KR100820291B1

KR100820291B1 - 발효된 해조류의 상등액을 유효성분으로 포함하는 혈액응고억제용 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100820291B1
Application number: KR1020060110847A
Authority: KR
Inventors: 이제희; 아노자 위크라마아라치; 프리샤니 에카나야키; 차밀라니 니카피티야; 마하나마 디조이사
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2008-04-07

Abstract

본 발명은 해조류 발효물의 상등액을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 1) 해조류, 증류수 및 증류수 ml 당 0.15 g의 설탕을 첨가한 후 혼합하여 발효시키는 단계; 2) 상기 발효액을 에탄올과 혼합하는 단계 및 3) 상기 혼합물을 침전시켜 증류수로 용해한 후 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 혈액응고 억제용 조성물의 제조방법 및 이로부터 생산된 혈액응고 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 혈액응고 억제용 조성물은 헤파린보다 혈액응고 활성이 우수하여 혈액응고제로 유용하게 사용될 수 있다.

해조류, 발효, 혈액응고 억제용 조성물, 혈액응고제

Description

발효된 해조류의 상등액을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물 및 그 제조방법{Blood coagulation inhibiting composition comprising supernatant from fermentated Lomentaria catenata as active ingredient and a method for preparing thereof}

도 1은 NaCl 농도구배하에 있는 DEAE-셀룰로오스 컬럼에 통과시킨 해조류의 분획물로부터 분리된 혈액응고성 다당류(◆)를 나타낸 도면으로, 도 1a는 5 ml의 분획물을 수득한 후 페놀-황산 분석법으로 측정한 그래프이고, 도 1b는 1,9-dimethylmethylene blue법으로 측정한 그래프이다.

도 2는 세파로오스 4B 컬럼에 통과시킨 해조류의 분획물로부터 분리된 혈액응고성 다당류를 나타낸 도면으로, 도 2a는 5 ml의 분획물을 수득한 후 페놀-황산 분석법으로 측정한 그래프이고(△), 도 2b는 1,9-dimethylmethylene blue법으로 측정한 그래프이다(○).

도 3은 천연 발효된 해조류로부터 분리된 다당류의 아가로스 겔 전기영동사진(도 3a) 및 PAGE 사진(도 3b)을 나타낸 도면으로, Leuconostoc 종으로부터 유래된 dextran sulfate sodium salt(8 kDa), 상어의 연골(shark cartilage)로부터 유래된 chondroitin 6 sulfate sodium salt(60 kDa) 및 dextran sodium salt(500 kDa)는 각각 PAGE의 표준 마커를 나타낸 것이다.

본 발명은 해조류 발효물의 상등액을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1) 해조류, 증류수 및 증류수 ml 당 0.15 g의 설탕을 첨가한 후 혼합하여 발효시키는 단계; 2) 상기 발효액을 에탄올과 혼합하는 단계 및 3) 상기 혼합물을 침전시켜 증류수로 용해한 후 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 혈액응고 억제용 조성물의 제조방법 및 이로부터 생산된 혈액응고 억제용 조성물에 관한 것이다.

헤파린(Heparin)은 이미 50년 넘게 심혈관 질환에 사용되어져 왔으나, 최근 혈소판 감소증(thrombocytopenia), 출혈(hemorrhagic effect), 선천성 또는 후천성 안티트롬빈 결핍에서의 무효능 및 피브린에 결합된 트롬빈을 억제하지 못하는 부작용이 나타나고 있다(Pereira, Melo & Mourao, 2002). 더욱이, 헤파린은 돼지의 장 또는 소의 폐에서 주로 추출되며(Pereira, Melo & Mourao, 2002), 매우 낮은 농도로 존재하기 때문에 가격이 비싸다. 또한, 항응고제 치료에 대한 수요가 증가함에 따라 선택적인 항응고제의 성분을 분석하려는 연구가 점점 증가되고 있다.

최근, 거대분자에서 유래된 식물이 생물학적 활성에 이용되어져 왔으며, 이 중에서 다당류 즉, 황산화된 모티프를 가진 다당류가 생물학적 거대분자로서 매우 중요한 역할을 수행하고 있다. 이러한 황산화된 다당류는 주로 비-포유동물 조직 에서 사용될 수 있으며 해양 미생물로부터 주로 추출되었다(Pereira, Melo & Mourao, 2002). 또한, 황산화된 다당류의 항응고제 활성은 폭넓게 연구되어져 왔다. 항응고제 활성을 가진 2가지 형태의 항산화된 다당류는 푸고이단(fucoidan) 및 갈락탄(galactan)이며, 이때 상기 푸코이단은 주로 미역(brown seaweed)에 풍부하며(Dobashi, Nishino, Fujihara & Nagumo 1989; Colliec, Fischer, Tapon-Bretaudiere, Boisson, Durand & Jozefonvicz 1991; Chevolot et al., 1999), 갈락탄은 홍조류(red seaweed)에 풍부하다고 알려져 있다(Sen et al., 1994; Carlucci et al., 1997; Kolender, Pujol, Damonte, Matulewicz, & Cerezo, 1997).

황산화된 갈락탄은 대부분 해양 무척추동물(Mourao & Perlin 1987; Pavao, Albano, Lawson & Mourao, 1989) 및 해초류(sea grasses; Aquino, Landeira-Fernandez, Valente, Andrade & Mourao, 2005) 특히, 홍조식물(Rhodophyta)과 같은 해초류(Lahaye, 2001; Velde, Pereira & Rollema, 2004)에 풍부하게 존재한다. 또한, 조류의 항산화된 갈락탄은 구조의 선택적 변형에 있어서 3-linked α-galactopyranose 및 4-linked β-galactopyranose에 의해 정렬되기 때문에, 카라기난(carrageenan) 또는 아라간(aragan)으로 불리기도 한다(Lahaye, 2001). 다양한 히드록실기는 황산염 에스테르(sulfate ester), 메틸기 또는 피루빈산(pyruvinic acid)으로 치환될 수 있기 때문에, 해양 조류의 황산화된 갈락탄 구조는 더욱 복잡하게 된다(Usov, 1998). 혈액응고 기작은 내재성 및 외재성의 2가지 경로로 나눌 수 있으며, 항응고 반응은 주로 혈액응고에 중요인자인 세린 프로테아제와 트롬빈의 억제 및 세린 프로테아제 억제제인 안티트롬빈 III(Shunmugam & Mody, 2000)의 활성에 의한 Factor Xa에 의해 발생하게 된다. 특히, 황산화된 갈락탄의 항응고제 활성은 혈액응고의 내재성 경로인 트롬빈 억제를 통해서 발생한다고 보고되었다(Shunmugam & Mody, 2000).

이에, 본 발명자들은 해조류를 자연적으로 발효시켜 혈액응고 억제용 조성물을 제조한 후 혈액응고 억제활성 측정 및 상기 해조류의 발효와 관련된 미생물을 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 발효된 해조류로부터 분리 및 정제된 혈액응고 억제용 조성물 및 상기 혈액응고 억제용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해조류 발효물의 상등액을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 1) 해조류, 증류수 및 증류수 ml 당 0.15 g의 설탕을 첨가한 후 혼합하여 발효시키는 단계; 2) 상기 발효액을 에탄올과 혼합하는 단계 및 3) 상기 혼합물을 침전시켜 증류수로 용해한 후 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 혈액응고 억제용 조성물 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 해조류 발효물의 상등액을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물을 제공한다.

제주도 해안에서 수득한 해조류를 시료로 사용하여 자연적으로 발효시킨 후 이로부터 혈액응고성 다당류를 추출하였다. 이때, 상기 해조류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 마디잘록이(Lomentaria catenata . L. catenata), 꼬시래기(Gracilaria verrucosa), 불등가사리(Gloiopeltis furcata) 및 잎꼬시래기(Gracilaria textorii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 마디잘록이(L. catenata)를 사용할 수 있다. 왜냐하면, 상기 4개 해조류 중 마디잘록이(L. catenata)의 항응고제 활성이 가장 높기 때문이다(표 1 참조). 또한, 상기 발효는 특별히 제한되는 것은 아니나, 값이 싸고 다당류를 가수분해하는데 보다 효과적인 천연 발효법을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 발효온도는 25 내지 30℃인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 25℃이고, 발효시간은 4주 내지 10주인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 4주간 발효시키는 것이 좋다. 왜냐하면, 발효 4주 이후부터는 해조류의 항응고제 활성이 더 이상 증가하지 않기 때문이다(표 2 참조).

상기 천연 발효법으로 발효시킨 해조류의 혈액응고 억제용 조성물을 분리하기 위하여, 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 필터 크로마토그래피를 이용하였고, 그 결과 정제된 혈액응고성 다당류의 분획물을 수득할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조). 또한, 상기 분획물의 순도 및 분자량을 각각 아가로스 겔 전기영동 및 PAGE를 이용하여 측정한 결과, 단일한 밴드를 형성하는 높은 순도(도 3a 참조) 및 100-500 kDa의 분자량을 가진 정제된 다당류임을 확인할 수 있었다(도 3b 참조). 특히, 상기 다당류의 분자량은 chondroitin 6 sulfate sodium salt(60kDa) 및 dextran sulfate sodium salt(500kDa) 사이에 분포하고 있었는데(도 3b 참조), 이는 미역류인 Codium pugniformis 유래의 항응고제인 황산화된 갈락탄(galactan)의 분자량(100-500 kDa)과 유사하다(Matsubara, Matuura, Hori & Miyazawa, 2000). 또한, 분리된 상기 혈액응고성 다당류는 PAGE 상에서 폭넓은 밴드를 형성하였는데, 이는 천연 발효된 해조류(L. catenata)에서 분리된 혈액응고성 다당류가 B. occidentalis(Farias, Valente, Pereira & Maurao, 2000), Gelidiuim crinale(Pereira et al., 2005) 및 G. cornea(Melo, Feitosa, Freitas & Paula, 2002)와 같은 해조류에서 분리된 다당류와 유사하게 이종간 반응을 수행할 수 있음을 의미한다.

또한, 상기 천연 발효된 해조류에서 분리한 다당류와 종래에 알려진 항응고제인 헤파린과의 항응고 활성을 비교분석한 결과, 표 3에서와 APTT 및 TT 분석에서는 40 μg/ml의 다당류 농도에서 대조군 및 헤파린에 비해 응고 억제가 연장된 반면, PT 분석에서는 어떠한 응고 억제도 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 혈액응고성 다당류가 혈액응고 반응의 통상적인 경로인 내재성 경로에서 보다 효과적으로 작용한다는 것을 의미한다. 한편, PT 분석에는 어떠한 효과도 볼 수 없었는데, 이는 상기 다당류가 혈액응고의 외재성 경로를 억제하지 못한다는 것을 의미한다. 또한, 해조류의 발효를 유도하는 미생물을 동정하기 위해, 16S rDNA의 서열을 분석하였고, 그 결과 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 16S rDNA 서열과 100%의 서열 상동성을 가진 1422 bp의 뉴클레오티드를 확인할 수 있었다(표 5 참조). 이는, 상기 천연 발효된 해조류 혼합물에 발효를 유도하는 바실러스 세레 우스 균주가 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 바실러스 세레우스는 α-아밀라제 생산에 매우 중요한 균주로 알려져 있고(Pandey, Nigam, Soccol, Soccol, Singh, & Mohan, 2000), 상기 균주의 발효 시 β-아밀라제 및 α-아밀라제가 생산된다고 보고되었다(Pandey, Nigam, Soccol, Soccol, Singh, & Mohan, 2000 및 Anto, Trivedi & Patel, 2006). 또한, 아밀라제는 해조류로부터 유래된 carragenan(황산화된 다당류)를 생산하는데 매우 중요한 효소로 알려져 있다(Knutsen, Murano,　D'Amato,　Toffanin,　Rizzo &　Paoletti, 1995). 따라서, 본 발명의 발효성 박테리아로부터 추출된 상기 효소는 아밀라제임을 시사한다. 이러한 결과로부터, 바실러스 세레우스를 통한 해조류의 발효는 해조류로부터 황산화된 다당류를 추출하는데 매우 유용한 방법임을 알 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) 해조류, 증류수 및 설탕을 혼합하여 발효시키는 단계;

2) 상기 발효액을 순도 99.9% 에탄올과 혼합하는 단계 및

3) 상기 혼합물을 침전시켜 증류수로 용해한 후, 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 혈액응고 억제용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이때, 상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 해조류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 마디잘록이(Lomentaria catenata . L. catenata), 꼬시래기(Gracilaria verrucosa), 불등가사리(Gloiopeltis furcata) 및 잎꼬시래기(Gracilaria textorii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 마디잘록이(L. catenata)를 사용할 수 있다. 또한, 단계 1)의 증류수 및 설탕의 혼합비는 증류수 ml 당 설탕을 0.15 g 첨가하여 혼합하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 증류수 300 ml에 45 g의 설탕을 첨가하여 혼합할 수 있다. 또한, 단계 1)의 발효는 특별히 제한되는 것은 아니나, 상기 혼합물을 25 내지 30 ℃에서 4주 내지 10주 동안 자연발효 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 발효시키는 것이 바람직하다. 이는, 기존의 효소를 이용하는 방법에 비해 값이 싸고, 다당류를 가수분해하는데 효과적이기 때문이다. 또한, 상기 단계 3)의 정제방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 이용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 해조류 발효 및 천연 다당류 추출

<1-1> 시료 및 시약 준비

제주도 해안에 서식하는 4개의 해조류(Lomentaria catenata, Gracilaria verrucosa, Gloiopeltis furcata 및 Gracilaria textorii)를 제주대학교 생물자원실험실의 전유진 박사님으부터 얻은 후 증류수를 이용하여 염, 모래 및 착생식물(epiphyte)을 제거하였고 상기 시료를 동결건조하여 -20^oC에 보관하였다. 활성부 분트롬보플라스틴 시간(Activated Partial Thromboplastin Time, APTT) 측정용 시약, CaCl₂ 용액, 프로트롬빈 시간(Prothrombin time, PT) 및 트롬빈 시간(Thrombin time, TT) 측정용 시약은 Fisher Diagnostics(미국)에서, DEAE-셀룰로오스 및 세파로오스 B 레진은 Sigma-Aldrich(미국)에서, Sodium Barbital은 Wako pure chemical사(일본)에서 각각 구입하였다.

<1-2> 시료 발효 및 천연 다당류 추출

상기 실시예 <1-1>에서 준비된 1.5g의 동결건조된 해조류 시료 및 45g의 설탕을 300 ml의 증류수가 들어있는 유리병 안에서 혼합하였다. 이때, 대조군으로는 설탕을 첨가하지 않은 혼합물을 사용하였다. 왜냐하면, 미생물은 통상적으로 해조류를 구성하는 다당류를 단당류 또는 올리고 당으로 분해해서 당을 탄소원으로 사용하기 때문에, 당을 첨가하지 않은 경우 미생물의 성장이 느리고, 발효가 아닌 부패가 발생할 수 있기 때문이다. 상기 혼합물을 발효시키기 위해, 25^oC에서 10주 동안 배양하였다. 발효 전, 및 발효 후 2주 간격으로 각 시료로부터 5 ml의 상등액을 추출하였다. 산출량을 측정하기 위하여, 미리-무게를 측정한 알루미늄 플레이트에 상기에서 2주 간격으로 준비한 설탕을 첨가한 반응물 및 설탕을 첨가하지 않은 반응물 1 ml을 분주한 후 105^oC에서 24시간 동안 오븐으로 건조시켰고, 무게의 차이를 mg/ml의 산출량으로 표기하였다. 또한, 상기 시료로부터 천연 다당류를 추출하기 위해서, 150 ml의 발효된 해조류 혼합물을 300 ml의 순도 99.9% 에탄올과 혼합하였다. 24시간 후, 상기 반응액을 10,000 rpm, 4^oC에서 20분 동안 원심분리하여 침전시켰고(Iacomini, Serrato, Sassaki, Lopes, Buchi & Gorin, 2005), 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 동결건조하여 추출하였다.

발효된 4개의 해조류(Lomentaria catenata, Gracilaria verrucosa, Gloiopeltis furcata 및 Gracilaria textorii)의 혈액응고 억제활성을 APTT, PT 및 TT으로 측정한 결과, 하기 표 1에서와 같이 4개의 해조류 중 Lomentaria catenata가 가장 높은 혈액응고 억제활성을 나타냄을 확인하였다(>1000s의 APTT 활성).

또한, 상기 Lomentaria catenata는 발효 4주째부터 10주째까지 높은 혈액응고 억제활성을 지속적으로 유지하고 있음을 관찰할 수 있었다(표 2).

혈액응고 억제활성이 가장 높은 발효 후 4주째 때부터 2주 간격으로 용해성 천연 다당류를 추출한 결과, 상기 발효는 주당 0.03 g의 건조된 해조류 혼합물의 용해성 분획물을 생산하였다. 이때, 상기에서 추출된 용해성 천연 다당류의 함량은 건조된 해초 중량의 17%에 해당한다. 따라서, 발효는 용해성 천연 다당류를 추출하는데 유용한 방법으로 사용될 수 있다.

< 실시예 2> 혈액응고성 다당류 동정

<2-1> 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 필터 크로마토그래피를 이용한 천연 혈액응고 억제용 조성물의 정제

200 mg의 천연 다당류 시료를 Mulloy & Mourao(1999)에 기재된 DEAE-셀룰로오스 컬럼을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 구체적으로, 시료를 50mM sodium acetate(pH 5.0)로 평형화시킨 다음 0.2 M NaCl을 함유한 상기 용액으로 세척된 FPLC 시스템(ProTeam LC^TM, Lincoln, USA)과 호환성을 가진 DEAE-셀룰로오스 컬럼(18 X 1)에 통과시켰으며, 상기 컬럼상에 있는 다당류를 2 M NaCl을 함유한 상기 용액 150 ml과 0.2 M NaCl을 함유한 150 ml의 50 mM sodium acetate(pH 5.0)을 60 ml/h 유속으로 혼합하여 선형 농도구배하에서 용출하였다. 상기로부터 5ml의 분획물을 수득하였고, 전체 다당류의 양 및 채색의 특성을 페놀-황산(H₂SO₄) 분석법 및 1,9-dimethylmethylene blue 분석법(Chaplin & Kennedy, 1994)을 이용하여 모티터링하였다. 혈액응고 억제활성은 APTT 분석법으로 측정하였고, 높은 활성을 가진 분획물을 수취하여 증류수에 용해 및 농축하였다.

또한, 부분적인 다당류 분리는 증류수로 평형화시킨 세파로오스 4B 컬럼을 이용한 겔 필터 크로마토그래피로 수행하였다. 상기 컬럼상에 있는 다당류를 15 ml/h 유속으로 증류수를 이용하여 용출하였다. 상기로부터 5ml의 분획물을 수득하였고, 총 다당류의 양 및 채색의 특성을 상기와 같은 방법으로 각각 수행하였다. 또한, 혈액응고 억제활성은 APTT 분석법으로 측정하였고, 높은 활성을 가진 분획물을 수취하여 증류수에 용해 및 농축하였다.

그 결과, 본 발명의 천연 다당류를 0.35~0.4 M의 NaCl 농도구배하에 있는 음이온 교환 크로마토그래피에 통과시켜 분리하였으며(도 1), 보다 순수한 혈액응고 억제활성을 갖는 분획물을 수득하기 위하여 세파로오스 4B 컬럼을 이용한 겔 필터 크로마토그래피로 더욱 정제하였다(도 2).

<2-2> 천연 혈액응고성 다당류의 순도 및 분자량 분석

상기 혈액응고성 다당류의 순도는 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다(Pereira, Mulloy 및 Mourao, 1999). 구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 분리한 다당류(~10μg)를 0.5%의 아가로스 겔에 적제한 후, 0.05 M 1,3-diaminopropane/acetate(pH 9.0) 용액에서 100v, 1시간 동안 전기영동하였고, 0.1% N-cetyl-N,N,N-trimethylammonium bromide 용액으로 고정하였다. 12시간 경과 후, 상기 겔을 건조하여 0.1% toluidine blue를 함유한 아세트산/에탄올/증류수(0.1:5:5, v/v)로 염색하였다. 또한, 상기에서 분리한 다당류의 분자량은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하였다(Pereira, Mulloy 및 Mourao, 1999). 표준 마커 및 시료(~10μg)를 각각 0.02 M sodium barbital(pH 8.6)을 포함한 6% 1 mm 두께의 폴리아크릴아미드 겔에 적제시켜 100v에서 30분 간 전기영동을 한 후, 상기 겔을 1% 아세트산을 함유한 0.1% toluidine blue로 염색하였고, 1% 아세트산에서 4시간 동안 세척하였다.

그 결과, 발효된 해조류(L. catenata)에서 분리된 혈액응고성 다당류는 아가로스 겔 상에서 단일한 점을 보임으로써 고도로 정제된 다당류임을 확인할 수 있었다(도 3A). 또한, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해서, 상기 정제된 다당류의 분자량은 100-500 kDa로써(도 3B), chondroitin 6 sulfate sodium salt(60kDa) 및 dextran sulfate sodium salt(500kDa) 사이에 분포하고 있음을 확인하였다(도 3B).

< 실시예 3> 다당류의 혈액응고 활성 분석

혈액응고 억제활성은 제조사의 지침에 따른 Dual-channel clot-2(SEAC, Italy)을 이용한 활성부분트롬보플라스틴 시간(APTT), 프로트롬빈 시간(PT) 및 트롬빈 시간(TT) 분석으로 측정하였고(Fisher Scientific Company, USA), 그 활성은 통상적으로 사용되고 있는 혈액응고 억제제인 헤파린과 비교하였다. 사람의 혈장은 Shida et al.,(2001)의 변형된 방법을 이용하여 준비하였다. 구체적으로, 10명의 건강한 기증자로부터 수득한 혈액을 2.5 % sodium citrate solution(9:1 v/v)를 포함한 원뿔형 튜브에 담았다. 혈장은 3000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 분리한 후 혈액응고 억제활성을 측정하기 전까지 -60^oC에 보관하였다.

천연 발효된 해조류(L. catenata) 다당류의 농도에 따른 혈액응고 억제활성을 APTT, PT 및 TT으로 측정한 결과, APTT 및 TT 분석에서는 40 μg/ml의 다당류 농도에서 대조군(Water) 및 헤파린에 비해 응고 억제가 연장된 반면, PT 분석에서는 어떠한 응고 억제도 나타나지 않았다(표 3).

< 실시예 4> 혈액응고성 다당류의 화학적 조성 분석

<4-1> 당 분석

분리된 시료의 헥소오스 함량은 페놀-황산 분석법(Chaplin & Kennedy 1994)으로 측정하였다. 중성당(galactose 및 glucose) 및 아미노당(glucosamine 및 galactosamine)은 Carbopac PA1 cartridge(4.5 x 50 mm)를 이용한 Bio-LC DX-600(Dionex Co., Sunnyvale, CA, USA)를 가진 CarboPac PA10 컬럼(4.5 x 250mm)을 이용하여 분획 및 정량하였다.

<4-2> 단백질량 분석

30 mg의 분리된 시료를 0.5 ml의 20% trifluoroacetic acid을 함유한 나선형 뚜껑을 가진 폴리프로필렌 튜브에서 가수분해하였다. 용해성 다당류에 있는 단백질량은 표준 단백질인 BSA를 이용한 Bradford 방법(Bradford, 1976)으로 측정하였다.

<4-3> 황산염 함유량 분석

황산염 함유량은 Silverstri, Hurst, Simpson & Settine (1982)에 기재된 rhodizonate 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 100 ml의 가수분해된 황산염을 600 ml의 바륨 용액(75 ml의 에탄올에 2.5 ml의 2 M 아세트산, 0.5 ml의 0.01 M BaCl₂ 및 2 ml의 0.02 M NaHCO₃를 희석시킨 용액) 및 300 ml의 rhodizonate 시약(20 ml의 증류수에 5 mg rhodizonate 및 100 mg ascorbate를 포함하고 있으며, 100 ml의 에탄올에 희석시킨 용액)와 혼합하였다. 흡광도는 상온에서 10분간 배양한 후 520 nm에서 측정하였다.

상기 혈액응고성 다당류의 당 분석은 한국기초과학연구원에 의뢰하여 분석하였고, 그 결과 상기 다당류의 당은 중성당인 갈락토오스(28.46%)와 글루코오스(1.18%)를 주로 함유하고 있음을 확인할 수 있었다(표 4).

또한, 황산염 함유량 및 단백질량 분석결과 상기 다당류는 mg 다당류당 298 μg 의 황산염(21.76 %)을 함유한 고도로 황산화된 물질이며, mg 다당류당 114 μg 의 단백질(9.42 %)을 함유하고 있었다. 따라서, 천연 발효된 해조류(L. catenata)로부터 분리된 혈액응고성 다당류는 황산화된 단백당(proteoglycan)임을 알 수 있다. 또한, 상기 혈액응고성 다당류에 함유된 황산염 및 단백질 양은 G. cornea(Melo, Feitosa, Freitas & Paula, 2002) 해조류 및 C. cylindricum (Matsubara, Matsuura, Bacic, Liao, Hori. & Miyazawa, 2001) 미역의 혈액응고성 다당류에 존재하는 황산염 및 단백질의 양보다 훨씬 높게 나타남을 알 수 있었다.

< 실시예 5> 16S rDNA 서열분석에 의한 발효성 미생물 동정

<5-1> 해조류를 발효시킨 미생물의 종류

해조류 혼합물의 상등액을 아가 플레이트에 분주하여 37 ^oC에서 배양한 후 클론 형성을 관찰하였다. 상기에서 형성된 클론을 각각 동결건조시킨 0.1 mg의 해조류를 포함하거나 또는 포함하지 않는 0.5 ml의 한천배지에 접종하여 40 ^oC에서 배양한 후, APTT 분석법을 이용하여 3, 6, 9, 12 및 24시간 간격으로 증가된 혈액응고 억제활성을 측정하였다.

<5-2> 16S rDNA 서열분석

상기 발효성 박테리아의 게놈 DNA는 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 분리하였다. 16S rDNA는 통상적인 16S 프라이머인 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3' 및 1522R: 5'-AAGGAGGTGATCCATCCGCA-3'를 이용하여 증폭하였고, 상기 PCR 산물은 AccuPrep^®PCR Purification Kit(Bioneer Co., 한국)를 이용하여 분리하였다. 서열분석 후, 상기 전장 서열과 Genebank에 등재된 다른 서열과의 상동성을 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)의 Blast 검색으로 분석하였다.

4주간 발효시킨 미생물을 아가 플레이트에 배양한 결과, 1 종류의 클론이 형성됨을 확인하였고 상기 클론으로부터 16S rDNA 유전자를 분리하여 서열분석한 결과, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 16S rDNA 서열과 100%의 서열 상동성을 가진 1422 bp의 뉴클레오티드를 확인할 수 있었다(표 5 참조).

따라서, 천연 발효된 해조류 혼합물에 있는 발효성 박테리아는 바실러스 세레우스임을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 클론된 박테리아 세포외 추출물과 해조류를 함께 배양할 경우 12시간째부터 혈액응고 활성을 관찰할 수 있었다(표 6). 이는 혈액응고성 다당류가 박테리아의 세포외 효소에 의해 해조류의 거대분자가 분해됨으로써 생산될 수 있음을 의미한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 자연적 발효를 이용한 해조류 유래의 혈액응고성 다당류 및 상기 다당류를 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물은 혈액응고를 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

마디잘록이(Lomentaria catenata), 꼬시래기(Gracilaria verrucosa), 불등가사리(Gloiopeltis furcata) 및 잎꼬시래기(Gracilaria textorii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 해조류 발효물의 상등액을 에탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈액응고 억제용 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 해조류 발효물은 해조류, 증류수 및 설탕을 혼합하여 발효시켜 얻어진 것인, 혈액응고 억제용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 증류수 및 설탕의 혼합비는 증류수 ml 당 설탕을 0.15 g 첨가하여 혼합하고, 발효는 25 내지 30 ℃에서 4주 내지 10주 동안 발효시키는 것인 혈액응고 억제용 조성물.
제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 해조류 발효는 자연발효 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 이루어지는 것인 혈액응고 억제용 조성물.
1) 마디잘록이(Lomentaria catenata), 꼬시래기(Gracilaria verrucosa), 불등가사리(Gloiopeltis furcata) 및 잎꼬시래기(Gracilaria textorii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 해조류, 증류수 및 증류수 ml 당 0.15 g의 설탕을 첨가한 후 혼합하여 발효시키는 단계;

2) 상기 발효된 발효액을 에탄올과 혼합하는 단계 및

3) 상기 혼합된 혼합물을 침전시켜 증류수로 용해한 후 음이온 교환 크로마토그래피 및 겔 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 혈액응고 억제용 조성물의 제조방법.