JP3117691B1 - 新規ヘパリチナーゼ及びその製造法 - Google Patents
新規ヘパリチナーゼ及びその製造法Info
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Abstract
グルコサミニド結合を切断する酵素であるが、糖鎖に結
合する硫酸基の有無、結合位置など、糖鎖構造の違いを
認識する種々の基質特異性の異なる新規酵素を提供す
る。 【解決手段】 ヘパラン硫酸及びヘパリンを分解する新
規酵素、ヘパリチナーゼT−IIを、この酵素の生産能を
有する新菌株バチルス・サーキュランスHpT298菌
株を培養して製造する。
Description
ヘパリンを分解する新規酵素ヘパリチナーゼ及びその製
法に関する。
ルコサミンとウロン酸との二糖単位の繰り返しを基本構
造とする、複合多糖であるヘパラン硫酸(以下HSと略
す)やヘパリン(以下Hepと略す)のグルコサミニド
結合を切断する酵素で、HSやHepの生体内での機能
あるいは生体成分中のこれら物質の分析研究試薬として
有用である。また、近年、抗血栓剤として開発が進めら
れている低分子ヘパリン調製時の低分子化剤として、あ
るいは体外循環装置による治療の際問題となるHepの
副作用を軽減するための素材(Hep除去剤)としても
有用性が注目されており、診断、治療の目的に多様な用
途が期待される。
用途に用いうる酵素は、糖鎖に結合する硫酸基の有無、
結合位置など、糖鎖構造の違いを認識する種々の基質特
異性の異なるヘパリチナーゼを取り揃えることが必要で
あり、また、酵素源としては安定的に大量供給出来るも
のが望ましい。かかる観点から、本発明者らは上記用途
を満足する酵素を微生物起源に求め、該酵素生産菌を検
索し、既にフラボバクテリューム属細菌からヘパリチナ
ーゼを三種見いだした(特開平2−57183号)。
や性質まで詳細に言及した報告としては、他にフラボバ
クテリューム属細菌やバチルス属細菌などから採取した
酵素が知られ、例えば第10回国際グリココンジュゲー
トシンポジウム要旨集〔330頁、1989年〕や特開
平2−142470号公報に開示されている。これら公
知の酵素類は上記の目的のために有用であるが、更に基
質特異性の異なる新規ヘパリチナーゼが上記の目的達成
のために求められている。
パリチナーゼ生産菌を広く自然界に検索した結果、埼玉
県下の土壌から分離したバチルス・サーキュランス(Ba
cillus circulans)HpT298菌株が新規ヘパリチナ
ーゼを生産する能力を持つことを見いだした。これらヘ
パリチナーゼを分画・精製し、理化学的性質や特異性の
異なる4種の新しいヘパリチナーゼを単離した。
課題を解決するためになされたもので、HS及びHep
を分解する新規酵素、ヘパリチナーゼT−I、ヘパリチ
ナーゼT−II、ヘパリチナーゼT−III及びヘパリチナ
ーゼT−IVのうちヘパリチナーゼT−II(以下、本酵素
と呼ぶ)に関するものであり、また本酵素の生産能を有
するバチルス属の細菌から本酵素を効率よく製造する方
法に関するものである。以下に本発明を更に詳細に説明
する。
生産能を有するバチルス属細菌であればいずれの菌株で
もよいが、本発明の実施例に用いたバチルス・サーキュ
ランスHpT298株は本発明者らがHep資化性菌の
検索によって埼玉県下の土壌から分離した新菌株で、そ
の菌学的性質は次の通りである。
の分類学上の位置を、バージェイズ・マニュアル・オブ
・システマテック・バクテリオロジー、第1版、第2巻
(1986年)を参照して検討すると、本菌は運動性を
有する好気性グラム陰性桿菌で芽胞を形成し、主たるイ
ソプレノイドキノンがメナキノン−7であり、細胞壁の
ペプチドグリカンにmeso−ジアミノピメリン酸を含
むことから、バチルス属に属する菌株と判定された。更
にその他の性質をバチルス属の公知種と比較すると、本
菌株はバチルス・サーキュランス(Bacillus circulan
s)の種に属すると同定された。しかしながら、公知の
バチルス・サーキュランス菌株、例えばIFO1363
2、IFO13635及びIFO13636は本発明の
酵素を生産せず、この点で公知の菌株と区別される新菌
株である。
産菌は、バチルス・SP(Bacillus・sp)BH100株
が知られているが(特開平2−142470号)、嫌気
条件での生育、最高生育温度、V−P培地でのpH、デン
プンの加水分解能、DNA中のG+C含量の項目で試験
結果が異なることから明らかなように、前記HpT29
8株はBH100株とは相違する。なお、前記HpT2
98株は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物国際
受託番号BP−3765として寄託されている。
バチルス・サーキュランスHpT298株あるいはバチ
ルス属に属する本酵素生産菌を、通常微生物の培養に用
いられる栄養培地、好ましくは酵素生産能を高めるため
にHepやHSあるいはこれらを含む物質を添加した培
地で培養することにより、培地液あるいは菌体中に生産
蓄積されるので、公知の方法で精製酵素を得ることがで
きる。
する本酵素生産菌を適当な栄養培地、例えば適当な炭素
源、窒素源、無機塩類とHepやHSあるいはこれらを
含む物質などを含む培地で菌を培養し、本酵素を培地中
か菌体中に生産蓄積させる。炭素源としては、資化でき
るものはいずれの物質も利用でき、例えば、D−グルコ
ース、D−キシロース、D−マンノース、L−アラビノ
ース、D−マンニトール、澱粉及びその加水分解物、糖
蜜、クエン酸塩、各種ペプトン類などが挙げられる。窒
素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、各種ペプトン
類、各種肉エキス類、大豆粉、脱脂大豆粉、コーンステ
ープリカー、アミノ酸溶液、アンモニウム塩など有機無
機の窒素化合物又はこれら含有物が利用できる。無機塩
としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナ
トリウム、カルシウムなどの塩類が使用される。そして
更に必要に応じて菌の生育あるいは酵素生産に必要な各
種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各
種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加す
ることができる。
てHepやHS又はそれらを含有する物質を添加すれば
大量に本酵素を生成させることができる。これら誘導物
質の添加は培養当初からでも培養途中に行ってもよい。
添加量としてはHepやHSとして通常0.2%〜2%
添加すれば良い結果が得られる。
いが、通常は液体培養が好適であり、工業的には深部通
気撹拌培養を行うのが有利である。本発明における培養
条件は、本酵素の生産に最も有利な条件を適当に選択、
調節して行う。培養温度は15〜51℃の範囲内で適宜
変更することができるが、特に好ましいのは40〜45
℃である。培養時間は培養条件によって異なるが1〜2
日程度であって、本酵素が最高蓄積量になる時期に培養
を終了すればよい。培地のpHは培地調製時に中性付近に
あればよく、通常の場合特に調節の必要はない。
体抽出液の双方から前記4種の酵素を得ることができ
る。培養上清液については、硫酸アンモニウムを加え、
0.6飽和として析出した沈澱物を透析した後、ハイド
ロキシアパタイト、イオン交換樹脂、ゲルろ過剤、吸着
剤を用いて酵素を分画精製する。また、菌体内酵素につ
いては、菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波又は機械
的破砕法によって菌体を破壊して酵素を抽出した後、そ
の遠心上清液を培養上清液に用いたのと同様の手法によ
り精製できる。しかし、これら精製の手法により本発明
は何ら制約を受けるものではない。
結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウロン
酸の4位と5位の炭素間に形成される二重結合が紫外吸
収を持つことを利用し、その増大を測定することにより
求められる。
ヘパリチナーゼT−II及びヘパリチナーゼT−IIIにつ
いては、ウシ腎臓由来のHSを、ヘパリチナーゼT−IV
については、ブタ腸粘膜由来のHepを用いる。
対し、酵素液10μl、100mMトリス・酢酸緩衝液(p
H7.0)25μl、20mM塩化カルシウム25μl及び
水15μlを加え、45℃で10分間反応させる。この
液に対し、0.06N塩酸溶液500μlを加え反応を停
止させ、232nmにおける紫外吸収Aを測定する。対照
液として同溶液のゼロ時間における紫外吸収A0を測定
する。
に1μmolの分解量を生じさせる力価を1単位として、
次の式から算出する。 A−A0/5.5(分子吸光係数を用いたモル補正)×
600/10(酵素希釈補正)×1/10(1分当りの
補正)=U/ml(使用酵素1ml当りの単位)
その他のヘパリチナーゼ類の理化学的性質を示す。 (1)作 用 いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸のグリコサミ
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部のグルクロ
ン酸又はイズロン酸の4位と5位の炭素の間に二重結合
を形成する。
pには殆ど作用せず、主としてHSに作用し、分解物と
して生ずる不飽和二糖は非硫酸化物(以下「△DiHS
−OS」という)及び少量のウロン酸−グルコサミン−
N−硫酸(以下「△DiHS−NS」という)である。
ヘパリチナーゼT−IIIはHepには殆ど作用せず、主
としてHSに作用し、分解物として生ずる不飽和二糖は
△DiHS−OS及び△DiHS−NSである。ヘパリ
チナーゼT−IVはHep及びHSに作用し、分解物とし
て生ずる不飽和二糖は△DiHS−NS、ウロン酸−グ
ルコサミン−N,6−ジ硫酸(以下「△DiHS−di
N,6S」という)、ウロン酸−2−硫酸−グルコサミ
ン−N−硫酸(以下「△DiHS−diU,NS」とい
う)及びウロン酸−2−硫酸−グルコサミン−N,6−
ジ硫酸(以下「△DiHS−triS」という)であ
る。
緩衝液及びトリス・塩酸緩衝液を用い、45℃、10分
間の反応で調べたところ、ヘパリチナーゼT−I及びヘ
パリチナーゼT−IIはいずれもpH5.5〜6.5であ
り、ヘパリチナーゼT−IIIはpH7.0〜8.0、ヘパ
リチナーゼT−IVはpH7.5〜8.0である。
・酢酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸
化ナトリウム緩衝液を用い、37℃、30分間処理して
調べたところ、ヘパリチナーゼT−IはpH4.5〜9.
5、ヘパリチナーゼT−IIはpH5.0〜9.5、ヘパリ
チナーゼT−IIIはpH5.0〜9.5、ヘパリチナーゼ
T−IVはpH5.0〜10.0の範囲でそれぞれ安定であ
る。
7.0を用い、10分間の反応で調べたところ、ヘパリ
チナーゼT−I及びヘパリチナーゼT−IIはいずれも5
5℃、ヘパリチナーゼT−IIIは50℃、ヘパリチナー
ゼT−IVは40℃である。
pH7.0を用い、60分間各温度で処理して調べたとこ
ろ、ヘパリチナーゼT−I及びヘパリチナーゼT−IIは
いずれも50℃以下、ヘパリチナーゼT−IIIは45℃
以下、ヘパリチナーゼT−IVは40℃以下でそれぞれ安
定である。
4、図6) 本酵素等を100mMの酢酸緩衝液、トリス・酢酸緩衝
液、トリス・塩酸緩衝液及びグリシン・水酸化ナトリウ
ム緩衝液を用い、37℃、30分間処理することによ
り、調べたところ、ヘパリチナーゼT−I、ヘパリチナ
ーゼT−II及びヘパリチナーゼT−IIIはpH4.5以
下、pH10.0以上で、ヘパリチナーゼT−IVはpH4.
5以下、pH10.5以上でそれぞれ急激に失活する。ま
た、本酵素等を50mMのトリス・酢酸緩衝液pH7.0を
用い、60分間各温度で処理して調べたところ、ヘパリ
チナーゼT−I及びヘパリチナーゼT−IIはそれぞれ5
5℃以上、ヘパリチナーゼT−IIIは50℃以上、ヘパ
リチナーゼT−IVは45℃以上でそれぞれ急激に失活す
る。
る。ヘパリチナーゼT−IはCa2+、Co2+、Mg2+、
Mn2+で賦活され、Zn2+で阻害される。ヘパリチナー
ゼT−IIはBa2+、Ca2+、Co2+、Mg2+、Mn2+で
賦活され、Zn2+で阻害される。ヘパリチナーゼT−II
IはZn2+で阻害される。ヘパリチナーゼT−IVはBa
2+、Ca2+、Mg2+で賦活され、Co2+、Zn2+で阻害
される。
性質を公知酵素と比較検討すると、ヘパリチナーゼT−
I、ヘパリチナーゼT−II及びヘパリチナーゼT−III
はヘパリンには殆ど作用せずヘパラン硫酸に作用し、分
解物がフラボバクテリューム属細菌の公知酵素のものと
異なる理由から、また、ヘパリチナーゼT−IVは、ヘパ
リン及びヘパラン硫酸に作用するがフラボバクテリュー
ム属細菌の公知酵素とは分解物が異なること及びバチル
ス属細菌の酵素とは至適温度や温度安定性が異なる等の
理由から、上記4種のヘパリチナーゼは公知酵素とは異
なる性質を有する新規酵素と確認された。
するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。 実施例 ペプトンA(極東製薬製)0.75%、酵母エキス(極
東製薬製)0.5%、ヘパリンナトリウム(シンテック
ス製)0.5%、K2 HPO4 0.1%、MgSO4・
7H2O 0.02%、NaCl0.1%、消泡剤アデカ
ノールLG109(旭電化製)0.005%(pH7.
0)の組成からなる生産培地20000mlを30000
ml容のジャーファーメンターに仕込み、120℃で20
分間蒸気滅菌後、予めハートインヒュージョン寒天培地
(栄研化学製)で45℃一日培養後、生産培地と同組成
(但し、ヘパリンナトリウムは0.2%、消泡剤は無添
加)の種培地に接種して、45℃、20時間振盪培養し
ておいたバチルス・サーキュランスHpT298株の培
養液600ml(3%)を無菌的に接種し、45℃で18
時間通気(1v.v.m)撹拌(300rpm)培養を行った。培
養終了後、培養液を連続遠心分離にて処理して菌体を集
め、この菌体(湿潤量110g)のうち半量を300ml
の0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)中に懸濁し、超音
波破砕器を用いて破砕した。破砕後、遠心分離により不
溶物を除去し、得られた上清液に硫酸アンモニウムを加
え0.6飽和とした。沈澱物を集め、20mMトリス・酢
酸緩衝液pH7.0で一夜透析し、透析液をDEAE−セ
ファセルカラム(4.2×25cm)に負荷し、同緩衝液
で溶出させた。その溶出液をハイドロキシアパタイトカ
ラム(3.2×24cm)に負荷し、同緩衝液中で食塩濃
度を0〜0.5Mまで直線的に上昇させることにより溶
出させた。Hep及びHSを基質として活性を測定した
ところ、通過液でヘパリチナーゼT−Iが、0.2M前
後でヘパリチナーゼT−IIが、0.4M前後でヘパリチ
ナーゼT−III及びヘパリチナーゼT−IVが溶出され
た。それぞれの画分を限外ろ過膜を用いて脱塩し、次い
で50mMトリス・酢酸緩衝液に置換した。そのうちヘパ
リチナーゼT−IとヘパリチナーゼT−IIの両画分につ
いては、それぞれをセファクリルS−300カラム
(3.8×100cm)に負荷し、0.2M食塩を含む5
0mMトリス・酢酸緩衝液でゲルろ過を行い、それぞれの
活性画分を集め、限外ろ過膜を用いて濃縮脱塩し、酵素
液を得た。又、ヘパリチナーゼT−III及びヘパリチナ
ーゼT−IVが同時に溶出された画分については、硫酸化
セルロファインカラム(3.2×20cm)に負荷し、5
0mMトリス・酢酸緩衝液中で食塩濃度0〜0.3Mまで
直線的に上昇させることにより溶出させた。0.1M前
後でヘパリチナーゼT−IIIが、0.15M前後でヘパリ
チナーゼT−IVが溶出され、それぞれの画分を限外ろ過
膜を用いて濃縮脱塩し、酵素液を得た。
硫酸を分解する新規のヘパリチナーゼT−IIを提供する
ことができる。
(ウシ腎臓由来)に対する各酵素の分解能を示す。
示す。
Claims (2)
- 【請求項1】 下記の理化学的性質を有するヘパリチナ
ーゼT−II。 (A) 作 用 ヘパリン及びヘパラン硫酸のグリコサミニド結合に作用
するリアーゼであり、切断部のグルクロン酸又はイズロ
ン酸の4位と5位の炭素の間に二重結合を形成する。 (B) 基質特異性 ヘパリンには殆ど作用せず、主としてヘパラン硫酸に作
用し、分解物として生ずる不飽和二糖は非硫酸化物及び
少量のウロン酸−グルコサミン−N−硫酸である。 (C) 至適pH 5.5−6.5 (D) 安定pH範囲 5.0−9.5 (E) 至適温度 55℃ (F) 安定温度範囲 50℃以下 (G) 阻害及び活性化 酵素活性がBa2+、Ca2+、Co2+、Mg2+、Mn2+で
賦活され、Zn 2+で阻害される。 - 【請求項2】 バチルス属に属するヘパリチナーゼT−
II生産能を有する細菌を培養し、その培養液又は菌体抽
出液からヘパリチナーゼT−IIを採取することを特徴と
する、請求項1記載のヘパリチナーゼT−IIの製造法。
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