DE69324918T2

DE69324918T2 - Arznei gegen cystische fibrosen

Info

Publication number: DE69324918T2
Application number: DE69324918T
Authority: DE
Inventors: Shiro Abe; Tomohiro Hisano; Akira Kimura; Kosaku Murata; Minoru Nishimura; Kenichi Okayama; Kenji Sakaguchi; Hisako Yamaguchi; Tetsuo Yamashita; Yoshimasa Yonemoto
Original assignee: Otsuka Chemical Co Ltd; Gunze Ltd
Current assignee: Otsuka Chemical Co Ltd; Gunze Ltd
Priority date: 1993-02-24
Filing date: 1993-02-24
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2013-02-25
Also published as: US5582825A; EP0642795A4; EP0642795B1; EP0642795A1; WO1994019006A1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung betrifft ein therapeutisches Medikament für Mukoviszidose (cystic fibrosis).

STAND DER TECHNIK

Bei der weißen Bevölkerung wird eine angeborene, auf einem Gendefekt beruhende Krankheit, welche als Mukoviszidose bekannt ist, mit einer Häufigkeit von 1/1000-2000 angetroffen. Diese Krankheit wird durch den Defekt eines Gens verursacht, welches für das Mukoviszidose-Transmembranleitfähigkeitsregulator(CFTR)-Protein codiert, und tritt im Falle einer bakteriellen Infektion der Atmungsorgane mit mukoiden Formen von Pseudomonas aeruginosa auf. Muköse Substanzen sammeln sich in der Lunge und bewirken eine Verstopfung der Atemwege, was zu einem frühzeitigen Tod führt. Obwohl derzeit Antibiotika und Verdauungsenzyme zur Behandlung dieser Krankheit verwendet werden, müssen angemessene therapeutische Maßnahmen noch geschaffen werden.
Vor kurzem haben (Richard C. Hubbard et al.) berichtet, daß symptomatische Verbesserungen bei Mukoviszidose erwartet werden können, wenn die DNA, die in dem Schleim enthalten ist, mit einer DNase lysiert wird [The New England Journal of Medicine 326, 812-815, 1992]. Jedoch ist die DNase kaum in der Lage, den Schleim zu lysieren, welcher von Bakterien der Gattung Pseudomonas produziert wird, so daß keine ausreichende Wirksamkeit erwartet werden kann.
Mittlerweile ist es nicht mehr abzuleugnen, daß die Wirkung von Antibiotika und Verdauungsenzymen auf Pseudomo nas aeruginosa durch das Alginat gefährdet wird, welches diese Mikroorganismen selbst produzieren.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder dieser Erfindung haben in einem großen Umfang eine Forschung durchgeführt, um ein therapeutisch wirksames Arzneimittel für Mukoviszidose zu entwickeln. Im Verlauf ihrer Untersuchungen haben die Erfinder gefunden, daß die muköse Substanz, welche von Stämmen von Pseudomonas aeruginosa sezerniert wird, die aus den Lungen von Patienten mit Mukoviszidose isoliert wurden, nicht nur DNA sondern ebenfalls Alginat enthielten, in einer Menge, die mehrere Male so hoch war wie die Menge an DNA. Inspiriert durch den Gedanken, daß, sollte dieses Alginat irgendwie zersetzt werden, die Erkrankungsrate der Mukoviszidose gesenkt werden könnte, führten die Erfinder eine weitere Forschung durch und haben gefunden, daß eine gewisse Alginatlyase zur Behandlung der Mukoviszidose wirksam ist.
Gemäß dieser Erfindung wird ein therapeutisches Medikament für Mukoviszidose zur Verfügung gestellt, welches als einen aktiven Bestandteil eine Alginatlyase umfaßt, die in der Lage ist, die muköse Substanz zu lysieren, welche in einem Patienten mit Mukoviszidose produziert wird. Ausführungsformen des therapeutischen Medikaments sind in den Unteransprüchen beansprucht.
Gemäß dieser Erfindung wird weiterhin die Verwendung einer Alginatlyase, wie beansprucht, für die Herstellung eines Medikaments in einer Form zur direkten Anwendung auf die betroffene Stelle durch Sprühen oder Auftragen zur Behandlung der Mukoviszidose zur Verfügung gestellt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird ein therapeutisches Medikament für Mukoviszidose zur Verfügung gestellt, welches als einen aktiven Bestand teil eine Alginatlyase umfaßt, die in der Lage ist, das Alginat zu lysieren, welches von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas produziert wird.
Die Alginatlyase, welche als der aktive Bestandteil des therapeutischen Medikaments dieser Erfindung verwendet werden kann, ist insoweit nicht beschränkt, als sie in der Lage ist, das Alginat zu lysieren, welches von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas produziert wird. Die bevorzugten Spezies der Alginatlyase zu Zwecken dieser Erfindung umfassen, neben anderen, die Alginatlyase mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz, welche der Sequenz Nr. 1 entspricht, die im folgenden dargestellt ist und welche die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweist (im folgenden als Al-I-Lyase bezeichnet) und die Alginatlyase mit einer N-terminalen Aminosäuresequenz, welche der Sequenz Nr. 2 entspricht, die ebenfalls nachfolgend erscheint und welche die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweist (im folgenden als Al-III-Lyase bezeichnet).

Physikochemische Eigenschaften der Al-I-Lyase

(1) Aktivität: Dieses Enzym lysiert Alginat zu Sacchariden mit einer nichtreduzierenden endständigen C&sub4;- C&sub5;-Doppelbindung und schließlich zu 4-Deoxy-5-ketouronsäure.
(2) Molekulargewicht: 60000
(3) Optimaler pH: 8,0
(4) Stabil bei pH: 6,0-8,0
(5) Optimale Temperatur: 70ºC
(6) Substratspezifität: in hohem Maße fähig, Alginat eines bakteriellen Ursprungs zu lysieren

Physikochemische Eigenschaften der Al-III-Lyase

(1) Aktivität: Dieses Enzym lysiert Alginat zu Sacchariden mit einer nichtreduzierenden endständigen C&sub4;- C&sub5;-Doppelbindung und schließlich zu 4-Deoxy-5-ketouronsäure.
(2) Molekulargewicht: 38000
(3) Optimaler pH: 8,0
(4) Stabil bei pH: 6,0-8,0
(5) Optimale Temperatur: 70ºC
(6) Substratspezifität: in sehr hohem Maße in der Lage, Alginat eines bakteriellen Ursprungs zu lysieren
Die obigen physikochemischen Eigenschaften werden nun im Detail beschrieben. Man sollte verstehen, daß die physikochemischen Eigenschaften der Al-I-Lyase und der Al-III- Lyase bestimmt wurden, indem die gereinigten Enzymproben verwendet wurden, die in den Referenzbeispielen 1 und 2 hergestellt wurden, welche nachstehend angegeben werden.

[Alginatlyaseaktivität]

Die Aktivität jeder Alginatlyase wurde gemäß dem Prinzip bestimmt, daß die Saccharide mit einer nichtreduzierenden endständigen C&sub4;-C&sub5;-Doppelbindung, wie sie bei der Lyse von Alginat produziert wurden, einen spezifischen Anstieg in der Extinktion bei 235 nm verursachen.
Insbesondere wurde die enzymatische Aktivität wie folgt bestimmt. Zuerst wurden 1,0 ml einer 0,2%igen wäßrigen Lösung des Alginats, 0,5 ml 200 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) und 0,1 ml der Enzymlösung zusammengemischt und nachdem die Mischung mit 0,4 ml Wasser verdünnt wurde, um 2,0 ml zu ergeben, wurde die Reaktion für 5 Minuten bei 25ºC durchgeführt. Die Reaktion wurde dann gestoppt und die Extinktion wurde bei 235 nm gemessen. Die Enzymaktivität wurde in einer Aktivität pro mg des Enzyms ausgedrückt, wobei die Menge des Enzyms, welche die Extinktion bei 235 nm in 1 Minute um "1" erhöhte, als Einheit (U) genommen wurde.
Das verwendete Substrat war ein Alginat, das aus einer Kultur der mukoiden Form von Pseudomonas aeruginosa gewonnen wurde, welche aus den Lungen eines Patienten mit Mukoviszidose isoliert wurde. Dieses Alginat eines bakteriellen Ursprungs ist ein Copolymer aus O-acetylierter β(1-4)-D- Mannuronsäure und seinem C&sub5;-Epimer L-Glucuronsäure, aber im Gegensatz zu dem Alginat vom Seetangtyp, welches aus Meerespflanzen wie z. B. Eisenia bicyclis stammt, ist es in hohem Maße acetyliert.

[Molekulargewicht]

Das Molekulargewicht wurde durch Gelfiltrationschromatographie bestimmt, wobei Sephadex G-150 (Pharmacia, Schweden) verwendet wurde. So wurde die Enzymlösung auf eine Säule mit Sephadex G-150 aufgetragen, welche mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war, und das Enzym wurde mit demselben Puffer bei 4ºC in 3,0 ml-Fraktionen alle 4 Minuten zur Molekulargewichtsbestimmung eluiert. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

[Wirkungen von pH und Temperatur]

Die Daten sind nachfolgend in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2

[Aminosäureanalyse]

Die N-terminale Aminosäuresequenz jedes Enzyms wurde bestimmt, indem ein Proteinsequenziergerät (Handelsname: Biosystem 477A, Applied Biosystems, USA), verbunden mit einem Aminosäurederivatanalysator (Handelsname: Biosystem 120A PTH-Analysator, Applied Biosystems, USA), verwendet wurde. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen sind nachfolgend gezeigt.
Die N-terminale Aminosäuresequenz von Al-I-Lyase:
His-Pro-Phe-Asp-Gln-Ala-Val-Val-Lys-Asp-Pro-Thr-Ala- Ser-Tyr-Val-Asp-Val-Lys-Ala-
Die N-terminale Aminosäuresequenz der Al-III-Lyase:
His-Pro-Phe-Asp-Gln-Ala-Val-Val-Lys-Asp-Pro-Thr-Ala- Ser-Tyr-Val-Asp-Val-Lys-Ala-

[Substratspezifität]

Al-I-Lyase: in hohem Maße in der Lage, Alginat eines bakteriellen Ursprungs zu lysieren
Al-III-Lyase: in sehr hohem Maße in der Lage, Alginat eines bakteriellen Ursprungs zu lysieren

[Wirkung von Chemikalien]

Die Daten sind nachstehend in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
+ ... inhibiert, - ... nicht inhibiert
Die Al-I-Lyase und die Al-III-Lyase zur Verwendung in dieser Erfindung können hergestellt werden, indem Flavobacterium sp. OTC-6, wie es aus dem Boden isoliert wird, in einem Alginat-haltigen Medium kultiviert wird.
Flavobacterium sp. OTC-6 ist ein neuer Mikroorganismus, welcher bisher in der Literatur nie beschrieben wurde und welcher bei dem National Institute for Bioscience and Human Technology unter der Zugriffsnummer FERN BP-4189 hinterlegt wurde.
Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Organismus sind nachstehend gezeigt.

(a) Morphologie:

(1) Zellform und Größe:
Stäbchen (0,3-0,6) · (1,0-1,2) um
(2) Beweglichkeit: nicht beweglich
(3) Flagellation: keine Flagellen
(4) Sporogenese: nicht sporulierend
(5) Gramfärbung: negativ

(b) Kultivierungseigenschaften:

(1) Nähragarplattenkultur:

Nach 24 Stunden Inkubation bei 30ºC werden runde Kolonien mit 1-2 mm im Durchmesser gebildet. Die Kolonien sind fest und weiß.

(2) Standardagarplattenkultur:

Nach 24 Stunden Inkubation bei 30ºC werden runde Kolonien mit 1-2 mm im Durchmesser gebildet. Die Kolonien sind fest und leicht gelb.

(3) Litmuth-Milchkultur:

Eine Inkubation bei 30ºC bewirkt keine Koagulation. Die Farbe ist blau-purpur und unverändert.

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Katalase: positiv
(2) Oxidase: positiv
(3) Urease: negativ
(4) Phosphatase: negativ
(5) OF-Test: negativ
(6) VP-Test: negativ
(7) Indolproduktion: negativ
(8) Schwefelwasserstoffproduktion: negativ
(9) Säureproduktion aus Zuckern:
positiv: Glucose
negativ: Arabinose, Cellobiose, Lactol, Mannitol, Raffinose, Sucrose, Xylose, Glycerol, Fructose, Maltose, Rhamnose.
(10) Hydrolyse von Stärke: negativ
(11) Hydrolyse von Gelatine: negativ
(12) Hydrolyse von Äskulin: negativ
(13) Reduktion von Nitrat: positiv
(14) pH zum Wachstum: 5,0-8,5
(15) Optimale Temperatur zum Wachstum: 28-34ºC
(16) NaCl-Konzentration zum Wachstum: 0-1%

(d) GC-Gehalt der DNA: 63%

Die Kultivierung von Flavobacterium sp. OTC-6 kann auf dieselbe Weise durchgeführt werden wie die Kultur von gewöhnlichen Bakterien und sie wird bevorzugt in einem Flüssigmedium unter Belüftung und Schütteln durchgeführt. Weiterhin ist es, um zu bewirken, daß dieser Organismus das betreffende Enzym produziert, im allgemeinen bevorzugt, eine Massenkultivierung in der Größenordnung von zehn durchzuführen und mehrere hundert Liter oder sogar mehr zuzugeben.
Dem Kulturmedium wird vorzugsweise Alginat als ein Bestandteil zugegeben. Die Menge an Alginat ist nicht besonders beschränkt, liegt aber üblicherweise vorzugsweise bei ca. 0,1-2 Gew.-% bezogen auf die Gesamtmenge des Mediums. Weiterhin kann das Kulturmedium zur Verwendung in dieser Erfindung zusätzlich zu Alginat jene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Salze enthalten, welche im allgemeinen bei der Kultivierung von Bakterien verwendet werden. Unter den Kohlenstoffquellen befindet sich Glucose. Organische stickstoffhaltige Substanzen wie z. B. Pepton, Fleischextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Hefeextrakt usw. und anorganische Stickstoffverbindungen wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid usw. können als die Stickstoffquellen verwendet werden. Die anorganischen Salze können bei spielsweise Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid sein.
Die Kultivierung wird bei einer Temperatur von ca. 25- 40ºC unter den pH-Bedingungen von ca. 5,5-8,0 durchgeführt und ist im allgemeinen in ca. 24-48 Stunden abgeschlossen. Wenn die resultierende Kulturnährlösung durch an sich bekannte Mittel gereinigt wird, wird die betreffende Alginatlyase erhalten. Beispielsweise wird ein Zellextrakt, welcher aus der Nährlösung abgetrennt wurde, durch Säulenchromatographie unter Verwendung von z. B. DEAE-Cellulose, Sephadex G-150 oder Hydroxylapatit gereinigt.
Bei der Verwendung der Alginatlyase als ein therapeutisches Medikament für Mukoviszidose kann diese zu verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, wobei besonders dafür gesorgt wird, keine Inaktivierung des Enzyms zu verursachen. Es ist wesentlich, eine Anwendung von überschüssiger Wärme oder die Verwendung eines Trägers, der dazu neigt, das Enzym zu deaktivieren, zu vermeiden. Somit ist es empfehlenswert, solche Zusätze wie Polyethylenglykol, physiologische Salzlösung, Phosphatpuffer usw. bei der Herstellung eines Sprays oder einer Lösung, solche Zusätze wie Stärke, Lactose usw. bei der Herstellung von Tabletten oder Pulvern, solche Zusätze wie Olivenöl, Polyethylenglykol usw. bei der Herstellung einer Emulsion oder solche Zusätze wie eine Hartgelierung usw. bei der Herstellung von Kapseln zu verwenden.
Es liegt ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung, einen Bronchodilator wie z. B. Aminophyllin, ein antibiotisches Arzneimittel wie z. B. ein Penicillin, Cephem oder neu Chinolon, eine DNase, einen Proteaseinhibitor und/oder ein Amilorid in geeigneten Mengen für eine erhöhte therapeutische Wirksamkeit einzuarbeiten.
Die Einheitsdosierungsform einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung dieser Erfindung kann gemäß dem therapeutischen Ziel ausgewählt werden und sie umfaßt ein Spray, eine Infusionslösung, eine Tablette, eine Lösung, eine Emulsion, ein Pulver, eine Kapsel, eine Injektionslösung usw.
Es gibt keine bestimmte Begrenzung für die Behandlungsmodalität mit der pharmazeutischen Zusammensetzung dieser Erfindung, und die Zusammensetzung kann gemäß einem Behandlungsprotokoll verabreicht werden, welches von dem Alter, Geschlecht und anderen Faktoren bei dem Patienten, der Schwere der Krankheit usw. abhängt. Als Veranschaulichung wird ein Spray oder eine Infusionslösung direkt auf die betroffene Stelle durch Sprühen oder Infusion angewendet. Die Tablette, die Lösung, die Emulsion, das Pulver und die Kapsel werden oral verabreicht. Die Injektion wird intravenös verabreicht, entweder so wie sie ist oder in Beimischung mit einer gewöhnlichen Infusionsflüssigkeit wie z. B. einer Glucoselösung, einer Aminosäureinfusion usw.
Die Dosierung der pharmazeutischen Zusammensetzung dieser Erfindung kann gemäß dem Verabreichungsverfahren, dem Geschlecht und anderen Faktoren bei dem Patienten, der Schwere der Krankheit usw. wohlüberlegt ausgewählt werden, aber im Hinblick auf den aktiven Bestandteil Alginatlyase beträgt die täglich Dosis pro kg Körpergewicht im allgemeinen 0,1-100 mg und vorzugsweise 1-10 mg.

BESTE WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Referenzbeispiele, pharmakologischen Testbeispiele und das Formulierungsbeispiel sollen dazu dienen, die Erfindung in größerem Detail zu beschreiben.

Referenzbeispiel 1 (Herstellung der Al-I-Lyase)

Flavobacterium sp. OTC-6 wurde in 10 l eines autoklavierten Flüssigmediums (enthaltend 1,50% Natriumalginat, 0,10% Ammoniumsulfat, 0,05% Magnesiumsulfatseptahydrat, 0,10% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,40% Dinatriumhydrogenphosphat-12-hydrat und 0,05% Hefeextrakt; pH 7,2) angeimpft und unter Schütteln bei 30ºC für 24 Stunden kultiviert. Die resultierende Nährlösung wurde zentrifugiert, um 73 g Zellen zu ernten. Die Zellen wurden in 60 ml 10 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,0) suspendiert, beschallt (9 kHz, 170 W, 10 min) und zentrifugiert (25000 G, 30 min), um einen Überstand abzutrennen (Zellextrakt).
Dieser Zellextrakt (120 ml, 6,68 g Protein) wurde gereinigt, indem eine DEAE-Cellulosesäule (Wako Pure Chemical), welche mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war, verwendet wurde (4 cm · 25 cm, Elution mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M NaCl).
Die resultierende aktive Fraktion (250 ml, 1,78 g Protein) wurde weiter gereinigt, wobei eine Hydroxylapatitsäule (Tosoh), die mit 5,0 mM Kaliumphosphatpuffer (im folgenden als KPB bezeichnet) (pH 7,0) äquilibriert war, verwendet wurde (4 cm · 25 cm, Elution mit einem linearen Gradienten von 5-500 mM KPB, pH 7,0), und das Eluat wurde konzentriert (20 ml, 208 mg Protein), indem eine Ultrafiltrationsmembran (Amicon PM10, Grace Japan) verwendet wurde.
Das Konzentrat wurde über eine Säule (2,5 cm · 60 cm) mit Sephadex G-150 (Pharmacia, Schweden) geleitet, welche mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war, und die aktive Fraktion (75 ml, 191 mg Protein) wurde weiterhin auf einer Säule mit QAE-Sephadex A-25 (Pharmacia) gereinigt, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war (2,5 cm · 30 cm, Elution mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M NaCl). Dieses Produkt wurde als Al-I-Lyase bezeichnet.

Referenzbeispiel 2 (Herstellung der Al-III-Lyase)

Unter Verwendung eines Zwei-Tonnen-Fermentationstanks wurden 1400 l eines autoklavierten Flüssigmediums (enthaltend 1,00% Natriumalginat, 0,01% Ammoniumsulfat, 0,05% Magnesiumsulfatseptahydrat, 0,10% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,40% Dinatriumhydrogenphosphat-12-hydrat und 0,05% Hefeextrakt; pH 7,2) mit Flavobacterium sp. OTC-6 bei einem 1,2%igen Inokulationsniveau inokuliert, und das inokulierte Medium wurde bei 30ºC für 17 Stunden inkubiert. Dieses Kultivierungsverfahren wurde unter Schütteln (170 Upm) und Einsprühen von Luft bei einer Flußgeschwindigkeit von 200 l/min durchgeführt. Die Zellen (350 g), welche aus 100 l Kulturnährlösung geerntet wurden, wurden in 5 l 5,0 mM KPB (pH 7,0) suspendiert, und die Suspension wurde durch einen Zellendisintegrator (Dyno-Mill-KDL, Shinmaru Enterprises Corporation) geleitet und zentrifugiert (25000 G, 30 min), um einen Überstand abzutrennen (Zellextrakt).
Dieser Zellextrakt (5,54 l, 51,2 g Protein) wurde über eine Säule (4,6 cm · 18 cm) mit DEAE-Cellulofine (Seikagaku Kogyo), welche mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war, geleitet und eine aktive Fraktion wurde als Ausfluß erhalten (6,05 l, 18,9 g Protein).
Diese Fraktion wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Säule (12 cm · 18 cm) mit Hydroxylapatit (Nacalai Tesque), welche mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war, durch das schrittweise Elutionsverfahren (20 mM, 40 mM und 100 mM KPB, pH 7,0) gereinigt.
Die Al-III-haltige Fraktion (2,64 l, 984 mg Protein), welche mit 40 mM KPB (pH 7,0) eluierte, wurde zu 40% mit Ammoniumsulfat gesättigt und unter Verwendung einer Säule mit Butyl-Sepharose F. F. (Pharmacia), welche mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war, welcher in ähnlicher Weise zu 40% mit Ammoniumsulfat gesättigt war, gereinigt (4,6 cm · 10 cm, Elution mit einem linearen Gradienten von zu 40-0% mit Ammoniumsulfat gesättigtem 5,0 mM KPB, pH 7,0).
Die resultierende aktive Fraktion wurde konzentriert (66 ml, 218 mg Protein), indem eine Ultrafiltrationsmembran (Amicon PM10, Grace Japan) verwendet wurde, und über eine Säule (5,0 cm · 60 cm) mit Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) geleitet, welche mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war. Die resultierende aktive Fraktion (176 ml, 153 mg Protein) wurde durch eine Säule (4,6 cm · 6,0 cm) mit S-Sepharose F. F. (Pharmacia) geleitet, welche mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war, und eine Elution mit einem linearen pH- Gradienten [5,0 mM KPB (pH 7,0) - 5,0 mM Dikaliumhydrogenphosphat (pH 8,6)] wurde durchgeführt. Die so erhaltene aktive Fraktion wurde als Al-III-Lyase bezeichnet.

Referenzbeispiel 3 (Herstellung der Al-II-Lyase)

Flavobacterium sp. OTC-6 wurde in 12 l eines autoklavierten Flüssigmediums (enthaltend 0,20% Natriumalginat, 0,10% Ammoniumsulfat, 0,05% Magnesiumsulfatseptahydrat, 0,10% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,40% Dinatriumhydrogenphosphat-12-hydrat und 0,05% Hefeextrakt; pH 7,2) angeimpft und aerob bei 30ºC für 24 Stunden kultiviert. Die resultierende Nährlösung wurde zentrifugiert, um 60 g Zellen zu ernten.
Die Zellen wurden in 100 ml 5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) suspendiert, beschallt (9 kHz, 10 min. 0ºC) und zentrifugiert (25000 G, 30 min), um einen Überstand abzutrennen (Zellextrakt). Dieser Zellextrakt (160 ml, 4,97 g Protein) wurde unter Verwendung einer Säule mit CM-Cellulose, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) äquilibriert war, gereinigt (4,6 cm · 46 cm; Elution mit einem linearen Gra dienten von 0-0,6 M NaCl). Die resultierende aktive Fraktion (1235 ml, 608 mg Protein) wurde weiter mit einer Säule mit Hydroxylapatit (Nacalai Tesque) gereinigt, welche mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war (4,6 cm · 26 cm; Elution mit einem linearen Gradienten von 5-500 mM KPB; pH 7,0).
Die resultierende aktive Fraktion (284 ml, 34,8 mg Protein) wurde zu 30% mit Ammoniumsulfat gesättigt und gereinigt, indem eine Säule mit Butyl-Toyopearl 650 M (Tosoh) verwendet wurde, die mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war, welcher in ähnlicher Weise zu 30% mit Ammoniumsulfat gesättigt war (1,5 cm · 15 cm, Elution mit einem linearen Gradienten von zu 30-0% mit Ammoniumsulfat gesättigtem 5,0 mM KPB; pH 7,0).
Die so erhaltene aktive Fraktion wurde konzentriert (5 ml, 10 mg Protein), indem eine Ultrafiltrationsmembran (Amicon PM10, Grace Japan) verwendet wurde, über eine Säule (2,6 cm · 74 cm) mit Toyopearl HW-55 (Tosoh) geleitet, welche mit 5,0 mM KPB (pH 7,0) äquilibriert war, und wieder mit einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Das Produkt wurde als Al-II-Lyase bezeichnet.
Die Al-II-Lyase, welche wie oben beschrieben hergestellt wurde, weist eine N-terminale Aminosäuresequenz auf, die der Sequenz Nr. 3 entspricht, welche im folgenden erscheint, und sie hat die folgenden physikochemischen Eigenschaften. Diese physikochemischen Eigenschaften wurden durch die Verfahren bestimmt, welche schon für die Alginatlyasen Al-I und Al-III beschrieben wurden.
(1) Aktivität: Dieses Enzym lysiert Alginat zu Sacchariden mit einer nichtreduzierenden endständigen C&sub4;- C&sub5;-Doppelbindung und schließlich zu 4-Deoxy-5-ketouronsäure.
(2) Molekulargewicht: 25000
(3) Optimaler pH: 8,0
(4) Stabil bei pH: 6,0-8,0
(5) Optimale Temperatur: 70ºC
(6) Substratspezifität: Das Enzym wirkt auf Alginat, wobei es eine besonders hohe lytische Wirkung bei dem Alginat zeigt, das aus Eisenia bicyclis stammt.

Pharmakologisches Testbeispiel 1

Die mukoide Form von Pseudomonas aeruginosa wurde von Dr. A. Prince an der Colombia University aus Mukoviszidose- Patienten isoliert. All die Spezies (7 Spezies) dieser mukoiden Form von Ps. aeruginosa wurden aerob in 100 ml TSB (Tryptische Sojanährlösung, Difco Laboratories, USA) bei 30ºC für 20 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt, und 4 Volumina 95%iges Ethanol wurden zu dem Überstand zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei 4ºC stehengelassen, und das Sediment wurde durch Zentrifugation gesammelt und zweimal mit 95%igem Ethanol und dann mit 100% Ethanol gewaschen. Das Sediment wurde in vacuo bei Raumtemperatur getrocknet, um ein bakterielles Alginat zur Verfügung zu stellen. Dieses Alginat wurde in Wasser gelöst und als das Substrat für den Test der Alginatlyaseaktivität verwendet.
Das Alginat wurde durch das Carbazolverfahren quantifiziert, wobei das Natriumalginat (Molekulargewicht 25700) von Eisenia bicyclis, wie es von Sigma Chemical, USA hergestellt wird, als der Standard verwendet wurde. Die DNA wurde durch das Diphenylaminverfahren getestet, wobei testikuläre Lachs-DNA (Sigma Chemical) als der Standard verwendet wurde. Als Alginatlyase wurden die Al-I-Lyase, die Al-II-Lyase bzw. die Al-III-Lyase, welche in den obigen Referenzbeispielen hergestellt wurden, verwendet.
Die Aktivitäten dieser Enzyme wurden entsprechend durch das Alginatlyasetestverfahren getestet, welches vorstehend beschrieben wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
In Tabelle 4 oben bezeichnet *1) das Gewicht der feuchten Zellen, die aus 100 ml der Nährlösung geerntet wurden, *2) bezeichnet die Menge der DNA, die sich in 100 ml der Nährlösung akkumulierte, *3) bezeichnet die Menge an Alginat, das sich in 100 ml der Nährlösung akkumulierte, und *4) bezeichnet die Aktivität pro mg des Enzyms, wie sie berechnet wurde, wenn die Menge an Enzym, welche die Extinktion bei 235 nm in 1 Minute um "1" erhöhte, als Ein heit (U) genommen wurde. Das Symbol A in der Spalte der Stämme steht für das Alginat, welches aus einer Kultur der mukoiden Form von Pseudomonas aeruginosa geerntet wurde, welche von Dr. A. M. Chakrabarty isoliert wurde, und Natriumalginat steht für das Natriumsalz von Alginat, das aus Eisenia bicyclis stammt, wie es von Sigma Chemical hergestellt wird.
Das Folgende kann man in Tabelle 4 sehen. So zeigen, während Al-II-Lyase keine Aktivität gegenüber irgendeinem der Alginate zeigt, die von den 7 Spezies der mukoiden Form von Ps. aeruginosa produziert werden, Al-I-Lyase und Al- III-Lyase eine Aktivität bei allen dieser Alginate, und insbesondere Al-III-Lyase ist bei den Alginaten bemerkenswert aktiv. Da Al-I-Lyase und Al-III-Lyase wie oben gezeigt wurde für die Alginate eine hohe Substratspezifität zeigen, die für den Schleim in Patienten mit Mukoviszidose verantwortlich sind, kann von diesen vermutet werden, daß sie bei der Behandlung der Mukoviszidose wirksam sind.

Pharmakologisches Testbeispiel 2

Zu der mukösen Substanz, welche von der mukoiden Form von Pseudomonas aeruginosa produziert wurde, die aus einem Mukoviszidose-Patienten isoliert wurde, wurde die Al-I- Lyase, welche in Referenzbeispiel 1 oben hergestellt wurde, zugegeben und die Änderung bei der Viskosität des Schleims wurde untersucht. So wurden 20 ug der Al-I-Lyase zu 20 ml der mukösen Substanz zugegeben, welche von dem Stamm 1, der in Tabelle 4 oben erwähnt wurde, hergestellt wurde (enthaltend 46,8 mg an Alginat und 4,46 mg an DNA), und die Viskosität des Schleims wurde hintereinander mit einem Viskosimeter bei 25ºC gemessen. Fig. 1 zeigt in einem Diagramm den Zeitverlauf der Viskosität der mukösen Substanz nach der Zugabe von Al-I-Lyase.
Zu Vergleichszwecken wurden jeweils 20 ug von DNase I und DNase II (Sigma Chemical) zu 20 ml des obigen Schleims zugegeben, 20 ug der Al-II-Lyase, welche in Referenzbeispiel 3 oben hergestellt wurde, wurde zu 20 ml desselben Schleims wie oben zugegeben, und in jedem Fall wurde die Änderung bei der Viskosität der mukösen Substanz untersucht. Fig. 2 zeigt in einem Diagramm den Zeitverlauf der Viskosität der mukösen Substanz nach der Zugabe von DNAse I und DNAse II. Fig. 3 zeigt in einem Diagramm den Zeitverlauf der Viskosität der mukösen Substanz, wenn Al-II-Lyase zugegeben wurde. Fig. 4 zeigt in einem Diagramm die Zeitverläufe der Viskosität der mukösen Substanz über einen Zeitraum von 60 Minuten nach der Zugabe jedes Enzyms.
Aus den Fig. 1 und 4 wird klar, daß die Zugabe von Al- I-Lyase eine rasche Abnahme bei der Viskosität der mukösen Substanz bewirkt. Es wurde ebenfalls bestätigt, daß 1 Stunde nach der Zugabe von Al-I-Lyase die Viskosität der mukösen Substanz auf ein Niveau abgefallen war, das mit der Viskosität von Wasser vergleichbar war. Wenn jedoch irgendeine von DNAse I, DNAse II und Al-II-Lyase zugegeben wurde, sank die Viskosität des Schleims überhaupt nicht.

Formulierungsbeispiel

In einer 150 mM Natriumchlorid/1 mM Calciumchlorid- Lösung wurden 4 mg/ml der Al-III-Lyase gelöst, welche in Referenzbeispiel 2 oben hergestellt wurde, um eine Spraypräparation zur Verfügung zu stellen.

Sequenztabelle

Sequenz-Nr.: 1
Sequenzlänge: 20
Sequenztyp: Aminosäuren
Topologie: linear
Molekültyp: Protein
Sequenz:
His Pro Phe Asp Gln Ala Val Val Lys Asp Pro Thr Ala Ser Tyr Val Asp Val Lys Ala
Sequenz-Nr.: 2
Sequenzlänge: 20
Sequenztyp: Aminosäuren
Topologie: linear
Molekültyp: Protein
Sequenz:
His Pro Phe Asp Gln Ala Val Val Lys Asp Pro Thr Ala Ser Tyr Val Asp Val Lys Ala
Sequenz-Nr.: 3
Sequenzlänge: 20
Sequenztyp: Aminosäuren
Topologie: linear
Molekültyp: Protein
Sequenz:
Ala Pro Ala Ala Ala His Ser Ser Ile Asp Leu Ser Lys Xaa Lys Leu Gln Ile Pro Val

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche den Zeitverlauf der Viskosität der mukösen Substanz nach der Zugabe von Al-I-Lyase zeigt. Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche den Zeitverlauf der Viskosität der mukösen Substanz nach der Zugabe von DNAse I und DNAse II zeigt. Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welche den Zeitverlauf der Viskosität der mukösen Substanz nach der Zugabe von Al-II-Lyase zeigt. Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Änderungen bei der Viskosität der mukösen Substanz über einen Zeitraum von 60 Minuten nach der Zugabe von Al-I-Lyase, DNAse (DNAse I und DNAse II) bzw. Al-II-Lyase zeigt.

Claims

1. Ein therapeutisches Medikament für Mukoviszidose, welches als einen aktiven Bestandteil eine Alginatlyase umfaßt, die fähig ist, die muköse Substanz zu lysieren, die in einem Patienten mit Mukoviszidose produziert wird.

2. Ein therapeutisches Medikament für Mukoviszidose, welches als einen aktiven Bestandteil eine Alginatlyase umfaßt, die fähig ist, das Alginat zu lysieren, das aus Stämmen von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas stammt.

3. Das therapeutische Medikament für Mukoviszidose wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Alginatlyase eine Alginatlyase ist, welche eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, die der Sequenz Nummer 1 entspricht, und welche die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweist:

(1) Aktivität: das Enzym lysiert Alginat zu Sacchariden mit einer nichtreduzierenden endständigen C&sub4;-C&sub5;- Doppelbindung und schließlich zu 4-Deoxy-5-ketouronsäure

(2) Molekulargewicht: 60000

(3) Optimaler pH: 8,0

(4) Stabil bei pH: 6,0-8,0

(5) Optimale Temperatur: 70ºC

(6) Substratspezifität: Das Enzym wirkt auf Alginat.

4. Das therapeutische Medikament für Mukoviszidose wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Alginatlyase eine Alginatlyase ist, welche eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweist, die der Sequenz Nummer 2 entspricht, und welche die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweist:

(2) Molekulargewicht: 38000

(3) Optimaler pH: 8,0

(4) Stabil bei pH: 6,0-8,0

(5) Optimale Temperatur: 70ºC

(6) Substratspezifität: Das Enzym wirkt auf Alginat, mit einer besonders hohen lytischen Wirkung auf Alginat bakteriellen Ursprungs.

5. Das therapeutische Medikament für Mukoviszidose wie in den Ansprüchen 1-4 beansprucht, welches weiterhin mit einer DNAse oder einem Antibiotikum formuliert ist.

6. Das therapeutische Medikament für Mukoviszidose wie in den Ansprüchen 1-5 beansprucht, welches in einer Einheitsdosierungsform eines Sprays, einer Infusionslösung, einer Tablette, einer Lösung oder einer Emulsion zur Verfügung gestellt wird.

7. Die Verwendung einer Alginatlyase gemäß den Ansprüchen 1-6 zur Herstellung eines Medikaments in einer Form für eine direkte Anwendung auf die betroffene Stelle durch Einsprühen oder Auftagen zur Behandlung der Mukoviszidose.