JPH07322878A - 新規なα−アガラーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アガロース由来の６糖以下のオリゴ糖のＤ−
ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース
との間のα−１，３結合を加水分解することを特徴とす
るα−アガラーゼ、及びビブリオ属微生物を用いた該酵
素の製法。 【効果】 新規なα−アガラーゼが提供され、該酵素を
用いることにより重合度の低いオリゴ糖を生産すること
が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、寒天及びアガロース由
来のオリゴ糖のα−１，３結合の分解活性を有する新規
なα−アガラーゼ並びにその製造方法に関するものであ
る。本酵素を用いることにより、従来法では得ることが
困難であった重合度の低いオリゴ糖を生産することがで
き、これらのオリゴ糖は、澱粉及び澱粉含有製品の老化
防止に効果を有している。

【０００２】

【従来の技術】寒天の主要構成成分であるアガロース
は、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラ
クトースが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を繰
り返してなる多糖である。寒天由来のオリゴ糖を製造す
るためには、このアガロースを分解し、低分子化しなけ
ればならないが、従来よりアガロースを化学的に分解す
る方法及び酵素的に分解する方法が知られている。化学
的に分解する方法では、酸を用いてアガロースを加水分
解することができ、この場合主としてα−１，３結合が
切断される。酵素的に分解する方法としては、シュード
モナス・アトランティカ、シュードモナス・エスピー N
-7（微工研菌寄9884号）等の生産するβ−アガラーゼを
利用してβ−１，４結合を切断する方法（L. M. Morric
e ら、European Journal ofBiochemistry, 137, 149-15
4 (1983) 等）と、アルテロモナス・アガーリティクス
の生産するα−アガラーゼを利用して、α−１，３結合
を切断する方法（P. Potinら、European Journal of Bi
ochemistry, 214, 599-607 (1993))が知られている。

【０００３】β−１，４結合を切断して得られるオリゴ
糖は、ネオアガロオリゴ糖と呼ばれ、その非還元末端は
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであり、その重
合度は偶数である。一方、α−１，３結合を切断して得
られるオリゴ糖は、アガロオリゴ糖と呼ばれ、その重合
度は偶数であり、その非還元末端はＤ−ガラクトースで
ある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】化学的に分解する方法
では、生産されるオリゴ糖の大きさを制御することが難
しく、特に重合度の低いオリゴ糖を選択的に作ることは
極めて難しい（徳永隆久ら、バイオサイエンスとインダ
ストリー、49巻７号 p.734 (1991) 等) 。一方、従来の
β−アガラーゼを用いる方法では、主に６糖以上のオリ
ゴ糖を選択的に生産することが可能であるが、β−１，
４結合のみの切断であるために重合度が偶数であるオリ
ゴ糖しか得られず、３糖や５糖のような重合度が奇数で
ある低分子のオリゴ糖を得ることができない。また、非
還元末端がＤ−ガラクトースであるオリゴ糖を製造する
ことも原理的に不可能である。一方、前述した従来のα
−アガラーゼは、非還元末端がＤ−ガラクトースである
オリゴ糖を製造することは可能であるが、重合度の高い
アガロースに対し作用するものであることから、６糖以
下のオリゴ糖の分解能はなく、更に重合度の低いオリゴ
糖を生産することができない。従って、従来法では、重
合度が低く、かつその非還元末端がＤ−ガラクトースで
あるアガロース由来のオリゴ糖を製造することができな
いという問題を抱えていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記事情
に鑑み、アガロース由来のオリゴ糖のα−１，３結合の
みを酵素的に切断することを目的として鋭意研究、探索
を行った結果、ビブリオ属に属する微生物が目的とする
酵素を生産することを見いだした。即ち、本発明は下記
の発明を包含する。 （１）アガロース由来の６糖以下のオリゴ糖のＤ−ガラ
クトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの
間のα−１，３結合を加水分解することを特徴とするα
−アガラーゼ。 （２）下記の理化学的性質を有することを特徴とするα
−アガラーゼ。 作用及び基質特異性 アガロース由来のオリゴ糖のＤ−ガラクトースと３，６
−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のα−１，３結
合を加水分解する。 至適 pH ７〜8.4 至適温度 30℃ pH安定性 ６〜９ 熱安定性 35℃で10分間加熱後の活性は、初期活性の約100 ％を保
持する。

【０００６】40℃で10分間加熱後の活性は、初期活性の
約50％を保持する。 分子量 約42,000（10％ SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による） アミノ末端アミノ酸配列 Ser →Gly →Thr →Gly →Ser →Lys →Leu →Ser →Le
u →Ala （３）ビブリオ属に属し、α−アガラーゼ生産能を有す
る微生物を培地に培養し、培養物中にα−アガラーゼを
生成蓄積させ、これを採取することを特徴とするα−ア
ガラーゼの製造方法。 （４）ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4であることを特
徴とする前記（３）に記載の製造方法。

【０００７】なお、本明細書において、アガロース由来
のオリゴ糖とは、寒天等から得られるアガロースから得
られる構成単糖の数が２以上８以下の糖をいう。本発明
のα−アガラーゼは、前記特徴を有する酵素の部分精製
品と精製品の両者を含むものである。本発明のα−アガ
ラーゼの一例である後述の実施例１で得られた精製品
（α−NAOS hydrolase) の理化学的性質を以下に示す。 （１）活性測定法 本酵素の精製品又は部分精製品の活性測定は以下のよう
に行う。ネオアガロビオースを基質として酵素反応を行
った後、未分解のネオアガロビオースの量を定量するこ
とにより、分解されたネオアガロビオースの量を高速液
体クロマトグラフィーを用いて定量する。詳しくは、以
下の通りである。

【０００８】20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8) に溶解
した0.１％ネオアガロビオース溶液を調製し、この90μ
ｌを基質として、酵素溶液10μｌと混合し、30℃にて、
５〜30分間、好ましくは10分間反応させた後、沸騰水中
で１分間加熱することによって反応を停止させる。この
反応溶液10μｌを内径4.5mm 、長さ250mm のカプセルパ
ックC-18（資生堂製）なるカラムに供し、水を溶離液と
して１ml/minの流速で溶出させたとき約 4.5分の保持時
間を示す酵素反応によって分解されなかったネオアガロ
ビオースの量を定量する。この値から分解されたネオア
ガロビオースの量に逆算し、１分間当り１マイクロモル
のネオアガロビオースを分解する酵素量を１単位（１
Ｕ）とする。 （２）基質特異性及び作用 20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8) に、ネオアガロビオ
ース、ネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオー
ス、アガロースの各基質を 0.3％濃度に調整し、30℃に
て酵素反応を行った。ネオアガロビオースの分解活性を
100 とするときのそれぞれの活性割合を表１に示す。

【０００９】

【表１】

【００１０】α−NAOS hydrolaseの作用様式の特定 0.3 ％ネオアガロヘキサオース溶液90μｌに該酵素溶液
10μｌ（50μg/ml) を加え、恒温水槽中30℃で３時間反
応した。反応生成物の10μｌを高速液体クロマトグラフ
ィーで分取するために、内径4.5mm 、長さ250mm のカプ
セルパックC-18（資生堂製）なるカラムに供し、水を溶
離液として１ml/minの流速で溶出させた。主な反応生成
物は、約 6.5〜7.2 分の保持時間を示した。この画分を
分取し、ブタノール：エタノール：水＝３：１：１の組
成からなる展開溶媒で薄層クロマトグラフィーに供した
ところ、Ｒｆ＝0.21にスポットを持つ反応生成物を確認
した。該画分を凍結乾燥後、高速原子衝撃法質量分析装
置によって、質量測定を行ったところ 792と測定され
た。これにより、該画分に含まれる反応生成物は非還元
末端の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが切断さ
れて生じるアガロペンタオースなる５糖であることが解
った。一方、還元末端のＤ−ガラクトースが切断されて
生じる分子量 774に相当する５糖は得られなかった。更
に、0.2 ％ネオアガロテトラオース溶液を基質溶液とし
て酵素反応を行ったとき、最も優先的に得られる反応生
成物の質量数は 486であった。これにより該質量数に相
当する反応生成物は、非還元末端の３，６−アンヒドロ
−Ｌ−ガラクトースが切断されて生じるアガロトリオー
スなる３糖であることが解った。一方、還元末端のＤ−
ガラクトースが切断されて生じる分子量 468に相当する
３糖は得られなかった。更に、0.2 ％ネオアガロビオー
ス溶液を基質溶液として酵素反応を行ったときの反応生
成物は、 ¹Ｈ−ＮＭＲの測定によって、Ｄ−ガラクトー
スと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであること
が明らかとなった。従って、α−NAOS hydrolaseは、非
還元末端の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを認
識し、α−１，３結合を加水分解する新規酵素であるこ
とが明らかとなった。 （３）至適 pH pHを5.5 から7.7 （リン酸緩衝液）、7.7 から8.9 （ビ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液）、9.0 から9.4 （グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液）に調整した0.1 ％ネオ
アガロビオース溶液90μｌに酵素溶液（40μg/ml) 10μ
ｌを加え、30℃にて10分間反応させた後、沸騰水中で１
分間加熱することによって反応を停止させた。この反応
溶液10μｌを内径4.5mm 、長さ250mm のカプセルパック
C-18（資生堂製）なるカラムに供し、水を溶離液として
１ml/minの流速で溶出させたとき約4.5 分の保持時間を
示す酵素反応によって分解されなかったネオアガロビオ
ースの量を定量した。ネオアガロビオース分解能の最も
高かったpHの活性を 100として各pHの相対活性値を図１
に示した。これにより反応至適pHは、７〜8.4 の中性か
ら弱アルカリ性であることがわかった。 （４）至適温度 酵素の失活が最小限に抑制され、かつ酵素反応が速やか
に進む温度は、30℃であった。 （５）安定性 pH安定性 本酵素を、前述の至適pHを測定した場合の各緩衝液で酵
素溶液を調製し、これを30分間30℃で保温した後、活性
を測定し、それぞれ非加熱時の活性を100 ％とした場
合、残存活性が80％を越える範囲として定めると、pH６
〜９で安定であった。

【００１１】熱安定性 該酵素溶液（40μg/ml）10μｌを30℃、35℃、40℃、50
℃、60℃の水浴中で５分間加熱した後、0.1 ％ネオアガ
ロビオース溶液90μｌ（pH７.8）に加え、30℃にて10分
間反応させた後、沸騰水中で１分間加熱することによっ
て反応を停止させた。この反応溶液10μｌの酵素活性を
測定し、非加熱時の酵素活性を100 ％として、加熱後の
残存活性を比較すると30℃、35℃では約100 ％、40℃で
約50％の残存活性を示した。これを図２に示した。 （６）ミカエリス定数及び最大反応速度 ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクト
ースがα−１，３結合してなるネオアガロビオースを基
質として、種々の濃度の基質溶液を作製し、これに該酵
素溶液（40μg/ml）10μｌを加え、活性測定法に従い酵
素活性を測定した。基質濃度の逆数と、それに対応する
酵素活性の逆数を二次元座標上にプロットし、ラインウ
ェーバーバルクの式を求め、これよりミカエリス定数
は、4.28±5.0mM 、最大反応速度は、87 U/mg 蛋白質で
あることがわかった。 （７）分子量 分子量は SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、及
びゲル濾過法で測定した。 SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法では、常法に従って、 SDSを含むポリアク
リルアミドゲルの濃度が10％のゲルで、分子量マーカー
（分子量 200,000のミオシン、 116,000のβ−ガラクト
シダーゼ、66,000の牛血清アルブミン、42,000のアルド
ラーゼ、30,000のカルボニックアンハイドラーゼ）とと
もに電気泳動を行い、移動度から分子量を求めたとこ
ろ、約42,000であった。ゲル濾過法では、ファルマシア
社製のSuperdex 200なるゲル濾過カラムを用いて、分子
量マーカー（分子量160,000 のイムノグロブリンＧ、6
7,000のヒト血清アルブミン、35,000のβ−ラクトグロ
ブリン、12,400のチトクロームＣ）のゲル濾過を行い、
各蛋白質の溶出量を測定した後、該酵素のゲル濾過を行
い、その溶出量とマーカー蛋白質の溶出量を比較計算し
分子量を計算したところ、約84,000（±16,000)であっ
た。 （８）アミノ末端アミノ酸配列 該酵素のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法によ
り決定した。該酵素溶液（１μg/μｌ）10μｌを、10％
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従って
行った後、該酵素をウェスタンブロッティング法により
バイオダインＡ（日本ポール社製）なる膜に吸着させ、
これをアミノ酸配列分析装置477A及び120Aプロテインシ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社製）によ
り、アミノ末端側10個のアミノ酸配列を決定した。その
結果、配列は Ser→Gly →Thr →Gly →Ser →Lys →Le
u →Ser →Leu →Ala であった。 （９）その他の特性 溶解性：水に可溶 紫外部吸収スペクトル：λmax=280nm 本発明のα−アガラーゼは、ビブリオ属に属し、α−ア
ガラーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にα−アガラーゼを生成蓄積させ、これを採取するこ
とにより得ることができる。

【００１２】ここで用いる微生物としては、ビブリオ属
に属し、α−アガラーゼを生産する能力を有する微生物
であれば、いずれでも用いることができる。その例とし
ては、ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4が挙げられる。
ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4は、海水中から分離さ
れたものであって下記に示す菌学的性質を有するもので
ある。 菌学的性質： １）形態 マリンブロス2216培地に生育した細胞について、 （イ）細胞の形態は桿菌で、大きさは0.25〜1.2 μm ×
0.5〜2.5 μm （ロ）運動性を有し、鞭毛を有す （ハ）グラム染色性は陰性 （ニ）胞子は形成しない ２）生育状態 マリンブロス2216平板培地での培養において、 （イ）18〜25℃で良好に生育する （ロ）淡黄色の色素沈着を有する （ハ）菌体の生育に従って寒天ゲルは液化される マリンブロス2216の液体培養において、 （ニ）pH７, ８, ９において旺盛に生育する ３）生理学的性質 （イ）Ｏ−Ｆテスト Ｆ （ロ）カタラーゼテスト 陽性 （ハ）オキシダーゼテスト 陽性 （ニ）グルコースからのガスの生成 無 （ホ）フォゲス−プロスカウエル反応 陰性 （ヘ）メチルレッド反応 陽性 （ト）ゼラチン分解能 有 （チ）エスクリン分解能 有 （リ）硝酸還元能 有 （ヌ）通性嫌気性 ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4は、平成３年３月６日
付で、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
FERM BP-4541 として寄託されている。

【００１３】培養に用いる培地は、前記微生物が利用し
得る窒素源、無機物等を含み、寒天又はアガロース等を
炭素源として含むものを用いる。寒天、アガロースは、
市販のものを用いることができる。寒天、アガロース以
外の炭素源としては、肉エキス、カゼイン分解物、トリ
プトン、ペプトン等が挙げられ、好ましくはペプトンを
用いる。

【００１４】窒素源としては、酵母エキスを用いる。更
に、塩類としては、塩化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化
マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化
カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カ
リウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ
酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニウム、
リン酸水素二ナトリウム等を組み合わせて用いる。

【００１５】寒天、アガロース以外の前記成分をすべて
含んだマリンブロス2216なる培地（ディフコ社製）に、
寒天又はアガロースを加えて用いることもできる。ま
た、前記塩類を適度に含む人工海水を用い、これにペプ
トン、酵母エキス、寒天等を加えた培地を用いることも
できる。寒天又はアガロースの濃度は、 0.1〜1.5 ％が
好ましく、この際、寒天又はアガロースの濃度を任意に
変えることにより固体培地、液体培地を作り分けること
が可能であるが、酵素生産を目的とする場合は、濃度
0.1〜0.4 ％の液体培養が好ましく、菌体の保存を目的
とするときは、濃度1.2〜1.5 ％の固体培養が好まし
い。

【００１６】培養条件は、培地の組成によって多少異な
るが、培養温度は、15〜30℃、好ましくは20〜25℃、pH
は、 7.0〜8.5 、好ましくは 7.8〜8.2 、培養時間は、
15〜48時間、好ましくは18〜24時間である。目的とする
酵素は、菌体内に存在するので、公知の菌体破砕法、例
えば超音波破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破
砕法、ダイノミル破砕法等のいずれかを行えばよく、そ
の菌体破砕物から目的とする酵素が分離精製される。本
発明において好ましい菌体破砕法は、ダイノミル破砕法
である。例えば、菌体破砕物から遠心分離又は濾過によ
り固形物を除去した後、上清に30〜90％飽和、好ましく
は40〜70％飽和の硫酸アンモニウム等の塩を加えて、目
的酵素を塩析させる。この塩析物を適当な緩衝液（pH
7.0〜8.5)、好ましくはリン酸カリウム緩衝液（pH 7.8)
に懸濁し、この懸濁液の容積の50〜200 倍の同緩衝液
を外液として透析を数回繰り返し、脱塩し、再溶解させ
る。これを市販の陰イオン交換性カラム、ゲル濾過カラ
ム、ハイドロキシアパタイトカラム等のカラムクロマト
グラフィーを組み合わせて電気泳動的に単一バンドにな
るまで精製することができる。

【００１７】本発明のα−アガラーゼを用いることによ
って、５糖以下の重合度の低いオリゴ糖を生産すること
ができる。即ち、まず、寒天又はアガロース由来の、ア
ガロオクタオース、アガロヘキサオース、アガロテトラ
オース、ネオアガロオクタオース、ネオアガロヘキサオ
ース、ネオアガロテトラオース等のオリゴ糖、好ましく
はこれらのうち２糖〜６糖を、それぞれ単独で又は任意
の割合の混合物として原料とし、前述したα−アガラー
ゼ、例えばα−NAOS hydrolaseを作用させることによ
り、更に重合度の低いオリゴ糖を生産することができ
る。ここで用いる原料は、必ずしも精製されたものを使
う必要はなく、市販品を用いてもよく、また寒天の酸分
解、又は市販のアガラーゼによって得たものを用いても
よい。これらの原料をリン酸緩衝液等の溶媒に溶解し、
濃度を 0.1〜1.0 ％、好ましくは 0.2〜0.6 ％に調整す
る。これに該α−アガラーゼを加え、25〜35℃で反応を
行う。反応時間は、２〜24時間で任意に調整し、酵素量
を適当に増減することにより、重合度の異なるオリゴ糖
を作ることができる。反応液中のオリゴ糖は、活性炭又
はシリカゲルを充填剤としたカラムクロマトグラフィー
を用いて、重合度毎に分離精製することができる。ま
た、この酵素反応に使用する場合のα−アガラーゼは、
完全精製する必要はなく、部分精製品で十分な効果を得
ることができる。

【００１８】以上のようにして得られるオリゴ糖は、ア
ガロビオース、アガロトリオース、アガロペンタオース
等である。

【００１９】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 ［実施例１］ α−NAOS hydrolaseの製造 500ml の人工海水（商品名シーライフ、マリンテック社
製）を調製し、これにペプトン５ｇ（日本製薬社製）、
酵母エキス１ｇ（ディフコ社製）を加え、pH8.0 に調整
後、3,000ml 容の三角フラスコに移し、寒天１ｇ（極東
社製）を加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行っ
た。これに−80℃で40％グリセロール中に保存したビブ
リオ(Vibrio) sp. JT0107-L4を室温で融解後、その１ml
を接種し、25℃、毎分 150回転で24時間培養した。得ら
れた培養液を前培養液とした。

【００２０】本培養は、以下の手順で実施した。5,000m
l 容のジャーファーメンター容器を用いて人工海水（商
品名シーライフ、マリンテック社製）3,000ml を調製
し、これにペプトン60ｇ（日本製薬社製）、酵母エキス
12ｇ（ディフコ社製）を加え、pHを8.0 に調整後、寒天
（極東社製）12ｇを加え、オートクレーブを用いて滅菌
操作を行った。これに前培養で得られた培養液の30mlを
接種し、25℃、毎分600回転で20時間培養し、得られた
菌体をシャープレス遠心分離装置で回収し、湿重量で約
50ｇを得た。これを20mMリン酸緩衝液(pH7.8) に懸濁し
総容量を100ml とし、直径0.2mm のガラスビーズ150ml
と混合し、ダイノミル破砕装置を用いて毎分3,000 回転
で15分間菌体破砕を行った。

【００２１】菌体破砕懸濁液は、20,000×ｇ、60分間の
遠心分離によりガラスビーズ、菌体デブリスを除去し、
得られた上清100ml に40％飽和となるように硫酸アンモ
ニウムを加え、生じた沈澱を 6,000×ｇ、30分間で除去
し、上清に更に70％飽和となるように硫酸アンモニウム
を加え、生じた沈澱を 6,000×ｇ、30分間の遠心により
回収し、30mlの20mMリン酸緩衝液(pH7.8) に懸濁し、同
緩衝液5,000ml で計３回透析を行い脱塩、再溶解を施し
た。

【００２２】この透析液を予め20mMリン酸緩衝液で平衡
化した QAE-Toyopearl（東ソー製）なる強陰イオン交換
樹脂34mlを充填したカラム（2.2cm ×９cm）に吸着さ
せ、20mMリン酸緩衝液(pH7.8) から0.5Mの塩化ナトリウ
ムを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.8) への直線濃度勾配法
（総溶出量300ml)で溶出させ、塩化ナトリウム濃度が0.
3Mと0.4Mの間に溶出してくる画分50mlを回収した。

【００２３】この画分を同緩衝液で200 mlに希釈し、 1
00mlずつ２本の画分に分け、それぞれを、予め20mMリン
酸緩衝液で平衡化したMono-Q（ファルマシア社製）なる
強陰イオン交換樹脂を担体としたカラム(1.0cm×10cm）
に吸着させ、前述の直線濃度勾配法（総溶出量 120ml)
により溶出させ、0.3Mから0.4Mの塩化ナトリウム濃度で
溶出する画分16mlを得た。これを再度、同緩衝液で４倍
に希釈し、Mono-Qでのクロマトグラフィーを繰り返し、
0.3Mから0.35M で溶出される画分８mlを得た。これを２
mlずつ４本に分別し、それぞれグレースジャパン社製遠
心限外濾過膜セントリコン50を用いて0.5ml に濃縮し
た。これを Superdex200（ファルマシア社製）なるゲル
濾過担体を用いたカラム(1.0cm×30cm）に供し、0.1Mの
塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.8) で溶出
させ、溶出量13.6mlから14.4mlの画分を得た。

【００２４】これを超純水を用いて４mlにし、HCA-8010
G （三井東圧化学社製）なるハイドロキシアパタイトを
充填したカラムを用いて10mMリン酸緩衝液(pH6.8）から
175mM リン酸緩衝液(pH6.8）への直線濃度勾配（溶出総
量15ml）にて溶出させ、7.5ml から8.5ml に溶出してく
る画分を得た。この画分をドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したと
ころ、目的酵素は約42,000の分子量を示した。この画分
の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて350 倍に上昇
し、全活性は 4.4Ｕ、活性収率は 2.5％であった。

【００２５】［実施例２］ アガロペンタオースの製造 ネオアガロヘキサオース20mgを９mlのリン酸緩衝液(pH
7.8) に溶解した溶液に、ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107
-L4から単離精製した 1.5Ｕのα−NAOS hydrolaseを１m
lのリン酸緩衝液(pH7.8) に溶解した溶液を加え、30℃
で５時間反応させ、ネオアガロヘキサオースを分解し
た。反応溶液を活性炭カラム（５mm×50mm）に吸着せし
め、１mlの水、１mlの10％エタノールで洗浄した後、３
mlの30％エタノールで溶出した。この30％エタノール画
分の溶媒をロータリーエバポレーターを用いて留去し、
更に凍結乾燥を行い重量を測定したところ、13.5mgであ
った。この反応生成物を薄層クロマトグラフィーによっ
て分析したところ、Ｒｆ＝0.21（展開溶媒；ブタノー
ル：エタノール：水＝３：１：１）に物質を確認した。
更にこの反応生成物の質量数を高速原子衝撃法質量分析
装置を用いて求めたところ、792 であった。これにより
該物質は、アガロペンタオースであることが明らかとな
り、得られたアガロペンタオースの収率は80％と計算さ
れた。

【００２６】

【発明の効果】本発明により、新規なα−アガラーゼが
提供され、該酵素を用いることにより重合度の低いオリ
ゴ糖を生産することが可能となり、更に、従来得ること
のできなかったアガロース由来の奇数オリゴ糖を得るこ
とが可能となった。本発明により得られたオリゴ糖は、
澱粉含有製品の老化防止に効果を有している。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のα−アガラーゼの至適pHを示す図であ
る。

【符号の説明】 ○ リン酸緩衝液 ● ビシン−水酸化ナトリウム緩衝液 □ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液

【図２】本発明のα−アガラーゼの熱安定性を示す図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 児玉 久 神奈川県横浜市緑区梅が丘６−２ 日本た ばこ産業株式会社生命科学研究所内 (72)発明者 野間 正名 神奈川県横浜市緑区梅が丘６−２ 日本た ばこ産業株式会社生命科学研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アガロース由来の６糖以下のオリゴ糖の
   Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクト
   ースとの間のα−１，３結合を加水分解することを特徴
   とするα−アガラーゼ。
2. 【請求項２】 下記の理化学的性質を有することを特徴
   とするα−アガラーゼ。 作用及び基質特異性 アガロース由来のオリゴ糖のＤ−ガラクトースと３，６
   −アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のα−１，３結
   合を加水分解する。 至適 pH ７〜8.4 至適温度 30℃ pH安定性 ６〜９ 熱安定性 35℃で５分間加熱後の活性は、初期活性の約100 ％を保
   持する。40℃で５分間加熱後の活性は、初期活性の約50
   ％を保持する。 分子量 約42,000（10％ SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   による） アミノ末端アミノ酸配列 Ser →Gly →Thr →Gly →Ser →Lys →Leu →Ser →Le
   u →Ala
3. 【請求項３】 ビブリオ属に属し、α−アガラーゼ生産
   能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にα−アガ
   ラーゼを生成蓄積させ、これを採取することを特徴とす
   るα−アガラーゼの製造方法。
4. 【請求項４】 微生物が、ビブリオ(Vibrio) sp. JT010
   7-L4であることを特徴とする請求項３記載の製造方法。