JPH0795947B2 - α−１，３−グルカナーゼの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、齲蝕原性連鎖球菌（Streptococcus mutans）
が産生および形成する歯垢に含まれる1,3−1,6−α−Ｄ
−グルカンのα−1,3−グルコシド結合を特異的に切断
分解する酵素である、α−1,3−グルカナーゼの製造方
法に関する。

具体的には、バチルス属に属する細菌あるいはその突然
変異株、特に、バチルス・サーキュランスBC−８菌（Ba
cillus circulans BC−８）、あるいはその突然変異株
を培養し、該培養物よりα−1,3−グルカナーゼを回収
する工程を含むα−1,3−グルカナーゼの製造方法に関
する。

〔従来の技術〕

齲蝕原性連鎖球菌が産生する不溶性グルカン（「ムタ
ン」とも称する）によって、該菌と不溶性グルカンから
なる複合体であるデンタルプラーク（dental plaqu
e）、すなわち、歯垢が形成される。そして、該歯が、
歯垢と共に歯の表面に付着し、そして、口腔内に存在す
る蔗糖を分解することによって、有機酸が生じ、この有
機酸の作用により、歯牙エナメル質が溶解されて、虫歯
が発生することが判明している。

従って、虫歯を予防するために、歯垢の主成分である前
記不溶性グルカンを分解して、前記歯の歯への付着を阻
止することが提案されている。

さらに、この不溶性グルカンは、1,3−1,6−α−Ｄ−グ
ルカンおよび1,6−α−Ｄ−グルカンより構成されてお
り、これらを分解するためには、α−1,3−グルコシド
結合を特異的に切断分解する酵素であるα−1,3−グル
カナーゼ〔正式名;1,3−（1,3:1,4）−α−Ｄグルカン
３−グルカノハイドロラーゼ（EC 3.2.1.59）；単に、
「グルカナーゼ」あるいは「ムタナーゼ」とも称する〕
と、α−1,6−グルコシド結合を特異的に切断分解する
酵素であるα−1,6−グルカナーゼ（単に、「デキスト
ラナーゼ」とも称する）の単独作用もしくは双方の酵素
の共同作用が有効であることが判明している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来より、α−1,3−グルカナーゼの産生菌株の報告は
いくつかなされている。例えば、トリコデルマ（Tricho
derma）属〔例えば、トルコデルマ ハリジアヌム（Tri
choderma harzianum）CB−S 243.71:FERM P−1161〕に
属する糸状菌、ストレプトミセス（Streptomyces）属に
属する放線菌、フラボバクテリウム（Flavobacterium）
属〔例えば、フラボバクテリウム EK−01（微工研菌寄
第2506号）〕、シュドモナス（Pseudomonas）属（例え
ば、シュドモナス SK−01（微工研菌寄第4273号）〕に
属する細菌などが該当する。

なお、バチルス属に属する細菌（例えば、Bacillus ci
rculans:FERM P−4765）が、α−1,6−およびα−1,3−
グルコシド結合を分解する能力を有する新規の酵素を産
生することも報告されている（特開昭55−88693号参
照）が、その開示内容からすれば、本発明により得られ
るα−1,3−グルカナーゼとは基質特異性の点で相違し
ており、別異の酵素であると考えられる。

バチルス属に属する細菌は、従来より食品の加工等にお
いて広く利用されており、人体への病原性や毒素産生性
がないこと、さらに有用酵素の生産などにおいて工業的
に汎用されており、その大量培養法に関する知見も広く
集積されている。

一方、バチルス属に属する細菌は形質転換が容易なこと
から遺伝学的、生化学的知見も大腸菌に次いで集積され
ている。

従って、バチルス属に属する細菌を用いて、口腔内の歯
垢を分解するα−1,3−グルカナーゼを産生させること
ができれば好都合である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、バチルス属に属する細菌を用いたα−1,3−
グルカナーゼの工業的生産方法の提供を意図するもので
あり、その要旨とするところは、不溶性グルカンなどに
含まれるα−1,3−グルコシド結合を特異的に切断分解
する酵素であるα−1,3−グルカナーゼを産生する能力
を有する、バチルス属に属する細菌もしくはその突然変
異株を培養培地に接種して、所定の培養条件下で培養し
た後、該培養物を遠心分離して、菌体を分離除去し、産
生されたα−1,3−グルカナーゼを採取する工程を含む
ことにある。

A.α−1,3−グルカナーゼを産生するバチルス・サーキ
ュランス・BC−８菌（Bucillus circulans BC−８）を
利用したα−1,3−グルカナーゼの製造方法 本発明者は、不溶性グルカンを炭素源として分解利用す
る微生物の検索を行った。その結果、バチルス属に属す
る細菌の中で、特に、強力にα−1,3−グルカナーゼを
産生する菌株を見出し、これをバチルス・サーキュラン
スBC−８菌（以下、「BC−８菌」と称する）と命名し
た。そして、この菌株を、茨城県筑波郡谷田部町東１丁
目１番３に所在の通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に、昭和60年３月13日に寄託し、微工研条寄第73
3号（FERM BP−733）の受託番号が付与されている。

本発明のα−1,3−グルカナーゼを製造する方法を、BC
−８菌を用いた場合に関して、以下に詳細に説明する。

まず、BC−８菌の菌学的性状は、以下の通りである。

〔BC−８菌の菌学的性状〕 （１）細胞：グラム陽性桿菌、大きさ0.5×1.3〜2.6μ
ｍ、運動性なし、胞子（endospore）を形成。

胞子は長楕円形で、端に片寄って存在。

好気的に増殖。

（２）コロニーの性状：ペプトン・イーストエキス寒天
上で、円形で平滑な淡黄白色集落を形成する。

（３）化学的性質 ・カタラーゼ（Catalase）： （＋） ・オキシダーゼ（Oxidase）： 弱（＋） ・ボーゲス−プロスカウエル（Voges−Proskauel）試
験： （−） ・インドール（Indole）産生： （−） ・グリセリンからのジヒドロキシアセトン（Dihydroxya
cetone）産生： （−） ・硝酸還元： （−） ・カゼイン加水分解： （−） ・澱粉加水分解： （＋） ・チロシン（Tyrosine）加水分解： （−） ・ゼラチン加水分解： （−） ・0.01％リゾチーム（Lysozyme）を含む液体培地での増
殖： （−） ・NaClを含む培地での増殖:5％NaCl; （＋） ７％NaCl; （−） ・ブドウ糖、乳糖、マンニット（Mannitol）、トレハロ
ーズ（Trehalose）から酸を産生するが、ガスは発生し
ない。

・アラビノーズ（Arabinose）、果糖、マンノーズ（Man
nose）、キシローズ（Xylose）からは酸もガスも発生し
ない。

・増殖温度:170℃〜37℃で増殖するが、10℃及び45℃で
は増殖は認められない。

・ビタミン：ビオチン要求性あり。

・DNAのＧ＋Ｃ含有量:49.5mol％ 上記した諸性質によって、BC−８菌は好気性有芽胞桿菌
バチルス属に属し、分類上、バチルス・サーキュランス
・ジョルダン（Bucillus circulans Jordan）と分類さ
れた。

1.BC−８菌の培養 （ａ）BC−８菌のための培養培地 α−1,3−グルカナーゼを製造するために、まずBC−８
菌を天然、または人工培地に接種して培養するが、工業
的生産には液体培地で通気攪拌培養法によって実施する
のが、コスト、収率の上からも有利である。

培地の栄養源としては、微生物一般に用いられるものが
使用される。例えば、炭素源として、齲蝕原性連鎖球菌
が産生する不溶性グルカンが最も有効で、窒素源として
は、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ペプト
ン、酵母エキス等が用いられる。無機塩としては、リン
酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム
等の塩類が用いられる。

特に、不溶性グルカン（後述する不溶性グルカンの調製
例を参照）を培地中に、培養基質および酵素酸生誘導物
質として0.1％（W/V）以上の量を粉砕し、懸濁状態で添
加することで、α−1,3−グルカナーゼを高収率で得る
ことができる。

（ｂ）BC−８菌の培養 前述のようにして調製した培地に、BC−８菌を接種し、
所定の培養温度、好ましくは、30℃〜37℃で、培養基の
pHを６〜７で、α−1,3−グルカナーゼが培養液中にて
最も高い活性を示すまで、所定の培養時間（培養条件に
よって異なるが、通常通気攪拌用培養では、１〜３日
間）培養する。

2.培養物からα−1,3−グルカナーゼの採取・精製 菌体から産生されたα−1,3−グルカナーゼを含む培養
物から、遠心分離によって菌体を取り除いて、粗酵素液
を得る。

また、この培地中に予め不溶性グルカンを培養基質とし
て添加した場合には、培養終了時に若干の不溶物が残存
し、これにα−1,3−グルカナーゼが吸着されてしまう
ため、培養前に、無菌濾過した適当量のデキストラナー
ゼを加えるか、あるいは培養後に、培養液にデキストラ
ナーゼを加え、不溶物を分解した後、遠心分離して粗酵
素液を調製する。

さらに、水可溶性低分子グルカン溶液（後述する水可溶
性低分子グルカン溶液の調製例を参照）で、培養液中に
沈殿した前記不溶物（沈殿物）を洗浄し、吸着したα−
1,3−グルカナーゼを溶出させて、その後、遠心分離し
て粗酵素液を調製する方法も有効である。

このように、デキストラナーゼ処理、水可溶性低分子グ
ルカン処理の両者を適宜組み合わせて、調製することに
よって、α−1,3−グルカナーゼの収率を上げることが
可能である。

このようにして得られた粗酵素液は、そのままでも製品
として充分に使用可能であるが、さらに該酵素液を公知
の分離精製方法、例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧濃縮
法、硫安等による塩析法、エタノール等による溶媒分画
法、等電点沈殿法、カラムクロマト分画法などを、単独
あるいは適宜組み合わせることによって精製酵素液を採
取することも可能である。

不溶性グルカンの調製例 ３％トッドヘビットブロス（Todd Hewitt Broth）〔デ
ィフコ（Difco）社製〕を含む液体培地に、齲蝕原性連
鎖球菌（Streptococcus mutans）OMZ−176株を接種し、
37℃にて、24時間静置培養する。得られた培養液から、
遠心分離によって、菌体を除去した後、50％飽和の硫安
塩析を実施し、生じた不溶物を遠心分離にかけて沈殿物
として集める。これを、50mMクエン酸緩衝液（pH6.5）
に溶解し、同緩衝液にて透析して、これを不溶性グルカ
ン合成酵素液とした。

透析終了後、この酵素液に基質として、10％の蔗糖を含
有する50mMクエン酸緩衝液（pH6.5）を加えて、37℃
で、24〜48時間反応させて、不溶性グルカンを合成し
た。遠心分離によって不溶性グルカンを集め、蒸留水で
洗浄し、次いで、エタノール、アセトンで洗浄した後、
100℃以下で加熱通風乾燥して不溶性グルカンを調製し
た。

水可溶性低分子グルカンの調製例 前述の不溶性グルカンの調製例と同様にして調製した齲
蝕原性連鎖球菌の不溶性グルカン合成酵素液を、透析チ
ューブに入れ、透析外液に10％の蔗糖を含む50mMのクエ
ン酸緩衝液（pH6.5）を用いて、37℃で、24〜48時間、
攪拌しながら低分子グルカンの合成と透析とを同時に行
った。

透析終了後の透析外液には、水可溶性低分子グルカンが
含まれているので、そのままでも前述のα−1,3−グル
カナーゼの採取に用いることが可能であるが、必要な場
合には、透析外液に66％（V/V）となるようにエタノー
ルを加え、遠心分離によって沈殿物を集めて、エターノ
ール、アセトンで洗浄した後、100℃以下で加熱通風乾
燥すれば、より良質の水可溶性低分子グルカンを分取す
ることができる。

B.BC−８菌を用いて得られたα−1,3−グルカナーゼの
理化学的性質 BC−８菌を用いて、本発明の製造方法によって得られる
α−1,3−グルカナーゼの理化学的性質は、以下の通り
である。

（１）作用及び基質特異性 α−1,3−グルコシド結合を有する多糖基質を、エンド
タイプに加水分解する性質を有し、特に、齲蝕原性連鎖
球菌が酸生する不溶性グルカンをよく分解する。

（ａ）高分子基質に対する作用 下記表Ｉに示した各種基質0.5mg、0.2M MES緩衝液〔２
−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォネート、pH6.
5〕または50mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、BC−８菌が産生し
たα−1,3−グルカナーゼ溶液10μｌを含む反応液100μ
ｌを、37℃で、１時間インキュベートし、生成した還元
糖をソモギーネルソン（Somogyi Nelson）法で比色定量
した。

その結果、表Ｉに示したように、α−1,3−グルコシド
結合を有する1,3−α−Ｄ−グルカン、1,3−1,6−α−
Ｄ−グルカンには非常によく作用する。しかしながら、
他のα−1,6−グルコシド結合を含む基質にはほとんど
作用せず、またニゲラン〔ニゲロース（Nigerose）単位
でα−1,3−グルコシド結合が含まれている〕にもほと
んど作用しなかった。

これは、α−1,3−グルコシド結合部分、しかも連続的
にα−1,3−グルコシド結合が並んでいるようなグルカ
ンのα−1,3−グルコシド結合部分に対して特異的に作
用することを示している。

（ｂ）低分子基質に対する作用 表IIに示した各種基質0.2mg、50mM MES緩衝液（pH6.
5）、BC−８菌が産生したα−1,3−グルカナーゼ溶液10
μｌを含む反応液50μｌを、37℃で、15時間インキュベ
ートし、その後、５分間煮沸して酵素反応を停止し、遠
心分離を行い、上清をシリカゲル（Silicagel 70 FMプ
レート、和光純薬社製）またはセルロース（HPTLC−cel
luoseプレート、Merck社製）の薄層にスポットした。シ
リカゲル薄層の場合は、ｎ−プロパノール、エチルアセ
テート、水（6:1:3）で、セルロース薄層の場合には、
エチルアセテート、酢酸、水（3:2:2）で展開し、ジフ
ェニルアミン−アニリン（diphenyl−amine−aniline）
試薬を用いて、分離された糖を検出した。

その結果、表IIに示したように、ニゲロース、イソマル
トース、イソマルトヘプタオースは全く分解しなかっ
た。こ れは、デキストラナーゼ活性を全く有しないことを示す
ものである。

（２）至適pH及び安定pH 第１図は、BC−８菌が産生したα−1,3−グルカナーゼ
の各pHにおける活性を示すグラフであり、pH7.0の燐酸
緩衝液を用いた時のグルカナーゼ活性を100％として、
各pHでの相対的活性値を比較したものである。作用pH
は、第１図のような曲線として得られ、pH4.0〜9.0の広
範囲にわたってその活性が認められる。特に、pH5.0付
近において最大の活性を示す。

第２図は、BC−８菌が産生したα−1,3−グルカナーゼ
の各pHにおける安定性を示すグラフで、α−1,3−グル
カナーゼを各pHにおいて、40℃で、５時間放置した後、
残存活性を測定（pH7.0の燐酸緩衝液を用いて時間を開
けなかったものを100％とした）したものである。pH安
定性は、第２図に示したように、pH6.0〜10.0にわたる
広範囲において安定であり、特に、pH7.0〜9.0において
非常に安定である。

（３）至適温度及び安定温度 作用至適温度は、第３図から明らかな通り、45℃〜50℃
である。

第４図は、BC−８菌が産生したα−1,3−グルカナーゼ
の各温度における安定性を示すグラフで、α−1,3−グ
ルカナーゼを各温度に５時間保った後、残存活性を測定
（pH7.0の燐酸緩衝液にて時間を開けなかったものの活
性を100％とした）したものである。第４図に示したよ
うに40℃以下の温度において安定である。

（４）金属塩、酵素阻害剤の影響 Fe²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Ag²⁺によって阻害を受け、特に、Hg
²⁺、Ag²⁺によって著しい阻害を受ける。また、pCMB（ｐ
−クロロ安息香酸第二水銀）も著しい阻害を示す。

（５）フェノール硫酸法を用いるα−1,3−グルカナー
ゼの活性測定法 通常、6mg/mlの1,3−α−Ｄ−グルカン（表Ｉの脚注参
照）（50mM燐酸緩衝液、pH7.0）懸濁液0.2mlに、0.1ml
のα−1,3−グルカナーゼ溶液を加えて、40℃で、16時
間反応を行い、エタノール（最終濃度60％）で反応を停
止した後、可溶性となった糖を、フェノール硫酸法で定
量した。

上記反応条件において、100nmolのブドウ糖に相当する6
0％エタノール可溶性の糖を生成する酵素量を１単位と
した。実際的には、各種濃度のα−1,3−グルカナーゼ
を用いて、標準曲線を作成して、それによって酵素活性
値を読み取った。

（６）分子量 本酵素の分子量は、第５図に示したように、SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法によって、180,000と決
定された。

C.BC−８菌の突然変異株を利用したα−1,3−グルカナ
ーゼの製造方法 本発明者は、上述のようにBC−８菌を利用することで、
初期の目的であるα−1,3−グルカナーゼを製造するこ
とができたが、より効率良くα−1,3−グルカナーゼを
製造するために、誘導基質を培地中に加えなければなら
ないBC−８菌の代わりに、炭素源として一般に用いられ
るブドウ糖を加えるだけで、α−1,3−グルカナーゼを
構成的に産生する突然変異株を利用できれば好都合であ
る。

そこで、本発明者は、BC−８菌を突然変異誘起剤にて処
理し、ブドウ糖を炭素源として分解利用してα−1,3−
グルカナーゼを産生する突然変異株を検索した結果、バ
チルス・サーキュランス BC−８−033〔Bacillu scircu
lans BC−８−033（微工研条寄第1515号:FERM BP−151
5）（以下、「BC−８菌変異株」と称する）〕が構成的
に、かつ強力にα−1,3−グルカナーゼを産生すること
を見出した。

以下に、このBC−８菌変異株を用いた、本発明のα−1,
3−グルカナーゼの製造方法を詳細に説明する。

1.BC−８菌変異株の分離 BC−８菌を、1.0％ブドウ糖、1.0％バクトトリプトン
（Difco社製）、0.5％酵母エキス（Difco社製）、0.5％
食塩からなる、pH7.0に調整し、滅菌した液体培地に植
菌し、37℃で振盪培養した。対数増殖期で培養を停止
し、遠心分離によりBC−８菌体を集めた。これを４℃の
50mM燐酸緩衝液（pH6.5）で洗浄した後、50μg/mlのＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（50
mM燐酸緩衝液、pH6.5）溶液に懸濁し、37℃で、20分間
処理した。その後、50mM燐酸緩衝液（pH6.5）でよく洗
菌し、さらに、菌体を上記液体培地に植菌し、37℃で、
３時間振盪培養し、菌体を30％グリセロール溶液に懸濁
させて、−80℃で保存した。この菌体保存溶液を随時溶
解し、この中から炭素源として、不溶性グルカンの代わ
りにブドウ糖のみを培地成分として用いた場合でも、多
量にα−1,3−グルカナーゼを産生する突然変異株の検
索を行ったところ、前述したような性質を有するBC−８
菌変異株が分離された。

2.BC−８菌変異株の菌学的性状 構成的にα−1,3−グルカナーゼを産生する性質以外
は、前記BC−８菌と同様である。

3.BC−８菌変異株の培養 （ａ）BC−８菌変異株培養のための培地 α−1,3−グルカナーゼを製造するために、まずBC−８
菌変異株を天然、または人工培地に接種して培養する
が、工業的生産には液体培地で通気攪拌培養法によって
実施するのが、コスト、収率の上からも有利である。

培地の栄養源としては、微生物一般に用いられるものが
使用される。例えば、炭素源としてブドウ糖が最も有効
で、窒素源としては、リン酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、ペプトン、酵母エキスなどが用いられる。無機
塩としては、リン酸、ナトリウム、カリウム、鉄、マン
ガン、亜鉛、コバルト、銅などの塩類が用いられる。

（ｂ）BC−８菌変異株の培養 このように調製した培地に、BC−８菌変異株を接種し、
所定の培養温度、好ましくは、30℃〜37℃で、培養基の
pHを６〜７で、α−1,3−グルカナーゼが培養液中で最
も高い活性を示すまで、所定の培養時間（培養条件によ
って異なるが、通常通気攪拌培養では、１〜３日間）培
養する。

4.培養物からのα−1,3−グルカナーゼの採取・精製 このようにして、充分にα−1,3−グルカナーゼが産生
された培養物から、遠心分離によって菌体を取り除け
ば、粗酵素液が得られる。

得られた粗酵素液は、そのままでも製品として充分に使
用可能であるが、さらに該酵素液を公知の分離精製法、
例えば、限外濾過膜濃縮法、硫安などによる塩析法、エ
タノールなどによる溶媒分画法、等電点沈澱法、カラム
クロマト分画法などを、単独あるいは適宜組合わせるこ
とによって精製酵素液を採取することが可能である。

D.BC−８菌変異株を用いて得られたα−1,3−グルカナ
ーゼの理化学的性質 本発明の製造方法によって得られるBC−８菌変異株のα
−1,3−グルカナーゼは、以下の理化学的性質を有す
る。

（１）作用及び基質特異性 BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼと同じ。

（２）至適pH及び安定pH BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼと同じ。

（３）至適温度及び安定温度 BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼと同じ。

（４）金属塩、酵素阻害剤の影響 BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼと同じ。

（５）分子量 BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼと同じ。

（６）還元糖増加活性測定方法 通常、5mg/mlの1,3−α−Ｄ−グルカン（表Ｉの脚注参
照）（50mM燐酸緩衝液、pH7.0）懸濁液50μｌに、40μ
ｌの50mM燐酸緩衝液、pH7.0を加え、さらに10μｌのα
−1,3−グルカナーゼ溶液を加えて、37℃で、60分間反
応させ、ソモギー銅試薬100μｌを加えて反応を停止さ
せた。これを煮沸水中に10分間放置した後、冷却し、ネ
ルソン試薬100μｌを加えよく攪拌した後、1mlのイオン
交換水を加えて遠心分離を行った。遠心分離して得られ
た上清の550nmにおける吸光度を測定し、還元糖の増加
量を求めた。

上記した反応条件において、60分間に、60nmolのブドウ
糖に相当する還元糖を遊離させるα−1,3−グルカナー
ゼの活性を１単位とした。実際的には、各種濃度のα−
1,3−グルカナーゼを用いて標準曲線を作成し、それに
よって還元糖増加活性を求めた。

なお、還元糖増加活性測定法により求めた酵素活性１単
位は、フェノール硫酸法を用いる活性測定法による280
単位の酵素活性に相当する。

〔実施例〕

バチルス・サーキュランス・BC−８菌を利用したα−1,
3−グルカナーゼの製造方法 実施例１ 前記不溶性グルカンの調製例に従って調製し、超音波で
破砕、懸濁した不溶性グルカン0.5％（乾燥重量のW/
V）、燐酸二アンモニウム〔（NH₄）₂HPO₄〕0.5％、燐酸
一カリウム（KH₂PO₄）0.1％、食塩0.1％、酵母エキス
（Difco社製）0.1％を含む液体培地（pH7.0）100mlを、
500ml容の綿栓をしたエルレンマイヤーフラスコに入れ
る。加熱滅菌後、別に滅菌した1M硫酸マグネシウム水溶
液および0.1M塩化カルシウム水溶液をそれぞれ1mlずつ
添加して、予め同じ培地で24時間培養したBC−８菌培養
液5mlを接種して、37℃で、ロータリー型振盪培養法に
て、48時間培養した。

培養液に対して、前記水可溶性低分子グルカン溶液の調
製例にて調製した当量の水可溶性低分子グルカン溶液を
添加し、その後、遠心分離を行い、培養上清を得た。こ
の培養上清中のα−1,3−グルカナーゼの活性は、元の
培地1ml当たりに換算してフェノール硫酸法を用いる活
性測定法において770単位/mlであった。

実施例２ 上記実施例１と同様の液体培地を、綿栓とした31容のエ
ルレンマイヤーフラスコに500ml入れ、加熱滅菌跡、実
施例１の培地濃度と同濃度になるように、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウムを加え、さらにピニシリウム（Pe
nicillium）属に属するカビが産生したデキストラナー
ゼ（生化学工業社製）水溶液を、フラスコ１本当たりデ
キストラナーゼが4mgとなるように、無菌濾過して加え
た。

同様の培地で24時間培養したBC−８菌培養液の25mlを接
種して、37℃にてロータリ型振盪培養法にて48時間培養
した。培養終了後、実施例１の場合と同様に、水可溶性
低分子グルカン溶液による処理を行い、培養上清を得
た。得られた培養上清中のα−1,3−グルカナーゼ活性
は、元の培地1ml当たりに換算して、フェノール硫酸法
を用いる活性測定法において775単位/mlであった。培地
中に予めデキストラナーゼを加えておいた場合は、培養
終了後、BC−８菌の菌体以外の残存不溶物は殆ど存在し
なかった。

実施例３ 実施例１と同じ液体培地を綿栓をした31容のエルレンマ
イヤーフラスコに500mlずつ分注し、加熱滅菌後、実施
例１に示した培地濃度と同濃度になるように、硫酸マグ
ネシウム、塩化カルシウムを加え、同様の培地で24時間
培養したBC−８菌培養液を、フラスコ１本あたり25ml接
種して、37℃にて、ロータリー型振盪培養法により、48
時間培養した。

この様にして培養した培養液4.51を遠心分離にかけ、上
清（１）とBC−８菌体及びグルカン残留物を含む沈殿画
分に分けた。この沈殿画分に、水可溶性低分子グルカン
溶液（前記調製例を参照）250mlを添加し、沈殿をこの
溶液中に懸濁して、０℃で10分間放置した。これを遠心
分離にかけ、上清（２）と沈殿画分に分けた。この沈殿
画分に対し、再び水可溶性低分子グルカン溶液を250ml
加えて、前述と同様の処理を行い、上清（３）と沈澱画
分に分けた。上記上清（１）、（２）、（３）を合わ
せ、０〜40％（V/V）のエタノール分画を行い、沈殿物
を遠心分離により集め、少量の50mM燐酸緩衝液（pH7.
0）中に懸濁した。この懸濁液を同緩衝液を外液にして
透析し、透析後、遠心分離により、上清（４）と沈殿画
分に分けた。この沈殿画分を水可溶性低分子グルカン溶
液（100mlずつ）により、上記と同様に、二度処理を行
い、上清（５）および（６）を得た。上清（４）、
（５）、（６）を集め、これにデキストラナーゼCG（生
化学工業社より市販）2,000生化学工業社単位を加え、3
7℃で、６時間反応させた。遠心分離を行い、上清
（７）と沈殿画分に分け、沈殿画分に対しては、200ml
ずつの水可溶性低分子グルカン溶液による処理を二度行
い、遠心上清（８）および（９）を得た。上清（７）、
（８）、（９）を合わせ、限外濾過によって濃縮し、濃
縮液を50mM燐酸緩衝液（pH7.0）を外液にして透析し
た。

この透析液を、同緩衝液で平衡化したセファアクリルＳ
−200カラムに入れ、同緩衝液を用いて溶出した。デキ
ストラナーゼは、セファアクリル樹脂に親和性を持つた
め、この処理によって酵素液に加えたデキストラナーゼ
を取り除くことができた。溶出されてきたグルカナーゼ
画分を集め、50mM燐酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したDEA
E−セファセルカラムに加え、吸着されずに同緩衝液で
溶出されてくるグルカナーゼ画分を集めた。限外濾過に
よってこの画分を濃縮し、50mM酢酸緩衝液（pH4.5）を
外液として透析した。これを、同緩衝液で平衡化したCM
−セファロースCL−6Bカラムに入れ、酢酸緩衝液で充分
カラムを洗浄した後、０〜0.6Mの食塩（50mM酢酸緩衝
液、pH4.5）の直線濃度勾配により溶出した。グルカナ
ーゼ活性を示す画分を集め、SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行ったところ、１本のタンパクバンドの
みが検出された。以上の精製操作によって、BC−８菌の
グルカナーゼは、電気泳動的に均一にまで精製され、フ
ェノール硫酸法を用いる活性測定法において49,400単位
（タンパク質として338μｇ）の精製グルカナーゼが得
られた。このグルカナーゼ標品の比活性は、フェノール
硫酸法を用いる活性測定法において144,000（単位/mgタ
ンパク）であった。

BC−８金変異株を利用したα−1,3−グルカナーゼの製
造方法 実施例４ 1.0％ブドウ糖、1.0％ポリペプトン（大五栄養化学社
製）、0.5％酵母エキスＳ（大五栄養化学社製）、0.5％
食塩、0.4％燐酸一カリウム、0.4％硫酸アンモニウム、
0.1％グリシン、25PPM塩化第二鉄、7.8PPM硫酸マンガ
ン、8.35PPM塩化亜鉛、10PPM塩化コバルト、6PPM硫酸
銅、5PPMモリブデン酸ナトリウム、5PPMホウ酸ナトリウ
ム、からなるpH7.0の滅菌した培養液3lの入ったミニジ
ャーファーメンターにBC−８菌変異株を植菌した（植菌
量は、前記培養液で予め前培養したもの２％相当量）。
次に、これを37℃で、水酸化ナトリウム溶液を用いて、
pHを6.35以上に調整しながら通気攪拌培養を行った。30
時間の培養で、α−1,3−グルカナーゼの活性は、前記
還元糖増加活性測定法で364.8単位/ml（フェノール硫酸
法を用いる活性測定法で、102,000単位/ml）となり、BC
−８菌変異株は、BC−８菌を不溶性グルカンを炭素源と
して用いて培養した場合に比較して、130倍以上の活性
のα−1,3−グルカナーゼを構成的に生産することが判
明した（第６図参照）。前記培養開始後30時間の培養液
を、ミニジャーファーメンターから取り出し、遠心分離
によって菌体を取り除いて培養上清2470mlを得た。この
全α−1,3−グルカナーゼ活性は、前記還元糖増加活性
測定法で901,000単位であった。

この培養上清を限外濾過器により濃縮し、濃縮酵素液に
0.1モル濃度となるように、塩化アンモニウムを添加し
て、濃アンモニア水で、pHを8.5に調整した。これに50
％（V/V）となるように冷エタノールを加え、エタノー
ル分画を行った。沈殿画分を遠心分離によって集めて、
少量の0.1M塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液（pH8.
5）に懸濁溶解した。不溶物を遠心分離によって取り除
いた後、上清を50mM燐酸緩衝液（pH7.0）を外液として
透析した。透析終了後、再び遠心分離を行い、不溶物を
取に除き、上清のα−1,3−グルカナーゼを含む130mlの
溶液を得た。この溶液の全α−1,3−グルカナーゼ活性
は、還元糖増加活性測定法で559,000単位であった。

このエタノール分画後のα−1,3−グルカナーゼ溶液を
用いて、さらに硫酸アンモニウム分画を行った。硫酸ア
ンモニウム80％飽和において、析出する物質を遠心分離
により集め、少量の50mM燐酸緩衝液（pH7.0）に溶解し
た。同じ緩衝液で透析を行い、不溶物を遠心分離によっ
て取り除き、上清のα−1,3−グルカナーゼ溶液を得
た。この全α−1,3−グルカナーゼ活性は、還元糖増加
活性測定法で503,000単位、比活性は526単位/mgタンパ
クであった。以上の精製操作によるα−1,3−グルカナ
ーゼの収率は、56％であった。

〔発明の効果〕

α−1,3−グルカナーゼは、虫歯の原因となる齲蝕原性
連鎖球菌が産生する不溶性グルカンのα−1,3−グルコ
シド結合を特異的に切断する酵素である。本発明による
α−1,3−グルカナーゼの製造方法によれば、このよう
な作用を有するα−1,3−グルカナーゼを産生するバチ
ルス属に属する細菌あるいはその突然変異株、特に、バ
チルス・サーキュランスBC−８菌あるいはその突然変異
株の培養を経て、容易にα−1,3−グルカナーゼを分離
採取することができる。

さらに、本発明に使用されるバチルス属に属する細菌あ
るいはその突然変異株、特に、バチルス・サーキュラン
スBC−８菌あるいはその突然変異株は、他の細菌と比較
して、以下の点において優れている。

炭疽菌（Bacillus anthracis）を除いて、バチルス属に
属する細菌には、病原菌や毒性のある菌は全く見当たら
ない。従って、工業的な各種の酵素生産や食品類〔例え
ば、納豆菌（Bacillus natto）〕の生産によく利用され
ている。それらの経験を生かして、本発明にこれら細菌
を応用できる可能性が高い。また、本発明を工業的に使
用する場合、安全性の点においても何ら遜色がない。

また、バチルス属に属する細菌の中でも、枯草菌（Baci
llus subtilis）は形質転換が可能で、数ある細菌の中
でも、大腸菌に次いで遺伝学的背景がよく研究されてい
る。このように、バチルス属に属する細菌は、これら細
菌に関する知見を利用できるので、今後本発明を遺伝子
工学的に、あるいは遺伝生化学的に発展させる上で有利
である。

以上の二点を勘案すれば、本発明は従来のものに比べ
て、一段と工業的にも安全に使用し得る優れた製造方法
の提供をも可能ならしめるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼ
の各pHにおける活性を示すグラフ； 第２図は、BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼ
の各pHにおける安定性を示すグラフ； 第３図は、BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼ
の各温度における活性を示すグラフ； 第４図は、BC−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼ
の各温度における安定性を示すグラフ； 第５図は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でのB
C−８菌が産生するα−1,3−グルカナーゼの分子量の決
定を示すグラフ；および 第６図は、BC−８菌変異株の培養時間と、培養液中に生
産されたα−1,3−グルカナーゼの活性との関係を示す
グラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】α−1,3−グルカナーゼの製造方法であっ
   て、 （ａ）バチルス（Bacillus）属に属する細菌あるいはそ
   の突然変異株を、培養培地に接種し、 （ｂ）前記培養培地にて、前記バチルス属に属する細菌
   あるいはその突然変異株を培養し、 （ｃ）遠心分離によって、前記バチルス属に属する細菌
   あるいはその突然変異株の培養物から菌体を分離・除去
   し、そして、 （ｄ）前記培養物に含まれるα−1,3−グカナーゼを採
   取する、工程を含み；および、前記α−1,3−グルカナ
   ーゼが、 （ｅ）α−1,3−グルコシド結合を有する多糖基質をエ
   ンドタイプに加水分解し、 （ｆ）1,3−α−Ｄ−グルカンのα−1,3−グルコシド結
   合を特異的に分解し、 （ｇ）pH5.0にて至適pHを示し、 （ｈ）45℃〜50℃の至適温度を有し、および （ｉ）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
   て決定された180,000の分子量を有すること、 を特徴とするα−1,3−グルカナーゼの製造方法。
2. 【請求項２】前記バチルス属に属する細菌が、バチルス
   ・サーキュランス（Bucillus circulans）菌である、特
   許請求の範囲第１項に記載のα−1,3−グルカナーゼの
   製造方法。
3. 【請求項３】前記バチルス・サーキュランス菌が、バチ
   ルス・サーキュランスBC−８菌（Bacillus circulans B
   C−8:FERM BP−733）である特許請求の範囲第２項に記
   載のα−1,3−グルカナーゼの製造方法。