JPH07322886A - オリゴ糖及び単糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アガロースを含む基質に対し、アガロース由
来の多糖及びオリゴ糖のいずれにも作用するβ−アガラ
ーゼと、アガロース由来のオリゴ糖に特異的に作用する
α−アガラーゼを作用させることを特徴とするオリゴ糖
及び／又は単糖の製造方法、アガロース由来のオリゴ糖
を含む基質に対し、アガロース由来の多糖及びオリゴ糖
のいずれにも作用するβ−アガラーゼと、アガロース由
来のオリゴ糖に特異的に作用するα−アガラーゼを作用
させることを特徴とするオリゴ糖及び／又は単糖の製造
方法、並びに寒天又はアガロースから派生するオリゴ糖
を基質として、アガロース由来の６糖以下のオリゴ糖の
Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクト
ースとの間のα−１，３結合を加水分解するα−アガラ
ーゼを作用させることを特徴とするオリゴ糖及び／又は
単糖の製造方法。 【効果】 寒天又はアガロース由来の重合度が５以下の
オリゴ糖、及び単糖である３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガ
ラクトース、Ｄ−ガラクトースを効果的に製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、澱粉及び澱粉含有製品
の老化を防止する効果を有する寒天又はアガロース由来
のオリゴ糖及び単糖の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】澱粉及び澱粉含有製品は、食用の他に接
着剤等の用途がある。しかし、それらの製品中に水分が
含まれている場合、澱粉と水分の相互作用により製品の
柔軟性が低下し、老化現象が生じる。これは、食品では
保湿性の低下による硬化、また接着剤等の非食用製品に
おいては乾燥によるひび割れ等の劣化現象の直接要因と
なっている。この老化現象を抑制するために従来多くの
試みがなされている。例えば、澱粉含有食品に対するデ
キストリン、ソルビット、脂肪酸モノグリセリド、レシ
チン等の添加、非食用製品に対するグリセリン、ホルム
アミド等の添加が行われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記添
加物による老化防止は完全でなく、またホルムアミド等
の使用は作業環境上の危険を伴う。このため、より効果
が大きく、安全性の高い老化防止物質の開発が待望され
てきた。これに対して、近年寒天由来のオリゴ糖の老化
防止効果が強力であるという報告がなされている（特開
昭62-210955 号公報) 。その製造方法の特徴は、従来の
アガラーゼ、例えば、シュードモナス・エスピー N-7
（微工研菌寄9884号）の生産するアガラーゼ、あるいは
シュードモナス・アトランティカの生産するアガラーゼ
（シグマ社）を用い、寒天を原料としてオリゴ糖等を製
造するものであり、この方法で生産されたオリゴ糖液の
60％以上が６糖以上のオリゴ糖と難分解物で占められる
というものである（特開平2-65788 号公報, 同2-65789
号公報）。

【０００４】これらの寒天由来のアガロース分解物は、
その重合度により老化防止効果に顕著な差異が認められ
る。即ち、20糖以上のオリゴ糖では効果がなく、十分な
効果を得るためには６糖未満のオリゴ糖又は単糖とする
ことが必要である（特開昭62-210955 号公報, 同62-210
974 号公報, 特公平3-37897 号公報) 。このことから、
より強力な老化防止効果を期待するためには、重合度の
小さいオリゴ糖を選択的に得る必要がある。

【０００５】しかしながら、前述のように従来の方法で
は、６糖未満、即ち５糖以下のオリゴ糖は40％以下の少
量であり、老化防止の効果を十分に得ているとは言い難
い。特に、より高い効果が期待できる５糖、３糖等の構
成単糖の数が奇数であるオリゴ糖及び単糖については、
従来のアガラーゼの作用では原理的に生産することがで
きないという問題点を有するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記事情
に鑑み鋭意研究を行った結果、以下の方法により前記課
題を解決することができることを見出した。 （第１の方法）アガロースを含む基質に対し、アガロー
ス由来の多糖及びオリゴ糖のいずれにも作用するβ−ア
ガラーゼと、アガロース由来のオリゴ糖に特異的に作用
するα−アガラーゼを作用させることを特徴とするオリ
ゴ糖及び／又は単糖の製造方法。

【０００７】（第２の方法）アガロース由来のオリゴ糖
を含む基質に対し、アガロース由来の多糖及びオリゴ糖
のいずれにも作用するβ−アガラーゼと、アガロース由
来のオリゴ糖に特異的に作用するα−アガラーゼを作用
させることを特徴とするオリゴ糖及び／又は単糖の製造
方法。

【０００８】（第３の方法）アガロース由来のオリゴ糖
を含む基質に対し、アガロース由来のオリゴ糖に特異的
に作用するα−アガラーゼを作用させることを特徴とす
るオリゴ糖及び／又は単糖の製造方法。

【０００９】以下、本発明について詳しく説明する。本
発明の第１の方法は、アガロースを含む基質に対し、ア
ガロース由来の多糖及びオリゴ糖のいずれにも作用する
β−アガラーゼと、アガロース由来のオリゴ糖に特異的
に作用するα−アガラーゼを作用させることによりオリ
ゴ糖及び／又は単糖を製造する方法である。

【００１０】この方法に用いられる「アガロース」は、
寒天の主要な多糖成分であり、Ｄ−ガラクトースと３，
６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとが交互にα−１，
３結合及びβ−１，４結合を繰り返してなるものであ
る。「アガロースを含む基質」とは、アガロースのみか
らなるものでも、アガロースにオリゴ糖を添加したもの
であってもよい。溶媒中のアガロース濃度は、 0.1〜1.
0 重量％の範囲が好ましい。

【００１１】この方法に用いられる「アガロース由来の
多糖及びオリゴ糖のいずれにも作用するβ−アガラーゼ
（以下「β−アガラーゼＡ」という。）」とは、Ｄ−ガ
ラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースと
の間のβ−１，４結合を加水分解するβ−アガラーゼで
あって、アガロース由来の多糖及びオリゴ糖のいずれに
も作用するβ−アガラーゼであれば、特に限定されるも
のではない。

【００１２】なお、本発明において「オリゴ糖」とは、
構成単糖が２個以上８個以下の糖を指し、「多糖」と
は、単糖及びオリゴ糖以外の糖を指す。但し、本発明に
おける基質としてのオリゴ糖としては、構成単糖が２個
以上６個以下のものが好ましい。前記β−アガラーゼＡ
としては、ビブリオ属に属する微生物が生産するものが
好ましく、具体的にはビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4
由来のagarase0107 が挙げられる。

【００１３】このβ−アガラーゼＡの一例であるagaras
e0107 の理化学的性質を以下に示す。 （１）酵素活性測定法 酵素反応によって生じた還元糖の量をネルソン−ソモギ
法により測定する。詳しくは、以下の通りである。20mM
トリス塩酸緩衝液(pH8.0) に溶解した 0.2％の低温融解
性アガロース（シグマ製）のゲルを作製し、この90μｌ
を基質として、β−アガラーゼＡを含む溶液10μｌと混
合し、30℃にて、５〜15分間、好ましくは５分間反応さ
せる。反応終了後、銅試薬 100μｌを加え、沸騰水中で
10分間加熱する。加熱後、水で急速冷却し、ネルソン試
薬 100μｌを加え、蒸留水で全容積を2.5ml にする。60
分後に660nm の吸光度を測定し、測定値をガラクトース
量に換算し、１分間当り１マイクロモルのガラクトース
量に相当する還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとする。 （２）基質特異性及び作用 少なくとも寒天及びアガロースをエンド型に分解し、低
分子化する反応を触媒する。

【００１４】アガロース由来の多糖及びアガロース由来
のオリゴ糖を基質として、それらの、Ｄ−ガラクトース
と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のβ−
１，４結合を加水分解する。これに対して、アルギン
酸、カラギーナン等の多糖を分解しなかった。 （３）至適 pH pHを４及び５（酢酸緩衝液）、６及び７（リン酸緩衝
液）、８（トリス−塩酸緩衝液）、９及び10（グリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液）に調整した 0.2％の低温融
解性アガロース（シグマ製）のゲル90μｌにβ−アガラ
ーゼＡを含む溶液(0.2μg/μｌ）10μｌを加え、30℃に
て５分間反応させた。反応終了後、銅試薬100μｌを加
え、沸騰水中で10分間加熱した。加熱後、水で急速冷却
し、ネルソン試薬 100μｌを加え、蒸留水で全容積を2.
5ml にした。60分後に660nm の吸光度を測定した。その
結果、図１に示したように至適 pH は、７〜 8.5の中性
から弱アルカリ性であった。 （４）至適温度 20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) に溶解した 0.2％の低
温融解性アガロース（シグマ製）のゲル90μｌにβ−ア
ガラーゼＡを含む溶液（0.08μg/μｌ）10μｌを加え、
25℃で２, ５,10, 20, 30, 40, 50, 60 分間保温した
後、それぞれ生成した還元糖の量をネルソン−ソモギ法
により測定した。同様にして30, 35, 40℃での反応生成
物の還元糖の量を測定した。この結果、30℃での反応生
成物の量が最も多くなったので、オリゴ糖を得るための
至適温度は30℃と決定した。これを図２に示した。 （５）pH安定性 pHを 3.6〜5.6 （酢酸緩衝液）、 5.5〜7.6 （リン酸緩
衝液）、 7.5〜９（トリス−塩酸緩衝液）、９〜10（グ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液）に調整した酵素溶液
の活性を酵素活性測定法に従って測定し、各pHでの活性
値を100 ％とし、これを初期値とした。更に各酵素溶液
を４℃で１週間保存した後、残存活性を測定し、初期値
の80％以上の活性を保持するpH領域を求めたところ、６
〜９であった。 （６）熱安定性 該酵素溶液(0.1μg/μｌ）10μｌを30℃、40℃、50℃、
60℃の水浴中で15分間加熱した後、酵素活性測定法に従
って酵素活性を測定した。該酵素溶液の非加熱時の活性
を100 ％として活性を比較したところ、図３に示したよ
うに、30℃、40℃では約100 ％、50℃で約85％の残存活
性を示した。なお60℃ではほぼ完全に失活した。 （７）等電点 ファルマシア社製ファストゲルIEF4-6.5を用いて、同社
製ファストシステム等電点測定装置にて測定したところ
約6.3 であった。 （８）分子量 SDSを含むポリアクリルアミドゲルの濃度が10〜20％の
グラジエントゲルで、分子量マーカー（分子量94,000の
ホスホリラーゼ、67,000の牛血清アルブミン、43,000の
卵白アルブミン）とともに電気泳動した結果、該酵素の
分子量は約95,000と求められた。また、該酵素の遺伝子
の全塩基配列から推定されるアミノ酸配列から分子量を
計算すると約105,300 と求められた。該酵素の遺伝子の
全塩基配列は、特願平5-96549 号明細書に示されてい
る。これにより、本酵素は公知のアガラーゼと区別され
る。 （９）アミノ末端アミノ酸配列 該酵素のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法によ
り決定した。該酵素溶液(0.4μg/μｌ）100 μｌを、
0.1％ SDSを含む蒸留水を透析外液として透析し、その
酵素溶液をアミノ酸配列分析装置477Aプロテインシーク
エンサー（アプライドバイオシステムズ社製）により、
アミノ末端側７個のアミノ酸配列を決定した。その結
果、配列は、Ala →Thr →Leu →Val →Thr →Ser →Ph
e であった。 （10）その他の特性 溶解性：水に可溶 紫外部吸収：λmax=280nm 前記agarase0107 を生産する菌であるビブリオ(Vibrio)
sp. JT0107-L4は、海水中から分離されたものであり、
以下に示す菌学的性質を有する。 菌学的性質： １）形態 マリンブロス2216培地に生育した細胞について、 （イ）細胞の形態は桿菌で、大きさは0.25〜1.2 μm ×
0.5〜2.5 μm （ロ）運動性を有し、鞭毛を有す （ハ）グラム染色性は陰性 （ニ）胞子は形成しない ２）生育状態 マリンブロス2216平板培地での培養において、 （イ）18〜25℃で良好に生育する （ロ）淡黄色の色素沈着を有する （ハ）菌体の生育に従って寒天ゲルは液化される マリンブロス2216の液体培養において、 （ニ）pH７, ８, ９において旺盛に生育する ３）生理学的性質 （イ）Ｏ−Ｆテスト Ｆ （ロ）カタラーゼテスト 陽性 （ハ）オキシダーゼテスト 陽性 （ニ）グルコースからのガスの生成 無 （ホ）フォゲス−プロスカウエル反応 陰性 （ヘ）メチルレッド反応 陽性 （ト）ゼラチン分解能 有 （チ）エスクリン分解能 有 （リ）硝酸還元能 有 （ヌ）通性嫌気性 ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4は、平成３年３月６日
付で、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
FERM BP-4541 として寄託されている。

【００１５】このビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4を用
いて、前記agarase0107 を生産するためには、まず、寒
天又はアガロースを炭素源として該微生物の液体培養を
行う。培養温度は、前記酵素を生産する範囲内で変更し
得るが、通常18〜25℃程度の回転振とう培養、好ましく
は20℃、毎分 150回転の振とう培養で、培養時間は３〜
８日間程度、好ましくは５〜７日間程度とする。培養終
了後、培養液から遠心分離により固形物を除去して、培
養上清を回収する。培養上清に、80〜90％飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、分泌生産された蛋白質を
塩析させる。塩析物は遠心分離により集め、20mMトリス
−塩酸緩衝液(pH8.0) を透析外液として透析を行い、透
析サンプルをQAE-Toyopearl 及びMono-Qなる強陰イオン
交換カラムに供し、塩化ナトリウムを用いた直線濃度勾
配法により蛋白質を順次溶出させ、agarase0107 のみを
分離する。

【００１６】本発明に用いられる「アガロース由来のオ
リゴ糖に特異的に作用するα−アガラーゼ」とは、Ｄ−
ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース
との間のα−１，３結合を加水分解し、アガロース由来
のオリゴ糖に特異的に作用する酵素であれば、特に限定
されるものではないが、ビブリオ属に属する微生物由来
で、アガロース由来の６糖以下のオリゴ糖のＤ−ガラク
トースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間
のα−１，３結合を加水分解するα−アガラーゼが好ま
しく、具体的には、前記ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-
L4由来のα−NAOS hydrolase等が挙げられる。

【００１７】本発明に用いられるα−アガラーゼの一例
であるビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4由来のα−NAOS
hydrolaseの理化学的性質を以下に示す。 （１）酵素活性測定法 本酵素の精製品又は部分精製品の活性測定は以下のよう
に行う。ネオアガロビオースを基質として酵素反応を行
った後、未分解のネオアガロビオースの量を定量するこ
とにより、分解されたネオアガロビオースの量を高速液
体クロマトグラフィーを用いて定量する。詳しくは、以
下の通りである。

【００１８】20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8) に溶解
した0.１％ネオアガロビオース溶液を調製し、この90μ
ｌを基質として、酵素溶液10μｌと混合し、30℃にて、
５〜30分間、好ましくは10分間反応させた後、沸騰水中
で１分間加熱することによって反応を停止させる。この
反応溶液10μｌを内径4.5mm 、長さ250mm のカプセルパ
ックC-18（資生堂製）なるカラムに供し、水を溶離液と
して１ml/minの流速で溶出させたとき約 4.5分の保持時
間を示す酵素反応によって分解されなかったネオアガロ
ビオースの量を定量する。この値から分解されたネオア
ガロビオースの量に逆算し、１分間当り１マイクロモル
のネオアガロビオースを分解する酵素量を１Ｕとする。 （２）基質特異性及び作用 20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.8) に、ネオアガロビオ
ース、ネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオー
ス、アガロースの各基質を 0.3％濃度に調整し、30℃に
て酵素反応を行った。ネオアガロビオースの分解活性を
100 とするときのそれぞれの活性割合を表１に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】α−NAOS hydrolaseの作用様式の特定 0.3 ％ネオアガロヘキサオース溶液90μｌに該酵素溶液
10μｌ（50μg/ml) を加え、恒温水槽中30℃で３時間反
応した。反応生成物の10μｌを高速液体クロマトグラフ
ィーで分取するために、内径4.5mm 、長さ250mm のカプ
セルパックC-18（資生堂製）なるカラムに供し、水を溶
離液として１ml/minの流速で溶出させた。主な反応生成
物は、約 6.5〜7.2 分の保持時間を示した。この画分を
分取し、ブタノール：エタノール：水＝３：１：１の組
成からなる展開溶媒で薄層クロマトグラフィーに供した
ところ、Ｒｆ＝0.21にスポットを持つ反応生成物を確認
した。該画分を凍結乾燥後、高速原子衝撃法質量分析装
置によって、質量測定を行ったところ 792と測定され
た。これにより、該画分に含まれる反応生成物は非還元
末端の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが切断さ
れて生じるアガロペンタオースなる５糖であることが解
った。一方、還元末端のＤ−ガラクトースが切断されて
生じる分子量 774に相当する５糖は得られなかった。更
に、0.2 ％ネオアガロテトラオース溶液を基質溶液とし
て酵素反応を行ったとき、最も優先的に得られる反応生
成物の質量数は 486であった。これにより該質量数に相
当する反応生成物は、非還元末端の３，６−アンヒドロ
−Ｌ−ガラクトースが切断されて生じるアガロトリオー
スなる３糖であることが解った。一方、還元末端のＤ−
ガラクトースが切断されて生じる分子量 468に相当する
３糖は得られなかった。更に、0.2 ％ネオアガロビオー
ス溶液を基質溶液として酵素反応を行ったときの反応生
成物は、 ¹Ｈ−ＮＭＲの測定結果からＤ−ガラクトース
及び３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであること
が明らかとなった。以上のことから、α−NAOS hydrola
seは、非還元末端の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクト
ースを認識し、α−１，３結合を加水分解するエキソ型
の新規酵素であることが明らかとなった。３，６−アン
ヒドロ−Ｌ−ガラクトースの ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを
図４に示した。 （３）至適 pH pHを5.5 から7.7 （リン酸緩衝液）、7.7 から8.9 （ビ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液）、9.0 から9.4 （グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液）に調整した0.1 ％ネオ
アガロビオース溶液90μｌに酵素溶液（40μg/ml) 10μ
ｌを加え、30℃にて10分間反応させた後、沸騰水中で１
分間加熱することによって反応を停止させた。この反応
溶液10μｌを内径4.5mm 、長さ250mm のカプセルパック
C-18（資生堂製）なるカラムに供し、水を溶離液として
１ml/minの流速で溶出させたとき約4.5 分の保持時間を
示す酵素反応によって分解されなかったネオアガロビオ
ースの量を定量した。ネオアガロビオース分解能の最も
高かったpHの活性を100％として各pHの相対活性値を図
５に示した。これにより反応至適pHは、７〜8.4 の中性
から弱アルカリ性であることがわかった。 （４）至適温度 酵素の失活が最小限に抑制され、かつ酵素反応が速やか
に進む温度は、30℃であった。 （５）安定性 pH安定性 本酵素を、前述の至適pHを測定した場合の各緩衝液で酵
素溶液を調製し、これを30分間30℃で保温した後、活性
を測定し、それぞれ非加熱時の活性を100 ％とした場
合、残存活性が80％を越える範囲として定めると、pH６
〜９で安定であった。

【００２１】熱安定性 該酵素溶液（40μg/ml）10μｌを30℃、35℃、40℃、50
℃、60℃の水浴中で５分間加熱した後、0.1 ％ネオアガ
ロビオース溶液90μｌ（pH７.8）に加え、30℃にて10分
間反応させた後、沸騰水中で１分間加熱することによっ
て反応を停止させた。この反応溶液10μｌの酵素活性を
測定し、非加熱時の酵素活性を100 ％として、加熱後の
残存活性を比較すると30℃、35℃では約100 ％、40℃で
約50％の残存活性を示した。なお、60℃ではほぼ完全に
失活した。この結果を図６に示した。 （６）ミカエリス定数及び最大反応速度 ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクト
ースがα−１，３結合してなるネオアガロビオースを基
質として、種々の濃度の基質溶液を作製し、これに該酵
素溶液（40μg/ml）10μｌを加え、酵素活性測定法に従
い酵素活性を測定した。基質濃度の逆数と、それに対応
する酵素活性の逆数を二次元座標上にプロットし、ライ
ンウェーバーバルクの式を求め、これよりミカエリス定
数は、4.28±5.0mM 、最大反応速度は、87 U/mg 蛋白質
であることがわかった。 （７）分子量 分子量は SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、及
びゲル濾過法で測定した。 SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法では、常法に従って、 SDSを含むポリアク
リルアミドゲルの濃度が10％のゲルで、分子量マーカー
（分子量 200,000のミオシン、 116,000のβ−ガラクト
シダーゼ、66,000の牛血清アルブミン、42,000のアルド
ラーゼ、30,000のカルボニックアンハイドラーゼ）とと
もに電気泳動を行い、移動度から分子量を求めたとこ
ろ、約42,000であった。ゲル濾過法では、ファルマシア
社製のSuperdex 200なるゲル濾過カラムを用いて、分子
量マーカー（分子量160,000 のイムノグロブリンＧ、6
7,000のヒト血清アルブミン、35,000のβ−ラクトグロ
ブリン、12,400のチトクロームＣ）のゲル濾過を行い、
各蛋白質の溶出量を測定した後、該酵素のゲル濾過を行
い、その溶出量とマーカー蛋白質の溶出量を比較計算し
分子量を測定したところ、約84,000（±16,000)であっ
た。 （８）アミノ末端アミノ酸配列 該酵素のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分解法によ
り決定した。該酵素溶液（１μg/μｌ）10μｌを、10％
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を常法に従って
行った後、該酵素をウェスタンブロッティング法により
バイオダインＡ（日本ポール社製）なる膜に吸着させ、
これをアミノ酸配列分析装置477A及び120Aプロテインシ
ークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）によ
り、アミノ末端側10個のアミノ酸配列を決定した。その
結果、配列は Ser→Gly →Thr →Gly →Ser →Lys →Le
u →Ser →Leu →Ala であった。 （９）その他の特性 溶解性：水に可溶 紫外部吸収スペクトル：λmax=280nm 本発明に用いられるα−アガラーゼは、ビブリオ属に属
し、α−アガラーゼ生産能を有する微生物を培地に培養
し、培養物中にα−アガラーゼを生成蓄積させ、これを
採取することにより得ることができる。

【００２２】ここで用いる微生物としては、ビブリオ属
に属し、α−アガラーゼを生産する能力を有する微生物
であれば、いずれでも用いることができる。その例とし
ては、前述したビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4が挙げ
られる。培養に用いる培地は、前記微生物が利用し得る
窒素源、無機物等を含み、寒天又はアガロース等を炭素
源として含むものを用いる。

【００２３】寒天、アガロースは、市販のものを用いる
ことができる。寒天、アガロース以外の炭素源として
は、肉エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン
等が挙げられ、好ましくはペプトンを用いる。窒素源と
しては、酵母エキスを用いる。更に、塩類としては、塩
化ナトリウム、クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナ
トリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリ
ウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロン
チウム、ホウ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化
ナトリウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウ
ム等を組み合わせて用いる。

【００２４】寒天、アガロース以外の前記成分をすべて
含んだマリンブロス2216なる培地（ディフコ社製）に、
寒天又はアガロースを加えて用いることもできる。ま
た、前記塩類を適度に含む人工海水、例えばシーライフ
（マリンテック社製）を用い、これにペプトン、酵母エ
キス、寒天等を加えた培地を用いることもできる。寒天
又はアガロースの濃度は、 0.1〜1.5 ％が好ましく、こ
の際、寒天又はアガロースの濃度を任意に変えることに
より固体培地、液体培地を作り分けることが可能である
が、酵素生産を目的とする場合は、濃度 0.1〜0.4 ％の
液体培養が好ましく、菌体の保存を目的とするときは、
濃度 1.2〜1.5 ％の固体培養が好ましい。

【００２５】培養条件は、培地の組成によって多少異な
るが、培養温度は、15〜30℃、好ましくは20〜25℃、pH
は、 7.0〜8.5 、好ましくは 7.8〜8.2 、培養時間は、
15〜48時間、好ましくは18〜24時間である。目的とする
酵素は、菌体内に存在するので、公知の菌体破砕法、例
えば超音波破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破
砕法、ダイノミル破砕法等を行えばよく、その菌体破砕
物から目的とする酵素が分離精製される。好ましい菌体
破砕法としては、ダイノミル破砕法が挙げられる。例え
ば、菌体破砕物から遠心分離又は濾過により固形物を除
去した後、上清に30〜90％飽和、好ましくは40〜70％飽
和の硫酸アンモニウム等の塩を加えて、目的酵素を塩析
させる。この塩析物を適当な緩衝液（pH 7.0〜8.5)、好
ましくはリン酸カリウム緩衝液（pH 7.8) に懸濁し、こ
の懸濁液の容積の50〜200 倍の同緩衝液を外液として透
析を数回繰り返し、脱塩し、再溶解させる。これを市販
の陰イオン交換性カラム、ゲル濾過カラム、ハイドロキ
シアパタイトカラム等のカラムクロマトグラフィーを組
み合わせて電気泳動的に単一バンドになるまで精製する
ことができる。次に、本発明の第１の方法の好ましい態
様について具体的に説明する。

【００２６】まず、寒天等から得られるアガロースを
0.1〜1.0 重量％、好ましくは 0.1〜0.5 重量％含むも
のを基質とし、これにβ−アガラーゼＡを基質１ｇ当り
１〜300U、好ましくは５〜50U の範囲で添加する。反応
は、温度30〜45℃、好ましくは30〜40℃、pH７〜8.5 、
好ましくは 7.7〜8.3 の条件下で行う。反応時間は、基
質量、pH、温度、攪拌速度、目的とする反応生成物のオ
リゴ糖の重合度等によって大きく異なるが、通常３〜24
時間である。

【００２７】次に、α−アガラーゼを基質１ｇ当り 0.3
〜300U、好ましくは３〜150Uの範囲で添加する。反応
は、温度25〜35℃、好ましくは25〜30℃、pH 7.5〜8.5
、好ましくは 7.8〜8.2 の条件下で行う。反応時間
は、基質量、pH、温度、攪拌速度等によって大きく異な
るが、通常１〜20時間である。このようにして得られた
反応物中には、５糖以下のオリゴ糖及び単糖が70〜100
重量％の範囲で含まれている。この場合、反応物中の単
糖の比率を上げるためには、基質１ｇ当りのβ−アガラ
ーゼＡの量を増やし反応時間を長くすることにより、生
成するネオアガロビオースの量を増やせばよく、５糖及
び／又は３糖の比率を高めるためには、β−アガラーゼ
Ａの量を減らし反応時間を短くし５糖及び／又は３糖を
選択的に得ればよい。

【００２８】前記混合物から分離精製することにより、
５糖であるアガロペンタオース（Ｄ−ガラクトース（β
−１，４）３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（α
−１，３）Ｄ−ガラクトース（β−１，４）３，６−ア
ンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（α−１，３）Ｄ−ガラク
トース、分子量：792)、３糖であるアガロトリオース
（Ｄ−ガラクトース（β−１，４）３，６−アンヒドロ
−Ｌ−ガラクトース（α−１，３）Ｄ−ガラクトース、
分子量：486)、及び単糖である３，６−アンヒドロ−Ｌ
−ガラクトースを得ることができる。

【００２９】この場合の分離精製法としては、例えば、
シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー、又は活
性炭を用いたカラムクロマトグラフィーが挙げられる。
本発明の第１の方法において、β−アガラーゼＡ及びα
−アガラーゼが同一の微生物から得られたものである場
合は、この二種類の酵素の反応におけるpH、温度等を変
える必要はなく、同一条件で反応することができ、更
に、β−アガラーゼＡ及びα−アガラーゼを同時にアガ
ロースに作用させることも可能である。これにより、反
応工程の簡略化が可能である。具体的には、前述したビ
ブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4から得られるα−アガラ
ーゼ（α-NAOS hydrolase)及びβ−アガラーゼＡ（agar
ase0107)を用いた場合である。

【００３０】また、β−アガラーゼＡの反応条件をコン
トロールすることにより、６糖よりも大きい偶数のオリ
ゴ糖を選択的に生成させ、これを基質としてα−アガラ
ーゼを作用させれば、選択的に生成されたオリゴ糖より
重合度が１少ない奇数のオリゴ糖を得ることができる。
次に、本発明の第２の方法について説明する。

【００３１】本発明の第２の方法は、アガロース由来の
オリゴ糖を含む基質に対し、β−アガラーゼＡと、アガ
ロース由来のオリゴ糖に特異的に作用するα−アガラー
ゼを作用させることによりオリゴ糖及び／又は単糖を製
造する方法である。ここで、「アガロース由来のオリゴ
糖を含む基質」とは、オリゴ糖のみからなる場合、及び
他に添加剤等を含む場合の両方を含むものである。な
お、前述したように、オリゴ糖とは、２糖以上８糖以下
の糖をいうが、２糖以上６糖以下の糖が好ましい。

【００３２】このアガロース由来のオリゴ糖としては、
ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテトラオース、ネ
オアガロビオース等が挙げられる。このようなオリゴ糖
は市販品（シグマ社製）を用いることもできる。また、
このようなオリゴ糖を合成により得る方法としては、前
述したβ−アガラーゼＡをアガロースに作用させること
により得る方法、及び従来より用いられているアガロー
ス由来の多糖には作用するが、６糖以下のオリゴ糖には
作用しないβ−アガラーゼ（以下「アガラーゼＢ」とい
う。）をアガロースに作用させる方法が挙げられる。

【００３３】このアガラーゼＢの具体例としては、シュ
ードモナス・エスピー N-7（微工研菌寄9884号）の生産
するアガラーゼ、又はシュードモナス・アトランティカ
の生産するアガラーゼ（シグマ社）等が挙げられる。こ
れらのアガラーゼＢの理化学的性質、生産菌の菌学的性
質、及び酵素の生産方法等については、文献に詳しく記
載されている（特開平1-228465号公報、L. M. Morrice
ら、European Journalof Biochemistry, 135, 553-558
(1983)等）。

【００３４】なお、α−アガラーゼ及びβ−アガラーゼ
Ａについては、本発明の第１の方法と同様である。次
に、本発明の第２の方法の好ましい態様について具体的
に説明する。まず、アガロース由来のオリゴ糖を 0.1〜
2.0 重量％、好ましくは 0.3〜1.0重量％含むものを基
質とし、これにβ−アガラーゼＡを基質１ｇ当り 0.5〜
20U、好ましくは１〜10U の範囲で添加する。反応は、
温度30〜45℃、好ましくは30〜40℃、pH７〜8.5 、好ま
しくは 7.7〜8.3 の条件下で行う。反応時間は、基質
量、pH、温度、攪拌速度等によって大きく異なるが、通
常３〜24時間である。

【００３５】次に、α−アガラーゼを基質１ｇ当り0.５
〜50U 、好ましくは1.５〜15U の範囲で添加する。反応
は、温度25〜35℃、好ましくは25〜30℃、pH 7.5〜8.5
、好ましくは 7.8〜8.2 の条件下で行う。反応時間
は、基質量、pH、温度、攪拌速度等によって大きく異な
るが、通常１〜20時間である。なお、本発明の第２の方
法では、本発明の第１の方法と同様β−アガラーゼＡ及
びα−アガラーゼを同時にアガロース由来のオリゴ糖に
作用させることも可能である。この場合、本発明の第１
の方法と同様に、両酵素が同じ微生物由来のものであれ
ば、反応工程の簡略化が可能である。具体的には、前述
したビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4から得られるα−
アガラーゼ（α-NAOS hydrolase)及びβ−アガラーゼＡ
（agarase0107)を用いた場合である。

【００３６】このようにして得られた反応物中には、５
糖以下のオリゴ糖及び単糖が70〜100 重量％の範囲で含
まれている。この場合、反応物中の単糖の比率を上げる
ためには、ネオアガロテトラオースを基質とし、β−ア
ガラーゼＡ（agarase0107)の反応条件を前記範囲内で調
節し、ネオアガロテトラオースをネオアガロビオースに
完全分解すればよい。反応物中の５糖の割合を増やすた
めには、ネオアガロオクタオースを基質とし、β−アガ
ラーゼＡ(agarase0107) の反応条件を前記範囲内で調節
し、ネオアガロオクタオースをネオアガロヘキサオース
に部分分解すればよい。また、反応物中の３糖の割合を
増やすためには、ネオアガロヘキサオースを基質とし、
β−アガラーゼＡ（agarase0107)の反応条件を前記範囲
内で調節し、ネオアガロヘキサオースをネオアガロテト
ラオースに部分分解すればよい。

【００３７】前記混合物から分離精製することにより、
アガロペンタオース、アガロトリオース、及び単糖であ
るＤ−ガラクトース、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラク
トースを得ることができる。次に、本発明の第３の方法
について説明する。本発明の第３の方法は、アガロース
由来のオリゴ糖を含む基質に対し、アガロース由来のオ
リゴ糖に特異的に作用するα−アガラーゼを作用させる
ことによりオリゴ糖及び／又は単糖を製造する方法であ
る。ここで、「アガロース由来のオリゴ糖を含む基質」
とは、本発明の第２の方法で説明したものと同様であ
り、「α−アガラーゼ」については、本発明の第１の方
法と同様である。

【００３８】本発明の第３の方法によって、重合度が低
く、かつ非還元末端がＤ−ガラクトースであるオリゴ
糖、及び／又は単糖を生産することができる。即ち、ま
ず、寒天又はアガロース由来の、アガロオクタオース、
アガロヘキサオース、アガロテトラオース、ネオアガロ
オクタオース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテ
トラオース等のオリゴ糖、好ましくはこれらのうち２糖
〜６糖を、それぞれ単独で又は任意の割合の混合物とし
て原料とし、前述したα−アガラーゼ、例えばα−NAOS
hydrolaseを作用させることにより、更に重合度の低い
オリゴ糖及び／又は単糖を生産することができる。ここ
で用いる原料は、必ずしも精製されたものを使う必要は
なく、市販品を用いてもよく、また寒天の酸分解、又は
市販のアガラーゼによって得たものを用いてもよい。こ
れらの原料をリン酸緩衝液等の溶媒に溶解し、濃度を
0.1〜1.0 ％、好ましくは 0.2〜0.6 ％に調整する。こ
れに該α−アガラーゼを加え、25〜35℃で反応を行う。
反応時間は、２〜24時間で任意に調整し、酵素量を適当
に増減することにより、重合度の異なるオリゴ糖を作る
ことができる。反応液中のオリゴ糖及び／又は単糖は、
活性炭又はシリカゲルを充填剤としたカラムクロマトグ
ラフィーを用いて、重合度毎に分離精製することができ
る。また、この酵素反応に使用する場合のα−アガラー
ゼは、完全精製する必要はなく、部分精製品で十分な効
果を得ることができる。

【００３９】以上のようにして得られるオリゴ糖は、ア
ガロビオース、アガロトリオース、アガロペンタオース
等であり、単糖は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクト
ース、Ｄ−ガラクトースである。なお、本発明に用いら
れるβ−アガラーゼＡ及びα−アガラーゼは、完全精製
する必要はなく、部分精製品で十分な効果を得ることが
できる。

【００４０】

【実施例】以下、製造例及び実施例によって本発明を具
体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定される
ものではない。 ［製造例１］ α−NAOS hydrolaseの製造 500ml の人工海水（商品名シーライフ、マリンテック社
製）を調製し、これにペプトン５ｇ（日本製薬社製）、
酵母エキス１ｇ（ディフコ社製）を加え、pH8.0 に調整
後、3,000ml 容の三角フラスコに移し、寒天１ｇ（極東
社製）を加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行っ
た。これに−80℃で40％グリセロール中に保存したビブ
リオ(Vibrio) sp. JT0107-L4を室温で融解後、その１ml
を接種し、25℃、毎分 150回転で24時間培養した。得ら
れた培養液を前培養液とした。

【００４１】本培養は、以下の手順で実施した。5,000m
l 容のジャーファーメンター容器を用いて人工海水（商
品名シーライフ、マリンテック社製）3,000ml を調製
し、これにペプトン60ｇ（日本製薬社製）、酵母エキス
12ｇ（ディフコ社製）を加え、pHを8.0 に調整後、寒天
（極東社製）12ｇを加え、オートクレーブを用いて滅菌
操作を行った。これに前培養で得られた培養液の30mlを
接種し、25℃、毎分600回転で20時間培養し、得られた
菌体をシャープレス遠心分離装置で回収し、湿重量で約
50ｇを得た。これを20mMリン酸緩衝液(pH7.8) に懸濁し
総容量を100ml とし、直径0.2mm のガラスビーズ150ml
と混合し、ダイノミル破砕装置を用いて毎分3,000 回転
で15分間菌体破砕を行った。

【００４２】菌体破砕懸濁液は、20,000×ｇ、60分間の
遠心分離によりガラスビーズ、菌体デブリスを除去し、
得られた上清100ml に40％飽和となるように硫酸アンモ
ニウムを加え、生じた沈澱を 6,000×ｇ、30分間で除去
し、上清に更に70％飽和となるように硫酸アンモニウム
を加え、生じた沈澱を 6,000×ｇ、30分間の遠心により
回収し、30mlの20mMリン酸緩衝液(pH7.8) に懸濁し、同
緩衝液5,000ml で計３回透析を行い脱塩し、再溶解を施
した。

【００４３】この透析液を予め20mMリン酸緩衝液で平衡
化した QAE-Toyopearl（東ソー製）なる強陰イオン交換
樹脂34mlを充填したカラム（2.2cm ×９cm）に吸着さ
せ、20mMリン酸緩衝液(pH7.8) から0.5Mの塩化ナトリウ
ムを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.8) への直線濃度勾配法
（総溶出量300ml)で溶出させ、塩化ナトリウム濃度が0.
3Mと0.4Mの間に溶出してくる画分50mlを回収した。

【００４４】この画分を同緩衝液で200 mlに希釈し、 1
00mlずつ２本の画分に分け、それぞれを、予め20mMリン
酸緩衝液で平衡化したMono-Q（ファルマシア社製）なる
強陰イオン交換樹脂を担体としたカラム(1.0cm×10cm）
に吸着させ、前述の直線濃度勾配法（総溶出量 120ml)
により溶出させ、0.3Mから0.4Mの塩化ナトリウム濃度で
溶出する画分16mlを得た。これを再度、同緩衝液で４倍
に希釈し、Mono-Qでのクロマトグラフィーを繰り返し、
0.3Mから0.35M で溶出される画分８mlを得た。これを２
mlずつ４本に分別し、それぞれグレースジャパン社製遠
心限外濾過膜セントリコン50を用いて0.5ml に濃縮し
た。これを Superdex200（ファルマシア社製）なるゲル
濾過担体を用いたカラム(1.0cm×30cm）に供し、0.1Mの
塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.8) で溶出
させ、溶出量13.6mlから14.4mlの画分を得た。

【００４５】これを超純水を用いて４mlにし、HCA-8010
G （三井東圧化学社製）なるハイドロキシアパタイトを
充填したカラムを用いて10mMリン酸緩衝液(pH6.8）から
175mM リン酸緩衝液(pH6.8）への直線濃度勾配（溶出総
量15ml）にて溶出させ、7.5ml から8.5ml に溶出してく
る画分を得た。この画分をドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したと
ころ、目的酵素は約42,000の分子量を示した。この画分
の比活性は、菌体破砕時の比活性に比べて350 倍に上昇
し、全活性は 4.4Ｕ、活性収率は 2.5％であった。

【００４６】［製造例２］ agarase0107 の製造 ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4の培養液1,000ml を遠
心分離し、約900ml の培養上清と固形物とに分離した。
蛋白質を塩析するために、この培養上清に硫酸アンモニ
ウムを90％飽和になるように攪拌しながら徐々に添加
し、５℃で一晩放置した。生じた塩析物を遠心分離によ
り回収し、セロハンチューブを透析膜として、20mMトリ
ス−塩酸緩衝液(pH8.0) 3,000ml に対して透析した。透
析は５℃で18時間行い、その間透析外液を２回交換し
た。得られたサンプルを、予め20mMトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0) で平衡化したＱＡＥトヨパール（東ソー社製の
強陰イオン交換樹脂）を担体としたカラム（１cm×2.5c
m ）に吸着させた。このサンプルを、20mMトリス−塩酸
緩衝液(pH8.0) から0.5M塩化ナトリウムを含有する20mM
トリス−塩酸緩衝液(pH8.0) への直線濃度勾配法（総溶
出量４ml）により溶出させ、塩化ナトリウム濃度0.5M以
降に溶出してくる画分６mlを回収した。得られた画分に
20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) を加えて24mlとし、前
述の緩衝液で予め平衡化したＭＯＮＯ−Ｑ（ファルマシ
ア社製の強陰イオン交換樹脂）を担体としたカラム(0.5
cm×５cm）に吸着させて前述の直線濃度勾配法（総溶出
量15ml）により溶出させた。

【００４７】agarase0107 は、0.5Mの塩化ナトリウム濃
度で溶出し、分離することができた。波長280nm におけ
る紫外吸収の吸光度からagarase0107 の収量を求めたと
ころ、培養液1,000ml 当り0.91mgであった。また、酵素
活性を測定した結果、酵素１mg当り約6.3 Ｕの力価を示
した。ここで、ガラクトース量に換算して、１分間当り
１マイクロモルのガラクトース量に相当する還元糖を得
る酵素活性を１Ｕとした。この結果より、agarase0107
の単位重量当りの活性は、培養上清と比較して約48倍に
上昇したことがわかる。

【００４８】更に、得られたagarase0107 を、ＳＤＳを
含有するポリアクリルアミドゲルの濃度が10〜20％のグ
ラジエントゲルを用いて、分子量マーカー（分子量94,0
00のホスホリラーゼ、分子量67,000のウシ血清アルブミ
ン及び分子量43,000の卵白アルブミン）と共に電気泳動
してagarase0107 の分子量を求めたところ、約95,000で
あった。また、agarase0107 の等電点をファルマシア社
製のファストゲルシステムによって測定したところ、約
6.3 であった。

【００４９】［実施例１］ ３，６−アンヒドロ−Ｌ−
ガラクトースの製造 アガロース100mg を20mlの水に溶解した溶液に、ビブリ
オ(Vibrio) sp. JT0107-L4から単離精製した2Uのagaras
e0107 を0.2ml のトリス−塩酸緩衝液（pH8.0)に溶解し
た溶液を加え、恒温水槽中30℃で18時間反応させた。こ
の後、ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4から単離精製し
た3.8Uのα−NAOS hydrolaseを１mlのリン酸カリウム緩
衝液(pH7.8) に溶解した溶液を加え、更に同温度で４時
間反応を行った。反応溶液を凍結乾燥した後、５mlのメ
タノールを加え、可溶分をイアトロビーズ（ヤトロン社
製）なるシリカゲル担体を用いたカラム（15mmφ×840m
m)に添加し、クロロホルム：メタノール：水＝70：28：
２の組成からなる溶液からクロロホルム：メタノール：
水＝53：45：２の組成からなる溶液への直線濃度勾配法
（総溶出量960ml)にて溶出を行ったところ、クロロホル
ム：メタノール：水＝68.5：29.5：２から66.7：31.3：
２の溶媒組成の時に、薄層クロマトグラフィーでＲｆ＝
0.7〜0.8 （展開溶媒；ブタノール：エタノール：水＝
３：１：１）に反応生成物を確認した。この溶出液の溶
媒をエバポレーターで留去し、20mgを得た。この50μｇ
を高速原子衝撃法質量分析装置にて質量測定を行ったと
ころ、該物質の質量数は、 162であった。更に、後述す
る実施例４に示した分析結果から該物質は、３，６−ア
ンヒドロ−Ｌ−ガラクトースであることが明らかとなっ
た。但し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは、
ピラノース型閉環構造をとらずに１位の炭素に水酸基が
２個付加しているジオール型で存在する場合もあり、そ
の場合の分子量は 180となる。３，６−アンヒドロ−Ｌ
−ガラクトースの構造を以下に示す。

【００５０】

【化１】

【００５１】［実施例２］ アガロトリオースの製造 ネオアガロヘキサオース30mgを10mlのリン酸緩衝液(pH
7.8) に溶解した溶液に、ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107
-L4から単離精製した0.1Uのagarase0107 を0.1ml のリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.8) に溶解した溶液を加え、30
℃で３時間反応後、ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107-L4か
ら単離精製した1.5Uのα−NAOS hydrolaseを0.1ml のリ
ン酸緩衝液(pH7.8) に溶解した溶液を加え、30℃で５時
間反応させた。反応溶液を活性炭カラム（５mmφ×50m
m）に吸着せしめ、１mlの水、１mlの10％エタノールで
洗浄した後、３mlの24％エタノールで溶出した。この24
％エタノール画分の溶媒をロータリーエバポレーターを
用いて留去し、更に凍結乾燥を行い重量を測定したとこ
ろ、11.4mgであった。この反応生成物を薄層クロマトグ
ラフィーによって分析したところ、Ｒｆ＝0.3 （展開溶
媒；ブタノール：エタノール：水＝３：１：１）である
物質を確認した。更にこの反応生成物の質量数を高速原
子衝撃法質量分析装置を用いて求めたところ、486 であ
った。これにより該物質は、アガロトリオースであるこ
とが明らかとなり、得られたアガロトリオースの収率は
76％と計算された。アガロトリオースの構造を以下に示
す。

【００５２】

【化２】

【００５３】［実施例３］ アガロペンタオースの製造 ネオアガロヘキサオース30mgを10mlのリン酸緩衝液(pH
7.8) に溶解した溶液に、ビブリオ(Vibrio) sp. JT0107
-L4から単離精製した1.5Uのα−NAOS hydrolaseを0.1ml
のリン酸緩衝液(pH7.8) に溶解した溶液を加え、30℃
で５時間反応させ、ネオアガロヘキサオースを分解し
た。反応溶液を活性炭カラム（５mmφ×50mm）に吸着せ
しめ、１mlの水、１mlの10％エタノールで洗浄した後、
３mlの30％エタノールで溶出した。この30％エタノール
画分の溶媒をロータリーエバポレーターを用いて留去
し、更に凍結乾燥を行い重量を測定したところ、13.5mg
であった。この反応生成物を薄層クロマトグラフィーに
よって分析したところ、Ｒｆ＝0.21（展開溶媒；ブタノ
ール：エタノール：水＝３：１：１）である物質を確認
した。更にこの反応生成物の質量数を高速原子衝撃法質
量分析装置を用いて求めたところ、792 であった。これ
により該物質は、アガロペンタオースであることが明ら
かとなり、得られたアガロペンタオースの収率は80％と
計算された。アガロペンタオースの構造を以下に示す。

【００５４】

【化３】

【００５５】［実施例４］ ３，６−アンヒドロ−Ｌ−
ガラクトースの製造及び構造決定 ネオアガロビオース100mg を9.5ml の水に溶解した溶液
に、ビブリオ(Vibrio)sp. JT0107-L4から単離精製した
1.9Uのα−NAOS hydrolaseを0.5ml のリン酸緩衝液(pH
7.8) に溶解した溶液を加え、30℃で３時間反応を行っ
た。反応溶液を凍結乾燥した後、クロロホルム：メタノ
ール：水＝35：14：11なる組成の溶媒2.5ml を加え試料
を懸濁させ、これをイアトロビーズ（ヤトロン社製）な
るシリカゲル担体を用いたカラム（20mmφ×240mm)に添
加し、クロロホルム：メタノール：水＝70：28：２の組
成からなる溶液からクロロホルム：メタノール：水＝5
3：45：２の組成からなる溶液への直線濃度勾配法（総
溶出量960ml)にて溶出を行ったところ、クロロホルム：
メタノール：水＝68.1：29.9：２から65.5：32.5：２の
溶媒組成の時に、薄層クロマトグラフィーでＲｆ＝ 0.7
〜0.8 （展開溶媒；ブタノール：エタノール：水＝３：
１：１）に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを確
認した。この溶出液の溶媒をエバポレーターで留去し、
49mgを得た。この溶出物の ¹Ｈ−核磁気共鳴装置による
分析結果、及び該物質のアセチル体の ¹Ｈ−核磁気共鳴
装置による分析結果によって、該物質は３，６−アンヒ
ドロ−Ｌ−ガラクトースであると決定された。収率は98
％であった。該物質のアセチル化は、該物質49mgを１ml
のピリジン溶媒中で１mlの無水酢酸と室温で18時間反応
させることによって行った。得られたアセチル体は、シ
リカゲル担体を用いたカラム（20mmφ×240mm)に添加
し、ヘキサン：酢酸エチル＝80：20の組成からなる溶液
からヘキサン：酢酸エチル＝10：90の組成からなる溶液
への直線濃度勾配法（総溶出量320ml)にて溶出を行った
ところ、ヘキサン：酢酸エチル＝30：70の溶媒組成の時
に、薄層クロマトグラフィーでＲｆ＝0.５（展開溶媒；
ベンゼン：酢酸エチル＝７：３）の反応生成物を確認し
た。これを ¹Ｈ−核磁気共鳴装置にて解析した。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、寒天又はアガロース由来
の重合度が５以下のオリゴ糖、及び単糖である３，６−
アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース、Ｄ−ガラクトースを効
果的に製造することができるようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】agarase0107 の至適pHを示す図である。

【図２】agarase0107 の至適温度を示す図である。

【符号の説明】

○ 25℃での酵素反応 ● 30℃での酵素反応 □ 35℃での酵素反応 ■ 40℃での酵素反応

【図３】agarase0107 の熱安定性を示す図である。

【図４】３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの ¹Ｈ
−ＮＭＲスペクトルを示す図である。

【図５】α−NAOS hydrolaseの至適pHを示す図である。

【符号の説明】

○ リン酸緩衝液 ● ビシン−水酸化ナトリウム緩衝液 □ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液

【図６】α−NAOS hydrolaseの熱安定性を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 児玉 久 神奈川県横浜市緑区梅が丘６−２ 日本た ばこ産業株式会社生命科学研究所内 (72)発明者 野間 正名 神奈川県横浜市緑区梅が丘６−２ 日本た ばこ産業株式会社生命科学研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アガロースを含む基質に対し、アガロー
   ス由来の多糖及びオリゴ糖のいずれにも作用するβ−ア
   ガラーゼと、アガロース由来のオリゴ糖に特異的に作用
   するα−アガラーゼを作用させることを特徴とするオリ
   ゴ糖及び／又は単糖の製造方法。
2. 【請求項２】 アガロース由来のオリゴ糖を含む基質に
   対し、アガロース由来の多糖及びオリゴ糖のいずれにも
   作用するβ−アガラーゼと、アガロース由来のオリゴ糖
   に特異的に作用するα−アガラーゼを作用させることを
   特徴とするオリゴ糖及び／又は単糖の製造方法。
3. 【請求項３】 前記アガロース由来の多糖及びオリゴ糖
   のいずれにも作用するβ−アガラーゼが下記の理化学的
   性質を有するβ−アガラーゼであることを特徴とする請
   求項１又は２記載の製造方法。 作用 少なくとも寒天及びアガロースをエンド型に分解し、低
   分子化する反応を触媒する。 基質特異性 寒天及びアガロースを加水分解するが、カラギーナン及
   びアルギン酸には作用しない。 至適 pH ７〜8.5 （30℃） 至適温度 30℃ pH安定性 ６〜９ 熱安定性 50℃で15分間の加熱で最大活性の約85％を保持する。 等電点 約6.3 分子量 約95,000（10−20％ SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
   泳動による） アミノ末端アミノ酸配列 Ala →Thr →Leu →Val →Thr →Ser →Phe
4. 【請求項４】 アガロース由来のオリゴ糖を含む基質に
   対し、アガロース由来のオリゴ糖に特異的に作用するα
   −アガラーゼを作用させることを特徴とするオリゴ糖及
   び／又は単糖の製造方法。
5. 【請求項５】 前記アガロース由来のオリゴ糖を含む基
   質がネオアガロヘキサオースを含む基質であることを特
   徴とする請求項２又は４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 得られるオリゴ糖がアガロペンタオース
   であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に
   記載の製造方法。
7. 【請求項７】 得られるオリゴ糖がアガロトリオースで
   あることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記
   載の製造方法。
8. 【請求項８】 得られる単糖が３，６−アンヒドロ−Ｌ
   −ガラクトースであることを特徴とする請求項１〜５の
   いずれか１項に記載の製造方法。
9. 【請求項９】 前記α−アガラーゼがアガロース由来の
   ６糖以下のオリゴ糖のＤ−ガラクトースと３，６−アン
   ヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のα−１，３結合を加
   水分解するα−アガラーゼであることを特徴とする請求
   項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 前記α−アガラーゼが下記の理化学的
    性質を有するα−アガラーゼであることを特徴とする請
    求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。 作用及び基質特異性 アガロース由来のオリゴ糖のＤ−ガラクトースと３，６
    −アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のα−１，３結
    合を加水分解する。 至適 pH ７〜8.4 至適温度 30℃ pH安定性 ６〜９ 熱安定性 35℃で５分間加熱後の活性は、初期活性の約100 ％を保
    持する。40℃で５分間加熱後の活性は、初期活性の約50
    ％を保持する。 分子量 約42,000（10％ SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
    による） アミノ末端アミノ酸配列 Ser →Gly →Thr →Gly →Ser →Lys →Leu →Ser →Le
    u →Ala