JPS63301788A - α−1,3−グルカナーゼの製造方法 - Google Patents
α−1,3−グルカナーゼの製造方法Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、う蝕原性連鎖球菌(Streptococc
usmutans)が産生ずる歯垢などに含まれる1、
3−1゜6−α−D−グルカンのα−1,3−グルコシ
ド結合を特異的に切断分解する酵素であるα−1,3−
グルカナーゼを製造する方法に関する。
usmutans)が産生ずる歯垢などに含まれる1、
3−1゜6−α−D−グルカンのα−1,3−グルコシ
ド結合を特異的に切断分解する酵素であるα−1,3−
グルカナーゼを製造する方法に関する。
とりわけ、バチルス属の細菌或いはその突然変異株、特
にバチルス サーキユランス BC−8菌(Bacil
lus circulans BC−8)或いはその突
然変異株を培養し、該培養物よりα−1,3−グルカナ
ーゼを製造する方法に関する。
にバチルス サーキユランス BC−8菌(Bacil
lus circulans BC−8)或いはその突
然変異株を培養し、該培養物よりα−1,3−グルカナ
ーゼを製造する方法に関する。
(従来の技術)
虫歯の原因となろう蝕原性連鎖球菌
(Streptococcus 5utans)は、該
菌が産生ずる不溶性グルカン(ムタンとも言う)によっ
て、該菌と不溶性グルカンの複合体であるデンタルプラ
ーク(dental plaque )即ち歯垢を形成
して、歯の表面に付着し、該菌が口腔内に存在する蔗糖
を分解して生じる有機酸の作用により、歯牙エナメル質
を溶解することによって虫歯が起こることが判明してい
る。
菌が産生ずる不溶性グルカン(ムタンとも言う)によっ
て、該菌と不溶性グルカンの複合体であるデンタルプラ
ーク(dental plaque )即ち歯垢を形成
して、歯の表面に付着し、該菌が口腔内に存在する蔗糖
を分解して生じる有機酸の作用により、歯牙エナメル質
を溶解することによって虫歯が起こることが判明してい
る。
従って、虫歯を予防するためには、歯垢の主成分である
前記不溶性グルカンを分解して、前記苗の歯への付着を
阻止すればよいことが提案されている。
前記不溶性グルカンを分解して、前記苗の歯への付着を
阻止すればよいことが提案されている。
さらに、この不溶性グルカンは、1.3−1.6−α−
D−グルカン及び1,6−α−D−グルカンよりなって
おり、これらを分解するにはそれぞれ、α−1,3−グ
ルコシド結合を特異的に切断分解する酵素であるα−1
,3−グルカナーゼ〔正式名は1,3−(1,3: 1
,4 )−α−D−グルカン3−グルカノハイドロラー
ゼ(EC3,2,1,59) 、単にグルカナーゼ或い
はムタナーゼともいう)と、α−1,6−グルコシド結
合を特異的に切断分解する酵素であるα−1,6−グル
カナーゼ(単にデキストラナーゼともいう)の単独或い
は両酵素の共同作用が有効であることが判明している。
D−グルカン及び1,6−α−D−グルカンよりなって
おり、これらを分解するにはそれぞれ、α−1,3−グ
ルコシド結合を特異的に切断分解する酵素であるα−1
,3−グルカナーゼ〔正式名は1,3−(1,3: 1
,4 )−α−D−グルカン3−グルカノハイドロラー
ゼ(EC3,2,1,59) 、単にグルカナーゼ或い
はムタナーゼともいう)と、α−1,6−グルコシド結
合を特異的に切断分解する酵素であるα−1,6−グル
カナーゼ(単にデキストラナーゼともいう)の単独或い
は両酵素の共同作用が有効であることが判明している。
(発明が解決しようとする問題点)
従来よりα−1,3−グルカナーゼの産生菌株の報告は
いくつかなされている。例えば、トリコデルマ(Tri
choder翔a)属〔例えばトリコデルマ ハリジア
ヌムTrichoderma harzianum
CB−5243,71(FERM−P−1161> )
に属する糸状菌、ストレプトミセス(S trep t
otrryces )属に属する放線菌、フラボバクテ
リウム属 (Flavobactertum) (例えばフラボ
バクテリウムII!に−01(微工研菌寄第2506号
)〕、シュドモナス(Pseudomonas )属(
例えば1シュドモナス5K−01(漱工研菌寄第427
3号)〕に属する細菌などがそれである。
いくつかなされている。例えば、トリコデルマ(Tri
choder翔a)属〔例えばトリコデルマ ハリジア
ヌムTrichoderma harzianum
CB−5243,71(FERM−P−1161> )
に属する糸状菌、ストレプトミセス(S trep t
otrryces )属に属する放線菌、フラボバクテ
リウム属 (Flavobactertum) (例えばフラボ
バクテリウムII!に−01(微工研菌寄第2506号
)〕、シュドモナス(Pseudomonas )属(
例えば1シュドモナス5K−01(漱工研菌寄第427
3号)〕に属する細菌などがそれである。
尚、バチルス属に属する細菌(例えば、Bacillu
s circulansFERM−P−4765)がα
−1,6−及びα−1,3−グルコシド結合を分解する
新規酵素を産生ずることについても報告されている(特
開昭55−88693号参照)が、その新規酵素が報告
通りであれば、本発明のα−1,3−グルカナーゼとは
基質特異性の点で相違しており別個の酵素であると考え
られる。
s circulansFERM−P−4765)がα
−1,6−及びα−1,3−グルコシド結合を分解する
新規酵素を産生ずることについても報告されている(特
開昭55−88693号参照)が、その新規酵素が報告
通りであれば、本発明のα−1,3−グルカナーゼとは
基質特異性の点で相違しており別個の酵素であると考え
られる。
バチルス属の細菌は従来より食品の加工等に広く利用さ
れており、人体への病原性や毒素産生性がないこと、さ
らに有用酵素の生産などで工業的にもよく利用されてお
り、その大量培養法に関する知見は広(集積されている
。一方バチルス属の細菌は形質転換が容易なことから遺
伝学的、生化学的知見も大腸菌についで集積されている
。
れており、人体への病原性や毒素産生性がないこと、さ
らに有用酵素の生産などで工業的にもよく利用されてお
り、その大量培養法に関する知見は広(集積されている
。一方バチルス属の細菌は形質転換が容易なことから遺
伝学的、生化学的知見も大腸菌についで集積されている
。
従って、バチルス属の細菌を用いて、口腔内の歯垢を分
解するα−1,3−グルカナーゼを産生させることがで
きれば好都合である。従来バチルス属の細菌を用いてα
−1,3−グルカナーゼを工業的生産に供し得る製造方
法を開′示しているものはなかったわけで、本発明の解
決しようとする問題点はここにある。
解するα−1,3−グルカナーゼを産生させることがで
きれば好都合である。従来バチルス属の細菌を用いてα
−1,3−グルカナーゼを工業的生産に供し得る製造方
法を開′示しているものはなかったわけで、本発明の解
決しようとする問題点はここにある。
(問題点を解決するための手段)
本発明のα−1,3−グルカナーゼの製造方法の要旨と
するところは、不溶性グルカンなどに含まれるα−1,
3−グルコシド結合を特異的に切断分解する酵素である
α−1,3−グルカナーゼを産生ずるバチルス属に属す
る細菌或いはその突然変異株を、培養培地に接種して所
定の培養条件下で培養した後、該培養物を遠心分離して
、菌体を分離除去し、α−1,3−グルカナーゼを採取
するようにしたことである。
するところは、不溶性グルカンなどに含まれるα−1,
3−グルコシド結合を特異的に切断分解する酵素である
α−1,3−グルカナーゼを産生ずるバチルス属に属す
る細菌或いはその突然変異株を、培養培地に接種して所
定の培養条件下で培養した後、該培養物を遠心分離して
、菌体を分離除去し、α−1,3−グルカナーゼを採取
するようにしたことである。
まず、本発明者は、不溶性グルカンを炭素源として分解
利用する微生物を検索した結果、バチルス(Bactl
lus)属に属する細菌の中で、とりわけバチルス サ
ーキュランスBC−8菌(Bacillus circ
ulans BC−8(微工研条寄第733号)(FE
RM BP−733)(以下BC−8菌と言う)が、強
力にα−1,3−グルカナーゼを産生ずることを見出し
た。このBC−8菌を用いた本発明のα−1,3−グル
カナーゼを製造する方法について、以下により詳細に説
明する。
利用する微生物を検索した結果、バチルス(Bactl
lus)属に属する細菌の中で、とりわけバチルス サ
ーキュランスBC−8菌(Bacillus circ
ulans BC−8(微工研条寄第733号)(FE
RM BP−733)(以下BC−8菌と言う)が、強
力にα−1,3−グルカナーゼを産生ずることを見出し
た。このBC−8菌を用いた本発明のα−1,3−グル
カナーゼを製造する方法について、以下により詳細に説
明する。
まず、本発明の方法に利用する前記BC−8菌は下記の
通りの菌学的性状を有するものであることが判明してい
る。
通りの菌学的性状を有するものであることが判明してい
る。
(BC−8の ・
+1) 細胞
グラム陽性桿菌、大きさ0.5 Xl、3〜2.6μm
、運動性なし、胞子(endospore)を形成。
、運動性なし、胞子(endospore)を形成。
胞子は長楕円形で、端に片寄って存在、好気的に増殖。
(2)コロニーの性状
ペプトン・イーストエキス寒天上で、円形で平滑な淡黄
白色集落を形成する。
白色集落を形成する。
(3)化学的性質
・カタラーゼ(Catalase) : (+ )
・オキシダーゼ(Oxidase) :弱(+)・ホ
ーケス−ブロスカラエル (Voges−Proskauel)試験:(−)・イ
ンドール(Indole)産生:(−)・グリセリンか
らジヒドロキシアセトン(Dihydroxyacet
one)産生:(−)・硝酸還元:(−) ・カゼイン加水分解=(−) ・澱粉加水分解=(+) ・チロシン(7yrosine)加水分解:(−)・ゼ
ラチン加水分解:(−) ・0.001%リゾチーム(Lysozy+we)を含
む液体培地での増殖:(−) ・NaC1を含む培地での増殖: 5%NaC1で(+
)7%NaC1で(−) ・ブドウ糖、乳糖、マンニット(Mannitol)ト
レハローズ(Trehalose )から酸を産生ずる
が、ガスは発生しない。
・オキシダーゼ(Oxidase) :弱(+)・ホ
ーケス−ブロスカラエル (Voges−Proskauel)試験:(−)・イ
ンドール(Indole)産生:(−)・グリセリンか
らジヒドロキシアセトン(Dihydroxyacet
one)産生:(−)・硝酸還元:(−) ・カゼイン加水分解=(−) ・澱粉加水分解=(+) ・チロシン(7yrosine)加水分解:(−)・ゼ
ラチン加水分解:(−) ・0.001%リゾチーム(Lysozy+we)を含
む液体培地での増殖:(−) ・NaC1を含む培地での増殖: 5%NaC1で(+
)7%NaC1で(−) ・ブドウ糖、乳糖、マンニット(Mannitol)ト
レハローズ(Trehalose )から酸を産生ずる
が、ガスは発生しない。
・アラビノーズ(Arabinose ) 、果糖、マ
ンノーズ(Mannose ) 、キジローズ(Xy
1ose)からは酸もガスも発生しない。
ンノーズ(Mannose ) 、キジローズ(Xy
1ose)からは酸もガスも発生しない。
・増殖温度:17℃〜37℃で増殖するが、10℃及び
45℃では増殖は認められな い。
45℃では増殖は認められな い。
・ビタミン:ビオチン要求性あり。
・DNAのG+C含有量: 49.5 mo1%上記し
た諸性質によって、BC−8菌は好気性有芽胞桿菌バチ
ルス(Bacillus)属に属し、分類上バチルス
サーキュランス ジヨルダン(Bacillus ci
rculans Jordan )と分類されると判明
した。
た諸性質によって、BC−8菌は好気性有芽胞桿菌バチ
ルス(Bacillus)属に属し、分類上バチルス
サーキュランス ジヨルダン(Bacillus ci
rculans Jordan )と分類されると判明
した。
1、観」回■豊墨
(a) BC−8菌培養のための培地α−1,3−グ
ルカナーゼを製造するためには、まず上記BC−8菌を
天然、または人工培地に接種して培養するが、工業的生
産には液体培地で通気攪拌培養法によって実施するのが
、コスト、収率の上からも有利である。
ルカナーゼを製造するためには、まず上記BC−8菌を
天然、または人工培地に接種して培養するが、工業的生
産には液体培地で通気攪拌培養法によって実施するのが
、コスト、収率の上からも有利である。
培地の栄養源としては、微生物一般に用いられるものが
使用される0例えば、炭素源として、う蝕原性連鎖球菌
が産生ずる不溶性グルカンが最も有効で、窒素源として
は、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペプトン
、酵母エキス等が用いられる。無機塩としては、リン酸
、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等
の塩類が用いられる。
使用される0例えば、炭素源として、う蝕原性連鎖球菌
が産生ずる不溶性グルカンが最も有効で、窒素源として
は、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペプトン
、酵母エキス等が用いられる。無機塩としては、リン酸
、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等
の塩類が用いられる。
特に、不溶性グルカン(後記不溶性グルカンの調製例を
参照)を培地中に、培養基質及び酵素産生誘導物質とし
て0.1%(W/V)以上、粉砕、懸濁状態で添加する
ことによって、α−1,3−グルカナーゼを高収率で得
ることができる。
参照)を培地中に、培養基質及び酵素産生誘導物質とし
て0.1%(W/V)以上、粉砕、懸濁状態で添加する
ことによって、α−1,3−グルカナーゼを高収率で得
ることができる。
(b) BC−8菌の培養
上記(a)項にて調製した培地に、BC−8菌を接種し
、所定の培養温度、好ましくは30℃〜37℃で、培養
基のpnを6〜7で、α−1,3−グルカナーゼが培養
液中で最も高い活性を示すまで、所定の培養時間(培養
条件によって異なるが、通常通気攪拌培養では、1〜3
日)培養する。
、所定の培養温度、好ましくは30℃〜37℃で、培養
基のpnを6〜7で、α−1,3−グルカナーゼが培養
液中で最も高い活性を示すまで、所定の培養時間(培養
条件によって異なるが、通常通気攪拌培養では、1〜3
日)培養する。
2、戸 からα−1,3−グルカナーゼのこのように
して、充分にα−1,3−グルカナーゼが産生された培
養物から、遠心分離によって菌体を取り除けば、粗酵素
液が得られる。
して、充分にα−1,3−グルカナーゼが産生された培
養物から、遠心分離によって菌体を取り除けば、粗酵素
液が得られる。
また、前記培地中に予め不溶性グルカンを培養基質とし
て添加した場合には、培養終了時に若干の不溶物が残存
し、これにα−1,3−グルカナーゼが吸着されてしま
うため、予め培養前に、無菌濾過した適当量のデキスト
ラナーゼを加えるか、或いは培養後に、培養液にデキス
トラナーゼを加えて、不溶物を分解した後、遠心分離に
かけて粗酵素液を調製する。
て添加した場合には、培養終了時に若干の不溶物が残存
し、これにα−1,3−グルカナーゼが吸着されてしま
うため、予め培養前に、無菌濾過した適当量のデキスト
ラナーゼを加えるか、或いは培養後に、培養液にデキス
トラナーゼを加えて、不溶物を分解した後、遠心分離に
かけて粗酵素液を調製する。
さらに、水可溶性低分子グルカン溶液(後記水可溶性低
分子グルカン溶液の調製例を参照)で、培養液中に沈殿
した前記不溶物(沈殿)を洗い、吸着したα−1,3−
グルカナーゼを溶出させて、その後遠心分離にかけて粗
酵素液を調製する方法も有効である。
分子グルカン溶液の調製例を参照)で、培養液中に沈殿
した前記不溶物(沈殿)を洗い、吸着したα−1,3−
グルカナーゼを溶出させて、その後遠心分離にかけて粗
酵素液を調製する方法も有効である。
このように、デキストラナーゼ処理、水可溶性低分子グ
ルカン処理の両者を適宜組み合わせて、調製することに
よって、α−1,3−グルカナーゼの採取の収率を上げ
ることが可能である。
ルカン処理の両者を適宜組み合わせて、調製することに
よって、α−1,3−グルカナーゼの採取の収率を上げ
ることが可能である。
前述のようにして得られた粗酵素液は、そのままでも製
品として充分に使用可能であるが、さらに該酵素液を公
知の分離精製方法、例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧t
HW法、硫安等による塩析法、エタノール等による溶媒
分画法、等電点沈殿法、カラムクロマト分画性などを、
単独或いは適宜組み合わせることによって精製酵素液を
採取することが可能である。
品として充分に使用可能であるが、さらに該酵素液を公
知の分離精製方法、例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧t
HW法、硫安等による塩析法、エタノール等による溶媒
分画法、等電点沈殿法、カラムクロマト分画性などを、
単独或いは適宜組み合わせることによって精製酵素液を
採取することが可能である。
゛ グルカンの81
トフドヘビットブロス(Todd Hewitt Br
oth)〔ディフコ(Difco )社製〕3%を含む
液体培地に、う蝕原性連鎖球菌(Streptococ
cusaeutans) OMZ−176株を接種し、
37℃にて24時間静置培養する。得られた培養液から
、遠心分離によって、菌体を除去した後、50%飽和の
硫安塩析を実施し、生じた不溶物を遠心分離にかけて沈
殿物として集める。これを50−一クエン酸緩衝液(p
H6,5)に溶解し、同緩衝液にて透析して、これを不
溶性グルカン合成酵素液とした。
oth)〔ディフコ(Difco )社製〕3%を含む
液体培地に、う蝕原性連鎖球菌(Streptococ
cusaeutans) OMZ−176株を接種し、
37℃にて24時間静置培養する。得られた培養液から
、遠心分離によって、菌体を除去した後、50%飽和の
硫安塩析を実施し、生じた不溶物を遠心分離にかけて沈
殿物として集める。これを50−一クエン酸緩衝液(p
H6,5)に溶解し、同緩衝液にて透析して、これを不
溶性グルカン合成酵素液とした。
透析終了後、この酵素液に基質として、10%の蔗糖を
含有する50 mMクエン酸緩衝液(pH6,5)を加
えて、37℃で24〜48時間反応させて、不溶性グル
カンを合成した。遠心分離によって不溶性グルカンを集
め、蒸留水にて洗浄し、次いでエタノール、アセトンで
洗浄した後、100℃以下で加熱通風乾燥して不溶性グ
ルカンを調製した。
含有する50 mMクエン酸緩衝液(pH6,5)を加
えて、37℃で24〜48時間反応させて、不溶性グル
カンを合成した。遠心分離によって不溶性グルカンを集
め、蒸留水にて洗浄し、次いでエタノール、アセトンで
洗浄した後、100℃以下で加熱通風乾燥して不溶性グ
ルカンを調製した。
口″ グルカンのζ1
前述の不溶性グルカンの調製例と同様にして調製したう
蝕原性連鎖球菌の不溶性グルカン合成酵素液を、透析チ
ューブにいれ、透析外液に10%の蔗糖を含む50 m
Mのクエン酸緩衝液(pH6,5)を用いて、37℃で
24〜48時間、攪拌しながら低分子グルカンの合成と
透析とを同時に行った。
蝕原性連鎖球菌の不溶性グルカン合成酵素液を、透析チ
ューブにいれ、透析外液に10%の蔗糖を含む50 m
Mのクエン酸緩衝液(pH6,5)を用いて、37℃で
24〜48時間、攪拌しながら低分子グルカンの合成と
透析とを同時に行った。
この透析終了後の透析外液には、水可溶性低分子グルカ
ンが含まれているので、そのままでも前述のα−1,3
−グルカナーゼの採取に用いることが可能であるが、必
要な場合には、透析外液に66%(V/V)となるよう
にエタノールを加え、遠心分離によって沈殿物を集めて
、エタノール、アセトンで洗浄した後、100℃以下で
加熱通風乾燥すれば、より良質の水可溶性低分子グルカ
ンを分取することができる。
ンが含まれているので、そのままでも前述のα−1,3
−グルカナーゼの採取に用いることが可能であるが、必
要な場合には、透析外液に66%(V/V)となるよう
にエタノールを加え、遠心分離によって沈殿物を集めて
、エタノール、アセトンで洗浄した後、100℃以下で
加熱通風乾燥すれば、より良質の水可溶性低分子グルカ
ンを分取することができる。
B、BC−8いて′ ゛れたα−13−グルカーゼの
本発明の製造方法によって得られるBC−8菌のα−1
,3−グルカナーゼは、下記の通りの理化学的性質を有
する。
,3−グルカナーゼは、下記の通りの理化学的性質を有
する。
(1) 作用及び基質特異性
α−1,3−グルコシド結合を有する多糖基質を、エン
ドタイプに加水分解する性質を有し、特にう蝕原性連鎖
球菌の産生ずる不溶性グルカンをよく分解する。
ドタイプに加水分解する性質を有し、特にう蝕原性連鎖
球菌の産生ずる不溶性グルカンをよく分解する。
(a) 高分子基質に対する作用
表Iに示した各種基質0.5 mg、0.2MMB5緩
衝液(2−(N−モルフォリノ)エタンスルフォネート
、pH6,5)或いは50 mMリン酸ナナトリウム緩
衝液pH7,0) 、BC−8菌のα−1,3−グルカ
ナーゼ溶液10μlを含む反応液100μlを37℃、
1時間インキエベートし、生成した還元糖をソモギーネ
ルソン(Sosogyi Ne1son)法で比色定置
した。
衝液(2−(N−モルフォリノ)エタンスルフォネート
、pH6,5)或いは50 mMリン酸ナナトリウム緩
衝液pH7,0) 、BC−8菌のα−1,3−グルカ
ナーゼ溶液10μlを含む反応液100μlを37℃、
1時間インキエベートし、生成した還元糖をソモギーネ
ルソン(Sosogyi Ne1son)法で比色定置
した。
その結果、表■に示したように、α−1,3−グルコシ
ド結合を有する1、3−α−D−グルカン、1.3−1
.6−α−D−グルカンには非常によく作用する。しか
しながら、他のα−1,6−グルコシド結合を含む基質
にはほとんど作用せず、またニゲラン〔ニゲロース(N
igerose)単位でα−1,3−グルコシド結合が
含まれている〕にもほとんど作用しなかった。
ド結合を有する1、3−α−D−グルカン、1.3−1
.6−α−D−グルカンには非常によく作用する。しか
しながら、他のα−1,6−グルコシド結合を含む基質
にはほとんど作用せず、またニゲラン〔ニゲロース(N
igerose)単位でα−1,3−グルコシド結合が
含まれている〕にもほとんど作用しなかった。
これは、α−1,3−グルコシド結合部分しかも連続的
にα−1,3−グルコシド結合が並んだようなグルカン
のα−1,3−グルコシド結合部分に対して特異的に作
用することを示している。
にα−1,3−グルコシド結合が並んだようなグルカン
のα−1,3−グルコシド結合部分に対して特異的に作
用することを示している。
(bl 低分子基質に対する作用
表■に示した各種基質0.2 tag、50 mMME
S緩衝液(pH6,5) 、BC−8菌のα−1,3−
グルカナーゼ溶液10μEを含む反応液50μlを37
℃、15時間インキエベートし、その後5分間無溝して
酵素反応を停止し、遠心分離にかけ、遠心上清を、シリ
カゲル(Silicagel 70 FMプレート、和
光純薬社製)又はセルロース()IPTLC−cell
uloseプレート、Merck社製)の薄層にスポッ
トした。シリカゲル薄層の場合は、n−プロパツール(
n−propanol) sエチルアセテート(eth
ylacetate) 、水(6:1:3)で、セルロ
ース薄層の場合には、エチルアセテ−、ト、酢酸、水(
3:2:2)で展開し、ジフェニルアミン−アニリン(
diphenylaw+1ne−aniline)試薬
を用いて分離された糖を検出した。
S緩衝液(pH6,5) 、BC−8菌のα−1,3−
グルカナーゼ溶液10μEを含む反応液50μlを37
℃、15時間インキエベートし、その後5分間無溝して
酵素反応を停止し、遠心分離にかけ、遠心上清を、シリ
カゲル(Silicagel 70 FMプレート、和
光純薬社製)又はセルロース()IPTLC−cell
uloseプレート、Merck社製)の薄層にスポッ
トした。シリカゲル薄層の場合は、n−プロパツール(
n−propanol) sエチルアセテート(eth
ylacetate) 、水(6:1:3)で、セルロ
ース薄層の場合には、エチルアセテ−、ト、酢酸、水(
3:2:2)で展開し、ジフェニルアミン−アニリン(
diphenylaw+1ne−aniline)試薬
を用いて分離された糖を検出した。
その結果、表■に示したように、ニゲ
ロース、イソマルトース、イソマルトヘプタオースを全
く分解しない、これは、デキストラナーゼ活性を全く有
しないことを示している。
く分解しない、これは、デキストラナーゼ活性を全く有
しないことを示している。
(2) 至適pH及び安定pH
第1図は、BC−8菌のα−1,3−グルカナーゼの各
pHにおける活性を示すグラフで、pH7,0の燐酸緩
衝液を用いた時のグルカナーゼ活性を100%として、
各pHでの相対的活性値を比較したものである0作用p
Hは、第1図のような曲線として得られ、p)14.0
〜9.0の広範囲にわたってその活性が認められる。特
に、pH5,0付近において最大の活性を示す。
pHにおける活性を示すグラフで、pH7,0の燐酸緩
衝液を用いた時のグルカナーゼ活性を100%として、
各pHでの相対的活性値を比較したものである0作用p
Hは、第1図のような曲線として得られ、p)14.0
〜9.0の広範囲にわたってその活性が認められる。特
に、pH5,0付近において最大の活性を示す。
第2図は、BC−8菌のα−1,3−グルカナーゼの各
pHにおける安定性を示すグラフで、α−1,3−グル
カナーゼを各pHにおいて、40℃で5時間放置した後
、残存活性を測定(pit 7.0の燐酸緩衝液を用い
て時間を置かなかったものを100%とした)したもの
である、pH安定性は、第2図に示したように、pH6
,0〜10.0にわたる広範囲において安定であり、特
にP117.0〜9.0において非常に安定である。
pHにおける安定性を示すグラフで、α−1,3−グル
カナーゼを各pHにおいて、40℃で5時間放置した後
、残存活性を測定(pit 7.0の燐酸緩衝液を用い
て時間を置かなかったものを100%とした)したもの
である、pH安定性は、第2図に示したように、pH6
,0〜10.0にわたる広範囲において安定であり、特
にP117.0〜9.0において非常に安定である。
(3) 至適温度及び安定温度
作用至適温度は、第3図に示したように、45℃〜50
℃である。
℃である。
第4図は、各温度におけるBC−8菌のα−1,3−グ
ルカナーゼの安定性を示すグラフで、α−1,3−グル
カナーゼを各温度に5時間保った後、残存活性を測定(
pH7,0の燐酸緩衝液にて時間を置かなかったものの
活性を100%とした)したものである、第4図に示し
たように40℃以下の温度において安定である。
ルカナーゼの安定性を示すグラフで、α−1,3−グル
カナーゼを各温度に5時間保った後、残存活性を測定(
pH7,0の燐酸緩衝液にて時間を置かなかったものの
活性を100%とした)したものである、第4図に示し
たように40℃以下の温度において安定である。
(4)金属塩、酵素阻害剤の影響
Fe ”、pb”、Hg g *、Agt*によって阻
害を受け、特にHg z +、Ag z *は著しい阻
害を示す。またpCMB (p−クロロ安息香酸第二水
銀)も著しい阻害を示す。
害を受け、特にHg z +、Ag z *は著しい阻
害を示す。またpCMB (p−クロロ安息香酸第二水
銀)も著しい阻害を示す。
(5) フェノール硫酸法を用いるα−1,3−グル
カナーゼの活性測定法 通常、6 mg/+wlの1.3−α−D−グルカン(
表■脚注参照)(50mM燐酸緩衝液。
カナーゼの活性測定法 通常、6 mg/+wlの1.3−α−D−グルカン(
表■脚注参照)(50mM燐酸緩衝液。
pH7,0)懸濁液0.2+11に、0.1 mlのα
−1,3−グルカナーゼ溶液を加えて、40℃で16時
間反応を行い、エタノール(最終濃度60%)で反応を
停止した後、可溶性となった糖をフェノール硫酸法で定
量した。
−1,3−グルカナーゼ溶液を加えて、40℃で16時
間反応を行い、エタノール(最終濃度60%)で反応を
停止した後、可溶性となった糖をフェノール硫酸法で定
量した。
上記反応条件において、100 nmo+のブドウ糖に
相当する60%エタノール可溶性の糖を生成する酵素量
を1単位とした。実際的には、各種濃度のα−1,3−
グルカナーゼを用いて、標準曲線を作成して、それによ
って酵素活性値を読み取った。
相当する60%エタノール可溶性の糖を生成する酵素量
を1単位とした。実際的には、各種濃度のα−1,3−
グルカナーゼを用いて、標準曲線を作成して、それによ
って酵素活性値を読み取った。
(6)分子量
本酵素の分子量は、第5図に示したように、5DS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によって、180,0
00と決定された。
リアクリルアミドゲル電気泳動法によって、180,0
00と決定された。
本発明者は、上述のようにBC−8菌から初期の目的で
あるα−1,3−グルカナーゼを製造することができた
が、より効率良くα−1,3−グルカナーゼを製造する
ために、誘導基質(inducer)を培地中に加えな
ければならないBC−8菌の代わりに、炭素源として一
般に用いられるブドウ糖を加えるだけで、α−1,3−
グルカナーゼを構成的(constitutive)に
産生ずる突然変異株を利用できれば好都合である。
あるα−1,3−グルカナーゼを製造することができた
が、より効率良くα−1,3−グルカナーゼを製造する
ために、誘導基質(inducer)を培地中に加えな
ければならないBC−8菌の代わりに、炭素源として一
般に用いられるブドウ糖を加えるだけで、α−1,3−
グルカナーゼを構成的(constitutive)に
産生ずる突然変異株を利用できれば好都合である。
そこで、本発明者は、BC−8菌を突然変異誘起剤にて
処理し、ブドウ糖を炭素源として分解利用してα−1,
3−グルカナーゼを産生ずる突然変異株を検索した結果
、バチルス サーキュランスBC−8−033(Bac
illus circulans BC−8−033(
徽工研条寄第1515号”) (PERM BP−15
15) (以下、BC−8菌変異株と言う)〕が構成的
(constitutive)に、かつ強力にα−1,
3−グルカナーゼを産生ずることを見出した。以下にこ
のBC−8菌変異株を用いた本発明のα−1,3−グル
カナーゼを製造する方法について詳細に説明する。
処理し、ブドウ糖を炭素源として分解利用してα−1,
3−グルカナーゼを産生ずる突然変異株を検索した結果
、バチルス サーキュランスBC−8−033(Bac
illus circulans BC−8−033(
徽工研条寄第1515号”) (PERM BP−15
15) (以下、BC−8菌変異株と言う)〕が構成的
(constitutive)に、かつ強力にα−1,
3−グルカナーゼを産生ずることを見出した。以下にこ
のBC−8菌変異株を用いた本発明のα−1,3−グル
カナーゼを製造する方法について詳細に説明する。
1、 8C−8菌変異株の分離
前記BC−8菌を、1.0%ブドウ糖、1.0%バタト
トリプトン(Difco社製) 、0.5%酵母エキス
(Djfco社製)、0.5%食塩から成るpH7,0
に調製し滅菌した液体培地に植菌し、37℃で振盪培養
した。対数増殖期で培養を停止し、遠心分離によりBC
−8菌体を集めた。これを冷却した(4℃) 50 m
M燐酸緩衝液(pH6,5)で洗浄した後、50μg/
隋lのN−メチル−N゛−ニトロ−N−ニトロソグアニ
ジン(50n+M燐酸緩衝液、pH6,5)溶液に懸濁
し、37℃で20分間処理した。その後、50 +wM
燐酸緩衝液(pH6,5)でよく洗菌し、さらに菌体を
上記液体培地に植菌し、37℃、3時間、振盪培養し、
菌体を30%グリセロール溶液に懸濁させて、−80℃
で保存した。この菌体保存溶液を随時溶解し、この中か
ら炭素源として、不溶性グルカンの代わりにブドウ糖の
みを培地成分として用いた場合でも、多量にα−1,3
−グルカナーゼを産生ずる突然変異株の検索を行った結
果、このような性質を有するBC−8菌変異株を分離し
た。
トリプトン(Difco社製) 、0.5%酵母エキス
(Djfco社製)、0.5%食塩から成るpH7,0
に調製し滅菌した液体培地に植菌し、37℃で振盪培養
した。対数増殖期で培養を停止し、遠心分離によりBC
−8菌体を集めた。これを冷却した(4℃) 50 m
M燐酸緩衝液(pH6,5)で洗浄した後、50μg/
隋lのN−メチル−N゛−ニトロ−N−ニトロソグアニ
ジン(50n+M燐酸緩衝液、pH6,5)溶液に懸濁
し、37℃で20分間処理した。その後、50 +wM
燐酸緩衝液(pH6,5)でよく洗菌し、さらに菌体を
上記液体培地に植菌し、37℃、3時間、振盪培養し、
菌体を30%グリセロール溶液に懸濁させて、−80℃
で保存した。この菌体保存溶液を随時溶解し、この中か
ら炭素源として、不溶性グルカンの代わりにブドウ糖の
みを培地成分として用いた場合でも、多量にα−1,3
−グルカナーゼを産生ずる突然変異株の検索を行った結
果、このような性質を有するBC−8菌変異株を分離し
た。
2、8C−8菌変異株の菌学的性状
構成的にα−1,3−グルカナーゼを産生ずる性質以外
は、前記BC−8菌と同じ。
は、前記BC−8菌と同じ。
3.8C−8菌変異株の培養
(al BC−8菌変異株培養のための培地α−1,
3−グルカナーゼを製造するためには、まず上記BC−
8菌変異株を天然、または人工培地に接種して培養する
が、工業的生産には液体培地で通気攪拌培養法によって
実施するのが、コスト、収率の上からも有利である。
3−グルカナーゼを製造するためには、まず上記BC−
8菌変異株を天然、または人工培地に接種して培養する
が、工業的生産には液体培地で通気攪拌培養法によって
実施するのが、コスト、収率の上からも有利である。
培地の栄養源としては、微生物一般に用いられるものが
使用される0例えば、炭素源としてブドウ糖が最も有効
で、窒素源としては、リン酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。無機
塩としては、リン酸、ナトリウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛、コバルト、銅などの塩類が用いられる。
使用される0例えば、炭素源としてブドウ糖が最も有効
で、窒素源としては、リン酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。無機
塩としては、リン酸、ナトリウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛、コバルト、銅などの塩類が用いられる。
(bl BC−8菌変異株の培養
上記(a)項にて調製した培地に、BC−8菌変異株を
接種し、所定の培養温度、好ましくは30℃〜37℃で
、培養基のpHを6〜7で、α−1,3−グルカナーゼ
が培養液中で最も高い活性を示すまで、所定の培養時間
(培養条件によって異なるが、通常通気攪拌培養では1
〜3日)培養する。
接種し、所定の培養温度、好ましくは30℃〜37℃で
、培養基のpHを6〜7で、α−1,3−グルカナーゼ
が培養液中で最も高い活性を示すまで、所定の培養時間
(培養条件によって異なるが、通常通気攪拌培養では1
〜3日)培養する。
4、培養物からのα−1,3−グルカナーゼの採取精製
このようにして、充分にα−1,3−グルカナーゼが産
生された培養物から、遠心分離によって菌体を取り除け
ば、粗酵素液が得られる。
生された培養物から、遠心分離によって菌体を取り除け
ば、粗酵素液が得られる。
得られた粗酵素液は、そのままでも製品として充分に使
用可能であるが、さらに該酵素液を公知の分離精製法、
例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧濃縮法、硫安などによ
る塩析法、エタノールなどによる溶媒分画法、等電点沈
澱法、カラムクロマト分画法などを、単独或いは適宜組
合わせることによって精製酵素液を採取することが可能
である。
用可能であるが、さらに該酵素液を公知の分離精製法、
例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧濃縮法、硫安などによ
る塩析法、エタノールなどによる溶媒分画法、等電点沈
澱法、カラムクロマト分画法などを、単独或いは適宜組
合わせることによって精製酵素液を採取することが可能
である。
本発明の製造方法によって得られるBC−8菌変異株の
α−1,3−グルカナーゼは、下記の通りの理化学的性
質を有する。
α−1,3−グルカナーゼは、下記の通りの理化学的性
質を有する。
(1) 作用及び基質特異性
BC−8菌の産生ずるα−1,3−グルカナーゼと同じ
。
。
(2)至適pH及び安定pH
BC−8菌の産生ずるα−1,3−グルカナーゼと同じ
。
。
(3)至適温度及び安定温度
BC−8菌の産生ずるα−1,3−グルカナーゼと同じ
。
。
(4)金属塩、酵素阻害剤の影響
BC−8菌の産生ずるα−1,3−グルカナーゼと同じ
。
。
(5)分子量
BC−8菌の産生ずるα−1,3−グルカナーゼと同じ
。
。
(6)還元糖増加活性測定方法
通常、5Il1g/WaIlの1.3−α−D−グルカ
ン(表I脚注参照)(50mM燐酸緩衝液、pH7,0
)懸濁液50μlに、40μlの50 mM燐酸緩衝液
、pH7,0を加え、さら?、ZIOtt It (7
) α−1,3−グルカナーゼ溶液を加えて、37℃で
60分間反応させ、ソモギー銅試薬100μlを加えて
反応を停止させた。これを煮沸水中に1o分間放置した
後冷却し、ネルソン試薬100μlを加えよく攪拌後、 1+sJのイオン交換水を加えて遠心分離を行った。遠
心分離上清の550 nsにおける吸光度を測定し還元
糖の増加量を求めた。
ン(表I脚注参照)(50mM燐酸緩衝液、pH7,0
)懸濁液50μlに、40μlの50 mM燐酸緩衝液
、pH7,0を加え、さら?、ZIOtt It (7
) α−1,3−グルカナーゼ溶液を加えて、37℃で
60分間反応させ、ソモギー銅試薬100μlを加えて
反応を停止させた。これを煮沸水中に1o分間放置した
後冷却し、ネルソン試薬100μlを加えよく攪拌後、 1+sJのイオン交換水を加えて遠心分離を行った。遠
心分離上清の550 nsにおける吸光度を測定し還元
糖の増加量を求めた。
上記の反応条件において、60分間に60 nmolの
ブドウ糖に相当する還元糖を遊離させるα−1,3−グ
ルカナーゼの活性を1単位とした。
ブドウ糖に相当する還元糖を遊離させるα−1,3−グ
ルカナーゼの活性を1単位とした。
実際的には、各種濃度のα−1,3−グルヵナーゼを用
いて標準曲線を作成し、それによって還元糖増加活性を
求めた。
いて標準曲線を作成し、それによって還元糖増加活性を
求めた。
尚、還元糖増加活性法により求めた酵素活性1単位は、
フェノール硫酸法を用いる活性測定法による280単位
の酵素活性に相当する。
フェノール硫酸法を用いる活性測定法による280単位
の酵素活性に相当する。
(実施例)
たα−13−グル力 −ゼの1゛6
叉l拠上
前記不溶性グルカンの調製例によって調整し、超音波で
破砕懸濁した不溶性グルカン0.5%(乾燥重量の−/
V)、燐酸2アンモニウム((NH4)tHPO4)
0.5%、燐酸1カリウム(KHzPO*) 0.1%
、食塩0.1%、酵母エキス(Difco社製)0.1
%を含有する液体培地(pH7,0) 100 mlを
500mf容の綿栓をしたエルレンマイヤーフラスコに
入れる。加熱減菌後、別に滅菌した1M硫酸マグネシウ
ム水溶液及び0.1 M塩化カルシウム水溶液をそれぞ
れ1mlずつ添加して、予め同じ培地で24時間培養し
たBC−8菌培養液5mlを接種して、37℃でロータ
リー型振盪培養法にて48時間培養した。
破砕懸濁した不溶性グルカン0.5%(乾燥重量の−/
V)、燐酸2アンモニウム((NH4)tHPO4)
0.5%、燐酸1カリウム(KHzPO*) 0.1%
、食塩0.1%、酵母エキス(Difco社製)0.1
%を含有する液体培地(pH7,0) 100 mlを
500mf容の綿栓をしたエルレンマイヤーフラスコに
入れる。加熱減菌後、別に滅菌した1M硫酸マグネシウ
ム水溶液及び0.1 M塩化カルシウム水溶液をそれぞ
れ1mlずつ添加して、予め同じ培地で24時間培養し
たBC−8菌培養液5mlを接種して、37℃でロータ
リー型振盪培養法にて48時間培養した。
培養液に対して、前記水可溶性低分子グルカン溶液の調
製例にて調製した当量の水可溶性低分子グルカン溶液を
添加し、その後遠心分離を行い、培養上清を得た。この
培養上清中のα−1,3−グルカナーゼの活性は、元の
培地1ml当たりに換算してフェノール硫酸法を用いる
活性測定法において770単位/n+1であった。
製例にて調製した当量の水可溶性低分子グルカン溶液を
添加し、その後遠心分離を行い、培養上清を得た。この
培養上清中のα−1,3−グルカナーゼの活性は、元の
培地1ml当たりに換算してフェノール硫酸法を用いる
活性測定法において770単位/n+1であった。
大施斑主
上記実施例1と同様の液体培地を、綿栓をした31容の
エルレンマイヤーフラスコに500 s+1入れ、加熱
滅菌後、実施例1と同濃度になるように、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム、を加え、さらにペニシリウム (Penicillium) 属に属するかびの生産
したデキストラナーゼ(生化学工業社製)水溶液を、フ
ラスコ1本当たりデキストラナーゼが4n+gとなるよ
うに、無菌濾過して加えた。
エルレンマイヤーフラスコに500 s+1入れ、加熱
滅菌後、実施例1と同濃度になるように、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム、を加え、さらにペニシリウム (Penicillium) 属に属するかびの生産
したデキストラナーゼ(生化学工業社製)水溶液を、フ
ラスコ1本当たりデキストラナーゼが4n+gとなるよ
うに、無菌濾過して加えた。
同様の培地で24時間培養したBC−8菌培養液を25
a+1接種して、37℃にてロータリ型振盪培養法にて
48時間培養した。培養終了後、実施例1の場合と同様
に、水可溶性低分子グルカン溶液による処理を行い、培
養上清を得た。
a+1接種して、37℃にてロータリ型振盪培養法にて
48時間培養した。培養終了後、実施例1の場合と同様
に、水可溶性低分子グルカン溶液による処理を行い、培
養上清を得た。
得られた培養上滑中のα−1,3−グルカナーゼ活性は
、元の培地1 +wl当たりに換算して、フェノール硫
酸法を用いる活性測定法において775単位/s+1で
あった。培地中に予めデキストラナーゼを加えておいた
場合には、培養終了後、BC−8菌菌体以外の残存不溶
物は殆ど存在しなかった。
、元の培地1 +wl当たりに換算して、フェノール硫
酸法を用いる活性測定法において775単位/s+1で
あった。培地中に予めデキストラナーゼを加えておいた
場合には、培養終了後、BC−8菌菌体以外の残存不溶
物は殆ど存在しなかった。
実施■ユ
実施例1と同じ液体培地を綿栓をした31容のエルレン
マイヤーフラスコに500 mli’つ ・分注し、加
熱滅菌後、実施例1と同濃度になるように、硫酸マグネ
シウム、塩化カルシウムを加え、同様の培地で24時間
培養したBC−8菌培養液を、フラスコ1本あたり25
ml接種して、37℃にてロータリー型振盪培養法に
より、48時間培養した。この様にして培養した培養液
4.5 j!を遠心分離にかけ、上清(1)とBC−8
%体及びグルカン残留物を含む沈殿画分に分けた。この
沈殿画分に、水可溶性低分子グルカン溶液(前記調製側
参照)250 mlを添加し、沈殿をこの溶液中に懸濁
して、0℃で10分間放置した。これを遠心分離にかけ
、上清(2)と沈殿画分に分けた。この沈殿画分に対し
、再び水可溶性低分子グルカン溶液を250 ml加え
て、前述と同様の処理を行い、上清(3)と沈澱画分に
分けた。上記上清(1)、 (2)、 (3)を合わせ
、0〜40%(V/V)のエタノール分画を行い、沈殿
物を遠心分離により集め、少量の50 n+M燐酸緩衝
液(pH7,0)中に懸濁した。この懸濁液を同緩衝液
を外液にして透析し、透析後、遠心分離により、上滑(
4)と沈殿画分に分けた。この沈殿画分を水可溶性低分
子グルカン溶液(100allずつ)により、上記と同
様に二層処理を行い、上清(5)、 (61を得た。上
清(41,(5)、 (6)を集め、これにデキストラ
ナーゼCG (生化学工業社より市販)2.000
生化学工業単位を加え、37℃で6時間反応させた。遠
心分離を行い、上清(7)と沈殿画分に分け、沈殿画分
に対しては、200 mlずつの水可溶性低分子グルカ
ン溶液による処理を二層行い、遠心上清(8)、 (9
1を得た。 (7)、 (81,(9)を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、濃縮液を50 mM燐酸緩衝液(
pH7,0)を外液にして透析した。この透析液を同緩
衝液で平衡化したセファアクリルS −200カラムに
入れ、同緩衝液を用いて溶出した。デキストラナーゼは
、セファアクリル樹脂に親和性を持つため、この処理に
よって酵素液に加えたデキストラナーゼを取り除くこと
ができた。溶出されてきたグルカナーゼ画分を集め、5
0−M燐酸緩衝液(pH7゜0)で平衡化したDBAf
!−セファセルカラムに加え、吸着されずに同緩衝液で
溶出されてくるグルカナーゼ画分を集めた。限外濾過に
よってこの両分を濃縮し、50 sM酢酸緩衝液(pH
4,5)を外液として透析した。これを、同緩衝液で平
衡化したCトセファロースCL−6Bカラムに入れ、酢
酸緩衝液で充分カラムを洗浄した後、0〜0.6 Mの
食塩(50+*M 酢酸緩衝液、pH4,5)の直線
濃度勾配により溶出した。
マイヤーフラスコに500 mli’つ ・分注し、加
熱滅菌後、実施例1と同濃度になるように、硫酸マグネ
シウム、塩化カルシウムを加え、同様の培地で24時間
培養したBC−8菌培養液を、フラスコ1本あたり25
ml接種して、37℃にてロータリー型振盪培養法に
より、48時間培養した。この様にして培養した培養液
4.5 j!を遠心分離にかけ、上清(1)とBC−8
%体及びグルカン残留物を含む沈殿画分に分けた。この
沈殿画分に、水可溶性低分子グルカン溶液(前記調製側
参照)250 mlを添加し、沈殿をこの溶液中に懸濁
して、0℃で10分間放置した。これを遠心分離にかけ
、上清(2)と沈殿画分に分けた。この沈殿画分に対し
、再び水可溶性低分子グルカン溶液を250 ml加え
て、前述と同様の処理を行い、上清(3)と沈澱画分に
分けた。上記上清(1)、 (2)、 (3)を合わせ
、0〜40%(V/V)のエタノール分画を行い、沈殿
物を遠心分離により集め、少量の50 n+M燐酸緩衝
液(pH7,0)中に懸濁した。この懸濁液を同緩衝液
を外液にして透析し、透析後、遠心分離により、上滑(
4)と沈殿画分に分けた。この沈殿画分を水可溶性低分
子グルカン溶液(100allずつ)により、上記と同
様に二層処理を行い、上清(5)、 (61を得た。上
清(41,(5)、 (6)を集め、これにデキストラ
ナーゼCG (生化学工業社より市販)2.000
生化学工業単位を加え、37℃で6時間反応させた。遠
心分離を行い、上清(7)と沈殿画分に分け、沈殿画分
に対しては、200 mlずつの水可溶性低分子グルカ
ン溶液による処理を二層行い、遠心上清(8)、 (9
1を得た。 (7)、 (81,(9)を合わせ、限外
濾過によって濃縮し、濃縮液を50 mM燐酸緩衝液(
pH7,0)を外液にして透析した。この透析液を同緩
衝液で平衡化したセファアクリルS −200カラムに
入れ、同緩衝液を用いて溶出した。デキストラナーゼは
、セファアクリル樹脂に親和性を持つため、この処理に
よって酵素液に加えたデキストラナーゼを取り除くこと
ができた。溶出されてきたグルカナーゼ画分を集め、5
0−M燐酸緩衝液(pH7゜0)で平衡化したDBAf
!−セファセルカラムに加え、吸着されずに同緩衝液で
溶出されてくるグルカナーゼ画分を集めた。限外濾過に
よってこの両分を濃縮し、50 sM酢酸緩衝液(pH
4,5)を外液として透析した。これを、同緩衝液で平
衡化したCトセファロースCL−6Bカラムに入れ、酢
酸緩衝液で充分カラムを洗浄した後、0〜0.6 Mの
食塩(50+*M 酢酸緩衝液、pH4,5)の直線
濃度勾配により溶出した。
グルカナーゼ活性を示す両分を集め、SO3−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行ったところ、1本のタンパ
クバンドのみが検出された、以上の精製操作によって、
BC−8菌のグルカナーゼは、電気泳動的に均一にまで
精製され、フェノール硫酸法を用いる活性測定法におい
て49.400単位(タンパク質として338μg)の
精製グルカナーゼが得られた。このグルカナーゼ標品の
比活性は、フェノール硫酸法を用いる活性測定法におい
て144,000(単位/l1gタンパク)であった。
リルアミドゲル電気泳動を行ったところ、1本のタンパ
クバンドのみが検出された、以上の精製操作によって、
BC−8菌のグルカナーゼは、電気泳動的に均一にまで
精製され、フェノール硫酸法を用いる活性測定法におい
て49.400単位(タンパク質として338μg)の
精製グルカナーゼが得られた。このグルカナーゼ標品の
比活性は、フェノール硫酸法を用いる活性測定法におい
て144,000(単位/l1gタンパク)であった。
m汰
実施■」
1.0%ブドウ糖、1.0%ポリペプトン(大豆栄養化
学社製) 、0.5%酵母エキスS (大豆栄養化学社
製) 、0.5%食塩、0.4%燐酸1カリウム、0.
4%硫酸アンモニウム、0.1%グリシン、25 PP
M 塩化第二鉄、7.8 PPM硫酸マンガン、8.
35 PPM 塩化亜鉛、10 PPM 塩化コバ
ルト、6 PPM硫酸銅、5 PPMモリブデン酸ナト
リウム、5 PPMホウ酸ナトリウム、からなるpH7
,0の滅菌した培養液3j!の入ったミニジャーファー
メンタ−にBC−8菌変異株を植菌した(植菌量は、前
記培養液で予め前培養したもの2%)0次にこれを37
℃で水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを6.35以
上に調整しながら通気撹拌培養を行った。培養30時間
でα−1,3−グルカナーゼの活性は、前記還元糖増加
活性測定法で364.8本位/−1(フェノール硫酸法
を用いる活性測定法で、102.000単位/111)
となり、BC−8菌変異株は、BC−8菌を不溶性グル
カンを炭素源として用いて培養した場合に比較して、1
30倍以上の活性のα−1,3−グルカナーゼを構成的
に生産することが判明した(第6図参照)。
学社製) 、0.5%酵母エキスS (大豆栄養化学社
製) 、0.5%食塩、0.4%燐酸1カリウム、0.
4%硫酸アンモニウム、0.1%グリシン、25 PP
M 塩化第二鉄、7.8 PPM硫酸マンガン、8.
35 PPM 塩化亜鉛、10 PPM 塩化コバ
ルト、6 PPM硫酸銅、5 PPMモリブデン酸ナト
リウム、5 PPMホウ酸ナトリウム、からなるpH7
,0の滅菌した培養液3j!の入ったミニジャーファー
メンタ−にBC−8菌変異株を植菌した(植菌量は、前
記培養液で予め前培養したもの2%)0次にこれを37
℃で水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを6.35以
上に調整しながら通気撹拌培養を行った。培養30時間
でα−1,3−グルカナーゼの活性は、前記還元糖増加
活性測定法で364.8本位/−1(フェノール硫酸法
を用いる活性測定法で、102.000単位/111)
となり、BC−8菌変異株は、BC−8菌を不溶性グル
カンを炭素源として用いて培養した場合に比較して、1
30倍以上の活性のα−1,3−グルカナーゼを構成的
に生産することが判明した(第6図参照)。
前記培養開始後30時間の培養液を、ミニジャーファー
メンタ−から取り出し、遠心分離によって菌体を取り除
いて培養上清2470sj!を得た、この全α−1,3
−グルカナーゼ活性は、前記還元糖増加活性測定法で9
01.000単位であった。
メンタ−から取り出し、遠心分離によって菌体を取り除
いて培養上清2470sj!を得た、この全α−1,3
−グルカナーゼ活性は、前記還元糖増加活性測定法で9
01.000単位であった。
この培養上清を限外濾過器により濃縮し、濃縮酵素液に
0.1モル濃度となるように、塩化アンモニウムを添加
して、濃アンモニア水でpHを8゜5に調整した。これ
に50%(V /V )となるように冷エタノールを加
え、エタノール分画を行った。沈殿画分を遠心分離によ
って集めて、少量の0.1M塩化アンモニウム−アンモ
ニア緩衝液(pH8,5)に懸濁溶解した。不溶物を遠
心分離によって取り除いた後、上清を5011M 燐酸
緩衝液(pH7,0)を外液として透析した。透析終了
後、再び遠心分離を行い、不溶物を取り除き上清のα−
1,3−グルカナーゼを含む溶液130 talを得た
。この溶液の全α−1,3−グルカナーゼ活性は、還元
糖増加活性測定法で559.000単位であった。
0.1モル濃度となるように、塩化アンモニウムを添加
して、濃アンモニア水でpHを8゜5に調整した。これ
に50%(V /V )となるように冷エタノールを加
え、エタノール分画を行った。沈殿画分を遠心分離によ
って集めて、少量の0.1M塩化アンモニウム−アンモ
ニア緩衝液(pH8,5)に懸濁溶解した。不溶物を遠
心分離によって取り除いた後、上清を5011M 燐酸
緩衝液(pH7,0)を外液として透析した。透析終了
後、再び遠心分離を行い、不溶物を取り除き上清のα−
1,3−グルカナーゼを含む溶液130 talを得た
。この溶液の全α−1,3−グルカナーゼ活性は、還元
糖増加活性測定法で559.000単位であった。
このエタノール分画後のα−1,3−グルカナーゼ溶液
を用いてさらに硫酸アンモニウム分画を行った。硫酸ア
ンモニウム80%飽和において、析出してくる物質を遠
心分離により集め、少量の50 mM燐酸緩衝液(pH
7,0)に溶解した。同じ緩衝液で透析し、不溶物を遠
心分離によって取り除き、上清のα−1,3−グルカナ
ーゼ溶液を得た。この全α−1,3−グルカナーゼ活性
は、還元糖増加活性測定法で503,000単位、比活
性は526単位/mgタンパクであった。以上の精製操
作によるα−1,3−グルカナーゼの回収率は56%で
あった。
を用いてさらに硫酸アンモニウム分画を行った。硫酸ア
ンモニウム80%飽和において、析出してくる物質を遠
心分離により集め、少量の50 mM燐酸緩衝液(pH
7,0)に溶解した。同じ緩衝液で透析し、不溶物を遠
心分離によって取り除き、上清のα−1,3−グルカナ
ーゼ溶液を得た。この全α−1,3−グルカナーゼ活性
は、還元糖増加活性測定法で503,000単位、比活
性は526単位/mgタンパクであった。以上の精製操
作によるα−1,3−グルカナーゼの回収率は56%で
あった。
一■Bc−8菌変異株のα−1,3−グルカナーゼのオ
リゴIJ!、二1人−に対する1t、”:n
zSrIQ)十陥
5’r%Wiイソマルトヘ
プタオース81 ブドウ需力(α−1,6−結合でつ
ながったヘプタオース −デキストリン1
ブドウwJ<主としてα−1,4−16合で
つなA(Ill+、田炒預fこα−1,6−I給でつな
力(ったオリコ゛を店 −イソマ
ルトース1 ブドウP6’ff−1,6−結合
でつながった二塘−ニゲロース14
]゛ドドウ切b−1,3−結合−cつなめ鳴った三糖
−セロビオース0S
ブドウ糖がβ−1,4−結合でつながった二塘−マル
トース1 フ゛ドウP/l(α−1,4
−結合でつながった二ti −
1,3−α−シグルカン1 ブドウ糖が主としてα
−1,3−結合でつながった多糖 +1.3
−1.6−α−シグルカン1 ブドウ糖がα−1,3−
結合又はα−1,6−結合でつな力くった多り3 +
本1 =4sa+altoheptaose(生(ヒ
与ζエゴ荏1P失D 、*’l −Dextrin(
□’□、4く3・司scsaalLose(Mコぢi【
イEフa、4 ・・−Ntgαな遁(シグマ(Sigm
a)仕顆、柘 ・・伽11obiose(利洸剥]諸じ
■、4 ・・情旧勇e…紡珈U瞬封Φ、 率7 ・・−ζ二、シリウム(Penicilli−デ
キストラナーゼで4のα−L6−4&合0附を宗W肖匁
4 ・・・ストレプトコッカス ミュータンス(Str
eptococcus +nutans)Orti:1
76の産生する水工)割生り゛ルカン。
リゴIJ!、二1人−に対する1t、”:n
zSrIQ)十陥
5’r%Wiイソマルトヘ
プタオース81 ブドウ需力(α−1,6−結合でつ
ながったヘプタオース −デキストリン1
ブドウwJ<主としてα−1,4−16合で
つなA(Ill+、田炒預fこα−1,6−I給でつな
力(ったオリコ゛を店 −イソマ
ルトース1 ブドウP6’ff−1,6−結合
でつながった二塘−ニゲロース14
]゛ドドウ切b−1,3−結合−cつなめ鳴った三糖
−セロビオース0S
ブドウ糖がβ−1,4−結合でつながった二塘−マル
トース1 フ゛ドウP/l(α−1,4
−結合でつながった二ti −
1,3−α−シグルカン1 ブドウ糖が主としてα
−1,3−結合でつながった多糖 +1.3
−1.6−α−シグルカン1 ブドウ糖がα−1,3−
結合又はα−1,6−結合でつな力くった多り3 +
本1 =4sa+altoheptaose(生(ヒ
与ζエゴ荏1P失D 、*’l −Dextrin(
□’□、4く3・司scsaalLose(Mコぢi【
イEフa、4 ・・−Ntgαな遁(シグマ(Sigm
a)仕顆、柘 ・・伽11obiose(利洸剥]諸じ
■、4 ・・情旧勇e…紡珈U瞬封Φ、 率7 ・・−ζ二、シリウム(Penicilli−デ
キストラナーゼで4のα−L6−4&合0附を宗W肖匁
4 ・・・ストレプトコッカス ミュータンス(Str
eptococcus +nutans)Orti:1
76の産生する水工)割生り゛ルカン。
U のα−13−グルカナーゼ に・ る
−基質 結合 用
いた11踵ν夜 生成しf3yd)MWC(資)り デキストラ%l α−1,6と若干のc
r−1,3MES” 0.6pu
1−1 デキストランa2 α−1,6と若干のα
−1,3432,8O さミオ1 α−1,4と若干のα
−1,6130O グリコーゲン1 α−1,4とα−1,6旧
Oニゲラン” α−1,
3とα−1,4130,6P1.4 ニゲ、:、 ン* h et−1+
3とα−1,4MES 2.0P
1.7 プルラン1 α−1,4とα−1,6恋
OF2 1.3−α−D−グルカン1 α−1,3と若干の
α−1,6遣1 65.IP
62.3 1.3−1.6−α−〇−グルカン1 α−1,3とα
−L6 MES 54.
9P 53.7 ml −Dextran印功)シ鉢聾象MslO〜2
0居、112 −f)exLran(ファルマシ7 (
Phna:ia)巳DexLran Tl0)、4 ・
・−5tarch(メルクね1幻社製、(至)、−・・
弔1ycogen(メルク昨πω仕肋、f+ −−−
Nigetan(シグマ(Sigm)社製、アスペルギ
ルス アワモリ(Aspergillus ¥ri)
FfklE)、4 −−−Nigin(シグマ(Si−
ω社製、アスペルギルス ジャポニカス(Asperg
illus japawicus)由来、4 ・・・ス
トレプトコアカス ミュータンス(SLreo+以*工
US利bμs)OりIZ 176の産生ずる沖31羽生
グルカン、1・・反応系0.2門の橿3媛几夜(pl+
6.5)を使用。
−基質 結合 用
いた11踵ν夜 生成しf3yd)MWC(資)り デキストラ%l α−1,6と若干のc
r−1,3MES” 0.6pu
1−1 デキストランa2 α−1,6と若干のα
−1,3432,8O さミオ1 α−1,4と若干のα
−1,6130O グリコーゲン1 α−1,4とα−1,6旧
Oニゲラン” α−1,
3とα−1,4130,6P1.4 ニゲ、:、 ン* h et−1+
3とα−1,4MES 2.0P
1.7 プルラン1 α−1,4とα−1,6恋
OF2 1.3−α−D−グルカン1 α−1,3と若干の
α−1,6遣1 65.IP
62.3 1.3−1.6−α−〇−グルカン1 α−1,3とα
−L6 MES 54.
9P 53.7 ml −Dextran印功)シ鉢聾象MslO〜2
0居、112 −f)exLran(ファルマシ7 (
Phna:ia)巳DexLran Tl0)、4 ・
・−5tarch(メルクね1幻社製、(至)、−・・
弔1ycogen(メルク昨πω仕肋、f+ −−−
Nigetan(シグマ(Sigm)社製、アスペルギ
ルス アワモリ(Aspergillus ¥ri)
FfklE)、4 −−−Nigin(シグマ(Si−
ω社製、アスペルギルス ジャポニカス(Asperg
illus japawicus)由来、4 ・・・ス
トレプトコアカス ミュータンス(SLreo+以*工
US利bμs)OりIZ 176の産生ずる沖31羽生
グルカン、1・・反応系0.2門の橿3媛几夜(pl+
6.5)を使用。
井・・反応系0.05 Mの塙酸ナトリウム$!11腋
(pH7,0)を使用。
(pH7,0)を使用。
(効果)
α−1,3−グルカナーゼは、虫歯の原因となろう蝕原
性連鎖球菌が産生ずる不溶性グルカンのα−1,3−グ
ルコシド結合を特異的に切断する酵素である。本発明に
よるα−1,3−グルカナーゼの製造方法によれば、こ
のような作用のあるα−1,3−グルカナーゼを産生ず
るバチルス属に属する細菌或いはその突然変異株、特に
バチルスサーキエランスBC−8菌或いはその突然変異
株を培養して、容易にα−1,3−グルカナーゼを分離
採取することができる。
性連鎖球菌が産生ずる不溶性グルカンのα−1,3−グ
ルコシド結合を特異的に切断する酵素である。本発明に
よるα−1,3−グルカナーゼの製造方法によれば、こ
のような作用のあるα−1,3−グルカナーゼを産生ず
るバチルス属に属する細菌或いはその突然変異株、特に
バチルスサーキエランスBC−8菌或いはその突然変異
株を培養して、容易にα−1,3−グルカナーゼを分離
採取することができる。
さらに、本発明に使用されるバチルス属に属する細菌或
いはその突然変異株、特にバチルスサーキュランスBC
−8菌或いはその突然変異株は、下記の通り、他の細菌
に比較して優れている。
いはその突然変異株、特にバチルスサーキュランスBC
−8菌或いはその突然変異株は、下記の通り、他の細菌
に比較して優れている。
(11バチルス属の細菌には、炭厄菌
(Bacillus anthracis)を除いて、
病原菌や毒性のある菌は全く見当たらない。従って、工
業的な各種の酵素生産や食品類〔例えば、納豆菌(Ba
cillus natto) )の生産によく利用され
ている。それらの経験を生かして本発明と結合して生か
せる可能性が高い。また、本発明を工業的に使用する場
合、安全性の点においても、優れた方法であることを示
している。
病原菌や毒性のある菌は全く見当たらない。従って、工
業的な各種の酵素生産や食品類〔例えば、納豆菌(Ba
cillus natto) )の生産によく利用され
ている。それらの経験を生かして本発明と結合して生か
せる可能性が高い。また、本発明を工業的に使用する場
合、安全性の点においても、優れた方法であることを示
している。
(2)バチルス属の細菌の中でも、枯草菌(Bacil
lus 5ubtilis)は、形質転換(trans
forw+ation)が可能で、数ある細菌の中でも
、大腸菌についで遺伝学的背景がよく研究されている。
lus 5ubtilis)は、形質転換(trans
forw+ation)が可能で、数ある細菌の中でも
、大腸菌についで遺伝学的背景がよく研究されている。
バチルス属の細菌はそれらの知見を利用できるので、今
後本発明を遺伝子工学的に、或いは遺伝生化学的に発展
させる上で有利である。
後本発明を遺伝子工学的に、或いは遺伝生化学的に発展
させる上で有利である。
以上の二点を勘案すれば、本発明は従来のものに比べて
、一段と工業的にも安全に使用し得る優れた製造方法を
提供できるものである。
、一段と工業的にも安全に使用し得る優れた製造方法を
提供できるものである。
第1図は、BC−8菌のα−1,3−グルカナーゼの各
pHにおける活性を示すグラフ、第2図は、BC−8菌
のα−1,3−グルカナーゼの各pHにおける安定性を
示すグラフ、第3図は、BC−8菌のα−1,3−グル
カナーゼの各温度における活性を示すグラフ、第4図は
、BC−8菌のα−1,3−グルカナーゼの各温度にお
ける安定性を示すグラフ、第5図は、SO3−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動でのBG−8菌のα−1,3−
グルカナーゼの分子量の決定を示すグラフ、第6図は、
QC−8菌変異株の培養時間と培養液中に生産されたα
−1,3−グルカナーゼの活性との関係を示すグラフで
ある。
pHにおける活性を示すグラフ、第2図は、BC−8菌
のα−1,3−グルカナーゼの各pHにおける安定性を
示すグラフ、第3図は、BC−8菌のα−1,3−グル
カナーゼの各温度における活性を示すグラフ、第4図は
、BC−8菌のα−1,3−グルカナーゼの各温度にお
ける安定性を示すグラフ、第5図は、SO3−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動でのBG−8菌のα−1,3−
グルカナーゼの分子量の決定を示すグラフ、第6図は、
QC−8菌変異株の培養時間と培養液中に生産されたα
−1,3−グルカナーゼの活性との関係を示すグラフで
ある。
Claims (2)
- (1)歯垢などに含まれる1,3−α−D−グルカンの
α−1,3−グルコシド結合を特異的に切断分解する酵
素であるα−1,3−グルカナーゼを産生するバチルス
属に属する細菌或いはその突然変異株を、培養培地に接
種して所定の培養条件下で培養した後、該培養物を遠心
分離して、該培養物から菌体を分離除去し、α−1,3
−グルカナーゼを採取することを特徴とするα−1,3
−グルカナーゼの製造方法。 - (2)前記バチルス属に属する細菌が、バチルスサーキ
ュランスBC−8菌(Bacillus circul
ansBC−8)である特許請求の範囲第1項に記載の
α−1,3−グルカナーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62297218A JPH0795947B2 (ja) | 1987-01-29 | 1987-11-25 | α−1,3−グルカナーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1913087 | 1987-01-29 | ||
JP62-19130 | 1987-01-29 | ||
JP62297218A JPH0795947B2 (ja) | 1987-01-29 | 1987-11-25 | α−1,3−グルカナーゼの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63301788A true JPS63301788A (ja) | 1988-12-08 |
JPH0795947B2 JPH0795947B2 (ja) | 1995-10-18 |
Family
ID=26355950
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62297218A Expired - Lifetime JPH0795947B2 (ja) | 1987-01-29 | 1987-11-25 | α−1,3−グルカナーゼの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0795947B2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10472616B2 (en) | 2015-07-15 | 2019-11-12 | Genofocus Co., Ltd. | Genes encoding alpha-1,3-glucanase and methods of using the same |
WO2020099491A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a polypeptide having dnase activity |
WO2022043273A2 (en) | 2020-08-24 | 2022-03-03 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a fructanase |
WO2023110900A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising enzymes |
-
1987
- 1987-11-25 JP JP62297218A patent/JPH0795947B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J GEN MICROBIOL=1980 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10472616B2 (en) | 2015-07-15 | 2019-11-12 | Genofocus Co., Ltd. | Genes encoding alpha-1,3-glucanase and methods of using the same |
WO2020099491A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a polypeptide having dnase activity |
WO2020099490A1 (en) | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising enzymes |
WO2022043273A2 (en) | 2020-08-24 | 2022-03-03 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising a fructanase |
WO2023110900A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Novozymes A/S | Oral care composition comprising enzymes |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0795947B2 (ja) | 1995-10-18 |
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