JPH01252281A

JPH01252281A - 新規エキソキシラナーゼ２、その製法、及び該酵素によるキシロース等の製法

Info

Publication number: JPH01252281A
Application number: JP63078132A
Authority: JP
Inventors: Tatsu Araya; 龍新家; Takashi Minamimori; 南森　隆司; Hirofumi Akano; 裕文赤野; Takeshi Sato; 猛佐藤; Hajime Okumura; 奥村　一; Kichiya Kawamura; 川村　吉也
Original assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Current assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Priority date: 1988-04-01
Filing date: 1988-04-01
Publication date: 1989-10-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規エキソキシラナーゼ■その製法、及び該酵
素によるキシロース等の製法に関する。

（従来の技術〕現在、キシロースは綿実等のキシランを酸による部分加
水分解法により製造している。しかし、この方法では収
率も低く、かつ精製工程も繁雑であった。そこで、本発
明者らは酵素法によるキシロースの製造に着目し、本発
明を完成するに到った。

キシロースを生産する為のキシラナーゼとしては従来か
らバシラス・プミルスが生産する酵素（八。

Ｂ、Ｃ，４７９５７〜９６３．１９８３）やクロストリ
ティウム属に属する微生物が生産する酵素（特開昭６２
−２９９７．１）が知られているが、これらは菌体内酵
素でその生産に問題があった。更に、耐熱性も低かった
。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は耐熱性に優れ、その生産に有利な菌体外酵素を
効率的に製造する方法を提供するものである。

〔課題を解決するための手段］本発明者らは工業化する際、微生物汚染及びエネルギー
的な面から有利となる６０〜６５℃付近でオリゴ糖生産
能力の強い微生物の検索を行なった結果、土壌より分離
したバシラス・ステアロサーモフィラスと同定された微
生物が６０〜６５℃付近で効率よ＜；トンロオリゴ糖を
生成するキシラナーゼを菌体外に多量生産することを認
め、本発明を完成した。

以下にこの発明に使用するキシラナーゼ生産菌の代表で
あるバシラス・ステアロサーモフィラスＮｏ、２１株（
微工研菌寄第９８８１号）の菌学的性質を記載する。

Ａ、形態的特徴 ■細胞の形及び大きさ；桿菌で大きさは０．６〜１．０Ｘ２．０〜３．５μｒｎ
■細胞の多形性；　無し ■運　動　性；　有り ■胞子形成能　；　有り、胞子の形状は楕円形で、ター
ミナル部に位置し、径は１．０〜１．８μである。

■ダラム染色性、　陽性 ■抗　酸　性；　無しＢ、生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　」− ■ＭＲテスト　　　　　　− ■ＶＰテスト　　　　　　± ■インドールの生成　　　− ■硫化水素の生成　　　　− ■デンプンの加水分解　　」− ■ゼラチンの液化能　　　十 ■色素の生成　　　　　　微弱に水溶性褐色色素を生成
する ■カタラーゼの生成　　　士［相］オキシダーゼの生成　　士 ■生育の範囲　　　　　　ｐＨ中性付近温度５４〜７０
℃ ＠酸素に対する態度　　　絶対好気性［相］下記のＩＪ！ｉ　ＩＱから酸及びガスの生成の有
無酸　　ガス（１）Ｌ−アラビノース　　　士　　　−（２）Ｄ−キ
シロース　　　　±　　　−（３）Ｄ−グルコース　　
　　＋　　　−（４）Ｄ−マンノース　　　　　十　　
　−（５）Ｄ−フラクトース　　　十　　　−（６）Ｄ
−ガラクトース　　　±　　　−（７）麦芽ＩＪＮ　　
　　　　　　±　　−（８）　　ショオ唐　　　　　　
　　＋　　　−（９）乳糖　　　−− ００）トレハロース　　　　十　　　−（ＩＩ）　　Ｄ
−ソルヒノ１〜　　　　−−０２）Ｄ−マンニット　　
　　十　　　−０３）　　イノジット　　　　　− ０７１）グリセリン　　　　±　　− ０５）デンプン　　　　　　十　　　−ａω　キシラン
　　　　　　士　　　−以上の菌学的性質に従い、本発
明の菌株バシラス・ステアロサーモフィルスＮｏ、２１
株の分類学的地位をハージェーズ・マニュアル・オブ・
デターミネティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版より求めると、好気
性、グラム陽性桿菌、胞子を形成する等の理由により、
本菌株はバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌
であると同定された。

さらに６５℃以上でも生育する事により、本菌株はバシ
ラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ、　５ｔｅａｒｏ−
Ｕ肛剪妨且用）、バシラス・シエレゲリー（」。

廷旦」貝ｉ　ｉ　）　＋　　バシラス・アシドカルダリ
ウス刊。

ａｃｉｄｏｃａｌｄｃ期川）らに近縁の神で用るこ七が
ゎがった。

さらに胞子の位置、生育ｐ　Ｈ、スターチの分解能力等
の性質から、本菌株はバシラス・ステアロサーモフィラ
スであると同定した。

このバシラス・ステアロサーモフィラスＮｏ。２１株は
キシラナーゼとして新規なエンドキシラナーゼＩ及びエ
キソキシラナーゼＨを産仕する。

エンドキシラナーゼＩの特性は次の通りである。

Ａ４作用本酵素はキシランに作用し、キシロビオース、キシロト
リオースを多量及びキシロテトラオース、キシロペンタ
オースを少量生成する。しかし、キシロースは殆ど生成
しない。

Ｂ、基質特異性キシランを分解する。

Ｃ９至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲ｐ　Ｈ５，０〜９．０の範囲で作用し、至適ｐＨは７．
０付近である。

Ｄ１作用温度範囲及び最適作用温度約７０’Ｃまで作用し、最適作用温度は６１℃である（
１％キシラン、ｐＨ７，０，１２時間反応）。

Ｅ、熱安定性ｐＨ７，０，６０分間加熱処理後、残存活性を測定した
。その結果７０℃で４５％、７５℃で１５％、　８０℃
でほぼ完全に失活した。

Ｆ１等電点　　　ｐＨ４，５付近Ｇ、力価の測定法２％キシランを含有する０、　１　Ｍリン酸緩衝液の１
ｍｌに酵素溶液１ｍｌを混合し、５５℃で６時間反応後
、遠心分離した上清液の還元糖を３，５−ジニトロサリ
チル酸法で測定した。この条件下で１時間にキシロース
１　ｍｇに推定する還元力を示す酵素量を１単位と定義
した。

Ｈ１精製方法木菌の培養上清液に６０％飽和の硫酸アンモニウムを加
えて塩析した。次いで塩析沈澱物をｐＨ５，５、５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液にとかし、セファデックスＧ１００カラム
に通した。次いでｐＨ５，５゜５０ｍＭ酢酸緩衝液で平
衡化したＣＭ−セファデックスＣ−５０に通過させ、凍
結乾燥し、濃縮後ファルマシアＦＰＬＣのクロマトフオ
ーカシングにかけた。ｐＨ４，５付近で？吉川したエン
ドキシラナーゼＩを得た。

１、分子量七フアクリルＳ−２００カラム（ファルマシア製）を用
いたゲル濾過により推定されたエンドキシラナーゼＩの
分子量は約２５．０００であった。

エキソキシラナーゼＩＩの特性は次の通りである。

Ａ８作用本酵素はキシランに作用し、キシロース及び少量のキシ
ロビオースを生成する。

Ｂ、基質特異性キシランを分解する。

Ｃ１至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲ｐＨ５〜９の範囲で作用し、至適ｐＨは６．５付近であ
る（１％キシラン、５５°ｃ、１２時間反応）。

（このｐＨ測定において、基質としては０．　］　Ｍリ
ン酸緩衝液にキシラン２％を加えたものを使用した）。

又、ｐＨ５〜８の範囲にて安定である（リン酸緩衝液中
で１時間室温放置後、残存Ｇ活性を測定した。）Ｄ１作用温度範囲及び最適作用温度温度４０〜約８０℃の範囲で作用し、最適作用温度は７
０℃付近である（１％キシラン、ｐＨ７，０゜１２時間
反応）。

Ｅ、熱安定性ＰＨ７，０，６０分間加熱処理後、残存活性を測定した
。その結果７０℃で６０％、　７５’Ｃで２５％、８０
℃でほぼ完全に失活した。

Ｆ０等電点　　　ｐＨ４，０付近Ｇ、力価の測定法２％キシランを含有する０、１Ｍリン酸緩衝液のｌ＋ｎ
１に酵素溶液ＩＴｎｌを混合し、５５℃で６時間反応後
、遠心分離した」−清液の還元糖を３，５−ジニトロサ
リチル酸法で測定した。この条件下で１時間にキシロー
ス１　ｍｇに推定する還元力を示す酵素量を１単位と定
義した。

Ｈ１精製方法本菌の培養上清液に６０％飽和の硫酸アンモニウムを用
いて塩析した。次いで塩析沈澱物をｐＨ５，５、５０ｍ
Ｍ酢酸緩衝液にとかし、セファデックス０１００カラム
に通した。次いでｐＨ５，５。

５０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化したけ一セファデックスＣ
−５０に通過さセ、凍結乾燥し、濃縮後ファルマシアＦ
ＰＬＣのクロマトフオーカシングにかけた。ｐＨ４，５
付近で溶出したエキソキシラナーゼＩＩを得た。

１０分子量七フアクリルＳ−２００カラム（ファルマシア製）を用
いたゲル濾過により推定されたエキソキシラナーゼＨの
分子量は約１００，０００であった。

次に、本菌を用いてエキソキシラナーゼＩＩを生産せし
める為の培養方法は通常の細菌の培養法が使用できる。

炭素源としては、各種キシラン、小麦ふすま、パルプ廃
液や穀物糖化粕、稲ワラ等のキシランを含む各種原料あ
るいはその他の糖類を単独または組み合わせて用いる事
が出来る。

窒素源としては、有機窒素含有物として各種アミノ酸、
コーン、ステイープリカー、マルトエキス、ペプトン、
イーストエキス等が、又、無機窒素化合物としては、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素等が単独また
は組み合わせて用いる事が出来る。

その他、ミネラル、ビタミン類等を適時添加するとよい
。

培養温度は５５℃〜７０℃が適しており、更に好ましく
は５５℃〜６０℃がよい。培養ｐＨは６．５〜７．５が
適しているが、更に好ましくは７．０がよい。培養日数
は１〜３日である。

培養方法は、液体培養、固体培養いずれでもよいが、好
気的に液体培養するのが好ましい。

培養終了後、公知の手法によりエキソキシラナーゼＩＩ
を得る事が出来る。

まず、培養液中の菌体等を遠心分離し上清液を得る。こ
の上清液を粗酵素として利用する事も可能である。この
上清液を６０％硫酸アンモニウムで沈澱させ、粗酵素を
得る。この粗酵素を一晩透析し、その透析内液をゲル濾
過、クロマトフオーカシングを行ないエキソキシラナー
ゼＨの最終標品を得る。

このようにして得たエキソキシラナーゼＩＩを用い、キ
シロオリゴ糖を製造する為の酵素反応は５５〜６０℃，
ｐＨ６，０〜８．０、反応時間１２〜２４時間、キシラ
ン濃度は０．５〜１％で行なうとよい。反応液の組成は
キシロース（×１）約７５Ｗ八χ（７０〜８０Ｗハχ）
、キシロビオ−，２，（Ｘ２）約２５Ｗ／ＷＸ（２０〜
３０Ｗ／ＷＸ）　テあった。

上記酵素反応を利用したキシロース等の製造には、精製
酵素にかえてバシラス属に属するエキソキシラナーゼ■
生産能を有する菌体培養液あるいはその遠心分離の上清
液等が挙げられる。

この発明のエキソキシラナーゼＩＩを作用させるキシラ
ン含有物質としては小麦麩等が挙げられる。

［発明の効果〕本発明は耐熱性に優れた新規なエキソキシラナーゼ■、
バシラス属に属する微生物による該酵素の製法、及び該
微生物によるキシロース及びキシロビオースの製法が提
供された。本発明の方法によるエキソキシラナーゼＨの
製法においては、該酵素が菌体外に産生される利点があ
る。また、本発明により得られるキシロース及びキシロ
ビオースは甘味料、保湿剤等として食品工業、化粧品工
業に有効に利用しうるものである。

〔実施例〕

次に実施例により、本発明を具体的に説明する。

実施例１　　粗酵素液の調製キシランＩＩＩＩへχ、酵母エキス０．１−八χ、Ｎ１
１．ＣＩｏ、２Ｗ／ＷＸ、Ｋｌｌ。ＰＯ４０，４Ｗ／Ｗ
χ、ＮａＣ１Ｏ，２Ｗ／ＷＸ、ＭｇＳＯ４，７１１２０
０，ＩＷ／Ｗχ、Ｆｅ５０．４＋＋２ｏ　Ｏ，００５Ｗ
／ｌ’ｌＸ、ＭｎＳＯ４０，０５Ｗ／１．１χ、ＣａＣ
１ｚ　・２ＨｚＯ０，０２Ｗ／ＷＺからなる培地（ｐＩ
（＝７．０）　１００ｍ１を１１の三角フラスコニ仕込
み、バシラス・ステアロサーモフィラス（微工研菌寄第
９８８１月）を接種した。木仕込め液を５５℃５４８時
間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離し上清液を
得た。この上清液は０．２４ユニット／ｍｌのキシラナ
ーゼを含有していた。

実施例２　　粗酵素液の調製実施例１の培地３１を５！のシャーファーメンタ−に仕
込み、実施例１の培養液１００＋ｎｆ全量を接種し０．
８ｖｖｍ、　２０Ｏｒｐｍにて６０℃１３０時間培養し
た。

培養後、培養液を遠心分離し上清液を得た。この上清液
は０．２４ユニツ）／ｍｆのキシラナーゼを含有してい
た。

実施例３　　酵素反応１実施例１で得られた上清液１−を１％キシランを含むｐ
Ｈ７，０のリン酸緩衝液１ｄに添加し５５℃５１２時間
反応させた。生成糖を高速液体クロマトグラフィー（カ
ラム　ナカライ５ＮＨ２，□チルシアン：フー７４：２
６．検出器　昭和型エソーデックスＲＩＳＥ−１１）に
て分析した結果、キシロース５−ハχ、キシロビオース
２０Ｗ／ＷＸ、キシロトリオース２５Ｗ／ＷＸ、キシロ
テトラオース２１−八χ、キシロペンタオース２９誓ハ
χから成る生成物が得られた。

実施例４　　酵素反応２実施例１で得られた培養上清液３０Ｍを、６０％硫酸ア
ンモニウムで沈澱させた。この沈澱を透析して得られた
粗酵素液をゲル濾過、クロマトフオーカシングし精製エ
キソキシラナーゼ■２．４ユニット／ｍｌの粗酵素液４
ｄを得た。

本酵素液１ｍｌに２％キシランを添加し、５５℃１ｐＨ
２，０で１２時間反応を行なった。

生成糖を分析した結果、キシロース７５−ハχ、キシロ
ビオース２５Ｗ／Ｗχからなる生成物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はエキソキシラナーセＩＩのｐＨと活性の関係を
示すグラフであり、第２図は該酵素のｐＨ安定性を示す
グラフであり、第３図は該酵素の温度と活性の関係を示
すグラフであり、そして第４図は該酵素の温度安定性を
示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記特性を有する新規エキソキシラナーゼIIＡ、
作用本酵素はキシランに作用し、キシロース及び少量のキシ
ロビオースを生成する。Ｂ、基質特異性キシランを分解する。Ｃ、至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲ｐＨ５〜９の範囲で作用し、至適ｐＨは６．５付近であ
る。又、ｐＨ５〜８の範囲で安定である。Ｄ、作用温度範囲及び最適作用温度温度４０〜８０℃の範囲で作用し、最適温度は７０℃付
近である。Ｅ、分子量約１０万前後Ｆ、等電点ｐＨ４．０付近
（２）バシラス属に属する下記の特性を有するエキソキ
シラナーゼII生産菌を培地に培養し、培養物からエキソ
キシラナーゼIIを製造する方法。Ａ、作用本酵素はキシランに作用し、キシロース及び少量のキシ
ロビオースを生成する。Ｂ、基質特異性キシランを分解する。Ｃ、至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲ｐＨ５〜９の範囲で作用し、至適ｐＨは６．５付近であ
る。又、ｐＨ５〜８の範囲で安定である。Ｄ、作用温度範囲及び最適作用温度温度４０〜８０℃の範囲で作用し、最適温度は７０℃付
近である。Ｅ、分子量約１００，０００Ｆ、等電点ｐＨ４．０付近
（３）バシラス属に属する微生物がバシラス・ステアロ
サーモフィラスＮｏ．２１である請求項２記載のエキソ
キシラナーゼIIを製造する方法。
（４）キシラン含有物質にエキソキシラナーゼIIを作用
させてキシロース及びキシロビオースを製造する方法。
（５）キシラン含有物質にバシラス属に属するエキソキ
シラナーゼII生産菌又はその処理物を作用させてキシロ
ース及びキシロビオースを製造する方法。
（６）処理物がエキソキシラナーゼIIの粗酵素である請
求項５記載のキシロース及びキシロビオースを製造する
方法。