JP3309188B2 - アルギン酸リアーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアルギン酸リアーゼに関
する。更に詳しくは、本発明は、昆布、ワカメなどの褐
藻類由来アルギン酸又はシュードモナス属細菌などの微
生物由来のアルギン酸に対して特に優れた分解活性を示
すアルギン酸リアーゼに関する。

【０００２】本明細書において、アルギン酸には、アル
ギン酸の塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのア
ルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのア
ルカリ土類金属塩や、アルギン酸のプロピレングリコー
ル誘導体、アセチル誘導体などのエステルも含まれる。

【０００３】

【従来の技術とその課題】アルギン酸は、昆布、ワカメ
などの褐藻類に２０〜５０％（乾物換算）含まれる主要
な構成多糖であり、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸
とからなる、ヘテロポリマー又はブロックポリマーであ
るとされている。

【０００４】栄養学的には食物繊維としての機能があ
り、特にアルギン酸のカリウム塩はＫ−Ｎａ交換能を有
し、体内のＮａを排泄する作用があると言われている。
この様な特性を有するアルギン酸を食品に適用できれ
ば、食品の生理的機能を高め得ることは明らかである。
ところが、アルギン酸は水に溶解すると極めて高粘性を
示すため、一般の食品に適用することは著しく困難であ
る。アルギン酸水溶液の粘度を低下させるためには、ア
ルギン酸リアーゼによりアルギン酸を分解することが有
効であると予想される。

【０００５】従来アルギン酸リアーゼは、細菌、褐藻、
貝などに存在し、細菌ではシュードモナス属、ビブリオ
属又はクレブシェラ属に属する細菌がアルギン酸リアー
ゼを産生することが知られている。しかしながら、これ
らの細菌のアルギン酸リアーゼ産生能は非常に低く且つ
産生されるアルギン酸リアーゼのアルギン酸分解能が非
常に低いため、工業的規模でアルギン酸を低分子化する
のに充分な量のアルギン酸リアーゼを得るには多大なコ
ストが必要になり、実質的には不可能である。

【０００６】また白色人種には、シェードモナス・アエ
ルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の呼吸器感染に
より、該細菌が産生するアルギン酸を主成分とする粘稠
物が肺に蓄積して気管支を閉塞し、死に至らしめる嚢胞
性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）という先
天性疾患が１０００〜２０００人に１人の割合で認めら
れている。この疾患の治療には、抗生物質や消化酵素が
用いられているがその効果は不充分であり、アルギン酸
分解活性の高いアルギン酸リアーゼの開発が望まれてい
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記従来技
術の現状に鑑み鋭意研究を重ね、日本各地の土壌、水、
海水などからサンプルを採取し、アルギン酸分解能を有
する微生物の検索を行った結果、アルギン酸リアーゼ産
生能が極めて高い細菌を２種発見した。而してこれらの
細菌菌体からアルギン酸分解能の高いアルギン酸リアー
ゼを非常に高収量で得ることができ、工業的規模でアル
ギン酸を低分子化できることを見い出し、先に特許出願
した（特願平３−１６４８９９号）。

【０００８】ところが、本発明者の更なる研究の結果、
上記細菌の中の１種が上記特許出願に記載のアルギン酸
リアーゼとは異なる新規なアルギン酸リアーゼをも産生
すること、及び該新規なアルギン酸リアーゼが前記出願
のものに比べて更に優れた特性を有することを見い出
し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち本発明は、配列番号：１で表わさ
れるＮ−末端アミノ酸配列を有し、下記理化学的性質を
有するアルギン酸リアーゼ（以下「Ａｌ−ＩＩ−２リア
ーゼ」という）及び配列番号：２で表わされるＮ−末端
アミノ酸配列を有し、下記理化学的性質を有するアルギ
ン酸リアーゼ（以下「Ａｌ−III リアーゼ」という）に
係る。

【００１０】Ａｌ−II−２リアーゼの理化学的性質； （１）作用：アルギン酸を非還元末端のＣ₄ −Ｃ₅ 間に
二重結合を有する糖に分解し、最終的に４−デオキシ−
５−ケトウロン酸に分解する （２）分子量：２５０００ （３）最適ｐＨ：８．０ （４）安定ｐＨ：７．０〜８．０ （５）至適温度：７０℃ （６）基質特異性：アルギン酸に作用し、褐藻類由来の
アルギン酸に対して極めて高い分解活性を有する

【００１１】Ａｌ−III リアーゼの理化学的性質； （１）作用：アルギン酸を非還元末端のＣ₄ −Ｃ₅ 間に
二重結合を有する糖に分解し、最終的に４−デオキシ−
５−ケトウロン酸に分解する （２）分子量：３８０００ （３）最適ｐＨ：８．０ （４）安定ｐＨ：７．０〜８．０ （５）至適温度：７０℃ （６）基質特異性：アルギン酸に作用し、特に細菌由来
のアルギン酸に対して高分解活性を有する。

【００１２】各理化学的性質につき、以下に詳述する。
Ａｌ−II−２リアーゼとしては、後記実施例１の「５．
トヨパールＨＷ−５５カラムによる精製」後の酵素液を
用いた。またＡｌ−III リアーゼの理化学的性質は、後
記する実施例２の「６．Ｓ−セファロースＦ．Ｆ．カラ
ムによる精製」後のピークII′のフラクションを用いて
測定した。

【００１３】なお、Ａｌ−II−２リアーゼ及びＡｌ−II
I −リアーゼの諸性質を、本発明者らが先に特許出願し
た特願平３−１６４８９９号に記載のアルギン酸リアー
ゼ（以下「Ａｌ−Ｉリアーゼ」という）のそれと比較す
る形で示す。 〔アルギン酸リアーゼ活性の測定〕アルギン酸リアーゼ
の活性は、アルギン酸リアーゼがアルギン酸を分解する
ことにより生成する非還元末端のＣ₄ −Ｃ₅ 間に２重結
合を有する糖が２３５ｎｍに特異的な吸光度上昇を示す
ことを利用して測定した。

【００１４】すなわち酵素活性の測定は、濃度０．２％
のアルギン酸水溶液１．０ｍｌ、２００ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び酵素液０．１ｍ
ｌを混合し、水０．４ｍｌを加えて全量２．０ｍｌと
し、２５℃で５分間反応させた後反応を停止させ、２３
５ｎｍの吸光度を測定した。酵素活性は、１分間に２３
５ｎｍの吸光度を「１」上昇させる酵素量を１単位
（Ｕ）とし、酵素１ｍｇ当たりに換算して示す。

【００１５】基質としては、海草（Eisenia bicyclis）
から単離されたアルギン酸ナトリウム（平均分子量２５
７００、粘度１０００ｃｐｓ、シグマケミカル社製、米
国）及び嚢胞性線維症患者の肺から分離された粘稠菌シ
ュードモナス・アエルギノーサＮｏ．１０−９１−２５
（米国、イリノイ大学、Ａ．Ｍ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ
ｙ博士）の培養物から単離したアルギン酸を用いた。こ
の細菌由来のアルギン酸は、ｏ−アセチル化、β（１−
４）結合Ｄ−マンヌロン酸とそのＣ５エピマー異性体で
あるＬ−グルロン酸との共重合体であるが、海草アルギ
ン酸とは異なり、高度にアセチル化されている。

【００１６】上記細菌由来アルギン酸の単離は具体的に
は以下の様にして行った。すなわち上記粘稠菌をＴＳＢ
培地（ディフコ・ラボラトリー社製、米国）で３０℃の
温度下好気的に２４時間培養し、培養物を遠心分離して
菌体を除去し、上澄液２倍量（ｖ／ｖ）の無水エタノー
ルを加え、４℃で２０時間放置した。析出したアルギン
酸を遠心分離により集め、室温下９５％エタノールで２
回洗浄した後、水に溶解させた。アルギン酸であること
の確認は、スタンダードとして上記シグマケミカル社製
海草アルギン酸ナトリウムを用い、カルバゾル法によっ
て行った。 〔分子量〕分子量は、セファデックスＧ−１５０（ファ
ルマシア社製、米国）を用いたゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより決定した。ゲル濾過の結果を図１（ａ）及び
図４（ｃ）に示す。蛋白質の溶出位置は、矢印により示
される。マーカー蛋白質としては、ａ：牛血清アルブミ
ン（６７ｋＤａ）、ｂ：オブアルブミン（４３ｋＤ
ａ）、ｃ：キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）及び
ｄ：リボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）を用いた。

【００１７】具体的には、酵素液を、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衝化したセファデックス
Ｇ−１５０を充填した目盛り付カラムに流してゲル濾過
し、酵素を４℃にて前記緩衝液で溶出し、４分毎に３．
０ｍｌずつ集めて分子量を測定した。結果を下記表１に
示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】〔ｐＨ及び温度の影響〕下記表２に示す。

【００２０】

【表２】

【００２１】〔アミノ酸分析〕酵素のＮ末端のアミノ酸
配列を、アミノ酸誘導体分析機（商品名：バイオシステ
ム １２０Ａ ＰＴＨ分析機、バイオシステム社製、米
国）を連結したプロテイン・シークエンサー（商品名：
バイオシステム４７７Ａ、バイオシステム社製、米国）
を用いて決定した。結果を下記表３に示す。

【００２２】

【表３】

【００２３】〔基質特異性〕下記表４に示す。

【００２４】

【表４】

【００２５】Ｍ／ｇ：マンヌロン酸残基／グルロン酸残
基の比 ｎｄ：測定せず アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ，ｎｄ）＊：シグマケミ
カル社製 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ；０．４〜０．５）：大
日本製薬（株）製 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ；１．４〜１．５）：大
日本製薬（株）製 アルギン酸カリウム（Ｍ／Ｇ，ｎｄ）：君津化学（株）
製 アルギン酸プロピレングリコール（Ｍ／Ｇ，ｎｄ）：君
津化学（株）製 アルギン酸＃１：シュードモナス・アエルギノーサＮ
ｏ．１０−９１−２５培養物から単離されたもの アルギン酸＃１ａ：アルギン酸＃１をｐＨ９．０にて１
００℃で３０分間熱処理したもの アルギン酸＃２：シュードモナス・アエルギノーサＮ
ｏ．２−９１−１８培養物から分離されたもの 〔化学物質の影響〕下記表５に示す。

【００２６】

【表５】

【００２７】表１〜４の結果から、本発明のアルギン酸
リアーゼが先の出願に係るアルギン酸リアーゼとは異な
る理化学的性質を有する、別異の酵素であることが判
る。

【００２８】本発明のアルギン酸リアーゼは、本発明者
が土壌中から分離したフラボバクテリウム・スピーシー
ズ（Flavobacterium SP.）ＯＴＣ−６を、アルギン酸を
含む培地中にて培養することにより製造できる。

【００２９】フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ
−６は文献未記載の新菌であり、工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている（微工研寄第１２１５９
号）。該菌の菌学的性質を以下に挙げる。

【００３０】（ａ）形態； （１）細胞の形及び大きさ：桿菌、（０．３〜０．６）
×（１．０〜１．２）μｍ （２）運動性の有無：無し （３）鞭毛の有無：無し （４）芽胞の有無：無し （５）グラム染色性：陰性

【００３１】（ｂ）各培地における生育状態； （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で、直
径１〜２ｍｍの円形コロニー、コロニーは固く白色 （２）標準寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で、直
径１〜２ｍｍの円形コロニー、コロニーは固く淡黄色 （３）リトマスミルク培養：３０℃の培養で凝固せず、
色調は青紫色で変化なし

【００３２】（ｃ）生理学的性質； （１）カタラーゼ：陽性 （２）オキシターゼ：陽性 （３）ウレアーゼ：陰性 （４）フォスファターゼ：陰性 （５）ＯＦテスト：陰性 （６）ＶＰテスト：陰性 （７）インドールの生成：陰性 （８）硫化水素の生成：陰性 （９）糖類からの酸の生成： 陽性…グルコース、 陰性…アラビノース、セロビオース、ラクトース、マン
ニトール、ラフィノース、スクロース、キシロース、グ
リセロール、フルクトース、マルトース、ラムノース （１０）テンプンの加水分解：陰性 （１１）ゼラチンの加水分解：陰性 （１２）エスクリンの加水分解：陰性 （１３）硝酸塩の還元：陽性 （１４）生育のｐＨ：５．０〜８．５ （１５）至適生育温度：２８〜３４℃ （１６）生育の食塩濃度：０〜１％

【００３３】（ｄ）ＤＮＡのＧＣ含量：６３％ フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ−６の培養
は、通常の細菌の培養と同様に行うことができ、液体培
地中にて通気攪拌下に行うのが好ましい。更に該細菌に
本酵素を生産させるには、通常十数リットル乃至数百リ
ットル程度若しくはそれ以上の大量培養を行うのが好ま
しい。

【００３４】培養に用いられる培地は、アルギン酸を必
須成分とする。アルギン酸の添加量は特に制限されるも
のではないが。通常培地全量に対して０．１〜２重量％
程度とするのがよい。更に本発明で用いられる培地に
は、アルギン酸以外に、細菌の培養に用いられる通常の
炭素源、窒素源、無機塩類などが含有されていてもよ
い。ここで炭素源としては、例えばグルコースなどが、
窒素源としては、例えばペプトン、肉エキス、コーンス
チープリカー、酵母エキスなどの有機窒素化合物や硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素化合物
が、また無機塩類としては、例えばリン酸一カリウム、
リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム
などがそれぞれ挙げられる。

【００３５】培養は、２５〜３５℃程度の温度条件下及
び５．５〜８．０程度のｐＨ条件下にて行われ、通常２
４〜４８時間程度で終了する。得られる培養物を従来公
知の手段に従って精製することにより、アルギン酸リア
ーゼを採取することができる。例えば、遠心分離にて培
養物から上澄液を分取し、これをＤＥＡＥ−セルロー
ス、セファデックスＧ−１５０、ヒドロキシアパタイト
などを用いたカラムクロマドクラフィーなどにより精製
すればよい。

【００３６】本発明において、アルギン酸リアーゼによ
るアルギン酸の分解は、通常の方法に従って行われる。
例えば、アルギン酸の水溶液にアルギン酸リアーゼを添
加すればよい。前記水溶液中のアルギン酸濃度は特に制
限されないが、通常０．１〜５重量％程度とすればよ
い。アルギン酸リアーゼの添加量も特に制限されず広い
範囲から適宜選択すればよい。反応温度は、アルギン酸
リアーゼが作用し得る温度であればよく、通常２０〜８
０℃程度である。

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、海草由来及び／又は細
菌由来のアルギン酸に対して、極めて優れた分解活性を
有するアルギン酸リアーゼを、高収率で提供することが
できる。特にＡｌ−III リアーゼは、嚢胞性線維症患者
が死に至る原因となる細菌由来アルギン酸に対して、従
来のアルギン酸リアーゼにはない著しい高活性を示し、
例えば、該疾患の治療薬としての用途が期待できる。ま
たＡｌ−II−２リアーゼは、海草由来アルギン酸に対し
て高分解活性を示し、食品や化学品などへのアルギン酸
の展開に大きな役割を果たしえるものと期待される。ま
た本発明のアルギン酸リアーゼは、従来のものよりも大
量に生産できるので、工業的な生産に適している。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を一層明瞭なも
のとする。 実施例１（Ａｌ−II−２リアーゼの製造）１．培養及び菌体抽出物の調製 ０．２％アルギン酸ナトリウム、０．１％硫酸アンモニ
ウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％
リン酸２水素１カリウム、０．４％リン酸１水素２ナト
リウム１２水和物及び０．０５％酵母エキスを含む培地
（ｐＨ７．２）１２リットル中にて、フラボバクテリウ
ム・スピーシーズＯＴＣ−６を好気的に３０℃で２０時
間培養した、菌体６０ｇを集め、一度０．８５％の冷食
塩水で洗浄し、１００ｍｌの５．０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、０℃の温度下９キロヘル
ツで１０分間超音波処理した。得られた均一物を４℃に
て２５０００ｇで３０分遠心分離し、上澄液（菌体抽出
物）をＡｌ−II−２リアーゼ源として用いた。

【００３９】２．ＣＭセルロースカラムによる精製 菌体抽出物（１６０ｍｌ、４９７０ｍｇ蛋白質）を１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衝化したＣ
Ｍセルロースカラム（４．６×４６ｃｍ）にかけて蛋白
質を吸着させ、塩化ナトリウム濃度０〜０．６モルの直
線濃度勾配を持った１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０、４０００ｍｌ）で溶出し、１０分毎に２０ｍｌ
ずつ集めた。塩化ナトリウム濃度が約０．１５モルのと
ころで溶出した活性を有するフラクションを得た。

【００４０】３．ヒドロキシアパタイトカラムによる精
製 上記で得られた活性を有するフラクション（１２３５ｍ
ｌ、６０８ｍｇ蛋白質）を直接、５．０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衝化したヒドロキシアパ
タイトカラム（４．６×２６ｃｍ）に流し、吸着した蛋
白質を０〜０．５モルの直線濃度勾配を持つリン酸カリ
ウム緩衝液で溶出し、１０分毎に１５ｍｌずつ集めた。
濃度が約０．３モルのところで溶出した、活性を有する
フラクションを得た。

【００４１】４．ブチルトヨパール６５０Ｍカラムによ
る精製 上記で得られた活性フラクション（２８４ｍｌ，３４．
８ｍｇ蛋白質）を３０％硫酸アンモニウムで飽和し、３
０％硫酸アンモニウム飽和−５．０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液で前もって平衝化したブチルトヨパール ６５０
Ｍカラム（東ソー（株）製、１．５×１５ｃｍ）にか
け、吸着した蛋白質を前記３０〜０％硫酸アンモニウム
飽和緩衝液で溶出し、５分毎に１０ｍｌずつ集めた。非
吸着フラクションを集め、アミコンＰＭ１０膜を用いた
限外濾過により約５ｍｌに濃縮し、Ａｌ−II−２リアー
ゼを主成分とする酵素液を得た。

【００４２】５．トヨパールＨＷ−５５カラムによる精
製 得られた酵素液（５ｍｌ、１０ｍｇ蛋白質）を５．０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衝化したト
ヨパールＨＷ−５５カラム（東ソー（株）製、２．６×
７４ｃｍ）にかけ、酵素を前記と同じ緩衝液で溶出し、
３分毎に４ｍｌずつ集めた。活性を有するフラクション
（Ｎｏ．７９〜８３）を集め、上記と同様に濃縮してＡ
ｌ−II−２リアーゼを含む酵素液を得た。これを、Ａｌ
−II−２リアーゼの性質を調べる試料として用いた。 〔ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動〕上記試
料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動に供し
た。結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）から、Ａｌ−
II−２リアーゼは分子量２５０００の単一蛋白質バンド
として移動することが判る。なおマーカー蛋白質として
は、上からミオシン（Ｈ−鎖）、ホスホリラーゼｂ、牛
血清アルブミン、オブアルブミン、α−キモトリプシノ
ーゲン、βーラクトグロブリン及びリゾチームを用い
た。

【００４３】下記表６に、各精製段階における、総蛋白
質量及び海草由来アルギン酸ナトリウムに対するアルギ
ン酸リアーゼ活性その他のデータを示す。

【００４４】

【表６】

【００４５】実施例２（Ａｌ−III リアーゼの調製）１．培養及び菌体抽出物の調製 ２トン容醗酵タンクにて、フラボバクテリウム・スピー
シーズＯＴＣ−６を１４００リットルのＡＬＧ培地
〔１．０％アルギン酸ナトリウム（シグマケミカル社
製）、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％硫酸マグ
ネシウム・７水和物、０．１％リン酸２水素１カリウ
ム、０．４％リン酸１水素２ナトリウム・１２水和物、
０．０５％酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製、
米国）：ｐＨ７．２〕に１．２％接種し、３０℃で１７
時間培養した。培養は撹拌下（１７０ｒｐｍ）、２００
リットル／分の割合で空気を供給しながら行った。

【００４６】１００リットルの培養液から得た菌体３５
０ｇを一度０．８５％の冷食塩水で洗浄し、５リットル
の５．０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、以下
「ＫＰＢ緩衝液」という）に懸濁し、続いてこの菌体懸
濁液を３リットル／時の割合で、径０．１ｍｍのガラス
ビーズを７０容量％含ませて菌体破砕機〔商品名：ダイ
ノ−ミル（ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ）−ＫＤＬ、シンマルエ
ンタープライズコーポレーション社製〕に通し、得られ
た液を４℃の温度下２５０００ｇで３０分間遠心分離
し、上澄液を得た。上澄液（菌体抽出物）をアルギン酸
リアーゼ源として用いた。

【００４７】２．ＤＥＡＥ−セルロファインカラムによ
る精製 菌体抽出物（５．５４リットル、５１．２ｇ蛋白）を
５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤ
ＥＡＥ−セルロファインカラム（４．６ｃｍ×１８ｃ
ｍ、生化学工業（株）製）に流して蛋白質を吸着し、該
蛋白質を食塩の濃度勾配（０〜０．５Ｍ）の５．０ｍＭ
ＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０、２０００ｍｌ）で溶出し、
５分毎に２５ｍｌずつ集めた。

【００４８】３．ヒドロキシアパタイトカラムによる精
製 上記で得られたフラクションのうち、非吸着クラクショ
ン（６．０５リットル、１８．９ｇ）を５．０ｍＭＫＰ
Ｂ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したヒドロキシアパタ
イトカラム（１２ｃｍ×１８ｃｍ）に通した。吸着した
蛋白質を、順次２０ｍＭ（４リットル）、４０ｍＭ（８
リットル）及び１００ｍＭ（８リットル）のＫＰＢ緩衝
液（ｐＨ７．０）で溶出し、９分毎に５００ｍｌずつ集
めた。

【００４９】各フラクションのアルギン酸リアーゼ活性
を図２に示す。アルギン酸リアーゼ活性は、基質とし
て、シグマケミカル社製の海草由来アルギン酸ナトリウ
ム（■）及びシュードモナス・アエルギノーサＮｏ．１
０−９１−２５の培養物から単離された細菌由来アルギ
ン酸（□）を用いて測定した。図２から、ヒドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィーにより、アルギン酸
リアーゼは２つのピーク（ピークＩ及びII）に分離する
ことが判る。ピークIIのフラクションは、電気泳動によ
り、Ａｌ−Ｉリアーゼ（分子量６０，０００）及びＡｌ
−II−２リアーゼ（分子量２５，０００）の２種を含ん
でいることが判る。細菌由来のアルギン酸に対するピー
クＩの活性は、ピークIIのそれよりも高い。

【００５０】なお、電気泳動は、ＳＤＳの存在下にポリ
アクリルアミドゲルを用いて行った。具体的には、酵素
液４０μｌを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動にかけ、染色液（エタノール４５％、酢酸１０
％、水４０％、コマジーブリリアントブルーＧ ０．２
５％）中にて、３７℃で３時間振盪し、脱色液（エタノ
ール２５％、酢酸７％）で数回脱色して蛋白質バンドを
確認した。

【００５１】４．ブチル−セファロースＦ．Ｆ．カラム
による精製 細菌由来アルギ酸に対して高活性を示す上記ピークＩに
ついて更に精製を行った。すなわち、ピークＩのフラク
ション（２．６４リットル、９８４ｍｇ蛋白）を４０％
硫酸アンモニウムで飽和し、これを４０％硫酸アンモニ
ウム飽和−５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したブチル−セファロースＦ．Ｆ．カラム（４．６
ｃｍ×１０ｃｍ、ファルマシア社製）に通した。カラム
に吸着した酵素を、硫酸アンモニウムの直線濃度勾配：
４０〜０％の５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０、３
３００ｍｌ）で溶出し、４分毎に２５ｍｌずつ集めた。

【００５２】５．セファクリルＳ−２００ＨＲカラムに
よる精製 上記で得られたフラクションのうち、硫酸アンモニウム
濃度が約３０％である、活性を示すフラクションを集
め、透析膜〔商品名：アミコンＰＭ１０、グレースジャ
パン（株）製〕を用いて６６ｍｌ（２１８ｍｇ蛋白）に
濃縮し、その後５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲカラム（５．
０ｃｍ×６０ｃｍ、ファルマシア社製）に通した。蛋白
質を５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出し、
４分毎に１２ｍｌずつ集めた。

【００５３】６．Ｓ−セファローズＦ．Ｆ．カラムによ
る精製 上記で得られたフラクションのうち、活性を示すフラク
ション（フラクションＮｏ．５８〜７０）を集め（１７
６ｍｌ、１５３ｍｇ蛋白）、５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＳ−セファロースＦ．Ｆ．
カラム（４．６ｃｍ×６．０ｃｍ、ファルマシア社製）
に通し、吸着した蛋白質を直線ｐＨ勾配〔５．０ｍＭＫ
ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）−５．０ｍＭリン酸１水素２
カリウム（ｐＨ８．６）、１０００ｍｌ〕で溶出し、５
分毎に１０ｍｌずつ集めた。

【００５４】各フラクションのｐＨとアルギン酸リアー
ゼ活性の関係を図３に示す。△；ｐＨ、●；アルギン酸
リアーゼ、▲；２８０ｎｍの吸収（Ａ₂₈₀ ）。アルギン
酸リアーゼ活性は基質として細菌由来アルギン酸を用い
て測定した、図３からＡｌ−III リアーゼのアルギン酸
リアーゼ活性がピークＩ′及びII′に分離することが判
る。ピークＩ′はｐＨ７．２、ピークII′はｐＨ７．３
でそれぞれ溶出した。

【００５５】ピークＩ′及びII′のフラクション（Ｎ
ｏ．４０、５５、６０及び６５）を、ポリアクリルアミ
ドゲル−電気泳動で分析した。結果を図４（ａ）及び図
４（ｂ）に示す。図４（ａ）はＳＤＳの非存在下及び図
４（ｂ）はＳＤＳの存在下に電気泳動を行ったものであ
る。図４（ａ）及び図４（ｂ）のレーン１、２、３及び
４は、それぞれフラクション４０、５５、６０及び６５
を示す。更に図４（ｂ）のレーン５はマーカー蛋白質で
あり、該蛋白質としては牛血清アルブミン（６７ＫＤ
ａ）、卵オブアルブミン（４３ＫＤａ）、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（３６ＫＤ
ａ）、炭酸脱水酵素（２９ＫＤａ）及びトリプシノーゲ
ン（２５ＫＤａ）を用いた。

【００５６】図４（ａ）から、単一蛋白質である、ピー
クＩ′のフラクション（Ｎｏ．４０）とピークII′のフ
ラクション（Ｎｏ．６０及び６５）の存在が示唆され
た。フラクションＮｏ．５５は、ピークＩ′及びII′の
蛋白質と同一分子量の２種の蛋白質を含んでいた。

【００５７】ピークＩ′及びII′の蛋白質をそれぞれＡ
ｌ−III −１リアーゼ及びＡｌ−III −２リアーゼとし
た。しかし、Ａｌ−III −１リアーゼ及びＡｌ−III −
２リアーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル−電気泳
動にかけると、フラクションＮｏ．５５の蛋白質と同様
に、全ての蛋白質（Ａｌ−III −１リアーゼ及びＡｌ−
III −２リアーゼ）が分子量３８０００と３５０００の
２種の蛋白質に分離した。更に、Ａｌ−III −１リアー
ゼとＡｌ−III −２リアーゼのＮ末端アミノ酸配列は一
致した。このことから、ピークＩ′及びII′に分離した
アルギン酸リアーゼは基本的に同一であり、還元剤の存
在下でのＳＤＳ処理により２種の異なる形態をとるもの
と考えられる。

【００５８】Ａｌ−III −１及びＡｌ−III −２蛋白質
の分子量は、セファデックスＧ−１５０カラムのゲル濾
過クロマトグラフィーにより測定した。結果を図４
（ｃ）に示す。

【００５９】下記表７に、各精製段階における、総蛋白
質量及び海草由来アルギン酸ナトリウムと細菌由来アル
ギン酸に対するアルギン酸リアーゼ活性その他のデータ
を示す。

【００６０】

【表７】

【００６１】表７から、Ａｌ−III リアーゼの活性比
（ＣＦ／ＳＷ：細菌由来アルギン酸に対する活性／海草
アルギン酸に対する活性）がヒドロキシアパタイトカラ
ムクロマトグラフィー後の各精製工程でほぼ一定してい
ることが判る。加えてＡｌ−III リアーゼの試料がポリ
アクリルアミドゲル−電気泳動的に均一になったことか
ら、Ａｌ−III リアーゼの海草アルギン酸に対する低活
性は該酵素特有の性質であることが明らかである。一
方、細菌由来アルギン酸に対するＡｌ−III リアーゼの
活性は、海草アルギン酸に対するそれより著しく高いこ
とが判る。

【配列表】

【００６２】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Ala Pro Ala Ala Ala His Ser Ser Ile Asp Leu Ser Lys Xaa Lys Leu 16 Gln Ile Pro Val 20

【００６３】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： His Pro Phe Asp Gln Ala Val Val Lys Asp Pro Thr Ala Ser Tyr Val 16 Asp Val Lys Ala 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１（ａ）は実施例１におけるＡｌ−II−２リ
アーゼのゲル濾過の結果を示す図面、及び図１（ｂ）は
実施例１におけるＡｌ−II−２リアーゼのポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果を示す図面である。

【図２】実施例２におけるヒドロキシアパタイトカラム
クロマトグラフィーによるアルギン酸リアーゼ活性の分
離を示す図面である。

【図３】実施例２におけるＳ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー後のアルギン酸リアーゼ活性の分離を示
す図面である。

【図４】実施例２におけるＳ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー後のＡｌ−III リアーゼのリアーゼ活性
の分離を示す図面である。図４（ａ）及び図４（ｂ）は
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面であ
り、図４（ｃ）はゲル濾過の結果を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 阿部 士朗 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地 グ ンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者 久野 智弘 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地 グ ンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者 西村 稔 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地 グ ンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者 米本 善政 徳島県徳島市川内町加賀須野463 大塚 化学株式会社食品研究所内 (72)発明者 山下 哲男 徳島県徳島市川内町加賀須野463 大塚 化学株式会社食品研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/88 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：２で表わされるＮ−末端アミ
   ノ酸配列を有し、下記理化学的性質を有するアルギン酸
   リアーゼ。 （１）作用：アルギン酸を非還元末端のＣ₄−Ｃ₅間に二
   重結合を有する糖に分解し、最終的に４−デオキシ−５
   −ケトウロン酸に分解する。 （２）分子量：３８０００ （３）最適ｐＨ：８．０ （４）安定ｐＨ：７．０〜８．０ （５）至適温度：７０℃ （６）基質特異性：アルギン酸に作用し、特に細菌由来
   のアルギン酸に対して高い分解活性を有する。