JP2660722B2 - 微生物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微生物に関する。詳しくは、エンド型糖脂質
分解酵素の産生能を有するロドコッカス エスピ−Ｇ−
74の変異株に関する。

（従来の技術と問題点） 動物界に広く存在しているスフィンゴ糖脂質は、スフ
ィンゴ塩基の第一級アルコール性水酸基がグリコシド結
合によって単糖又はオリゴ糖と結合し、更に脂肪酸がス
フィンゴ塩基に酸アミド結合したものであり、このスフ
ィンゴ塩基と脂肪酸からなる部分をセラミドと呼んでい
る（脂肪の化学、365頁、1974年、東京化学同人社発
行）。

スフィンゴ糖脂質は、細胞表層の主要な構成成分であ
り、細胞の膜抗原、血液型物質、相互識別、分化等の重
要な膜機能との関連が注目され、糖鎖の構造と機能の解
明が検討されているが、このためには、特異性の高い酵
素が重要な役割を果す。

しかし、従来糖脂質の糖鎖切断用の酵素としては、エ
キソ型糖脂質分解酵素のみが知られ、エンド型糖脂質分
解酵素は知られていなかった。

本発明者等は、糖脂質の糖鎖を切断する糖脂質分解酵
素を検索中のところ、さきに特異性の高いエンド型糖脂
質分解酵素を産生する微生物ロドコッカス エスピ−Ｇ
−74（Rhodococcus sp.G−74）を見出した（特開昭62−
69981号）。この微生物は、微工研菌寄第9424号（FERM
P−8424）として寄託されている。

この微生物を培養してエンド型糖脂質分解酵素（エン
ドグリコセラミダーゼ）産出させるには、培地中に誘導
剤（酵素の誘導物質）としてガングリオシド（糖脂質）
又はそれを含む牛脳アセトンパウダーを添加することが
必要であるが、この糖脂質は高価である上、培地中に分
泌された酵素と複合体を形成して酵素の精製を困難にす
る欠点がある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、上記の知見に基づいて検討を進めた結
果、このロドコッカス エスピ−Ｇ−74を変異処理して
得られた変異株が、培地中にガングリオシドのような糖
脂質が存在しない場合においても、エンド型糖脂質分解
酵素の産生能を有し、さらに糖脂質が存在する場合に
は、エンド型糖脂質分解酵素の産生量が著しく増加する
ことを確認し本発明を達成した。即ち本発明の要旨は、
糖脂質の非存在下において、エンド型糖脂質分解酵素の
産生能を有するロドコッカス エスピ−Ｍ−750（Rhodo
coccus sp.M−750）に存する。

以下本発明を詳細に説明する。

本発明に係るロドコッカス エスピ−Ｍ−750は、さ
きに本発明者等が東京都町田市で採取した土壌から分離
されたロドコッカス エスピ−Ｇ−74（Rhodococcus s
p.G−74）の変異株であって、微工研菌寄第9946号（FER
M P−9946）として寄託されている。

本発明に係るロドコッカス エスピ−Ｍ−750は、上
記のロドコッカス エスピ−Ｇ−74を変異処理すること
によって得ることができる。

変異処理法としては、周知の紫外線照射処理及びニト
ロソグアニジンによる処理等によって実施される。例え
ば、後記実施例に具体的に示すように、ロドコッカス
エスピ−Ｇ−74（以下Ｇ−74と略記する）を培養後集菌
し、これを滅菌処理食塩水に懸濁させて紫外線照射によ
り変異処理し、次いで照射後の菌を馬血液寒天培地上で
培養して透明環を形成しない変異株を選択採取し、次い
でこの変異株を培養した後ニトロソグアニジンを含む酢
酸緩衝液で変異処理する。なお、Ｇ−74は培地中にヘモ
シンを産生し、これが馬血液を溶血させてコロニーの周
囲に透明環を形成する。

以上のように変異処理して得られたロドコッカス エ
スピ−Ｍ−750（以下Ｍ−750と略記する）の形態学的特
徴、各種培地上の性状及び生理的、性化学的性質は、以
下に示す通りで、Ｇ−74のそれ等と特に異なる所はな
い。しかしながら、Ｇ−74が、培地中に糖脂質の存在す
る場合においてのみ、エンド型糖脂質分解酵素（以下特
に断らない限り単に酵素という）の産生能を有するのに
対して、本発明に係るＭ−750は、培地中に糖脂質が存
在しない場合においても、酵素の産生能を有し、更に糖
脂質が存在する場合には、酵素の産生能が著しく増大
（約10培）するという特徴を有し、この点においてＧ−
74と明白に相違している。

［ロドコッカス エスピ−Ｍ−750の形態学的特徴、各
種培地上の性状及び生理的、生化学的性質］ （１）形態学的特徴（ハート・インフュージョン寒天培
地上で30℃、６〜48時間培養） （イ）細胞形態：培養後、７時間位まで細胞は不均一に
伸長し、菌糸状に生育し、稀に分岐が観察される。その
後、菌糸状細胞はジグザグ状に曲がり、漸次分裂を繰り
返す。24時間以降の古い培養では、菌糸の分節（fragme
ntation）が生起し、桿状（1.6〜6.6×1.0〜1.2μｍ）
から球状（1.0〜1.2μｍ）になる。

（ロ）分裂様式：スナッピング（snapping）型 （ハ）運動性：なし （ニ）胞子形成：なし （ホ）グラム染色性：陽性 （ヘ）抗酸性：弱い抗酸性 （２）各種培地上の性状 （イ）30℃のシュクロース−硝酸塩寒天培地：生育微
弱；コロニー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし （ロ）30℃のグルコース−アスパラギン寒天培地：生育
微弱；コロニー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素な
し （ハ）30℃のグルコース−アスパラギン寒天培地：生育
微弱；コロニー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素な
し （ニ）30℃のスターチ寒天培地：生育微弱；コロニー色
は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし （ホ）30℃のチロシン寒天培地：生育微弱；コロニー色
は無色；気中菌糸なし （ヘ）30℃の普通寒天培地：生育良好；コロニー色は黄
味白色に近い薄燈色；気中菌糸なし；拡散性色素なし （ト）30℃のイースト−麦芽寒天培地：生育良好；コロ
ニー色はにぶ燈色；気中菌糸なし；拡散性色素なし （チ）30℃のオートミール寒天培地：生育微弱；コロニ
ー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし （３）生理的性質 （イ）生育温度範囲（ハートインフュージョン寒天培
地）:10〜37℃ （ロ）空気中での発育：良好 （ハ）嫌気条件下での発育：生育せず （ニ）カタラーゼ：陽性 （ホ）オキシダーゼ：陽性 （ヘ）Ｏ−Ｆテスト：陰性 （ト）酸の生成（グルコース）：陰性 （チ）ゼラチンの液化：陰性 （リ）スターチの加水分解：陰性 （ヌ）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：陰性 （ル）リトマスミルク：変化なし （オ）メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地及びペ
プトン−イースト鉄寒天培地）：陰性 （ワ）糖類の資化性（プリドハム−ゴトリーブ寒天培地
上で30℃、21日間培養）： Ｌ−アラピノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース ± シュクロース − イノシトール − Ｌ−ラムノース − ラフィノース − Ｄ−マンニット − （４）生化学的性質 （イ）DNAの塩基組成GC含量:69.5％ （ロ）細胞壁の主要なアミノ酸組成:DL−ジアミノピメ
リン酸 （ハ）細胞壁の糖組成：アラピノース、ガラクトース （ニ）グリコレート・テスト：グリコリル型 （ホ）ミコール酸の総炭素数:C₃₂−C₄₈ （ヘ）メナキノン組成:MK−８（H₂） （５）分類学的考察 ［高次の分類学上の位置］ 本菌株は、セルサイクル（cell cycle）に多形性を示
し、培養初期に菌糸状に生育し、古い培養では菌糸の分
節が起って、短桿状〜球状の細胞となる。細胞の分裂様
式はスナッピング（snapping）型を示す。グラム染色性
は強い陽性を示し、抗酸性染色は弱陽性を示す。本菌の
DNAのGC含量は69.5％の高い値を示し、細胞壁の主要な
アミノ酸組成はDL−ジアミノピリメン酸、糖組成はアラ
ピノース、ガラクトースを有し、細胞壁タイプIV型に属
す。ミコール酸炭素数はC₃₂−C₄₈、ペプチドグリカン糖
鎖部はグリコリル型を示す。

本菌株は以上示した形態的、生理・生化学的特性から
して“Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"
第２巻（1986）に記載されているNocardioforms Sectio
nに分類される。

［属レベルの同定］ “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"第
２巻（1986）、M.Goodfellow,M.D.Collins,D.E.Minniki
n,Journal of General Microbiology,96,351（1976）及
びD.E.Minnikin,M.Goodfellow,“Microbiological Clas
sification and ldentification"Academic Press,Londo
n,p.189（1980）によれば、Nocardioforms Sectionに帰
属する属は、ミコール酸の分子種組成の違いによって互
いに識別されている。本菌株はC₃₂−C₄₈のミコール酸を
有し、Corynebacterium、Mycobacterium、Nocardia属か
ら区別され、Rhodococcusのミコール酸分子種組成に合
致した。更にGC含量、細胞壁タイプ、ペプチドグリカン
糖鎖構造等においても、Rhodococcus属の諸性質によく
一致した。

よって、本菌株（Ｍ−750）は、ロドコッカス エス
ピ−（Rhodococcus sp.）と同定した。

本発明のＭ−750は、前述のようにガングリオシドの
ような糖脂質の存在下又は非存在下で培養することによ
り、培地中にエンド型糖脂質分解酵素を分泌産生し、特
に糖脂質が存在する場合には、エンド型糖脂質分解酵素
の産生量が著しく増加する。

この酵素は、スフィンゴ糖脂質を基質として糖鎖とセ
ラミドの結合を切断してオリゴ糖を生成するが、単糖は
生成しない。また、単糖とセラミドとが結合したセレブ
ロシドは分解しない。

より具体的には、 （１）オリゴ糖鎖中のグルコースが直接セラミドと結合
しているスフィンゴ糖脂質を基質とし、該グルコースと
セラミドの結合を切断してオリゴ糖を生成するエンド型
糖脂質分解酵素（以下酵素１という）と、 （２）オリゴ糖鎖中のガラクトースが直接セラミドと結
合しているスフィンゴ糖脂質を基質とし、該ガラクトー
スとセラミドの結合を切断してオリゴ糖を生成するエン
ド型糖脂質分解酵素（以下酵素２という）とからなる。

上記酵素１と酵素２は、本発明に係るＭ−750を培養
することにより培地中に分泌されるので、培地から硫安
塩析及び各種のカラムクロマトグラフィー処理によって
容易に精製分離することができる。

培地としては、例えばマイコロジカルペプトン培地
（オキソイド社製）が好適に使用されている。前記のよ
うに、Ｍ−750の培養には、培地中に糖脂質を含むこと
は必須ではないが、糖脂質を使用する場合には、例えば
糖鎖にシアル酸が結合したガングリオシド又はそれを含
む牛脳アセトンパウダーが好適である。糖脂質を使用し
ない場合には、マイコロジカルペプトンに、酵母エキ
ス、食塩等を添加した培地が好適である。培地中には上
記以外の各種の炭素源、窒素源を添加することができ
る。

培地のpHは、通常6.8〜7.2、好適には７付近であり、
温度は24〜30℃程度から選ばれる。培養は２〜４日間程
度が好ましい。

培養物からの酵素の採取、精製は、例えば上記菌株の
培養液を遠心分離して上清を採取し、固形硫安を飽和溶
液の80％になるように添加して塩析し、沈澱物を蒸留水
に溶解し、スファデックスＧ−100及びDEAE−セファロ
ースFFカラムクロマトグラフィーにより精製する。

次に、得られた酵素１及び酵素２の理化学的性質につ
いて詳細に説明するが、酵素活性の測定は以下の方法に
よった。

［酵素活性の測定］ 酵素液 100μｌ 基 質 100μｌ ［0.1Mの酢酸緩衝液（pH6.0）に5mg/mlの基質¹⁾及び1mg
/mlのTDC（タウロデオキシコール酸ナトリウム、界面活
性剤）を加えたもの］ 上記の酵素及び基質を混合し37℃で酵素活性の強さに
応じて１時間〜１夜間反応させた後、反応液100μｌを
採取し、パーク・ジョンソン（Park−Johnson）法によ
り還元力を測定し、１分間に１μmolのグルコース又は
ガラクトースに対応する還元力を生じる酵素量を１単位
とする。反応液は薄層クロマトグラフィーで分析してオ
リゴ糖及びセラミドが生じているかどうかを確認する。

基質¹⁾:酵素１の場合には、牛脳から単離したG_M1［Gal
β１→3GalNAcβ１→４（NeuAcα２→３）Galβ１→4Gl
cβ１→1Cer］を使用し、また酵素２の場合にはネオガ
ラトリアオシルセラミド（Neogalatriaosylceramide、G
alβ１→6Galβ１→6Galβ１→1Cer）を使用した。

［酵素１の理化学的性質］ （イ）作 用 スフィンゴ糖脂質に作用し、糖鎖とセラミドの結合を
切断してオリゴ糖とセラミドを生成する。

この際、基質としては、オリゴ糖鎖にシアル酸が結合
したガングリオシド（ganglioside）系列の酸性スフィ
ンゴ糖脂質で、例えばG_T1a,G_D1a,G_D1b,G_M1,G_M2,G_M3等
（脂質の化学、389〜391頁、1974年、東京化学同人社発
行）が挙げられる。また、オリゴ糖鎖にシアル酸が結合
していない中性スフィンゴ糖脂質で、オリゴ糖鎖中のグ
ルコースが直接セラミドと結合しているもの、例えばラ
クトシルセラミド（Galβ１→4Glcβ１→1Cer）、ネオ
ラクトテトラオシルセラミド（Galβ１→4GlcNAcβ１→
3Galβ１→4Glcβ１→1Cer）、フコシルペンタグリコシ
ルセラミド［Fucα１→3GalNAcα１→３（Fucα１→
２）Galβ１→4GlcB1→1Cer］等が挙げられる。

（ロ）基質特異性 上記のように、酵素１は、オリゴ糖鎖中のグルコース
が直接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、グ
ルコースとセラミドとの結合を特異的に切断してオリゴ
糖を生成する。即ち、所謂エンドグルコシルセラミダー
ゼ（endoglucosyl ceramidase）活性を有するが、単糖
は生成しない。換言すれば、エキソグリコシダーゼ活性
は有しない。

また、グルコースのような単糖とセラミドとが結合し
たセレブロシド（cerebroside）は分解しない。

（ハ）至適pH5〜5.5 （ニ）安定pH5〜９ （ホ）作用最適温は37℃であり、30〜40℃の範囲で適用
可能である。

（ヘ）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量は55,900である。

（ト）安定性 37℃で一夜間安定であり、また、凍結乾
燥品は−25℃で少なくとも数ヶ月間安定である。

（チ）阻害 酵素活性は銅イオン及び水銀イオンにより
阻害されるが、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、バリウムイオン、亜鉛イオン及びエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）による影響はない。

（リ）活性化 酵素の基質に対する活性は界面活性剤の
添加により顕著に増大する。即ち、反応の際に、前記TD
Cを0.5mg/ml添加すると、無添加の場合に比して反応は
2.5培に増大する。

［酵素２の理化学的性質］ （イ）作 用 スフィンゴ糖脂質に作用し、糖鎖とセラミドの結合を
切断してオリゴ糖とセラミドを生成する。

この際、基質としては、ネオガラトリアオシルセラミ
ド（Galβ１→6Galβ１→6Galβ１→1Cer）、ガラピオ
シルセラミド（Galα１→4Galβ１→1Cer）等の、オリ
ゴ糖鎖中のガラクトースが直接セラミドと結合している
スフィンゴ糖脂質が挙げられる。

（ロ）基質特異性 上記のように、酵素２は、オリゴ糖鎖中のグルコース
が直接セラミドと結合しているスフィンゴ糖脂質の、グ
ルコースとセラミドとの結合を特異的に切断してオリゴ
糖を生成する。即ち所謂エンドガラクトルシルセラミダ
ーゼ（endogalactosylceramidase）活性を有するが、単
糖は生成しない。換言すれば、エキソガラクトシダーゼ
活性は有しない。

また、ガラクトースのような単糖とセラミドとが結合
したセレブロシド（cerebrosibe）は分解しない。

（ハ）至適pH5〜5.5 （ニ）安定pH5〜９ （ホ）作用最適温は37℃であり、30〜40℃の範囲で適用
可能である。

（ヘ）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量は53,700である。

（ト）安定性37℃で一夜間安定であり、また、凍結乾燥
品は−25℃で少なくとも数ヶ月間安定である。

（チ）阻害 酵素活性は銅イオン及び水銀イオンにより
阻害されるが、カルシウムイオン、マグネシウムイオ
ン、バリウムイオン、亜鉛イオン及びエチレンジアミン
四酢酸（EDTA）による影響はない。

上記酵素１又は酵素２を利用して以下の事項を解明す
ることができる。

（１）スフィンゴ糖脂質における糖鎖の役割を知ること
ができる。

（２）本酵素で切り出したオリゴ糖は、簡単な方法によ
って［³H］−標識又は２−アミノピリジリンその他の蛍
光物質による標識をすることができ、このため、従来の
数百培の感度で糖鎖の構造決定ができる。

（３）本酵素は、スフィンゴ糖脂質に対して前述のよう
に特異的に作用し、糖蛋白質に対しては作用しないの
で、微量の試料についても、糖蛋白質であるか、糖脂質
であるかの識別を容易に行なうことができる。

以上の事項から、本酵素を使用して例えば細胞表層の
ウイルス・レセプター、細胞毒素（例えばコレラトキシ
ン）のレセプター、特異的ガン抗源、発生・分化に伴う
特異抗源等の構造決定及び糖鎖の役割等を調べることが
可能となり、その結果、それ等に対する診断薬、治療薬
等の開発が期待される。

（実施例） 以下に本発明を実施例について更に具体的に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限
定されるものではない。

実施例 （１）ロドコッカス エスピ−Ｍ−750の調製 ロドコッカス エスピ−Ｇ−74（Rhodococcus sp.G−
74）（微工研菌寄第8424号）を、マイコロジカルペプト
ン（オキソイド社製）１％、イーストエキス0.1％、塩
化ナトリウム0.2％を含む2000mlの液体培地（pH7.0〜7.
2）を用いて、30℃で24時間培養し、遠心分離（7500rpm
×15min.）して無菌的に集菌した。

この菌株を滅菌処理した食塩水に懸濁させて、620nm
における吸光度が0.4〜0.5になるように菌数を調整した
後、30cmの距離に水銀ランプ（GL−15）から紫外線を２
分間照射し、次いで馬血液寒天平板にまいて、30℃にお
いて４〜５日間培養し、コロニーの周囲に透明環を作ら
ないものを変異株として選択した。

こるして得られた変異株を、再び前記の液体培地にお
いて30℃で24時間培養し、遠心分離して集菌し、この菌
株を0.15M食塩及び0.5mg/mlのニトログアニジンを含有
する0.1Mの酢酸緩衝液（pH6）中に懸濁して室温で１時
間変異処理を行ない、次いで集菌し、滅菌生理食塩水で
洗浄した後、馬血液寒天平板にまいて、30℃において４
〜５日間培養し、周囲に透明環を作らないコロニーを採
取（野性株Ｇ−74はヘモリシンを産生するためコロニの
周囲に透明環を作る）し、これらを誘導剤（糖脂質）を
含まない培地で培養して、その培養上清の酵素活性を前
記の方法によって測定した。約1000株をスクリーニング
したところ、そのうちの１株（Ｍ−750）が誘導剤を含
まない培地においても酵素を産生した。Ｍ−750は馬血
液培地において透明環を作らないことからも分かるよう
に、ヘモリシン（溶血因子）を産生せず、Ｇ−74に比較
して酵素の精製が容易であった。

（１）酵素の調製 上記に得たＭ−750をマイコロジカルペプトン１〜２
％、イーストエキス0.1％、塩化ナトリウム0.2％を含む
2000mlの液体培地（pH7.0〜7.2）を用いて、30℃で３日
間通気撹拌培養し、遠心分離（7500rpm×15min.）し、
上清を採取した。

得られた上清液1800mlに80％濃度となるように硫安を
加え、１夜間放置後、遠心分離（8500r.p.mで45分間）
して生成した沈澱物を採取し、0.5％“トリトンＸ−10
0"（非イオン界面活性剤）を含む50mM酢酸緩衝液（pH
6）に溶解した。この溶液を、0.1％トリメンＸ−100と
0.2M NaClを含む50mM酢酸緩衝液（pH6）で平衝化した
“セファデックスＧ−100"のカラム（５×85cm）を用い
てゲル濾過し、溶出液の酵素活性を前記の方法で測定し
た。活性画分を集めて限外濾過（“アミコンXM50"膜使
用）により濃縮した。濃縮液を50mMの酢酸緩衝液（pH6.
0、0.1％“トリトンＸ−100"を含む）を用いて平衝化し
たDEAE−セファロースFFのカラム（2.2×24cm）にかけ
た。カラムをその３培容量の同一の緩衝液で洗浄し、次
いで塩化ナトリウムの０−0.3M直線濃度勾配液で溶出
し、溶出液を3.4ml宛順次採取し、100〜140の画分から
本発明の酵素１を得た。また、180〜200の画分から本発
明の酵素２を得た。こうして得られた酵素１及び酵素２
は夫々219m単位/mg及び15.5m単位/mgであった。上記で
使用した培地にガングリオシド0.1％を添加した場合の
酵素産生力は約10培に達した。なお、酵素１をハイドロ
キシルアパタイトカラムクロマトグラフィー、クロマト
フォーカシング及びTSKG3000SWカラムによる高速液体ク
ロマトグラフィーによって精製処理した結果23単位/mg
まで精製された。また、酵素２をハイドロキシルアパタ
イトカラムクロマトグラフィーにより精製処理した結果
33.3m単位/mgまで精製された。

参考のため、ロドコッカス エスピ−Ｍ−750の代り
に、ロドコッカス エスピ−Ｇ−74を使用し、かつガン
グリオシドを含有する上記液体培地を使用し、同様の処
理を行なって得られた酵素１及び酵素２は夫々48m単位/
mg及び8.6m単位/mgであった。また、ガングリオシドを
含有しない上記液体培地を使用し、同様の処理を行なっ
た場合、酵素１及び酵素２の存在は認められなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糖脂質の非存在において、エンド型糖脂質
   分解酵素の産生能を有するロドコッカス エスピ−Ｍ−
   750（Rhodococcus sp.M−750）。