに水を加えて
１Ｌとした液体培地（ｐＨ７．０）８００ｍｌにバチル
スｓｐ．Ｍ−９０菌株（一昼夜培養したもの）を植菌
し、４０時間好気的に培養して得られた培養液を遠心分
離して菌体を除き、上澄液を０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に対して１２時間透析して粗酵素液を得
た。
【００４７】透析後の粗酵素液を０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール
６５０Ｓ（商品名；東ソー（株）製）カラムに吸着さ
せ、０〜０．７ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させ
た（ステップ１）。
液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール
６５０Ｓ（商品名；東ソー（株）製）カラムに吸着さ
せ、０〜０．７ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させ
た（ステップ１）。
【００４８】溶出させた活性画分を集めて、０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行なった
後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化さ
せたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させ、
０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）、１５０ｍｌでカラムを洗浄し、０．１
５〜０．５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた
（ステップ２）。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行なった
後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化さ
せたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させ、
０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）、１５０ｍｌでカラムを洗浄し、０．１
５〜０．５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた
（ステップ２）。
【００４９】溶出させた活性画分を集めて、コロジオン
バックで濃縮した後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化させたトヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品
名；東ソー（株）製）カラムに負荷し、０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で酵素を溶出させる（ステップ
３）。
バックで濃縮した後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化させたトヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品
名；東ソー（株）製）カラムに負荷し、０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で酵素を溶出させる（ステップ
３）。
【００５０】溶出させた活性画分を集めて、０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたハイドロオ
キシアパタイトカラムに吸着させ、０．０１〜０．３Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）濃度での濃度勾配法によ
り酵素を溶出させて精製酵素を得た（ステップ４）。こ
の酵素標品はゲル濾過的およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ的に均
一な酵素蛋白である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたハイドロオ
キシアパタイトカラムに吸着させ、０．０１〜０．３Ｍ
のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）濃度での濃度勾配法によ
り酵素を溶出させて精製酵素を得た（ステップ４）。こ
の酵素標品はゲル濾過的およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ的に均
一な酵素蛋白である。
【００５１】得られた精製酵素についての各精製ステッ
プ毎の酵素活性、蛋白量、収率などを表２に示す。
プ毎の酵素活性、蛋白量、収率などを表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】表２によれば、ステップ３とステップ４と
における比活性に変化がなく、このことから、精製はス
テップ３の段階でほぼ終了していることが判る。また、
ステップ４で酵素が濃縮されたことが判る。
における比活性に変化がなく、このことから、精製はス
テップ３の段階でほぼ終了していることが判る。また、
ステップ４で酵素が濃縮されたことが判る。
【００５４】
【発明の効果】本発明によると、従来知られているアス
ペルギルス属由来の公知の酵素に比べて酵素活性が数十
倍高く、酵母マンナンに対する親和性が高く、保存安定
性の優れた新規なα−１，２−マンノシダーゼを提供す
ることができる。
ペルギルス属由来の公知の酵素に比べて酵素活性が数十
倍高く、酵母マンナンに対する親和性が高く、保存安定
性の優れた新規なα−１，２−マンノシダーゼを提供す
ることができる。
【００５５】また、本酵素はバチルス属の細菌を液体培
養することによって培地中に生産できるので、アスペル
ギルス属の糸状菌を固体培養または液体培養して製造さ
れる公知の酵素より培養および精製が容易である。
養することによって培地中に生産できるので、アスペル
ギルス属の糸状菌を固体培養または液体培養して製造さ
れる公知の酵素より培養および精製が容易である。
【００５６】更に、本酵素は、α−１，２−マンノシド
結合を含有する多糖またはオリゴ糖を加水分解する目的
だけでなく、本酵素の逆合成反応を利用する高マンノー
ス型オリゴ糖の調製についてもその活用が期待される。
結合を含有する多糖またはオリゴ糖を加水分解する目的
だけでなく、本酵素の逆合成反応を利用する高マンノー
ス型オリゴ糖の調製についてもその活用が期待される。
【図１】本発明である酵素のα−１，２−マンノシド結
合を有するマンノビオース（Ａ）、α−１，３−マンノ
シド結合を有するマンノビオース（Ｂ）、α−１，６−
マンノシド結合を有するα−マンノビオース（Ｃ）につ
いての経時的な分解能力を示す高速液体クロマトグラフ
ィによる測定曲線図である。
合を有するマンノビオース（Ａ）、α−１，３−マンノ
シド結合を有するマンノビオース（Ｂ）、α−１，６−
マンノシド結合を有するα−マンノビオース（Ｃ）につ
いての経時的な分解能力を示す高速液体クロマトグラフ
ィによる測定曲線図である。
【図２】本発明である酵素のパン酵母マンナンの側鎖オ
リゴ糖混合物について経時的な分解能力を示す高速液体
クロマトグラフィによる測定曲線図である。
リゴ糖混合物について経時的な分解能力を示す高速液体
クロマトグラフィによる測定曲線図である。
【図３】本発明である酵素の至適ｐＨを示すｐＨ−反応
活性曲線である。
活性曲線である。
【図４】本発明である酵素の安定ｐＨ範囲を示すｐＨ−
残存活性曲線である。
残存活性曲線である。
【図５】本発明である酵素の至適温度を示す温度−反応
活性曲線である。
活性曲線である。
【図６】本発明である酵素の安定温度を示す温度−残存
活性曲線である。
活性曲線である。
【図７】本発明である酵素のラウリル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
における展開写真の写生図である。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
における展開写真の写生図である。
【図８】本発明である酵素のショーデックスＷＳ−８０
３Ｆゲル濾過図である。
３Ｆゲル濾過図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有する新規酵素α
−１，２−マンノシダーゼ； 作用 （ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナン
またはオリゴ糖を基質とした場合、該糖類の非還元末端
位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に加水分解し
てマンノースを遊離する。 （ｂ）マンノースを基質とした場合、マンノースの脱水
縮合によってα−１，２−マンノシド結合を含むオリゴ
糖を生成する。 基質特異性 （ａ）α−マンナンに対しては、α−１，２−マンノシ
ド結合からなる側鎖を非還元末端から加水分解するが、
非還元末端部位がα−１，３−マンノシド結合である側
鎖またはα−１，６−マンノシド結合からなる主鎖を加
水分解しない。 （ｂ）α−１，２−マンノビオースを加水分解するが、
α−１，３−マンノビオースまたはα−１，６−マンノ
ビオースには実質的に作用しない。 （ｃ）α−１，２−マンノシド結合のみからなるマンノ
ースオリゴ糖を加水分解するが、非還元末端部位がα−
１，３−マンノシド結合であるマンノースオリゴ糖には
実質的に作用しない。 （ｄ）ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドには実
質的に作用しない。 （ｅ）β−マンノシド結合には作用しない。 （ｆ）可溶性澱粉を加水分解しない。 至適ｐＨ ５．５〜７．０ - 【請求項２】 バチルス属に属し、α−１，２−マンノ
シダーゼ生産能を有する細菌を培養し、その培養物から
α−１，２−マンノシダーゼを採取することを特徴とす
るα−１，２−マンノシダーゼの製造方法。 - 【請求項３】 α−１，２−マンノシダーゼ生産能を有
するバチルスｓｐ．Ｍ−９０菌株
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25449891A JP3055041B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およびその生産菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25449891A JP3055041B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およびその生産菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564586A JPH0564586A (ja) | 1993-03-19 |
| JP3055041B2 true JP3055041B2 (ja) | 2000-06-19 |
Family
ID=17265892
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25449891A Expired - Fee Related JP3055041B2 (ja) | 1991-09-06 | 1991-09-06 | α−１，２−マンノシダーゼ、その製造方法およびその生産菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3055041B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5591862A (en) * | 1993-06-11 | 1997-01-07 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Tetrazole derivatives, their production and use |
-
1991
- 1991-09-06 JP JP25449891A patent/JP3055041B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0564586A (ja) | 1993-03-19 |
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